（植物学专业论文）鞘氨醇单胞菌js061咔唑降解基因簇上游基因的分离和鉴定.pdf

摘要 咔唑是典型的含氮杂环芳烃污染物，具有致毒、致癌和致突变的“三致”作用，会给 环境和人类带来巨大的危害。微生物在环境治理方面具有高效、专一、经济和节能等诸 多优点，所以本实验利用微生物作为实验材料研究了咔唑降解的机制。本研究选择了从 咔唑污染土样中分离得到的一株能够降解咔唑的革兰氏阴性菌鞘氨醇单胞菌j s 0 6 1 作 材料来研究咔唑降解过程中各基因的特点及其编码的酶蛋白的性质。 从鞘氨醇单胞菌j s 0 6 1 菌株的基因组d n a 中分离得到降解咔唑的上游基因的基因 簇，利用软件和b l a s t 分析之后，证实我们获得了完整的降解咔唑的上游基因。将 该序列提交g e n b a n k ，获得了该基因的序列号为e u 8 5 4 3 0 2 。从b l a s t 比对结果和结 果中发现该基因簇是由基因c a r a a b c a c 构成，并且明确了该菌株中这几个基因的排列 顺序为c a r a a 一培一唧c c a r a c 。通过s o u t h e r n 杂交验证了该基因簇是来自于鞘 氨醇单胞菌j s 0 6 1 基因组，并且以单拷贝的形式存在。 利用p e t 2 8 a ( + ) 质粒分别构建了c a r a a ，c a r a c ，c a r b 和c a r c 基因的原核表达载 体，实现了这四种蛋白在b l 2 1 ( d e 3 0 ) 中的表达。确定了这四种蛋白的分子量分别为4 3 k d a ，1 5k d a ， 2 9k d a ( c a r b a ) 1 0k d a ( c a r b b ) 和3 1k d a 。但构成c a r b 的两个组 分c a r b a 和c a r b b 的表达比例上与其他菌种表达的c a r b 蛋白有很大差别。同时本研究 利用底物显色反应验证了p e t w b 重组质粒中表达的c a r b 蛋白具有裂解2 ，3 二羟基联 苯的生物学活性。 本实验利用n i - n t aa g a r o s e 成功的纯化了含有六个组氨酸的c a r b 和c a r c 融合蛋 白，并利用b a l b c 雌性小鼠制备了c a r c 蛋白的多克隆抗体。利用该抗体在蛋白水平 检测了s p h i n g o m o n a ss p j s 0 6 1 中c a r c 蛋白在不同底物浓度时的表达情况以及在相同浓 度下不同诱导时间的蛋白表达情况。结果证实了该蛋白只有在有底物存在时才表达，而 且在诱导时间相同、底物浓度不同时蛋白表达有明显的差别，证明了降解咔唑的酶蛋白 属于诱导表达类蛋白。 关键词：咔唑；c a r 基因簇；生物降解；鞘氨醇单胞菌 a b s t r a c t c a r b a z o l e ，a sac l a s s i cn - h y d r o a r o m a t i cc o m p o u n d ，i so f t e nr e l e a s e di n t o t h e e n v i r o n m e n tt oc a h s et r e m e n d o u sh a r md u et oi t st o x i c ，c a r c i n o g e n e s i sa n dm u t a g e n i c c h a r a c t e r i s t i c s t h ea d v a n t a g eo fm i c r o o r g a n i s mt ot r e a tt h ep o l l u t i o nc a ns a v em o n e ya n d e n e r g y i nt h i st h e s i s ，ag r a m n e g a t i v eb a c t e r i u mi s o l a t e df r o mc a r b a z o l e - p o l l u t e ds o i l ， s p h i n g o m o n a ss p j s 0 61 ，h a sb e e nu s e dt os t u d yt h ec h a r a c t e r i s t i co fc a r - d e g r a d i n gg e n e sa n d e n z y m e si nt h ep r o c e s so fc a r b a z o l ed e g r a d a t i o n t h ec a r - d e g r a d i n gg e n ec l u s t e rf o rt h ef i r s tt h r e es t e p sf r o ms p h i n g o m o n a ss p j s 0 61 g e n o m ed n a h a sb e e ni s o l a t e db yp c r t h eu p s t r e a mg e n e sd e g r a d i n gc a r b a z o l eh