（有机化学专业论文）农用抗生素8832＃的发酵制备及活性组分分离提取方法研究.pdf

南歼大学硕士研究生学位论文 摘要 f 遮慝抗生素8 8 3 2 # 藏栋懿发酵产物对，j 、麦券鬈痪_ 程稿花立零鑫病具畜强烈戆撩 制作用，符合人们对来来农药的要求，具有良好的发展前景。i ，一 本文酋先对农用抗生素8 8 3 2 # 的最优发酵条件进行了深入的研究，探索了 发酵过穆巾不圃藿耱、不露蛹、苓阏壤蓁基教影豌，技到了发爨_ 过程弱务因素 的最佳值，确定了摇瓶发酵的最佳条件。 为将来将这一优良藏种应用于实际生 产，稳定冀发酵产物。进一步进行丁发酵罐实验的尝试，获得了发酵罐实验影 嫡因素数秘步认识彝较优篷，取褥了缀大鹑进步，灌毪褥裂撼褰，为今爱农瘸 抗生素8 8 3 2 # 上游发酵制各工作奠定了基础。p 一7 本文的重点是农用抗生素8 8 3 2 犍的活性组分的分离提取方法的研究。酋先 剥月溶裁攀取法，逶过因耪不霹援瞧豹毒撬溶剂黠活蛙缝分避蟹提取，三耱与 水混溶的有机溶剂沉淀样品，确定丁其活性组分为大分子蛋囱物质。为将抗菌 蛋白分离出来，采用了硫酸铵分级沉淀法，通过测定不同沉淀区间蛋白质的抑 蓥率找劐袋健溪性段，冷冻干燥褥戮粗晶。逶过s d s - 聚嚣爝酝羧毫濠帮囊予交 换柱得到萁分子曩和等电点的大致信息，并利用先进的蛋白分离模式一s d s - 毛细管凝胶电泳和等电聚焦毛细管电泳，先通过对几种标准蛋白的分析，找剿所 臻努离攘式豹主要影骥毽素著避学徒纯，黯8 8 3 2 # 撵鑫送学分离努爨，褥爨冀 分子量和镣电点。与前面的缩论互相补充。使我们对8 8 3 2 # 有了更进一步的认 识。在此藻础上，利用商效离子交换色谱对活性组分进行分离，对今后的工作 提供了 警多菲豢骞癸缓豹绩意。 ， 农用抗生素以其商散低毒，环境优点受到越来越多的重视。本文利用缀典 l 的和先进的蛋白分离模式对这些方面作了一定程度的探索，獬到了初步的结果 亵德意，为今螽戆王终羹定7 夷努熬蒸确。y 关键塌农用抗壁， 虢酸铵演 分离提表缶法 离子交换 黼效离子交换色谱 一 堕墅查堂堡圭堡窒生兰垡堡壅 a b s t r a c t t h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t i o no f a g r i c u l t u r ea n t i b i o t i c8 8 3 2 # c a ns t r o n g l ys t r a i n a g a i n s tw h e a t s c a ba n df u s a r i u mw i l to f c o t t o n ，i ti sc o m p a r a b l et ot h ed e m a n do f t h ef u t u r e p e s t i c i d ea n dh a se x c e l l e n td e v e l o p m e n tf o r e g r o u n d t h eb e s tt a b l ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw a sf o u n db yt h eo p t i m i z a t i o no ft h e f e r m e n t a t i o nf a c t o r s ( d i f f e r e n tv a c c i n e ，p h ，c u l t u r em e d i u m ，e t c ) t h er e s u l tw i l lg i v e t h ej a rf e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n t sf u r t h e rt h eb e t t e rc o n d i t i o no ft h ei n f l u e n c i n gt e r m s ， w h i c hi sa s t r o n gf o u n d a t i o nf o rf u t u r ew o r k t h ee m p h a s i so ft h i sa r t i c l e w 船f o c u s i n g o n r e s e a r c h i n gt h e m e t h o df o r s e p a r a t i n ga n da n a l y z i n gt h ea c t i v ei n g r e d i e n t o f 8 8 3 2 # b yo r g a n i c s o l v e n te x t r a c t i o n a n d p r e c i p i t a t i o n ，i tw a s a s c e r t a i n e dt h a tt h ea c t i v ei n g r e d i e n tw a so n et y p eo f p r o t e i n t h e nt h e a n t i f t m g a lp r o t e i n i s p u r i f i e d a n d s e p a r a t e db y a m m