（微生物学专业论文）水稻黄单胞菌水稻致病变种xrva基因的调控功能分析.pdf

y 1 8 17 4 1 5 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：黑撕岣年7 月6 同 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布囱，解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文储躲吴狮新妣场疑晔疹 月r r | j tf 水稻黄单胞菌水稻致病变种x r v a 基因的调控功能分析 摘要 水稻黄单胞菌水稻致病变种是熊够在水稻上引起白叶枯病的一种重要 的植物病原细菌。x r v a 基因的编码产物是属于h - n s 家族的成员，该蛋白家 族成员广泛存在于革兰氏阴性病原细菌中，与病原细菌的许多细胞行为有 关。本实验室已构建了x r v a 基因的突变体和过量表达株，表型检测发现突 变体和过量表达株的致病性和胞外多糖的产量均显著降低，说明x r v a 基因 与病菌的致病性、胞外多糖的产量有关。 本研究证实x r v a 基因在水稻黄单胞菌水稻致病变种中的过量表达可以 延迟该菌在非寄主植物上引起的过敏反应。n o r t h e r n 杂交分析显示x r v a 基 因在h r p 诱导培养基x o m 2 中的表达量比在丰富培养基o b 中的表达量高， 说明x r v a 基因在x o m 2 培养基中被诱导表达。检测了x r v a 基因对其它1 0 个致病相关基因或调控基因的表达调控，7 个基因即g u m b , r p f c , 伊舨 r p f g , h r p g h r p x , c s r a ( x o m 2 培养基条件) 在x r v a 基因突变体中的表达 量都明显低于它们在野生型菌株中的表达量，说明突变体的胞外多糖产量 的降低可能与g u m b 基因的表达量显著降低有关以及突变体在水稻上致病性 的降低可能与r p f c , 伊级r p f g , h r p g h r p x , c s r a 这6 个致病相关基因 的表达量的降低有关。g u m b , g u m ( , r p f c 在x r v a 基因过量表达株中的表达 量都明显低于它们在野生型菌株中的表达量，说明过量表达株中胞外多糖 产量的降低可能与g u m b g u m k 这2 个基因的表达量显著降低有关，突变体 i 在水稻上的致病性的降低可能与r p f c 基因表达量的降低有关。另外，r p f b 基因在这些菌株中的表达没有明显差异，而g u m n 基因由于表达量过低，几 乎检测不到。本工作说明x r v a 基因在水稻黄单胞菌水稻致病变种中具有较 宽的调控范围，是一个重要的调控基因。 - 关键词：水稻黄单胞菌水稻致病变种x r v a 基因过敏反应n o r t h e r n 杂 交表达调控 h r e g u l a t i o na n a l y s i so ft h e x r v ag e n ei n x a n t h o m o n a s 鲫泫彳ep vo ry z a e a b s t r a c t x a t h o m o n a so r y z a ep v o r y z a ei st h ec a s u a la g e n to ft h eb a c t e r i a ll e a f b l i g h to fr i c e x r v ab e l o n g st ot h ef a m i l yo fh n sp r o t e i n ，w h i c he x i s ti n m a n yg r a m n e g a t i v eb a c t e r i a lp a t h o g e n sa n di n v o l v e di nv a r i o u sc e l l b e h a v i o r s w eh a v ea l r e a d yc o n s t r u c t e dx r v a g e n em u t a n ta n d x r v a o v e r - e x p r e s s i o ns t r a i ni nxo r y z a ep v o r y z a ea n df o u n dt h a tb o t ht h e m u t a n ta n dt h eo v e r - e x p r e s s i o ns t r a i ns h o w e dr e d u c t i o ni nv i r u l e n c ea n d e x o p o l y s a c c h a r i d e ( e p s ) p r o d u c t i o n ，i n d i c a t i n gt h a tx r v ag e n ei si n v o l v e d i nv i r u l e n c ea n de x o p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o no f t h eb a c t e r i u m i nt h i ss t u d y , i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a