（微生物学专业论文）耐高温乳酸菌的选育及应用研究.pdf

耐高温乳酸菌的选育及应用研究 摘要 本实验从青贮玉米饲料、果渣、牛奶、新鲜的泡菜汁等样品中筛选耐高温乳 酸菌。通过初筛、复筛，获得一株耐高温且产酸能力较强的菌株l 1 ；依据伯杰 氏系统细菌学手册和乳酸菌分类鉴定的标准和描述，对其进行了生理生化特性鉴 定并确定其为乳杆菌属( 1 a c o t o b a c i l l u s ) 德氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sd e l b b r u e c k i ) 。 对l 1 菌株进行h e - n e 激光诱变育种研究，经过多次诱变，在大量突变株中 选到了一株耐高温、产酸能力强的菌株t l i ，在7 0 c 高温培养下突变株菌数量是 原菌株的1 2 倍，菌数量最多达1 2 7 5 x1 0 9 个m l ；且其具有良好的遗传稳定性。 通过单因素试验和正交试验确定突变菌株t l l 的最佳增殖培养基组分为：玉 米粉1 6 + 麸皮5 ；在d 一淀粉酶( 5 u g 玉米粉、9 0 c 、3 0 r a i n ) 和糖化酶( 1 5 0 u g 玉米粉、5 5 、2 3 h ) 酶解作用下，最佳发酵条件为：发酵温度6 0 ，发酵时 间3 6 h ，p h 值3 5 。 在青贮玉米应用试验中，结果表明：添加t l l 菌后，腐败菌随着时间的延长 总菌数最后为零；感官评定结果显示：青贮饲料处理组效果明显地优于对照组的 效果；对处理组和对照组的化学分析表明：处理组的丁酸含量降低为零，乳酸和 丙酸的含量增加；酸性洗涤纤维含量降低了3 1 2 ；木质素含量降低了5 ；氨态 氮含量降低了3 6 4 ：干物质消化率提高了4 3 5 2 ；饲喂试验结果表明：奶牛的 日产奶量可提高l k g 以上，有显著的增产效果。综合以上结果得出：添加t l l 菌后快速降低了青贮饲料p h 值，显著降低了青贮饲料的霉变程度，减少了青贮 物料的损耗，提高了青贮饲料的品质。 在堆肥应用试验中，结果表明：添加t l l 菌后p h 值显著下降；挥发性有机 质含量下降了5 0 ；小麦种子发芽率提高了4 ，综合以上结果可以得出：添加 t l l 菌株显著缩短了到达高温期的时间，且高温持续时间较长，改善了堆料的质 地，促进了腐熟的时间，提高了小麦种子的发芽率。 关键词：耐高温乳酸菌，选育，青贮饲料，堆肥； s c r e e n i n go f t h e r m o t o l e r a n tl a c t i ca c i db a c t e r i aa n d a p p l i c a t i o n a b s t r a c t i nt h ee x p e r i m e n t , l a c t i ca c i db a c t e r i aw i t hh i g ht h e r m o t o l e r a n c ew e r ei s o l a t e d f r o ms i l a g e 、a p p l ep o m a c e 、m i l ka n d 舭s hp i c k l e s t h e nt h es t r a i nl 1w i t h t h e r m o t o l e r a c ea n dp r o d u c i n gm o r el a c t i ca c i dw a si s o l a t e dt h r o u g ht h ep r i m a r ya n d s e c o n d a r ys c r e e n i n g t h r o u g hr e p e a t i n gh e - n el a s e r - i n d u c e db r e e d i n gt h es t r a i nt l l w i t hh i g ht h e r m o t o l e m c ea n dp r o d u c i n gm o r el a c t i ca c i dw a ss c r e e n e d t h en u m b e r o ft h es t r a i nt l l o fi m p r o v e d1 2t i m e st h a nt h en u m b e ro ft h es t r a i nl 1i n7 0 t h e n u m b e ro f b a c t e r i aw a s1 2 7 5 x 1 0 9 u m 1 i th a ds t a b l eh e r e d i t y a c c o r d i n gt ot h ec r i t e r i aa n dd e s c r i p t i o no fb e r g e y sm a n u a lo fs y s t e m a t i c b a c t e r i o l o g ya n dc l a s s i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fl