a v eb e e n i s o l a t e ds u c c e s s f u l l ya n dt h ea l i g n m e n to ft h e s eg e n e sa sc a r a a c a r b c 口r c c a r a co w a sa l s oc o n f i r m e db ya n db l a s t t h e nu p d a t e dt h es e q u e n c et ot h eg e n b a n ka n d o b t a i n e dt h ea c c e s s i o nn u m b e re u 8 5 4 3 0 2 s o u t h e r nb l o th a sb e e np e r f o r m e dt of u r t h e r c o n f i r mt h ec a r - c l u s t e ri nt h ec h r o m o s o m a ld n ao fj s 0 61 t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e r e w a so n ec o p yo fc a rg e n ec l u s t e ri nt h eg e n o m e w eh a v ec o n s t r u c t e dc a r a a ，c a r a c ，c a r ba n dc a r cp l a s m i d sf o rg e n ee x p r e s s i o ni n p e t 2 8 a ( + ) ，w h i c hw a se x p r e s s e di nb l 21 ( d e 3 0 ) u n d e rt h ei n d u c t i o no fi p t g t h er e s u l t i n d i c a t e dt h a tt h em o l e c u l a rm a s so ft h e s ef o u rp r o t e i n sw e r e4 3k d a , 15k d a , 2 9k d a ( c a r b a ) & 14k d a ( c a r b b ) a n d31k d a , r e s p e c t i v e l y t h em o l e c u l a rw e i g h to fc a r bc o n s i s t i n go ft w o c o m p o n e n t sc a r b aa n dc a r b bw a ss i m i l a rt oc a 10 ，b u tt h eq u a n t i t yo fc a r b aa n dc a r b b w e r ed i f f e r e n tf r o mo t h e rb a c t e r i a m e a n w h i l e ，t h es u b s t r a t ec o l o rr e a c t i o nw a se m p l o y e dt o c o n f i r mt h er e c o m b i n a n tp l a s m i do fp e t w b t h ec a r be n z y m ee x p r e s s e di nt h i ss t u d yw a s o ft h eb i o a c t i v i t yt od e g r a d et h ea r o m a t i cr i n g c a r ba n dc a r cp r o t e i n sh a v eb e e np u r i f i e da n dt h ep o l y c l o n a la n t i b o d i e sh a v eb e e nm a d e i nf e m a l eb a l b cm i c e ，w h i c hw e r eu s e dt od e t e c tc a r ce x p r e s s i o nl e v e li ns p h i n g o m o n a s s p j s 0 6 1u n d e rt h ev a r i o u sc o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t ea n dt h es a l i l es u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n b u td i f f e r e n ti n d u c i n gt i m e t h i sp r o t e i nw a se x p r e s s e do n l yw h e nt h es u b s t r a t ew a se x i s t e d a n de x p r e s s i o nl e v e