o n i u m s u l p h a t e p r e c i p i t a t i o nm e t h o d u s i n g s d s - p a g ea n di o ne x c h a n g eh p l c ，t h ei n f o r m a t i o no f i t sp ia n di t sm o l e c u l a rw e i g h tw a so b t a i n e d f u r t h e r m o r e ，t h em o r ee x a c tp ia n dm o l e c u l a rw e i g h tv a l u e sw e r eo b t a i n e db y s e p a r a t i o n a n da n a l y s i so f8 8 3 2 # u s i n gs d s - c g ea n dc l e f t h e nt h ea c t i v e i n g r e d i e n t sw e r es e p a r a t e d o nh p i e c a g r i c u l t u r ea n t i b i o t i cg e t sm o l ea n d m o r ea t t e n t i o nd u et oi t sh i g ha c t i v i t ya n d g o o de n v i r o n m e n tc o m p a t i b i l i t y i nt h i sp a p e r , t h er e s e a r c hw a se x t e n d e do nt h e s e p a r a t i o na n da n a l y s i so f t h e a c t i v ep r o t e i nb yb o t hc l a s s i ca n da d v a n c e dm o d e s ，a n d ag o o df o u n d a t i o nf o rf u t u r er e s e a r c ho p e r a t i o nw a sf o u n d e d k e yw o r d s ：a g r i c u l t u r e a n t i b i o t i c s e p a r a t i o na n da n a l y s i s s d s - p a g e s d s - c g e h p i e c f e ；r m e n t a t i o n m e t h o da m m o n i u ms u l p h a t ep r e c i p i t a t i o n i o ne x c h a n g e c m f 第一章引言 第一节2 1 世纪农药的发展趋势 一、未来农药面临的新挑战 全世界每年因病虫草害造成的粮食损失约占总产量的5 0 ，在使用农药后挽 回损失1 5 。农药的使用不仅可以避免各种有害生物对农作物的危害，而且可 以促进作物的生长，提高作物的抗病性能，改善作物品质。但是随着多种以有 机氯和有机磷为主的农药的研制开发，化学合成农药遇到了一些尚待解决的问 题：首先，由于长期使用化学合成农药，农药本身及其在自然环境中的降解产 物，对水体，土壤和大气造成了严重污染，破坏了生态系统，危害了人畜健康； 其次，由于化学合成农药的长期使用，一些害虫产生了很强的抗药性，许多害 虫的天敌被杀灭，致使一些害虫十分猖獗，化学农药的研制开发难度越来越大， 耗资越来越多 1 】。所以，我们在以传统的随机合成筛选和类同合成为主要途径 的基础上，要对开拓新的农药研制思路予以高度重视。根据现代农药研制开发 的趋势和社会对农药的要求，未来农药必须具有以下特点乜】：环境相容性好， 活性高，安全性好。于是，生物防治得到了广泛的重视b ) 。 生物防治是利用有益的昆虫，微生物防治农林植物虫害、病害的一种方法， 主要内容包括以虫治虫，以菌治虫，以菌治病等方式。相对而言，生物农药的 开发费用大大低于化学农药，更由于微生物源农药源于自然，与环境的相容性 高，对人畜较安全，故人们在尽力开发化学农药的同时，积极应用生物工程技 术。从事微生物源农药的研制开发。 微生物源农药系利用微生物及其代谢产物作为防治农业有害物质的生物制 剂。在六十年代，美国注册了第一个微生物源农药 2 】。七十年代中期，世界上 曾掀起了微生物农药的研究开发高潮，诞生了一大批新的微生物源农药。到九 十年代，随着人类对环境要求越来越高，并由于分析技术的不断进步，全世界 微生物源农药又出现了新的发展势头，其年产值的上升率为1 0 一2 0 。当今， 有人把微生物源农药称为“白色农业”中的“白色农药”。近年来，微生物产 生的代谢产物作为农药农用抗生素，已成为微生物源农药的主体之一。 堕墅盔堂堡主堑塑生兰垡望塞 二、农用抗生素的发展及其特点 抗生素( a n t i b i o t i c s ) 是指由生物产生的能影响另一种生物生命活动的次 生代谢物质“。5 1 ，具有杀灭和促进，抑制等调节生长发育的功能。一般的概念是 狭义的抗生素，指由微生物产生的具有上述功能的生物活性物质。