a b ，t h es t r a i nl l w a sc l a s s i f i e d a st h eg e n u sl a c t o b a c i l l u sa n dt h es p e c i e sl a c t o b a c i l l u sd e l b b r u e c k io nt h eb a s i so f m o r p h o l o g i c a lo b s e f v a t i o na n dp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lt e s t s t h r o u g ht h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t sa n do r t h o g o n a lt e s t , t h eo p t i m a lc u l t u r a l c o n d i t i o n so ft h es t r a i nt l lw a s 勰f o l l o w s ：f i n a lp hb e i n g3 5 ，c u l t u r et e m p e r a t u r e b e i n g6 0 a n dc u l t u r et i m eb e i n g2 4 ha tt h ee n z y m o l y s i so fa - a m y l a s e0 0 c 、 3 0 r a i n 、5 u gc o r n ) a n ds a c c h a 曲：i n ge n z y m e ( 5 5 c 、2 - 3 h 、1 5 0 u g ) t h eo p t i m a l c o m p o s i t i o no fc u i t u r em e d i u mw a s1 6 c o r nf l o u r4 - 5 b r a n t h ec h a n g e so fp ha n db a c t e r i a lp o p u l a t i o nd u r i n gt h ef e r m e n f i o nw e r em e a s u r e d , a n df o u n dt h a ts p o i l a g eb a c t e r i ad e c r e a s e df a s ta n dw e l ez e r oi nt h ee n da f t e ra d d i n g i n t ol a b s e n s o r ya s s e s s m e n ta n dc o m p r e h e n s i v ea s s e s s m e n to fo r g a n i ca c i dw e r e s h o w e dt h eq u a l i t yo fs i l a g et r e a t e dw i t hla bw a sb e t t e rt h a nt h ec o n t r 0 1 t h er e s u l t s o f c h e m i c a la n a l y s i si n d i c a t e dt h ec o n t e n to f w a t e r , c r u d ep r o t e i n , c a , p ，a m m o n i a - n , d r ym a t t e r , a c i d , p r o p i o n i ca c i d ，w s c , s u mo fb a c t e r i ao fa l ls i l a g e st r e a t e dw i t hl a b i n e r e a s e ds i g n i f i c a n d yi nc o n t r a s tt oc o n t r 0 1 i nc o m p a r i s o nt ot h ec o n t r o l , t h ec o n t e n t o f p r o p i o n i ca c i da n dl a c t i ca c i di n c r e a s e d1 6 2 a n d 2 1 1 6 r e s p e c t i v e l y t h ec o n t e n t o fn d e a d ed e t e r g e n tl i g m i n ，b u t y r i ca c i dd e c r e a s e do b v i o u s l yi nc o n t r a s tt o c o n t r 0 1 t h ec o n t e n to fd e t e r g e n ta m m o n i a - n ，l i g m i na n da d fd e c r e a s e a3 6 4 ，3 h 1 7 5 a n d3 1 