lw a sc l e a rd i f f e r e n tw h e nd i f f e r e n ti n d u c t i o nt i m ea n ds u b s t r a t e c o n c e n 仃a t i o nw e r ea p p l i e d t h er e s u l tc o n f i r m e dt h a tc a r b a z o l ed e g r a d i n gp r o t e i n sw e r e i n d u c i b l eb yc a r b a z o l e k e yw o r d s ：c a r b a z o l e ；c a rg e n ec l u s t e r ：b i o d e g r a d a t i o n ；s p h i n g o m o n a s 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工 作所取得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：二耋皇到 日期： ，1 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件 和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以采用影印、 缩印或其它复制手段保存、汇编本学位论文。同意将本学位论文收录到中 国优秀博硕士学位论文全文数据库( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、 中国学位论文全文数据库( 中国科学技术信息研究所) 等数据库中，并以 电子出版物形式出版发行和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：t 耋兰兰丑 日 期：匕堕：! ! 侈 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：缈 日 电话： 邮编： 东北师范大学硕士学位论文 己i 言 ji口 伴随着工业技术的迅猛发展，人类社会物质文明提高的同时，许多负面效应也随之 产生，许多污染物被排放到人类居住的环境中。芳香族化合物广泛用于燃料和工业溶剂， 正以每年百万吨的数量被制造出来。其中多环芳香化合物、氯代芳香化合物是生产医药、 农药、塑料聚合物、炸药和其它日用品的最初原料；含硫芳香化合物作为合成复杂化合 物的有用中间体而广泛应用于化工、冶金和制药工业中；芳香族硝基化合物广泛应用于 生产染料、杀虫剂、增塑剂、炸药及溶剂2 1 。人工合成的芳香族化合物在利用时不可 避免的泄漏到环境中，由于其较稳定、水溶性低而在环境中长时期残留，并且具有相当 大的毒性和致癌、致突变作用，最终对人类的健康造成危害口“1 ，因此在发达国家，很 早就有一些微生物和化学工作者，从不同角度注意开展对这些芳香族化合物的生物降解 性研究，或追踪某些化合物在环境中的降解变化或观察某些化合物在人工处理体系中的 降解行为。 众所周知微生物降解既是自然环境中有机污染物转化的重要途径之，也是有机污 染物污染控制与污染环境修复的有效技术。开展典型有机污染物微生物转化与降解机理 的研究不仅在探索微生物生理代谢、遗传基因多样性与进化机制、微生物与环境污染物 的互作机理等方面具有的科学理论价值，而且还可为有机污染物的生物处理、污染环境 的生物修复提供创新的技术支持。应用生物降解原理治理被污染环境的生物修复技术近 年来发展很快，由于它不仅经济、有效、安全，而且所能处理的阈值低、残留少，其应 用前景十分广阔巧。7 。 1 1 咔唑的性质 咔唑，又称亚氨基二亚苯，无色单斜片晶体，相对密度为1 1 0 ，有特殊气味，微溶于 水，易溶于乙醇乙醚等有机溶剂。咔唑主要用于染料化学试剂、炸药、杀虫剂、润 滑剂、橡胶抗氧剂等的制造，此物质对人体危害极大，是一种诱变剂，尽管其本身的 毒性不强，但很易变为有致癌活性的衍生物。近年来又发现一些二氮杂苯并咔唑类化合 物，也具有明显致癌性，其中1 1 氮杂一二苯并( c ，i ) 咔唑及1 一氮杂二苯并( a ) 咔唑为 中强致癌物。它可以引起眼睛皮肤的刺激症状如吸入摄取或经皮肤吸收，可致死。这种 顽固型芳香族化合物一般存在于石油和其他的矿物燃料中。它的燃烧能直接导致氮氧化 物的形成，而氮氧化物的释放会形成酸雨。而且，咔唑还是一种极强的加氢脱硫抑制剂。 因此，在炼油的过程中咔唑和其它氮化物的去除将显著提高催化裂化的范围和精炼油产 量。实验证明去除原油中9 0 氮，可以使汽油产量提高2 0 ，还能减少设备的腐蚀，降 低精炼费用。 