以抗生素作 为农药，兴起于五十年代，当时曾将链霉素，土霉素，灰黄霉素等医用抗生素 用于农药0 1 。六十年代，日本相继开发出春雷霉素，多氧霉素，有效霉素等杀 菌抗生素，掀起了农用抗生素开发的第一个热潮。以后又开发了杀螨素，双丙 胺磷等杀虫与除草抗生素，农用抗生素已遍及农药所有领域。但随着拟除虫菊 酯的问世，使农用抗生索的研究开发陷入低潮。到九十年代，由于农用抗生素 的特殊作用，化学农药的抗性等问题，使不少人又注力于农用抗生素的研究， 诞生了一大批新的品种，用途扩大，效能已包括杀虫，杀螨，杀动物体内寄生 蠕虫，杀菌，除草和调节植物生长等 6 。7 】。农用抗生素已发展成为一类很重要的 农药。 农用抗生素是一类由生物合成的化学物质，具有以下特点陋 ： ( 1 ) 化学结构较复杂； ( 2 ) 活性高，使用剂量低，大多数农用抗生素可列入高效农药范围； ( 3 ) 环境相容性好，农用抗生素是生物合成的天然物质，比较容易在自 然界的大循环中降解消失，不污染环境，对非靶标生物影响较小，不破坏生态 平衡。当然也有少数例外。因此，研究开发农用抗生素仍需进行环境评价研究； ( 4 ) 毒性差别很大，在农用抗生素的研究开发中，不可忽视毒性和安全 性研究，需仔细筛选产生抗生素的微生物菌； ( 5 ) 生产原料多为再生性资源，通常农用抗生素采用发酵工程大量生产， 原料多为农副产品如淀粉、葡萄糖等由植物利用太阳能光合作用产生的再生性 资源，从资源利用角度看是非常合理的，僵发酵一般在稀溶液中进行，需要搅 拌通气操作，动能消耗较大； ( 6 ) 生产设备通用性强，只需改变菌种就可改变生产品种j 对于投资和 适应市场是非常有利的，但在发酵物后处理过程如提取，精制等工序各个品种 由不同的工艺要求，需分别安排流程和设备； ( 7 ) 抗药性问题，农用抗生素与化学合成农药一样也可能引起靶标生物 产生抗药性，其难易和快慢主要取决于防治对象和药物本身的性质，在实践中 要视不同品种和靶标生物的情况而定。 第二节农用抗生素的研究开发 一、农用抗生素研究开发的一般程序 农用抗生素与化学合成农药的研究开发程序有所不同，是先发现其活性后 研究鉴定其化学结构，一般可按图卜2 - 1 的过程进行。 图1 - 2 - 1 农用抗生素研究开发的一般程序 农用抗生素主要是通过微生物工程来生产制备的。微生物工程是生物技术 的重要组成和基础，是生物技术产业化的熏要环节。它将微生物学、生物化学 和化学工程学的基本原理有机地结合起来，广泛而深刻地揭示了发酵过程的本 质。它的形成和发展对生物特别是微生物的产业化有着非常重要的意义“ 。微 生物工程的生命力在于在促进产业化发展的基础上不断进行技术改造、更新、 创新，使其向高度人工控制和自动化的发酵生产转移，向高效合成代谢的发酵 生产转移，在较短时间内获取更多高质量的产品，以满足社会更大的需求。因 此，微生物工程既为人类创造更多的物质财富，又在生产实践中不断得到丰富 和发展。随着科学技术的进步，微生物工程定会迅速发展，影响到工、农、医 一塑茎查堂婴主婴墅生兰堡堡壅 和科技等众多领域，为人类带来更大效益。 微生物工程是利用微生物的生长和代谢活动生产各种有用物质的现代工 业，以发酵为主，习惯上也称为发酵工业m ”1 。它是利用微生物的特定的性状 和功能，通过现代化生物工程技术生产有用物质或直接应用于工业化生产的技 术体系，是将传统发酵与现代d n a 重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术 结合并发展起来的现代发酵技术，也可以说是渗透有工程学的微生物学，是发 酵技术工程化的发展。作为现代科学概念的微生物发酵工程，是在2 0 世纪4 0 年代随着抗生素工业的兴起而得到迅速发展的，逐步形成一个大有发展前途的 新兴工业部门。在国民经济的众多领域中发挥了巨大作用。 农用抗生素研究开发工程基本可分为发酵和提取两大部分。发酵生产部分 即上游工程或微生物反应工程，提取、鉴定部分也称后处理或下游加工工程。 完整的微生物工程包括从投入原料到最终获得产品的整个过程，就是要研究和 解决整个过程的工艺和设备问题，将实验室和中试成果迅速扩大到生产中去。 在实施生产过程中。需考虑以下三点： ( 1 ) 选择高效和性能稳定的优良菌株，这是前提条件： ( 2 ) 控制发酵过程中的各项条件，使之最佳化，这是发酵正常运转的保证； ( 3 ) 整个发酵过程包括后处理工序各个环节必须配套，才有可能获取所需 的产品这三方面相互依存，缺一不可 微生物工程与化学工程有许多相近之处。但微生物工程是处理和培养活的 有机体，存在其自身的特殊性f i l 】： ( 1 ) 作为生化反应，通常在常温常压下进行，安全性较高，还能使一种设备 具有多种用途： ( 2 )原料通常以碳水化合物为主，加入少量的无机氮源，只要不含毒物， 一般无精制的必要，微生物本身能有选择性地摄取所需物质： ( 3 )反应以生命体的自动调节方式进行，因此多个反应互不干扰，在单 一设备内很易进行； ( 4 ) 能够容易地生产复杂的高分子化合物，酶类，蛋白类的生产和光学活 性体的生产等是发酵工业最有特色的领域； ( 5 ) 微生物菌体本身是富含维生素，蛋白质，酶等的有用物质，般对 生物体无害； 4 南开大学硕士研究生学位论文 ( 6 ) 通过微生物的菌种改良，能够利用原有生产设备使生产飞跃上升。 