2 r e s p e c t i v e l y t h ef e e dt r i a lp r o v e dt h a tc o r ns i l a g et r t e dw i t ht h es h a i l lt l lc o m p 砌t oc 啪 s i l a g eu n t r e a t e dc o u l di n c r e a s et h em i l ky 丑c d ，a n dt h em i l ky i l e dc o u l di n c r e a s e d1k g e v e r y d a y p r o d u c t i o nr a i s e dr e m a r k a b l y a l lo ft h ea b o v e ，c o r ne m i l a g i n gw i t ht h e c o n t r i b u t i o no ft h es t r a i nt l lc o u l dn o to n l yr e d u c et h em o l d yr a t e , i n c r e a s et h et a s t e o ft h es i l a g e ，i m p r o v et h eq u a l i t yo ft h es i l a g eb u ta l s or a i s et h em i l ky i l e d i nt h ec o m p o s t i n gp r o c e s sp hd e c r e a s e dr e m a r k a b l yw i t ht h es t r a mt l l t h e v o l a t i l cs o l i dc o n t e n td e c r e a s e d5 0 ；s e e dg e r m i n a t i o np e r c e n t a g ei m p r o v e d4 a l l o ft h ea b o v e ，r h er e s u l t ss h o w e d ：t h es t r a i nt l lc o u l da c c e l e r a t et h ed e c o m p o s a b l e v e l o c i t yo fo r g a 丑i cm a t t e r ；i m p r o v et h ec o m p o s tq u a f f t ya n ds c c dg e r m i n a t i o n p e r c e n t a g eo ft h ew h e a t k e y w o r d s ：t h e r m o t o l e r a n t l a c t i ca c i db a c t e r i a , s c r e e n i n g , s i l a g e , c o m p o s t i n g h i 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：硅国毪 指导教师签名： 2 研年6 月1 1 日 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和 致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：桂囱年白 伽唧年6 目 第一章文献综述 1 耐高温乳酸菌的研究概况 1 ，1 嗜温乳酸菌的特性及有关科属 乳酸菌中嗜温菌包括乳球菌和明串珠菌，最适生长温度3 0 3 3 c 。乳球菌 包括两个亚种：乳酸亚种和乳脂亚种( s c 柚e i f 瓯1 9 8 5 ) 。伯杰氏细菌分类手册 第八版中给出了乳酸乳球亚种的形态，并认为它们通过糖酵解途径分解乳糖，并 产生l ( + ) 乳酸，是同型发酵。但一些乳酸乳球菌的菌种可将牛乳中的柠檬酸 代谢成重要的风味物质双乙酰，同时释放出c o , ，它们被认为是柠檬酸阳性菌株 或突变菌株，这一代谢特性是由质粒编码的，故未给出单独的种或亚种。乳酸球 菌乳脂亚种能够代谢柠橡酸产生丁二酮、乙醛等，不产生异味。是重要的干酪发 酵剂菌种，而乳酸乳球菌则使干酪形成异味( l a wa n ds h a r p e , 1 9 7 8 ) ，但因其细 胞容易被工业化浓缩而广泛应用。 明串珠菌是通过异型发酵的磷酸解酮酶途径代谢乳糖，除产生乳糖外，还产 生c 0 b 和乙醇、乙酸，也可发酵柠檬酸。由于乳酸产量低，将明串珠菌与乳球菌 混用可以增强风味物质的产量“。 1 2 嗜热乳酸菌特性及有关科属 嗜热乳酸菌最适生长温度4 0 4 5 c ，最重要的嗜热乳酸菌和唾液链球菌嗜 热亚种( 嗜热链球菌) 、乳杆菌的德氏乳杆菌保加利亚亚种( 保加利亚杆菌) 和 瑞士乳杆菌，是酸奶中常用的菌。嗜热乳酸菌比嗜温乳酸菌有更强的耐酸性，如 利用瑞士乳杆菌可将发酵乳的p h 值降低到4 o 以下，另外除瑞士乳杆菌外其它 均不代谢半乳糖( t u r n e ra n dm a r t l e y ，1 9 8 3 ) 。 