东北师范大学硕士学位论文 1 2 咔唑降解菌株 目前对咔唑的降解研究比较广泛，已将报道的能够利用咔唑的细菌有如下几种，鞘 安醇假单胞菌( s p h i n g o m o n a ss p ) c d h 一7 【引，鞘安醇假单胞菌( s p h i n g o m o n a ss p ) c b 3 【9 1 ， 假单胞菌( p s e u d o m o n a sr e s i n o v o r a n s ) c a l 0 和c a 0 6 【lo 】， 假单胞菌( p s e u d o m o n a s s p ) o m i 1l 】，紫色杆菌( j a n t h i n o b a c t e r i u ms p ) s t r a i nj 3 1 2 】，假单胞菌( p s e u d o m o n a s s p ) l d 2 1 1 3 1 ，茄科雷尔氏菌( r a l s t o n i as p ) r j g i i 1 2 3 【1 4 1 ，节杆菌( a r t h r o b a c t e rs p ) p j 3 【15 1 ， 类诺卡氏菌( n o c a r d i o i d e sa r o m a t i c i v o r a n s ) i c l 7 7 ，以及鞘安醇假单胞菌( s p h i n g o m o n a s s p ) k a l 1 7 】。在这些已经报道的能够降解咔唑的细菌中，除i c l 7 7 p f ，其他的有降解咔唑 能力的菌都是革兰氏阴性菌株。 1 3 咔唑的降解途径 大多数的芳香族化合物的生物降解途径基本上是一致的，一般都是先由双加氧酶或 单加氧酶的作用，形成邻苯二酚类的物质，然后在邻苯二酚2 ，3 双加氧酶( c 2 3 0 ) 或l ， 2 双加氧酶( c a t a ) 的作用下，裂解成为能够参与物质循环和能量代谢的中间产物。 咔唑的降解途径主要有两种，侧面双加氧途径和有角度双加氧途径。侧面双加氧途 径是在双加氧酶的作用下，首先将咔唑转化成不稳定的二醇形式，随后苯环上的两个羟 基特异性脱水生成单羟基咔唑。一般情况下，双加氧酶催化咔唑形成二氢二醇，随后进 一步脱水形成单羟基化合物( 如图1 1 ) 。 图1 1 咔唑的侧面双加氧酶裂解途径 另外一个咔唑降解途径是通过有角度双加氧酶的作用使咔唑逐步分解成为小分子， 从而进入微生物及其他生物代谢过程。此种咔唑降解途径研究最彻底的就是 p s e u d o m o n a sr e s i n o v o r a n sc a i o 。在c a l 0 中降解咔唑的途径和酶都有很多报道。降解途 径大至如下( f i g 1 ) ：首先，咔唑在l ，9 a - 双加氧酶( 1 ，9 a - - d i o x y g e n a s e ) 的有角度的 双氧化作用下，将一个氧分子引入取代基羟基生成中间代谢产物2 ，3 一二羟基2 氨 基联苯。再由c a r b a b b 编码的间位裂解酶的催化下裂解双醇环，经过水解酶( c a r c ) 的 作用形成2 羟2 ，4 - 二烯戊酸和邻氨基苯甲酸。然后在相应的由c 口r d e 聊a n t a b c 编码的 酶的作用下，最终形成一些小分子，如乙酰辅酶a 等能够进入t c a 循环的中间产物，从 2 东北师范大学硕士学位论文 而参与生物体内的代谢途径【1 6 1 。但是，并不是所有的降解咔唑的细菌中的酶和途径都相 同的。g i g e 等在研究l d 2 的降解中间产物的过程中，除了有c a l o q b 相同的邻氨基苯甲 酸之外，还发现了3 a ，4 _ 二羟基2 羟基丙酮酸 1 ，2 - a 喹啉1 ，5 - _ - - 烯【1 3 1 。由此证明， 在咔唑降解的过程中，l d 2 中存在一种不同于c a l 0 的降解途径( 图1 2 ) 。 天。 c 卫匦亟二 _ 扫i t k 坼 h ，| h 訇_ - 2 - 抽k 叫 i t c ac y c l e l _ - - - - - - _ 一 图1 - 2 咔唑的生物降解途径 1 4 降解咔唑的酶及其性质的研究进展 在咔唑的降解过程中，咔唑降解成邻氨基苯甲酸主要2 - - 个酶起作用。这三个酶是 1 ，9 a - 双加氧酶( c a r a a a c a d ) ，间位裂解酶( c a r b ) 和间位裂解酶水解酶( c a r c ) 。参与 咔唑降解整个过程中主要的酶依次是1 ，9 a - 双加氧酶( c a r d o ) ，2 氨基联苯2 ，3 二羟 基l ，2 双加氧酶( h o a d a ) ； 2 羟基6 氧6 ( 2 氨基联苯) 六甲基嘧啶2 ，4 二烯酸 ( 间位裂解化合物) 水解酶；2 羟基2 ，4 - 戊烯酸水解酶，4 羟基2 氧代醛缩酶；乙醛脱 氢酶；邻氨基苯甲酸l ，2 双加氧酶，邻苯二酚1 ，2 双加氧酶；c i s 粘康酸内酯化酶；以 及粘康酸内酯化合物6 异构酶等。 1 4 11 ，9 a - 双加氧酶( c a r d o ) l ，9 a - 双加氧酶是咔唑降解的起始反应酶。这个酶的性质不仅决定了降解底物的效 3 东j u j i l i 范大学硕士学位论文 率而且还决定这个微生物降解底物的范围。在c a l 0 中，和有c a r d o 活性的细菌是生物 降解多地辛污染方面的重要工具。r o s s 已经根据还原中心的性质和包含的组分的数目 被b a t i e 等人划分成三个组。c a r d o 体系中，包括一个r i e s k e 2 f e - 2 s 簇和单个铁构成 的末端氧化酶c a r a a ，铁氧化还原蛋白c a r a c 和铁氧还蛋白还原酶c a r a d 。 