发酵过程的这些特征决定了微生物工程的种种优点，使得发酵工程成为生 物技术的核心之而收到广泛重视，但发酵过程尚存一些问题需引起注意，例 如：底物不可能完全转化成目的产物，副产物的产生不可避免，造成提取和精 制困难，这是目前发酵行业下游操作落后的原因之一；微生物反应是活细胞的 反应，产物的获得除受环境因素影响外，也受细胞内因素的影响，并且菌体易 发生变异，实际控制相当困难；产物易失活，操作要在无杂菌污染的情况下进 行，要求较高等。 具有以上特征的农用抗生素发酵工业，需不断的努力革新，开创新的工艺 与设备。 二、农用抗生素研究开发上游工程“2 1 6 】 农用抗生素研究开发上游工程的内容是随着科学技术的发展而不断扩大和 充实的。其主要内容包括微生物菌种采集，微生物纯种分离。抗生素的生物合 成即发酵过程等。 ( 一) 微生物菌种采集： 从微生物中寻找药用生物活性物质已有6 0 多年历史，迄今已发现上万种 抗生素。微生物广泛存在于自然界，样品一般可从空气、土壤、水体、动植物 及其分泌物中采集。在发酵过程中较为常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵 母和霉菌等。从微生物中发现的抗生素，有6 0 以上是放线菌产生的。在农用 抗生素中，这一比率还要更高，因此人们在抗生素发酵工业中，非常重视对放 线菌的研究和应用。从自然界中得到的微生物菌种往往产量不高，达不到生产 要求。因此，人们在认识和了解微生物特性的基础上，应用微生物遗传变异和 代谢调控理论，通过控制微生物的生长代谢条件，特别是以物理和化学因素诱 发微生物突变而产生优起性状，进一步筛选出高产菌株，称为菌种优育。其内 容包括选种和育种两个方面，这两者是相互联系的。生产菌种的选育，一方面 应充分利用和改造现有微生物，另一方面还需不断开发新的微生物资源以满足 生产所需。 ( 二) 微生物纯种分离 从自然界采集的微生物样品，一般有多种微生物混杂，研究时首先必须将 其进行纯种分离。每克采集的土壤样品至少含有上千万个微生物，因此必须进 南开大学硕士研究生学位论文 行上千万倍的稀释，使各个微生物单独生长在培养基上，然后加以挑选。纯种 分离工作的重点是培养基成分和培养条件，利用不同的培养基和改变培养条件 能获得不同种类的微生物。 微生物具有生命活动能力，其世代时间一般是很短的，在传代过程中易发 生变异或死亡，直接影响到发酵产物的产量和质量“。因此，在发酵的同时， 必须作好保藏工作，防止菌种退化。菌种保藏主要是根据微生物的生理生化特 征，在人工创造的条件下，使其代谢处于不活泼的休眠状态，或者创造适于微 生物休眠的环境，主要是通过低温、干燥和缺氧三个手段。保城方法有”】：斜 面低温保藏法，矿油保藏法，载体吸附保藏法，真空冷冻干燥保藏法和液氮超 低温保藏法等。常用的是斜面低温保藏法“”：将菌种接种在不同成分的斜面培 养基上，待菌种充分生长后放在4 c 冰箱中保藏。此法使培养物处于较低温度 下，可以大大减缓微生物的代谢繁殖速度降低突变频率，是一种简便、存活率 高的保藏方法，适用于经常使用的菌种。 ( 三) 抗生素的生物合成过程发酵过程 微生物发酵过程主要包括两个阶段：种子培养和发酵。根据微生物种类不 同，可分为好气性发酵和厌气性发酵；根据培养基状态不同，分为固体发酵和 液体发酵两种。常用的方法是液体涂层分批发酵法，即将原料按一定比例溶于 水中，配成液体培养基，装在发酵容器中，经灭菌和按种后在液体培养基内部 进行发酵，这种方法具有很多优点： ( 1 )液体悬浮环境是许多微生物的最适环境； ( 2 )在液体培养蒸中，菌体及其底物、产物易于扩散，使发酵可在均质或 拟均质的条件下进行，便于控制； ( 3 )液体输送方便，易于机械化操作； ( 4 ) 产品质量稳定，易于提取、精制。 农用抗生素的发酵是利用微生物的生化活动和环境条件相互作用来完成 的，其中环境条件能够被直接调控。主要影响发酵质量的因素包括培养基成分 及其浓度、温度、p h 值，溶解氧等变量h 】。 1 培养基对发酵过程的影响及控制 培养基是生产中供菌种生长繁殖和积累发酵产物的基质，需要选择适当的 成分、浓度和配比 ，即选择合适的营养物浓度和碳氢比，适宜的p h 值，同 6 南开大学硕士研究生学位论文 时具有一定的p h 缓冲作用，以适应代谢作用所引起的培养基p h 变化。 2 温度对发酵过程的影响及控制 在发酵过程中除了满足生产菌种的营养需要外，还需维持菌的适当营养条 件。微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的，温度是保证酶活 性的重要条件。 温度对发酵的影响是多方面的，错综复杂，它是各种因素综合表现的结果。 从酶反应的动力学来看，温度升高，反应速率加大，生长代谢加快，产物分泌 期提前。但因酶本身极易因热失活，表现在菌体易于衰老，发酵周期缩短，影 响发酵的最终产量。温度还可以改变发酵液的物理性质，间接影响菌的生物合 成速度和方向。因此，在发酵中应选取最适合于菌的生长和产物合成的温度， 与其它条件相结合，在实验中选取最佳温度。 