1 3 微生物耐高温机制探究 1 9 6 9 年b r o c k 在美国黄石国家公园发现能在7 0 c 以上生长的t h e r m u s 高温菌， 其基因组g + c 含量高达6 7 。人们设想高温菌基因组g + c 含量可能与高温菌耐热性 有关啪。但随着高温菌研究的不断深人，特别是超高温菌的不断发现，人们相继 提出不同的观点。有些超高温菌最适生长温度可达1 0 0 2 以上：，但其6 + c 含量却 相对较低，如p y r o b a c u l u m o r g 柚。拓最适生长温度为1 0 2 ，基因组g + c 含量为4 6 冁， 最适生长温度1 0 0 ( 2 ，基因组g + c 含量仅有3 8 3 ，而迄今为止耐受温度最高的 p y l 0 1 0 b u s f u m a r i i 最高生长温度可达1 1 3 ，其基因组g + c 含量也只有5 3 。 核酸是生物遗传信息的携带者，由于高温菌特殊的生存环境，其d n a 也必须 具有热稳定性。基因组珧峨在细胞周期的大部分时间里与组蛋白、非组蛋白结 合，同时细胞内存在其它热稳定性因素，如热休克蛋白，高k 离子，d n a 拓扑异 构酶等，也可能参与稳定d n a ，因此基因组g + c 含量可能不是高温菌d n a 的热 稳定因素，更不是高温菌耐热性的因素田。而对于1 6 sr r n a 甚至其它r r n a , 如2 3 s r r n a ，5 sr r n a 等由于其在蛋白质合成过程中，核糖体不断的组装与解离，这 些小分子r n a 并不总是与其它分子如蛋白质分子结合，因此这r r n a 自身必须具 有相当高的热稳定性，在核糖体的组装过程中，r r n a 能够通过局部序列回折， 配对形成双链由于g c 碱基对在能量学上比a u 碱基对稳定，因此高g + c 可能 在这类分子中起重要的热稳定性作用嘲。 日本人大岛泰郎在其编著的好热性细菌一书中谈到好热菌耐热机制有内 因和外因。内因是指：基于分子内部结构上的变化所造成的分子内相互作用是决 定这个分子耐热的直接原因，如：核酸中g - c 对的增加；许多酶蛋白质等。外因 可分为保护因子型和生化修饰型。保护因子型是指和特定的金属离子或低分子物 质相结合而导致对热稳定，包括组成型和热诱导型。 组成型：在一般的生理环境下一些生物的高分子物质常常存在有保护因 子，例如：存在c 矿对嗜热均蛋白酶和淀粉酶有保护作用；存在”能使核酸稳 定。 热诱导型：保护因子只是在高温条件下才能被诱导合成出来。如：多胺对 蛋白质合成有保护效应。 生化修饰型：一旦被合成出来的生物高分子受到酶的修饰，就会成为对热稳 定的类型。 组成型：修饰反应与外界温度无关。 熟诱导型：惟有在高温时才会发生修饰反应的类型。如：t r n a 由于受到 修饰而出现5 一甲基一2 一硫代尿苷残基时就会变得对热稳定；由于膜脂质中的脂肪 酸组成发生变化而变得对热稳定忉。 i c l i n d a 等通过对常温下生活的共生梭菌余热球菌属的激烈热球菌和 t h e r m o c o c c u sl i t o r a l i s 的谷氨酸脱氢酶比较分析，发现常温菌与高温菌酶的最大 2 差异是某几个氨基酸的替换。这种替换增加了结构的疏水性和侧链分支。特别 是v a l 和i l e 的替换。研究表明，对蛋白质核心紧密包裹有助于提高蛋白质的 热稳定性 不同微生物对热有不同的抵抗能力，微生物的抵抗力与下列因素有关嘲： ( 1 ) 菌种：菌种不同，对热的抵抗力也不同。这与他们细胞结构特性有关。 从特性上比较，嗜热菌的抵抗力要大于嗜温菌和嗜冷菌，芽孢菌大于非芽孢菌， 革兰氏阳性菌大于革兰氏阴性菌，霉菌大于酵母菌，霉菌和酵母菌的孢子的大于 它们的菌丝体和营养细胞。霉菌的菌核抗热力特别大。 ( 2 ) 菌龄：在同一温度下，对数生长期的菌体细胞的抗热力较小，而稳定期 的老龄细胞的抗热力很强；同样，老龄细菌的芽孢也比幼龄细菌的抗热力大。 ( 3 ) 数量：实验证明，菌量越多抗热力越强。也就是说，含菌量越多，杀死 最后一个微生物所需的时间也越长，原因是菌体细胞能分泌出对菌体有保护作用 的蛋白质。这种物质有减低热力的作用，所以菌体细胞增多，这种保护物质的量 也就增加，这仍是增大抗热力的原因之一。 ( 4 ) 基质p a - 微生物生长要求p h 一般在7 左右，这也是微生物抗热力最强 的范围。当基质的p h 偏向酸性时，微生物的抗热力明显减弱。 ( 5 ) 基质中存在抑制性物质：基质中存在某些抑制性物质可以减低微生物的 抗热力，例如基质中存在5 0 2 或亚硝酸盐以及具有耐热性的抗菌素等。 ( 6 ) 基质的成分，性质 基质中水分：基质中水分少，生活在这种基质中的细菌的抗热力强( 即使 是同一种菌) ；反之，在温热环境中它们的抗热力弱。 基质中的化学成分：生活在脂肪、糖、蛋白质等物质中的细菌抗热力较大。 随着这些物质的浓度增大，其抗热力也随之提高，这是因为上述物质给细菌以保 护作用。 基质中不同盐类：不同盐类以不同浓度对细菌抗热力都会产生不同影响。 某些盐类的存在降低了基质中的水分活性，所以增强了细菌的抗忍能力。