to v e r - e x p r e s s i o nm u t a n to f x r v a s h o w e dd e l a y e de l i c i t a t i o no fh y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s ei nn o n h o s tp l a n t n o r t h e r nh y b r i d i z a t i o na n a l y s i ss h o w e dt h a t t h e e x p r e s s i o no fx r v ai n h r p - i n d u c i n gm e d i u mx o m 2i sh i g h e rt h a ni nr i c hm e d i u mo b ，s u g g e s t i n g t h a tt h ee x p r e s s i o no fx r v ai si n d u c e di nx o m 2m e d i u m t ok n o wt h e m e c h a n i s m so f x r v af u n c t i o n ，t h ee x p r e s s i o no f1 0g e n e s ，w h i c ha r ei n v o l v e d i nv i r u l e n c ea n de p s p r o d u c t i o n ，i nw i l d - t y p es t r a i n ，x r v am u t a n ta n dx r v a o v e r - e x p r e s s i o ns t r a i nw a sr e s p e c t i v e l yt e s t e db yn o r t h e r nh y b r i d i z a t i o n w ef o u n dt h a tt h ee x p r e s s i o no f g u m b ，r p f c , 偬仍馏厢h r p c , h r p xa n d i i i c s r a ( i nx o m 2m e d i u m ) i nx r v am u t a n ti s a p p a r e n t l yl o w e rt h a nt h e e x p r e s s i o no ft h e s eg e n e si nw i l d t y p es t r a i n ，i n d i c a t i n gt h a tt h er e d u c t i o n i ne p sp r o d u c t i o na n dv i r u l e n c ei n x r v am u t a n tr e s u l t e df r o mt h e d e c r e a s e de x p r e s s i o no fg u m ba n dt h eo t h e r6g e n e s t h e e x p r e s s i o no f g u m b , g u m k , r p f c i no v e r - e x p r e s s i o ns t r a i ni sl o w e rt h a nt h ee x p r e s s i o no f t h e s eg e n e si nw i l d 。t y p es t r a i n ，i m p l y i n gt h a tt h er e d u c e dp r o d u c t i o no f e p sa n dv i r u l e n c eo fo v e r - e x p r e s s i o ns t r a i n p a r t i a l l yr e s u l t e df r o mt h e d e c r e a s e de x p r e s s i o no f g u m b , g u m k a n dr v f c i na d d i t i o n ，t h ee x p r e s s i o n o fr p f bh a sn oo b v i o u sd i f f e r e n c eb e t w e e nx r v am u t a n t sa n dw i l d t y p e s t r a i n ；t h ee x p r e s s i o no fg u m ni s b a r e l yd e t e c t a b l e a l lt h e s er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tx r v ai sa n i m p o r t a n tr e g u l a t o r yg e n ei n v o l v e di nt h e r e s p o n s e ； 目录 第一章前言1 1 1 水稻黄单胞菌水稻致病变种的研究概况1 1 1 1 水稻黄单胞菌水稻致病变种的病理特征及分类l 1 1 2 水稻黄单胞菌水稻致病变种分子遗传学研究进展1 1 2 致病性调控基因的研究进展3 1 2 1h _ r p 基因的调控3 