3 p h 值对发酵过程的影响及控制 发酵过程中培养液p h 值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标， 对菌体的生长和产品的积累有很大影响，主要表现在以下四个方面： ( 1 ) p h 值影响酶的活性； ( 2 ) p h 值影响微生物细胞膜所带电荷的状态，从而改变细胞膜的渗透性， 影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄，因此影响代谢的正常运行； ( 3 ) p h 值影响培养基莱些组分和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对 这些物质的利用； ( 4 ) p h 不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发 生改变等。 每一种微生物蔼都有其最适的和能耐受的p h 范围。大多数放线菌生长最适 p h 为7 8 ，在实际发酵p h 值应根据特定的菌种和产物的化学性质来决定。 4 溶解氧对发酵的影响及其控制 好气性微生物深层培养时，需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些产 物的合成，若氧不足会造成代谢异常，产量降低。溶解氧最易成为发酵中的主 要矛盾。溶解氧浓度是发酵过程中的一个综合参数，它能很灵敏地反映出发酵 过程中供氧和需氧两个方面的变化。设备供氧能力的变化、菌龄的不同、加料 及补水措施、改变通气量等都会使发酵液中溶解氧浓度发生变化。供氧方面， 主要是设法提高溶解氧的推动力和设备的通气效率。另外，还需控制最佳的菌 南开大学硕士研究生学位论文 体浓度，保证需氧供氧，才能使微生物发酵达到最大效率。 5 反应器的设计 发酵设备是发酵工业最基本和最主要的设备。发酵设备必须具有适宜于微 生物生长和产物形成的各种条件，促进微生物的新陈代谢，使之能在低消耗下 获得高产量，因此，发酵设备应具有严密的结构，良好的液体混合性能，较高 的传质、传热速率，同时还应具有配套而又可靠的检测及控制仪表。在实践中 由于菌种的不同，产物不同或发酵类型及条件不同，应根据发酵过程的特点及 要求来设计和选择发酵设备的型式和结构。 微生物的发酵过程实质上是复杂的生物化学反应过程。原料大多为农副产 品，微生物就如化学反应中的催化剂，在发酵罐中生长繁殖的同时，进行生物 活性物质的合成( 代谢过程) 。不同的微生物在不同的条件下产生不同的代谢 物。利用各种不同的分离检测手段和生物筛选方法，可以寻找发现某些特定目 标需要的化合物。 三、农用抗生索研究开发下游工程 ( 一) 活性物质的分离纯化 发酵产物的分离、提取和精制过程o ”，又称后处理过程或下游加工过程， 是微生物工程的重要组成部分，亦是一个复杂而又耗资的工艺过程。 微生物发酵提供的初筛样品是含有许多化合物的未知混合物，必须进行分 离纯化，来寻找和判明其中某些化合物是真正的有效物质，并进一步了解该化 合物在混合样品中的含量、活性强度、生物学性质和理化性质，进一步鉴定其 化学结构。 发酵产品的一些特性对其分离纯化是很不利的：产品在发酵液中含量低， 杂质含量高，且某些杂质在结构和性质上与产品有许多相似之处；产品本身不 稳定易失活或分解等。随着生产与科学的发展，对产品的纯度要求越来越高， 因此分离纯化技术受到的重视与日俱增，后处理工作的成本占总制作成本的6 0 左右，有时可高达8 0 9 6 2 “。 下游加工工程可分为四个阶段：发酵液的预处理和固液分离，初步纯化( 提 取) ，高度纯化( 精制) ，成品加工。 其工艺流程如图1 2 _ 2 “1 ： 南开大学硕士研究生学位论文 发酵液 i 预处理( 加热，调p h ，絮凝) l 细胞分离( 过滤，离心分离，错流过滤) l 细胞破碎( 匀化，研磨) i 细胞碎片分离( 离心分离，错流过滤，双水相萃取) l 初步纯化( 沉淀，吸附，离子交换，萃取，超滤) ( 提取) i 高度纯化( 沉淀，超滤，色层分离，结晶) ( 精制) 成品加工( 浓缩，无菌过滤，干燥) 图i - 2 - 2 下游加工的工艺流程 1 发酵液的预处理和阐液分离 2 。“町 经过发酵所得的发酵液中不仅含有目的产物，还含有大量的水、未转化的 底物、微生物菌体及其它微量杂质。因此，必须进行分离与精制。 在进行分离与耩制之前，往往先对发酵液进行预处理。因为发酵液一般含 有凝胶物质，粘度较大，且微生物菌体细胞颗粒分散度高，其密度与水接近， 所以一般先加热、改变洲和添加化学物质，使细胞老化聚集成团，促进絮凝。 经预处理后的发酵液，首先分离出菌体，常用的方法有过滤，离心分离， 沉降及倾析等。在实验室使用最普遍的是离心分离。 2 初步纯化( 提取) 初步纯化的方法很多，常用的有吸附法，离子交换法，沉降法，溶剂萃取 法等。其中吸附法和溶剂萃取法主要用于小分子物质提取。”，溶剂萃取法会 9 南开大学硕士研究生学位论文 使蛋白发生变性，可用来辅助定性蛋白。农用抗生素8 8 3 2 # 的有效成分在我们 课题组的工作中已基本确定为蛋白质m 3 。对于蛋白质的提取，最常用的方法是 离子交换法o “3 ”和沉淀法，其中沉淀法常用于蛋白初步提纯，主要起浓缩作用， 可分为五种类型： ( 1 ) 盐析：加入高浓度盐类使蛋白沉淀。其机理是加盐除去蛋白水化层，从 而使蛋白相互吸引而沉淀。最常用的盐类为硫酸铵。 ( 2 ) 加入有机溶剂：使溶液介电常数降低，从而使水分子溶解能力降低，在 蛋白周围不易形成水化层，使蛋白沉淀。但有机溶剂易使蛋白失活。 ( 3 ) 调p h 值至蛋白等电点。 ( 4 ) 加入非离子型聚合物，如p e g ，其机理与加入有机溶剂类似。 ( 5 ) 加入聚电解质，其机理和盐析作用相似。 在实际生产中，最常用的是盐析法，此法简便易行，且对蛋白活性影响不 大，超滤法3 ”，双水相萃取法3 ”，反向胶束萃取法m 3 ，是近几年发展起来的新 技术，具有各自不同的优点，但成本较高，使用还不广泛，它们的进一步使用 还在研究中。 3 高度纯化( 精制) 经初步纯化后，发酵液体积已大大缩小，但纯度提高不多，需要进一步进 行精制。对于大分子物质，精制主要依赖于色层分离口”“ 。 色层分离是一种高效的分离技术。操作在柱中进行，包含圆定相和流动相， 物质因在两相间分配情况不同，在柱中的运动速率也相应不同，从而获得分离。 色层分离是一组相关技术的总称。根据分配机的不同。可以分为几个类型：凝 胶层析 ，离子交换层析“3 】，聚焦层析，疏水层析，亲和层析“】。 随着重组d n a 技术的发展，新的蛋白质不断出现，纯化蛋白质对色层分离 技术提出了更高的要求。用于分离蛋白质的介质的母体必须具有足够的亲水性， 以保证有较高的收率。同时应有足够的多孔性和足够的强度，以使大分子能够 透过。 色层分离是一种高效的分离技术，过去仅用于实验室中。最近十年来，规 模逐渐扩大而应用于工业制备上。 4 成品加工 根据产品应用时要求，一般经提取和精制后，还需一些加工步骤，如浓缩、 i o 一一旦墅查兰堡主! 窒生兰堡笙兰 无菌过滤、去热源、干燥、加入稳定剂等，主要对成品起灭菌和稳定作用。 ( 二) 农用抗生素的生产技术开发 开发一个农用抗生素品种必须在经济上满足农业使用成本的要求，否则难 以实现产业化。开发过程中必须注意几个关键问题。 1 优良菌种的选育 一般从自然界采集的野生型菌种产生抗生素的能力较差，需要人工精心选 育出工程菌种，满足生产技术的要求。此外，在生产过程中对营养及其它原料 要求简单易得且廉价，还要求在发酵液中副产物尽量少而简单，在选育优良菌 种的工作中要综合考虑这些指标。 2 发酵技术优化 优良的生产菌种必须在最佳的发酵条件下才能最大限度地合成所需的抗生 素物质。在发酵中要注意几个因素：培养基的组成，发酵温度和p h 的控制，供 氧量的控制。培养基不仅为微生物的生长繁殖提供必需的营养条件，还必须为 抗生素的合成提供原料、合成的前体、合成的诱导剂和副反应的抑制剂，对提 高抗生素的生产水平是非常重要的。在发酵过程中微生物的生长繁殖和抗生素 的生物合成两个阶段的条件有时是不同的，需根据不同菌种情况进行研究。 3 下游过程优化 抗生素分离提取工艺相当复杂且成本较高，需要根据产品的性质采用合适 的方法回收。 只有解决好以上几个关键的问题，才能大幅度地提高农用抗生素的生产效 率和降低成本。实现商品化开发。 第三节论文意义 杀菌农用抗生素的研究开发是农用抗生素中最为活跃的一个方面，具有非 常广泛的前途。本课题研究的农用抗生素8 8 3 2 # 菌株是经多年采种，分离筛选 得到的一株具有优良抗菌活性的放线菌，通过近几年的室内生测，小区实验和 大田实验，发现8 8 3 2 # 菌株的发酵产物对小麦赤霉病和棉花立枯病具有强烈的 抑制作用，其中对小麦赤霉病的防治作用已超过多菌灵，药效达到进口同类化 学合成农药水平。具有良好的发展前景。本论文对8 8 3 2 # 的发酵制备和活性组 分的分离提取方法进行了深入的探讨。 南开大学硕士研究生学位论文 在上游工程方面，首先在以往工作的基础上，对其最优发酵条件进行了更 加深入的研究，探索了发酵过程中不同菌种、不同p h 、不同培养基的影响，找 到了发酵过程的各因素的最佳值，确定了摇瓶发酵的最佳条件。为最终将这一 优秀菌种用于开发生产，进一步进行了发酵罐的条件实验，获得了发酵罐实验 影响因素的初步认识和较优值，为今后应用于实际生产作了一定的物质准备。 本文重点对农用抗生素8 8 3 2 # 的活性组分的分离提取方法进行了研究。通过 有机溶剂萃取法，有机溶剂沉淀法，硫酸铵沉降法，s d s p a g e 法，确定抗菌物 质为蛋白质大分子物质，并分离出了活性较高的几段区间。为探讨蛋白活性物 质的分离提取方法，采用蛋白分离的先进模式，毛细管凝胶电泳和等电聚焦毛 细管电泳，利用几种标准蛋白在不同分离条件下的分离情况考察分离的影响因 素，对这两种分离方法有了较深的认识，对所得的活性段产品进行分离，得到 活性蛋白组分的分子量和等电点。以等电点信息为依据，用高效液相制备色谱 制得活性较集中的组分，使我们对8 8 3 2 # 的认识更深入了一层，为今后的工作 提供了许多非常有价值的信息。 在研究过程中总结出了农用抗生素研究开发过程中的关键因素和影响条 件，指明了今后的研究开发工作努力方向，为将这一非常有应用前景的农用抗 生素的产业化提供了许多有用信息。毛细管电泳先进蛋白分离方法的研究为今 后测定活性蛋白样品的性质、结构起了积极的指导作用，为今后的分离提取及 性质结构等方面的研究打下了良好的基础。 第二章实验与方法部分 第一节农用抗生素8 8 3 2 # 的发酵制各 一、仪器药品 仪器：恒温摇床h q 4 s i i 型，武汉科学仪器厂 3 0 升发酵罐 菌种：农用抗生素8 8 3 2 # 菌株、小麦赤霉菌、棉花立枯菌( 均由本所生测 室提供) 。 培养基c 1 ，c 2 ，c j k 组成成分：硫酸镁、磷酸氢二钾、可溶性淀粉、酵母膏、 蛋白胨、葡萄糖、玉米浆。 