而钙、 镁离子可提高水分活性，从而降低了细菌的抗热能力。如在培养巨大芽孢杆菌的 培养基中，添加氯化钙可增强芽孢的抗热力。 j a c n i c k er 和d a n i c l arm 研究高温菌耐热机制，其原因有： 3 d n a , 分子的热稳定机制有提高胞内k + 浓度，d n a 反向螺旋酶，组蛋白及其 它d n a 结合蛋白等。在有些超高温菌细胞内l ( + 浓度可达1m 能够阻止高温条件 下d n a 分子脱嘌岭。在所有的超高温菌( 包括超高温的细菌，古菌) 细胞内都有 d n a 拓扑异构酶i ，又叫反向d n a 螺旋酶，它能够向超高温菌的d n a 分子中引入 正超螺旋，形成闭合环状的d n a 超螺旋分子。而常温菌中的d n a 螺旋酶能够向 d n a 分子中引入负超螺旋。由于不同的原因，正超螺旋比负超螺旋更能抵抗热变 性作用。而有趣的是在有些超高温的细菌、古菌中两种超螺旋酶都具有。在古菌 界中有些产甲烷古菌具有与真核生物组蛋白类似的d n a 结合蛋白，其结构和功 能与真核生物组蛋白相似，又称为古菌组蛋白。这类古菌组蛋白能与d n a 结合并 使其弯曲，包装d n a 形成类核小体结构。虽然这类古菌组蛋白多在产甲烷古菌中 存在，但在矿泉古菌界中的超高温菌中并不存在。在s u l f o l o b u sa c i d o c a l d a r i u s 中存在s a c 7 d 一类的d n a 结合蛋白，其功能可能类似组蛋白，提高d n a 的融链温 度。 膜脂：膜脂是嗜热菌细胞的基本组成成分，在耐高温机制方面起重要作用， 如维持膜的流动性、跨膜运输、维持胞内物质、维持跨膜化学渗透势和膜蛋白的 稳定性等作用。膜必须具有耐受环境温度变化的能力，同时也必须能够耐受其它 极端环境因素，如低p h ，高压等。高温菌的细胞膜通过改变膜脂脂肪酸的组成， 增加磷脂酰烷基链的长度，增加异构化支链的比率，或是增加脂肪酸饱和度等方 式使高温菌的细胞耐受高温。超高温菌维持膜的稳定性和适应性的分子机制根据 系统发育可分为两大类，一是矿泉古菌界的超高温古菌，二是细菌域中的超高温 细菌，包括t h e r m o t o g a l e s 和a q u i f i c a l e s ，在超高温古菌中用更稳定的醚键替代 细菌和真核生物中常见的酯键，用单层脂替代磷脂双分子层。由于醚键不仅仅局 限于古菌域，在细菌域中也有发现，因此膜脂中的醚键可能是真正的高温菌耐热 机制所在“”。 1 4 乳酸菌的鉴定方法 乳酸菌的鉴定方法与一般细菌的鉴定方法类似，大体上可分为表性特征鉴定 法、化学分类法和基于d n a 、r n a 的分子生物学及基因水平的鉴定方法。 1 4 1 表性特征鉴定方法“”1 4 ( 1 ) 形态和生理生化特征鉴定法。形态和生理生化特征鉴定是实验室进行 菌种鉴定中最为常见和最关键的环节，其中形态特征包括群体形态特征和个体形 态特征。群体形态特征又分为( a ) 平板上的菌落特征，包括菌落形状、大小、 边缘、表面及质地( 光滑、租糙、湿润、干燥与光泽等) 、隆起程度、透明度与 色泽等；( b ) 液体培养特征，包括生长量、生长类型与分布、混浊度、表面生长 状态、沉淀物、气味和颜色等。对乳酸菌来说，对鉴定具有重要意义的个体形态 特征主要有染色反应( 革兰氏染色) 、细胞形状、大小和排列方式、运动性，是 否有芽孢、鞭毛等。 细菌生理生化特征鉴定经常测定的项目包括：水解大分子的能力，如淀粉水 解、油脂水解、明胶液化等实验；分解糖或醇类产酸产气试验；其他产物的种类 和数量，如糖或醇类发酵试验、甲基红试验、v p 试验；分解蛋白胨中氨基酸 的能力，如吲哚试验和h 2 s 试验，此外，还有硝酸盐还原反应、柠檬酸盐或丙酸 盐利用试验等。用作分类鉴定特征的酶主要有：氧化酶、过氧化氢酶、凝固酶、 氨基酸脱氢酶、精氨酸水解酶、苯丙氨酸脱氢酶等。对乳酸菌鉴定来说，比较重 要的生理生化试验包括：氧化酶试验、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验，明胶 液化试验、各种糖发酵试验等。 近年来研制成功的多种微生物的糖类生化反应板，以使生化鉴定从原来的复 杂繁琐变得简单易行，便于推广。在众多的细菌快速鉴定系统中，法国梅里埃公 司生产的微生物快速鉴定试剂盒a p i ( a n a l y t i cp r o d u c t si n c ) 系统是在世晃范围 内应用最广、种类最多的细菌鉴定系统，它使微生物鉴定简易化、微量化、快速 化。在我国，a p i 系统以广泛应用于食品和临床微生物学检验。 ( 2 ) 抗菌谱试验分类法。不同种类的细菌对不同抗菌药物的敏感性不一， 同一种细菌的不同菌株对不同抗菌药物的敏感性也常存有差异，不过后者的差异 仍有一定的范围，对抗菌药物的敏感性的差异程度显示了不同种类细菌所具有的 特征，所以这种特征可以成为细菌分类鉴定的特征。在乳酸菌的鉴定中也是如此。 不同的乳酸菌都有其各自的抗菌谱，而对每一种抗生素，不同的乳酸菌会表现出 不同的敏感度，从而做出判断。 1 4 2 化学分类法n 1 4 “1 化学分类法是应用电泳、色谱和质谱等分析技术。