己知的大多数复合双加氧酶的末端加氧酶组分是由大( a ) 、小( d ) 两个亚基组成【l & 憎j ， 但c a r d o 的末端加氧酶组分只有一种蛋白c a r a a ，c a r a a 与其它复合双加氧酶的末端加 氧酶组分的大亚基有2 7 一3 0 的同源性，是一种新型的末端加氧酶【2 0 l 。c a r a a 是三聚体， 每个单体都有一个簇结合位点和一个f e 原子结合位点。在c a l 0 中存在两个c a r a a 基因， 这两个c a r a a 基因除一个碱基对不同外，其余完全相同。由c a r a a 编码的酶有可能是咔唑 降解过程的限速酶，基因重叠能提高这种酶的拷贝数。c a r a c 和c a r a d 是单体，n a d h 和n a d p h 都可作为c a r a d 的电子供体，但n a d h = l n a d p h 活性更高。c a r a d 可被n a d h 和n a d p h 还原，c a r a c 可被c a r a d 还原，c a r a a 可被c a r a c ，c a r a d 和n a d h 还原出2 1 j 。 在c a r d o 的底物特异性研究中，已经证实c a r d o 有广泛的底物并且能都催化多种氧化 反应，包括转角双氧化反应、侧面双氧化反应和单氧化反应【l 副，并且c 舢m o 能够攻击 一些含氯的多地辛同源物。 c a r a d 分别包含一个r i e s k e 2 f e - 2 s 簇，一个植物性1 拘 2 f e - 2 s 簇，和一个黄素腺 嘌呤二核苷酸( f a d ) 。后两个蛋白的功能是作为电子传递链将电子从还原型烟酰胺腺嘌 呤二核苷酸传递到末端氧化酶上，根据以上提到的电子传递蛋白的特性表明c a r d o 应 被划分到第三类双加氧酶中，根据b a t i e 的划分，这些的重要特性表明c a r d o 是一种新 的r o s 。进化树分析表明，在多组分单氧化酶体系中c a r a d 相关性非常接近还原酶类。 同样，c a r a a 是一种独特的氧化酶，因为它的氨基酸序列和其他已知双加氧酶相比具有 很低的同源性( 氨基酸水平1 9 的同源性) ，和其他的单加氧酶相比具有最高的同源性 3 5 ，最终c a r a a 是一个同源多聚体，这个在b a t i e 的化分体系中被划分到认氧化酶范围 内。因此c a r a c 介导的电子传递机制有许多很特别的特征。 1 4 22 氨基联苯2 ，3 二羟基1 ，2 双加氧酶( h o a d a ) 在芳香族化合物裂解过程中，有一个酶是依赖金属的双加氧酶。根据反应的类型这 种酶可以分为内部裂解酶和外部裂解酶两种。外部双加氧酶被分成三个类型，i i 【2 2 | 。 比较i 和i i 的主要结构表明氨基酸序列十分相似。他们可能有共同的起源。并且i i 类酶 看起来像是通过i 类酶的复制而来的。i i 类酶的两个区有相同的折叠方式，与许多的i i 类酶外部双加氧酶都十分相似。但是类酶外部双加氧酶与i i 就没有很近的进化关系。 类酶在空间结构上与i i 类酶外部双加氧酶是完全不同的，但是他们的调节区，包括被 推断为活性位点的分布与i i 类酶是完全一致的。p s e u d o m o n a sr e s i o v o r a n s c a i o 中的 c a r b 编码的2 氨基联苯2 ，3 二羟基1 ，2 双加氧酶( h o a d a ) 主要是在2 氨基2 ， 3 二羟基联苯的间位催化裂解。同样这个酶还能够催化裂解多氯三羟联苯和一个氯三羟 联苯。大多数的外部双加氧酶都是同源多聚体的状态，但是c a r b 由两个蛋白构成，c a r b a 和c a r b b 分子量分别为2 9 和1 0k d a 。这个酶催化位点的结构一般是由亚铁离子存在的一 个l i g b 区域的保守区。目前没有和c a r b a 十分相似的核酸序列或氨基酸序列。 4 东北师范大学硕士学位论文 1 4 3 间位裂解化合物水解酶 由阳，c 编码的问位裂解物水解酶3 l n q 2 羟基6 氧6 ( 2 氨基联苯) 六甲基嘧啶2 ，4 二烯酸水解酶。在咔唑的降解过程中，这个酶主要是将2 羟基6 氧6 ( 2 氨基联苯) 六 甲基嘧啶2 ，4 二烯酸水解成为邻氨基苯甲酸和2 ，4 二羟基羧酣2 1 2 3 1 。间位裂解物水解 酶已经被纯化，并且他的特征、动力常数等都已经被报道。由c a r c 编码的水解酶被验证 能够将二苯呋喃和联苯在间位裂解成为水杨酸和苯甲酸酯。这种酶经常作用于酮类物质 的c c 键上，但是作用在芳香族化合物的c c 键上很少见。其他生物降解途径中的裂解 c c 键的水解酶也有已经被分离的 2 4 - 2 t 。这样的水解酶的性质有时决定底物的特异性和 他们代表的催化降解类型【2 8 】。 1 5 咔唑降解基因簇的定位和分布的研究 在过去的2 0 年中，鉴定了许多降解芳香族化合物的基因簇。很多基因是分布在质粒 或者转座子上。核酸序列分析在大质粒的起源、分布机制和抗性上都提供了很多重要的 信息。