其它试剂：盐酸、氢氧化钠( 调节p h 值) 二、农用抗生素8 8 3 2 # 的摇瓶发酵制各 ( 一) 摇瓶发酵方法 1 、菌种保藏 农用抗生素8 8 3 2 # 菌种采用斜面低温保藏法：将c j k 培养基煮沸，加入少 量琼脂粉，待冷却盾在固化的琼脂培养基斜面上接种8 8 3 2 # 菌株的黑孢子粉， 菌种于3 0 恒温箱中培养7 2 小时，用胶塞封口，于4 冰箱中保藏，保藏期为 六个月，保藏期满后进行移种。 2 、摇瓶发酵 ( 1 ) 液体菌种培养 ， 、h 坼7 。 用灭菌铂丝从琼脂斜面培养基表面刮取少量8 8 3 2 # 菌的孢子粉加入1 0 0 毫。j ， 7 a0 升培养基c 1 中，于1 4 m p a ，1 2 0 高温灭菌2 0 分钟，转移到恒温摇床上，3 0 ，。 转速2 2 0 r p m ，发酵4 8 小时。 ( 2 ) 接种与发酵 将液体菌种以1 0 的接种量加入培养基c 2 中，控温3 0 ，转速2 2 0 r p m ， 发酵7 2 小时。 c 1 ，c 2 培养基与c j k 成分相同，组成比例不同。 3 、抗菌活性测定方法 # 1 。 y l 砂 南开大学硕士研究生学位论文 农用抗生素8 8 3 2 # 的抗菌活性测定采用平碟法m 1 。在直径为1 0 厘米的培养 皿中加入相应比例的培养基和待测液，摇匀，在1 4 m p a ，1 2 0 c 高温灭菌2 0 分 钟，取直径为5 厘米的测试菌块，均匀置于培养皿中，在3 0 c 恒温箱中培养7 2 小时。测定菌圈半径，以培养基作空白c k ，平行测定两份，求出抑菌率。 抑菌率= l - ( 待测液菌圈半径- 5 m m ) ( 空白菌圈半径一5 m m ) 1 0 0 。 ( 二) 摇瓶发酵条件的优化选择 1 、菌种选择 在斜面上选取不同方位的菌块，分别进行摇瓶发酵，测定其产物的抑菌活 性。 2 、发酵p h 优化 培养基c 2 用盐酸，氢氧化钠调节其p h 值。在以往工作的经验的基础上， 已知其活性较高的发酵p h 范围为5 - 6 4 ，如图2 - 1 一l 随1 ，在此范围内我们进行 进一步的优化来选择最佳发酵p h 值。 1 0 0 ( ) 8 0 0 箍6 0 0 最4 0 0 2 0 0 - - 小发赤霉- 蔺 一棉花i f = 枯篱 十雌米轮纹潴 o 、o 1 ； 一 “。l _ 4 55 0 5 56 06 57 07 58 0 p 值 图2 - i - i 摇瓶发酵p h 值初步优化结果 3 、培养基优化 改变培养基c 2 中各物质比例，配成4 种不同的培养基，取5 号菌种，p h 为5 6 为条件发酵，选出最优的培养基配方。 三、农用抗生素8 8 3 2 # 的发酵罐制备 以摇瓶发酵的最佳条件为指导，在不同的转速( 4 0 0 r p m ，5 6 0 r p m ) 和通气量 ( 7 0 0 l h 。1 0 0 0 l h ) 条件下进行2 0 升发酵罐制各，接种量为1 2 0 0 毫升，种龄为 4 0 h ，温度控制在2 8 ( 2 ，在不同发酵时间取样，测定其抑菌率，初步得出农用抗 生素8 8 3 2 # 大量制备的发酵条件。 1 4 一堕墅盔兰堡主翌窒生堂垡堡窒 第二节农用抗生素8 8 3 2 # 发酵产物活性组分的粗分离 取一批发酵液，离心分离出菌丝和培养基( 4 ，8 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ) ， 进行分离。 一、农用抗生素8 8 3 2 # 发酵液活性组分的有机溶剂萃取 取发酵液1 0 毫升，转移到5 0 毫升分液漏斗中，分别用1 0 毫升石油醚、乙 醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取三次，将有机相合并，旋转挥发蒸去溶剂，用去 离子水稀释至1 0 毫升，将水相亦配成1 0 毫升溶液，分别作生物活性测定。 - 二、控制电荷密度沉降活性蛋白 溶剂的极性可以影响蛋白的溶解度。当加入易与水相混合的有机溶剂时， 改变了溶液的介电常数。蛋白质问的静电作用反比于介质的介电常数，加入有 机溶剂，介电常数降低，增强了蛋白质分子间的静电作用力，减弱了蛋白质和 溶剂分子间的作用力，导致蛋白发生聚集而沉淀。另一个因素是脱水作用，由 于有机溶剂也必须溶解在溶液中，减少了与蛋白作用的水分子，从而使蛋白脱 水而沉淀。我们分别用甲醇、乙醇、丙酮为溶剂在冰盐浴下沉淀1 0 毫升发酵液， 得活性蛋白，进行生测活性测定。 三、控制水合进行活性蛋白分离提取“6 1 蛋白质在水中的溶解度取决于蛋白质分子上离子基团周围水分子的数目， 即取决于蛋白质的水合程度。控制水合程度即可控制蛋白质的溶解度。常用的 办法是加入无机盐，其中应用最广泛的无机赫是硫酸铵，因为硫酸铵在水中稳 定，溶解度大，并且是最温和的试剂，不易引起蛋白活性散失。当溶液中硫酸 铵的浓度从零增加时，刚开始蛋自的溶解度有所增加，即“盐溶”现象，当盐 浓度继续增加到某一点时，蛋白开始沉淀，即“盐析”现象。由于各种蛋白的 表面极性基团和带电数目的不同，并且在蛋白表面的分布也不同，产生了盐析 顺序上的先后差异。根据这个原理，可以用硫酸铵作沉淀荆来分级分离蛋白。 取定量发酵液，冷冻干燥浓缩。边搅拌边加入硫酸铵粉末，调节硫酸铵饱 和度为2 0 ，4 冰箱中静置过夜，烧杯中有絮状沉淀生成。