根据微生物细胞的组分、 5 代谢产物的组成与图谱等化学分类特征进行分类的方法。乳酸菌的菌体组分或代 谢产物在不同种属同存在差异，通过测定这些成分的含量，可以进行菌种鉴定。 如：乳酸菌代谢葡萄糖产生乳酸的量及其旋光性的测定，乳酸菌含有的醌分析， 细胞壁肽聚糖组分和结构分析、菌体脂肪酸组分、菌体单糖及其他生物大分子分 析等。目前在国家标准检验方法中，利用气相色谱法对双歧杆菌和乳酸杆菌进行 属间鉴定已成为必做项目之一 随着细胞学、分子生物学和遗传学等学科的发展及其研究方法和技术对细菌 分类学的渗透，d n a 的分子生物学及基因水平的鉴定方法使细菌分类学逐渐提高 到了一个新的水平。从2 0 世纪6 0 年代以后细菌分类学步入分子生物学时代，使 细菌分类工作在研究自然界各类群细菌种类及其相互问的亲缘关系，探索建立自 然分类系统方面加速了前进的步伐。 1 5 激光诱变育种 激光技术是2 0 世纪6 0 年代发展起来的- - f 3 新型技术。自1 9 6 0 年美国梅曼 制成世界上第一台红宝石激光器后激光技术的发展突飞猛进。它不仅强有力地促 进物理学、化学和现代学光学技术的发展，而且成功地应用在现代工业、农业、 医学、生物学等基础和运用科学领域。 i 5 1h e - n e 激光的生物学效应 在低功率的激光中，位于可见光范围内的h e - n e 激光目前是应用最广泛的激 光。h e - n e 激光的功率一般为1 3 m w 6 0 m w 之间，波长为6 3 2 。8 r i m ，生物学的研 究领域使用广泛，使用频率达4 0 ，研究过的生物近6 0 多种，h e - n e 激光的主要 生物学效应在于； ( 互) h e - n e 激光对生物的刺激及抑制作用。 ( h e - n e 激光对生物的诱变作用。 h e n e 激光可以诱发染色体畸变，破坏染色体，造成d n a 分子的损伤或突 变。 ，( 鸯h e - n e 激光对蛋白质及同功酶有一定的影响，通过对l o 多种植物的分析 得出：随着辐射剂量的增加，酶活性提高，但迁移率有所减少，如果剂量超出一 定范围，则酶的活性下降。 1 5 2 激光在微生物领域的研究进展 6 随着激光技术的不断发展，激光在生物学领域的研究中得到广泛应用。主要 表现在植物激光育种方面，国外开展较早的国家有美国、原苏联，澳大利亚等。 激光在微生物中的研究应用，尽管不如生物学其它领域研究得那么活跃，但 是现在也引起了极大的关注1 9 6 2 年美国宾法尼亚大学的b c h a n c e f f t l h s c h l e y e r 报道了激光研究藻类光合作用的工作，开拓了激光微生物的研究。赵学武“”探讨 了激光对盐生杜氏藻的诱变作用，发现经激光照射后的突变体的生长速率较原藻 最高增加2 0 ，生长长度增加7 5 ，b 一胡萝卜素生产能力比原藻增加1 9 。刘建 龙等町采用激光和亚硝基胍复合诱变处理，选育出一株高产碱性淀粉酶的突变 株，测得酶活是出发菌株酶活力的2 1 倍。r a m a b h a r a n 等( 1 9 7 6 ) 发现近紫外 光的辐照能抑制e c o l i 的生长和r n a 的合成。侯丙凯等嘲( 1 9 9 9 ) 利用激光微束辐 照油菜子叶叶柄，将来自苏云金杆菌的杀虫蛋白( i n s c c t i c i d a g r o t e i h z a p ) 基因导 入油菜细胞中，经植株再生和卡那霉素筛选，获得了转基因植株。向洋口1 1 等人从 1 9 8 4 年起，用激光对大肠杆菌进行育种研究，并用h e - n e 激光照射酱油酿造用米 曲霉3 3 6 株，从中选育了四株蛋白酶活力高的诱变菌株。1 9 9 8 年，陈五岭等运用 h e - n e 激光辐照金霉素链霉菌嘲，红霉素链霉菌嘲选育出了四环素和红霉素的高 产菌株。赵炎生等1 对比了紫外、h e - n e 激光、n d ：y a g 倍频脉冲激光对脱落酸 产生菌灰葡萄孢霉( b o t d , t i sc i n e r e a ) 的诱变效果，发现n d ：y a g 倍频脉冲激光诱变 效果最好，所得高产菌株效价提高率可达6 0 以上。1 9 9 7 年，陈五岭嘲首次用 h e n e 激光辐照香菇菌丝体，选育出几株生长率比亲本明显加快，过氧化物酶 ( p o d ) 酶活提高的诱变株，通过对诱变株的中试栽培嘲，他们发现新菌株比亲 本生长期平均缩短2 1 天左右。 八十年代以来，随着生物工程，特别是遗传工程的发展，激光微束开始向基 因工程，细胞工程等高技术生物领域渗透，并取得了良好的开端。1 9 8 4 年日本理 化研究所嘲首先报道了用激光微束对动物细胞施行显微操作导入外源d n a 的研究 结果。我国学者谭石慈嘲1 也进行了这方面的研究，并取得了一定的进展。可以预 料，随着近代科学技术日新月异的发展和各学科的相互渗透，激光诱变技术可能 在不远的将来为生物工程的发展作出巨大的贡献。 1 6 相关领域国内外现状及发展趋势 在微生物学研究中，高温菌( t h e r m o p h i l e ) 也称嗜热菌或好热菌，是人们感 7 兴趣的研究课题。