有少数具有催化降解能力的质粒的核苷酸序列已经完全测定。这些基因簇的特征 已经被描述【2 9 羽】。在大多数情况下这些基因位于质粒或者转座子上【3 7 】。核酸序列分析 不仅为我们提供关于起源的信息，还有一些分布机制和大质粒维持稳定的信息【3 8 训】。例 如n o v o s p h i n g o b i u ms t r a i nf 1 9 9 中的p n l l 质粒，这个质粒能够降解联苯和萘【4 2 1 。还有存 在于p s e u d o m o n a ss p s t r a i na d p 茵中的p a d p 1 质粒，这个质粒有矿化阿特拉津的功能【4 3 1 ， 还有来自于细菌p s e u d o m o n a s p u t i d as t r a i nm t 2 的t o l 质粒能够降解甲掣删。 在以前的研究中，通过t n 5 的诱变的方法，基因枪和基因步移的方法鉴定了 c a r a a a a b a b b c a c a d d f e 基因和c a t r b c a 基因的特征和性质【4 5 。在c a r 基因中g + c 的含量 ( 5 1 ) 低于c a l 0 中总d n a 中的含量( 6 2 ) 。表明c 甜基因通过横向基因转移的方式被招 募【4 5 1 。c a r 基因簇和他的空白区的新遗传结构表明，一些遗传重组经常发生在基因簇中。 通过对这个质粒上游2 1 一k b 的区域的降解邻氨基苯甲酸的a n t 基因的分析这个观点被进 一步证实。这个区域中包含四个几近相同的插入序列环绕在，和a n t 基因簇的周围，与 其他的在基因簇中基因重组相同。 q 生c p s e u d o m o n a sr e s i n o v o r a n sc a l 0 中分离得到的p c a r l 质粒编码的c a r 降解酶同样 能够降解多地辛化合物及其衍生物二苯并二恶英和二苯呋喃。p c a r l 主要有以下三点特征： 第一，这个1 9 9 0 3 5 k b 的质粒上携带着7 2 8 k b 的i i 类转座子t n 4 6 4 7 ，这个转座子上包含着 c a r 降解的操纵子 4 6 7 】。第二，p c a r l 的骨架显示出镶嵌的形式。第三，p c a r l 中假定的 r e p a 基因与i n c p 1 ，i n c p 9 和其他i i l c 组的已经被鉴定的重复子没有相似性闱。同时在一些咔 唑降解细菌中鉴定到一些类似：于- p c a r l 的质；l 宜【4 丌。这些发现表明，p c a r l 是一类新型的催 化降解质粒并且在瑾因在环境中的分布和耐受性上起着很重要的作用。 除t p c a r $ 1 , ，只有三个多地辛降解质粒被报道。这些包括1 6 0 和1 9 0 k b 的线性质 粒p d b f l 和p d b f 2 ，和一个1 0 0 k b 的环形质粒p y k 3 ，以及最近才将全序列报道的来自 于s p h i n g o m o n a ss p k a1 的质粒p c a r 3 。 东北师范大学硕士学位论文 2 5 4 一k b 的_ 1 j ：状质粒p c a r 3 中携带了能够降解咔哗的牲因，已报道的质粒巾，据甘 f i j t 解，这是第一个在鞘氨醇单胞菌属中报道的第个质粒有趣的是p c a r 3 上的c 卅1 u c a r - i i 基因能够利用p c a r 3 上的地，f d , i ，或卷陟的产物作为电子传递组分。 f k a n a m a e d ae ta l ，2 0 0 3 1 【m a s a k is h i n t a n e ta l ，2 0 0 0 1 幽j 3 确定基序列的醉解咔i 唑的质粒图谱 在p c a r 3 质粒中上游降解基| 刿部是单独分如的。疋甜、f d r l 、f d r l l 与c a r - i 、c a r - i i 基 因簇是分开的( 如图1 3 ) ，但是其它的基因均是成簇存在的。并且有的基凼j 其他小可的 属中的基因表现出很高的同源性。例如假单胞苗，伯克霍尔德氏苗或地杆菌。一此基闪被 两个重复序列包围并且c a r - i 基因簇能够被删除表明在重复序列中间的序列能够嵌台苴他 基因或者和p c a r 3 基因的结构重组有关。比较p c a r 3 和其他从鞘氨醇单胞菌中分离到的 咔哗降解质粒，或者比较c a r - i l i c a r - i i 基冈簇和j t 他的复制子对于了解p c a r 3 的进化非常 重要。p c a r 3 的一个核心区与p n l i 非常相似。这个区是复制、分离、结合和质粒传递的关 键区，一些基凼在这个区是非常保寸的和其他的鞘氨醇单胞属的c a r 降解基因相同。 在己经报道的可以降解咔唑的细菌中，咔唑的降解基冈都足成簇存在的，并且有一 定的排列顺序。在不同菌中已经克隆得到c a r 基因，其排列顺序如图1 _ 4 所示。 ( 1 1 1 i l l _ _ 卜1 _ - p _ _ - _ “o _ _ _ _ _ _ h - _ _ q 1 。”