4 ，1 0 0 0 0 r p m 离 心分离1 5 分钟，分离出沉淀。用5 毫升n a h 2 p 0 4 - - n a 2 h p o 。缓冲溶液( p h 为6 6 ) 溶解，转移至透析袋中( 透析袋规格巾2 1 ，0 5 m e d t a 煮沸1 小时，蒸馏水煮沸 1 小时，去除重金属离子) ，透析液为如前缓冲溶液( 蛋白在缓冲溶液中易于 保藏) ，隔2 4 小时换一次透析液，共换两次。在剩余的发酵液中再加入硫酸铵 塑堑查兰堡主堕塑生兰垡堡苎 调节饱和度依次至3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 ，7 0 ，8 0 ，9 0 ( 各饱和度下加硫酸 铵的量据表2 2 一1 ) ，收集所得沉淀，离心，溶解，透析，测定生物活性。 表2 - 2 1 硫酸铵饱和度计算表 终蛾度 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 始浓i 0 1 1 41 7 62 4 33 1 33 9 04 7 25 6 16 6 2 2 0 5 91 2 31 8 92 6 23 4 04 2 45 2 0 3 0 6 21 2 71 9 82 7 33 5 64 4 9 4 0 6 31 3 22 0 52 8 53 7 5 5 0 6 61 3 72 1 43 0 2 6 0 6 91 4 32 2 7 7 0 7 21 5 3 8 0 7 7 表中数据为2 5 y 2 时，i 0 0 0 m 1 溶液由初浓度调至终浓度所需加硫酸铵的克数。 将这几段所得活性蛋白冷冻干燥，收集产品。 四、s d s 一聚丙烯酰胺电泳法测定蛋白质分子量 将所得的活性蛋白选用夹心式垂直板电泳仪进行不连续体系的s d s - 聚丙烯 酰胺凝胶电泳，即s d s p a g e 1 、仪器药品 ( 1 ) 仪器：p e s - 4 2 型垂直板电泳仪( 南京生化仪器厂) 扫描仪：p h a r a i c i ab i o t e c hc o m p a n y ，i m a g em a s t e rv i ) s ( 2 ) s d s p a g e 配方( 表2 2 2 ) 表2 2 2s d s p a g e 试剂配方 试剂分离胶1 5 浓缩胶5 水 3 0 a c r b i s t r i s 1 0 s d s 4 6 毫升 1 0 0 毫升 5 0 毫升 2 0 0 微升 3 4 毫升 8 3 0 微升 6 3 0 微升 5 0 微升 南开大学硕士研究生学位论文 ( 3 ) 六种标准蛋白 兔磷酸化酶 牛血清蛋白 兔肌动蛋白 牛碳酸肝酶 胰蛋白酶抑制剂 鸡蛋清溶菌酶 分子量( 道尔顿，d a ) 9 7 4 0 0 6 6 2 0 0 4 3 0 0 0 3 1 0 0 0 2 0 1 0 0 1 4 4 0 0 丰度 1 6 2 8 l 1 5 4 8 5 9 3 5 2 7 1 4 1 8 7 1 3 2 4 6 3 7 4 3 6 2 、实验步骤 安装好夹心式垂直板电泳槽，用漓管吸取熔化的1 琼脂糖溶液，封住长玻 板与硅胶模之间的缝隙，待琼脂糖凝结后，将2 0 毫升1 5 的分离胶加至长短玻 板之间的缝隙，约8 厘米高。用注射器沿长玻板壁加3 厘米高的正丁醇，聚合 3 0 分钟，吸干正丁醇。再配制5 的浓缩胶，加入长短玻板间的缝隙内，插入样 品槽模板，聚合3 0 分钟，拔去模板，吸去水分。将t r i s ( - - 羟甲基氨基甲烷) 一甘氨酸缓冲液( p h 8 3 ) 倒入上下贮槽中，没过短板1 厘米，加样1 微升，再倒入 含0 i s d s 的t r i s - 盐酸缓冲溶液，调节电流至1 0 毫安待样品进入分离胶后， 调节电流至3 0 毫安，进行电泳。当染料( 溴酚蓝) 前沿距框底1 5 厘米对，停 止电泳。用考马斯亮蓝染色固定1 小时，乙酸作脱色剂，静置过夜，照相，进 行定性定量扫描。 五、紫外分析鉴定蛋白含量 提纯蛋白质的目的是为了获得高生物活性的物质，因此首先要建立欲分离 蛋白的纯度和浓度测定方法，才能够了解纯化过程中每一步的提纯倍数，确定 所选择分离条件的可行性，比较不同分离方法的优缺点，避免实验的盲目性。 目前常用的蛋白质定量方法有双缩脲法、l o w r y 法、紫外吸收法、凯氏定氮法 以及染料结合法等h ”s 咖，其中较为简便常用的是紫外吸收光度法。 在同一起源的蛋白质中，若芳香族的氨基酸含量变化不大，则可用紫外吸 塑茎查兰堡! ：堕茎生堂些堡茎 收光度法来确定蛋白质的含量。 1 、2 8 0 n m 处测定蛋白含量 蛋白质的芳香族氨基酸在2 8 0 n m 处有特征性的最大吸收，可测定0 1 0 5 m g m l 的蛋白浓度的溶液。由于在纯化过程中蛋白质溶液常含有核酸，而核 酸在2 6 0 n m 处亦有大的吸收，所以可采用如下方法进行粗略计算来扣除核酸的 影响： 蛋白质溶液的含量( m g m 1 ) = 1 5 5 a 2 0 7 6 a 2 。( 式2 - 2 1 ) a 2 8 0 ，a 2 分别为溶液在2 8 0 n m ，2 6 0 n m 处光程为l c m 时的吸光度值。 此法可直接测定样品含量，操作简单，不破坏蛋白质结构，在大多数蛋白 质的色谱分离中，2 8 0 n m 可作为蛋白