多年来关于高温生境的描述数不胜数，1 8 7 9 年米奎( p m i q u e l ) 从法国塞纳河中分离到能在7 0 c 环境中生长的杆菌，这种杆菌可能是嗜热芽孢杆 菌或其近缘种，他还从土壤和污物中分离到高温菌。这可能是有关高温菌的最早 的报道嘲。直到1 9 6 5 年至1 9 7 5 年，t h o m a sd b r o c k 指导并完成了为期十年的黄 石公园高温生境微生物野外及实验室研究嗍。在探索高温生境生命化学、生态学 及生物化学过程中m 1 ，发现了t h e 嘲u sa q u a t i c 船脚及在对该菌代谢酶的系统 研究中发现了构成p c r 核心的耐高温d n ap o l y m i s e 一即t a q 酶，正是b r o c k 等 对z a q u a t c u s 及黄石公园高温生境深入并具开创性的工作，开启了高温生境生命 研究的高潮嘲 在过去的3 0 年里大量高温菌新种和相关出版物以及多个完成或正在进行的 耗资巨大的全基因组测序都显示了科学团体对高温菌研究广泛而深入的关注分 子生态技术和脂肪酸分析的运用，发现目前已知的高温菌仅占了高温生境中高温 菌的极小一部分，一个重要的难点仍如传统微生物的一样不断探索新的分离方 法，其中如h u b e r 等( 1 9 9 5 ) 采用光钳技术与r n a 原位杂交成功分离到一株新的超 嗜热菌，x 目 t h c r m o t o g am a r i t i m a 全基因组的研究为基因水平转移( l g t , l a t e r a l g e n e t r a n s f e r ) 假说更进一步提供了强有力的支持证据删 据报道，某些超高温菌( h y p e r t h e r m o p h i l e s ) 的最适生长温度到8 0 以上慨 删。，其区分标准规并无一个严格的定义，而是由较宽的温度界限范围。一种划 分方案是将在5 5 以上环境中能够生长的菌叫高温菌，3 0 以上环境不能生长 的菌叫好冷菌，除此之外，所有的菌都叫好温菌，在3 7 环境以及3 7 环境以 下也能生长的高温菌成为兼性高温菌，而在这一温度范围内不能生长的高温菌称 专性高温菌m 。高温菌是一类能在4 5 以上生长和繁殖的极端环境微生物，包括 部分细菌、古菌和真菌。其中，最适生长温度在4 5 8 0 之问的高温菌为中度 嗜热菌，最适生长温度大于8 0 的微生物为超高温菌。目前发现的高温菌具有 如下特点：分类进化级位覆盖三个域；系统进化地位越低级生长温度越高， 如古菌为1 1 3 ，细菌为9 0 ，真菌为6 0 6 2 c ；已发现的最适生长温度超 过8 0 的高温菌无一不是严格厌氧的m 1 陕西科技大学成功选育出能耐受高温的乳球菌和乳杆菌两个系列益生乳酸 菌菌种，成功研发了能增强该菌株抗高温的植物保护剂，解决了喷雾中乳酸菌耐 8 高温关键技术问题：耐高温菌株的选育和抗高温保护剂的研究属国内首创，填补 了高活性乳酸菌奶粉的空白嘲。 陈健凯等( 2 0 0 5 ) 年利用双层包埋及包埋乳酸菌，经过严格的后加工环境， 嗜酸乳杆菌平常在5 0 则不能生长，经过包埋后，在5 0 、6 0 r a i n 的环境下， 存活率可维持在5 7 1 在6 0 1 2 、6 0 r a i n 环境下，存活率仍可维持在3 2 以上：干 酪乳杆菌的生长温度为2 5 4 5 c ，经过包埋后在5 0 、6 0 r a i n 的环境下，仍有 5 8 的存活率；在6 0 c 、6 0 r a i n 环境下，存活率有4 2 。其实验表明，双层包埋 的乳酸菌耐热性强，在高温环境中保持较高的生物活性 袁清珠等人从都尔伯特半荒漠草原牧区牧民家庭采集的6 2 份样品中分离到 3 4 株乳杆菌，其中1 株为高温菌( d b 4 0 - 3 ) ，4 5 生长而1 5 1 2 不生长，发酵松三 糖和核糖。中科院微生物研究所与美国合作已分离到嗜高温菌菌株，他们在缺 氧高温环境下如在岩石微细缝隙中靠“吃”铁、镍、甲烷等生存，维持它们自养 生命生活。这些研究发现为地下生物圈的。微生物世界”以及生命起源的研究、 探索以及古菌资源的开发展现巨大的潜力和光明的未来。 2 乳酸菌在青贮饲料中的应用 2 1 青贮及乳酸菌青贮添加剂的概念 青贮( s i l a g e ) 是一种保存越冬饲料作物青绿多汁的传统方式。它是以新鲜 的青绿饲料饲喂原料，利用植物表面自然附生的乳酸菌，在密闭条件下，通过厌 氧发酵，将植物表面的可溶性碳水化合物转化为乳酸、乙酸等有机酸，导致饲料 p h 降低，来抑制腐败微生物菌群的生长繁殖，从而达到保持作物的营养特性的 目的“”。青贮饲料就是把青绿或半干饲料装入青贮窖内在厌氧条件下靠乳酸菌发 酵制成能够长期保存的饲料。乳酸菌青贮添加剂，是专门用于饲料青贮的一类 微生物添加剂，主要作用是有目的地调节青贮内微生物区系，调控青贮发酵过程， 促进多糖与粗纤维的转化，从而有效地提高青贮饲料的质量m 。 2 2 青贮饲料的特点 ( 1 ) 青贮饲料可以维持原料青绿多汁的营养，调制过程中养分流失少，能 够较好的保存原料的蛋白、可溶性碳水化合物、小分子维生素和矿物质的含量。 ( 2 ) 适口性好，利于牲畜采食。