_ _ _ _ - _ _ 卜_ 日一 , 1 3 1 _ _ 卜_ 卜_ _ - 卜_ ( = 。 幽1 4 降解咔唑的上游基冈的组成和排列顺序 幽中所示菌株) f i g n i t 1 ：印h i n g o m o n ms p ，c a l 0 ：p s e u d o m o n 瑚r e s i n o v o r a 舾，i c l 7 7 ：n o c a r d t o t d , w9 p ， j 3 ：j 。h t h l n o b 。c t e r l s pk a i 5 p h i n g o m o n a ss p 对序列已经被鉴定的似单胞菌p s e u d o m o n a s c a l 0 分析表明，在c a l o q 6 蕞善1 | t 东北师范大学硕士学位论文 存在两个拷贝的c a r a a 序列，并且含有1 ，9 a - 双加氧酶的组分c a r a d 。对鞘氨醇单胞菌 s p h i n g o m o n o n a ss p k a l 的研究发现，c a r a a 和c a r b a 同源序列，与菌株c a l 0 的c a r 基因簇 部分序列的同源性为5 7 7 。k i l b a n e 报道的鞘氨醇单胞菌( s p h i n g o m o n o n a ss p ) g t i n l 1 菌株c a r a a b a c a c 基因簇中c a r a a b a 的序列与k a l 完全相同，不同的是在k a l 中存在两个 拷贝的c a r a a b a c a c 序列。其中c a r a c 的核酸序列与氨基酸序列与c a l o 几乎没有同源性 【1 2 1 。在革兰氏阳性菌株n o c a r d i o i d e sa r o m a t i c i v o r a n s i c l 7 7 中c a r c 和c a r b a b b 基因与革兰 氏阴性菌株c a i o 、k a l 以及紫色杆菌( j a n t h i n o b a c t e r i u ms p ) j 3 4 8 】中这两个基因的排 列顺序正好相反【1 6 】。i c l 7 7 菌株中c a r a a c b a b b a c a d f ( f l c a r d f e 操纵子的基因互相重叠区 为1 _ 4 个碱基，这样的重叠在革兰氏阴性菌株中以前是没有被发现的。此外，c a l o 和j 3 中c a r c 和c a r a d i 之间被一个读框隔开，但在k a l 中没有与c a r a d 相对应的基因而且与c a r 操纵子相邻的区域也没有发现编码n a d ( p ) h 的基因存在。在i c l 7 7 中这样的功能单位组 织比c a l 0 、j 3 和k a l 中更加有序【1 6 j 。 本研究的意义及目的 自然环境的污染越来越严重，不但影响了国民经济的可持续发展，甚至威胁到了人 类的健康、智力乃至生存。我国是世界上污染最为严重的国家之一，针对严重污染的环 境，我国尚未采取大规模的治理措施，少数治理的地区都采用成本比较高的物理化学法 为主，容易造成二次污染。微生物的生物修复技术在处理环境污染方面具有速度快、消 耗低、效率高、成本低、反应条件温和无二次污染等显著优点，加之其技术开发所预示 的广阔的市场前景，受到了各国政府、科技工作者和企业家的高度重视。所以环境污染 的微生物修复技术是我国今后治理环境污染必须发展的方向，具有广阔的市场和发展前 景。 本研究基于国内外的研究进展及现状，利用本实验室已经分离得到一株能够降解咔 唑的菌株鞘氨醇单胞菌属s p h i n g o m o n a ss p j s 0 6 1 作为研究材料利用分子生物学手段 从中分离出降解咔唑上游基因的基因簇。并从中表达了c a r a a 、c a r b 、c a r c 和c a r a c 基因 并纯化了其中的c a r c 和c a r b 蛋白。利用纯化的蛋白制备了c a r c 的多克隆抗体，并检测 了在j s 0 6 1 中该蛋白的表达情况。从而为治理环境中的咔唑污染提供了理论基础和技术 支持。此外，对菌体内降解基因的研究，有利于理解咔唑的降解途径和鉴定咔唑的降解 中间产物，从而更有效的理解咔唑降解的分子机理。 7 东北师范大学硕士学位论文 材料和方法 2 1 实验仪器 恒温摇床；7 2 2 分光光度计；p h 计；恒温培养箱；搅拌器；高速台式离心机；超速 冷冻离心机；电热恒温水浴锅：p c r 仪；凝胶成像系统；电子分析天平；超净工作台； 高压蒸气灭菌器；g e n eq u a n tp r o ( a m e r s h a mb i o s c i e n c e s ) 。 2 2 实验试剂和酶制剂 购于n e b 公司的核酸限制性内切酶e c o r i 、脚h d i i i 、x h o i 、n o d 、b s a 。d n a m a r k e r ) d - i n d l i i 、d n am a r k e r 九e c o t l 4 、o n es h o tl ap c rm 议、p r e m i xt a q 、t 4 d n a 连接酶，购自宝生物工程有限公司。