青贮过程中产生的乳酸不仅是很好的消化 9 促进剂、风味剂，而且还可以与很多矿物质作用生产乳酸盐，可以更好的被牲畜 吸收利用。 ( 3 ) 可作为青贮底物的原料品种繁多，常见的有各种牧草、农作物秸秆、 经济作物种植过程或收获后加工使用过程中产生的废弃物等等。随着近年来青贮 添加剂的广泛研究及应用，一些原先认为营养价值不高、贮存价值不大的农业废 弃物开始不断被重新认识和利用。添加一些具有营养促进作用的青贮添加剂进行 青贮发酵，不仅解决了农业废弃物的处理问题，还变废为宝，使之成为饲用原料。 ( 4 ) 可以提高饲料品质。青贮饲料不仅能维持原料的营养价值，而且由于 在发酵过程中微生物的活动可以产生很多牲畜所必需的小分子营养物质，而微生 物还可以提供菌体蛋白，添加一定的青贮剂可以降解原料中的纤维素成分转化为 小分子的单糖、寡糖，便于牲畜吸收利用，提高饲料的消化率，也就是提高了生 产率。 ( 5 ) 青贮是保存饲料的经济适用方法。青贮饲料贮藏空间比干草小，可以 节省大量的空间。每一立方米的空间可以贮存五、六百公斤的原料，其中含干物 质约为1 5 0 公斤，而每一立方干草重量仅为7 0 公斤，约含干物质6 0 公斤 ( 6 ) 青贮饲料可以全年供应平衡。青割方式由于受气候等条件的影响，容 易造成青饲料供应不及时或中断，同时由于作物种类之间的差异及收获时间的不 同，必定带来营养物质的不平衡。而采用常年青贮，在青饲料供应中就能以旺补 淡，以丰补歉，并保持饲料养分的相对稳定，保证了青饲料的全年供应平衡。 ( 7 ) 青贮饲料调制方便，可以扩大饲料资源。青贮饲料的调制方法简单， 易于掌握。修建青贮塔或购买塑料袋的费用相对较低。青贮饲料经一次调制可以 长期保存、利用。调制过程受天气条件的限制相对较小，在阴雨季节或天气不好 时，自然晒至干草困难，而对青贮的调制则影响较小。 2 3 青贮的原理 ( 1 ) 一般青贮：这种青贮方式是在缺氧环境中，让乳酸菌大量繁殖，从而 将饲料中的淀粉和可溶性糖变成乳酸；当乳酸积累到一定浓度后，便抑制腐败菌 等的生长，这样就可以把青贮料的养分长时间地保存下来。 青贮原料上附着的微生物，可分为有利和不利于青贮的两大类。对青贮有利 的微生物主要是乳酸菌，它的生长繁殖厌氧并要求有湿润的环境和一定数量的糖 1 0 类；对青贮不利的微生物有腐败菌等多种，它们大部分是不耐酸的菌类。 乳酸菌在青贮的最初几天数量很少，比腐生菌的数量少得多。但在几天后， 随氧气的耗尽，乳酸菌数目逐渐增加，变为优势。由于乳酸菌能将原料中的糖类 变为乳酸，所以乳酸浓度不断增加，达到一定量时即可抑制其他微生物活动，特 别是腐生菌在酸性环境下很快死亡 同型乳酸发酵：乳酸菌将糖按下列反应分解为乳酸，其化学反应式为： c 狙a 2 0 6 + 2 a d p - + 2 c h 3 c h o h c o o h + 2 a t p 在上述反应中不需要氧气，能量损失也很少 青贮成败的关键在于能否创造一定条件，保证乳酸菌的迅速繁殖，形成有利 于乳酸菌发酵的环境和排除有害的腐败过程的发生与发展。 乳酸菌的大量繁殖，须具备以下条件： 青贮原料要有一定的含糖量：含糖多的如玉米秸秆和禾本科青草等为易 青贮原料。 原料的含水量适度：禾本科植物以含水6 5 7 5 为宜。 温度适宜：一般以1 9 3 7 为宜。 缺氧：将原料压实，以排除空气。 ( 2 ) 低水青贮或半于青贮：这种青贮方式的基本原理是原料含水少，造成 对微生物的生理干燥。青饲料割后，经风干，水分含量降到4 0 5 5 时，植物细 胞质的渗透压达5 5 7 6 0 8 万帕。这样的风干植物对腐生菌、酪酸菌及乳酸菌， 均可造成生理干燥状态，使其生长繁殖受到限制。因此，在青贮过程中，微生物 发酵弱，蛋白质不被分解，有机酸形成量少。 由于低水青贮是微生物处于干燥状态及生长繁殖受到限制的情况下青贮，所 以原料青贮中糖分或乳酸的多少以及酸碱度值高低对于这种青贮方法已无关紧 要，从而较一般青贮法扩大了原料的范围。一般青贮法中认为不易青贮的原料( 如 豆科) 也可以顺利青贮。 ( 3 ) 外加剂青贮：该青贮方式主要从3 个方面来影响青贮的发酵作用：一 是促进乳酸发酵，如添加各种可溶性碳水化合物，接种乳酸菌，加酶制剂等，可 迅速产生大量乳酸，使氢离子浓度很快达6 3 1 1 5 8 5 u m o l l ( p h 3 8 4 2 ) ；二 是抑制不良发酵，如加各种酸类、抑制剂等，可阻止腐生菌等不利于青贮的微生 1 1 物生长：三是提高青贮饲料的营养物质含量，如添加尿素、氨化物，可增加蛋白 质的含量等。这样，也可将一般青贮法中认为不易青贮甚至难青贮的原料加以利 用，从而扩大了青贮原料的范围。 2 4 青贮添加剂 青贮添加剂的主要作用是能够增加青贮饲料的营养物质的含量，促进乳酸菌 的发酵，抑制有害细菌和霉菌的生长，减少青贮饲料氧和水分的含量，防止腐烂 等作用删。1 9 9 7 年u i ( a s t a 英国饲料执行规划( f o r a g ea p p r o v a ls c h e m eo ft h e u k ) 列出了8 0 种青贮饲料添加剂。根据其作用方式的不同，可以分为以下类型 见表1 i 。 表1 1 青贮饲