d n am a r k e rd l 2 0 0 0 购白天根生化科技有限公司。 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，购自s i g m a 公司。二抗为辣根过氧化物酶( h r p ) 标 记的羊抗鼠i g g ，购自北京中衫生物技术有限公司。 t a k a r aa g a r o s eg e ld n ap u r i f i c a t i o nk i td n a 凝胶回收试剂盒购自杭州维特杰生 物技术有限公司。g e n ei m a g e t mr a n d o mp r i m el a b e l i n gk i t ( a m e r s h a ml i f es c i e n c e ，u k r p n35 4 0 ) 、g e n ei m a g e t mc d p s t a r t md e t e c t i o nm o d u l e ( a m e r s h a ml i f es c i e n c e ，u k ， r p n 3 5 1 0 ) 购自a m e r s h a m 公司。 卡那霉素、i p t g ( 异丙基bd 硫代半乳糖苷) 、低分子量标准蛋e t ( 1 4 4 9 7 4k o a ) 和预染的低分子量标准蛋白( 1 4 4 9 7 4k m ) 购自北京鼎国生物技术发展中心：n i n t a a g a r o s e 亲和层析介质购白q i a g e n 公司；邻苯二酚( c a t e c h 0 1 ) 、2 ，3 二羟基联苯 ( 2 ，3 d i h y d r o x y b i p h e n y l ) 、咔唑( c a r b a z o l e ) 购自f l u k a 公司。 其余常规试剂为国产分析纯试剂。 2 3c a r a a ，c a r a c ，c a r b ，c a r c 及c a r 基因簇重组质粒构建 2 3 1 菌株、引物信息既反应体系 菌株s p h i n g o m o n a ss p j s 0 6 1 为本试验杨美英从被咔唑污染的土壤中经过富集训 化而分离得到的。利用该菌株的基因组d n a 为模板，根据网上已知序列( a b 0 9 5 9 5 3 ) 设计引物，扩增出c a r a a ，c a r a c ，c a r b ，c a r c 四个基因及它们的基因簇，并构建到原核表达 载体p e t - 2 8 a ( + ) 上，所利用的载体及菌种信息如下表。 表2 - 1 菌种和质粒的信息汇总 8 东北9 币范大学硕士学位论文 菌株和质粒相关特征 备注 质粒 p e t 2 8 “+ ) k i ：n r7 7 ，p b r 3 2 2o r i g i n ，表达载体 p e t w a a k i n r p e t 2 8 a ( + ) 载体中插入来自于j s 0 6 1 的l1 6 3 b p 片段 p e t w a c r p e t 一2 8 a ( + ) 载体中插入来自于j s 0 6 1 的3 3 0 b p 片段 p e t w b k i n rp e t 2 8 a ( + ) 载体中插入来自于j s 0 6 1 的11 7 7 b p 片段 p e t w c k i i i r p e t 2 8 a ( + ) 载体中插入来自于j s 0 6 1 的8 2 5 b p 片段 p e t w c a r c l u s t e rk i t i i p e t 2 8 a ( + ) 载体中插入来自于j s 0 6 1 的3 4 6 9 b p 片段 n o v a g e n 本研究 本研究 本研究 本研究 本研究 表2 2c a r a a ，c a r a c ，c a r b ，c a r cp c r 引物信息 基因名称引物 序 列 备注 j 引物l5 a t a a g a a t g c g g c c o c a t g g t g g c t a a c c a a c c a t c a a t 3 下划线部分为n o d 序列 一“ 引物25 c c r c t c r a rt c 从c g t g c r r c c t g a a t g c3 下划线部分为勋d ，i 序列 引物15 g g a a t t ca t g a c c g c a 从g g t c c g c3 下划线部分为历o r j 序列 。“。 引物25 c c c a a g c 垡t c a t g a c t g t g c c t t c g g c 3 下划线部分为砌d i 序列 。 引物15 c c g g a a t t c c ga a g c a c g t i g a t g g g c a c3 下划线部分为砌序列 一。 引物25 壁垒堡垒垒g 盟c t aaa c g a t t g c t 触广r c c3 下划线部分为肺加i 序列 引物l5 g g a a t t c a t g g t