1 2 2 致病因子调控基因4 1 2 3 其他调控基因5 1 3h - n s 相关蛋白的研究5 1 4 本研究的目的和意义6 第二章材料与方法8 2 1 材料8 2 1 1 菌株8 2 1 2 培养基及所用抗生素8 2 1 2 1 培养基8 2 1 2 2 抗生素1 0 2 1 3 常用溶液及缓冲液1 0 2 2 方法1 l 2 2 1 培养条件及保存1 l 2 2 2 琼脂糖凝胶电泳1 1 2 2 3d n a 的提取1 2 2 2 3 1 质粒的提取1 2 2 2 3 2 总d n a 的提取1 2 2 2 4p c r 反应1 3 2 2 4 1 引物设计1 3 2 2 4 2 反应体系1 4 2 2 4 3 扩增程序1 4 2 2 5d n a 的酶切、连接1 4 2 2 5 1d n a 的酶切1 4 2 2 5 2d n a 的连接1 5 2 2 6d n a 片段的回收1 5 v 2 2 6 1 电透析法回收d n a 片段1 5 2 2 6 2 试剂盒回收1 6 2 2 7 感受态细胞的制备1 6 2 2 7 1 电脉冲感受态细胞的制备1 6 2 2 7 2m g c l 2 - c a c i 。法感受态细胞的制备1 6 2 2 8 质粒d n a 的转化1 7 2 2 8 1 电脉冲转化法1 7 2 2 8 2 化学转化法1 8 2 2 9 三亲本接合1 8 2 2 1 0 水稻植株的致病性实验1 8 2 2 1 1 过敏反应1 9 2 2 1 2n o r t h e r n 杂交1 9 2 2 1 2 1r n a 样品制各1 9 2 2 1 2 2 杂交转膜1 9 2 2 1 2 3 预杂交2 0 2 2 1 2 4 探针制备2 0 2 2 1 2 5 杂交洗膜2 0 2 2 1 2 6 放射自显影2 0 第三章结果与分析2 l 3 1 生物信息学分析2 1 3 1 1 序列同源性分析2 1 3 1 2 功能域分析2 l 3 1 3x r v a 蛋白与ec o l i 中已知的4 个h n s 家族蛋白的c 末端氨基酸的序列 比对2 2 3 2x r v a 基因过量表达延迟非寄主植物上引起的过敏反应2 2 3 3 芯片结果表明x r v a 基因的突变和过量表达时表达受影响的基因是不同的2 3 3 4x r v d 基因自身表达调控2 4 3 4 1 培养条件的选择2 4 3 4 2 杂交探针的制备2 4 3 4 3n o r t h e r n 杂交分析2 5 3 5x r v d 基因对其他致病相关基因的调控分析2 6 3 5 1 需要检测的基因的选择2 6 3 5 2 培养条件的选择2 6 3 5 3 杂交探针的制备2 6 3 5 4n o r t h e r n 杂交分析2 7 v i 3 5 4 1x r v a 基因对g u m 基因簇的g u m b , g u m ( , g u m n3 个基因的调控分析 2 7 3 5 4 2x r v a 基因对r p f 基因簇的r p 五b , r p f c , r p f f , r p f 64 个基因的调 控分析2 8 3 5 4 3x r v a 基因对调控基因h r p g , h r p x 的调控分析2 9 3 5 4 4x r v a 基因对调控基因c 刚的调控分析2 9 第四章总结与讨论3 l 4 1x r v a 基因过量表达延迟非寄主植物上引起的过敏反应3 l 4 2x r v a 基因在x o m 2 培养基中被诱导表达3 1 4 3 芯片结果表明x r v a 基因的突变和过量表达时受调控的基因是不同的3 l 4 4x r v a 基因对其他致病相关基因的调控分析3 2 4 5 创新点与不足之处3 3 参考文献3 4 致谢3 8 攻读学位期间所发表论文3 9 广西大学硕士掌位议水稻。，t 簟胞菌水稻鸳靖变种x r v a 基因的调控功能分析 第一章前言 1 1 水稻黄单胞菌水稻致病变种的研究概况 1 1 1 水稻黄单胞菌水稻致病变种的病理特征及分类 水稻黄单胞菌水稻致病变种( x a n t h o m o n a so r y z a ep v d 秽犹，x o o ) 是一种可以在全 球范围内引起水稻白叶枯病的植物病原微生物。该菌最早是1 8 8 4 年在日本福岗地区发 现，随后发病范围不断扩大，目前已遍及世界各水稻产区【1 3 】。x o o 主要通过水孔、气孔 或伤口侵入植物，进入植物体后，在质外体空间增殖，并沿维管束蔓延，引起系统侵染。 白叶枯病的病症依据水稻品种抗性、发病条件和侵染部位的不同，可以分为叶枯型、急 性型、中脉型、凋萎型和黄化型等1 4 1 。 水稻黄单胞菌属于革兰氏阴性细菌，菌体直杆状，单极生鞭毛，绝对好氧，菌落为 黄色、表面光滑、粘稠。依据伯杰氏系统细菌学手册第二版( 2 0 0 4 ) ，水稻黄单胞 菌水稻致病变种属于黄单胞菌属( x a n t h o m o n a s ) ，黄单胞菌科( x a n t h o m o n a d a c e a e ) ，黄 单胞菌 j ( x a n t h o m o n a d a l e s ) 。黄单胞菌属的绝大部分成员属于植物病原菌，主要有水稻 白叶枯病菌、柑桔溃疡病菌( xa x o n o p o d i s p v c i t r i , x a c ) 、十字花科植物的黑腐病菌伍 c a m p e s t r i sp v c a m p e s t r i s ，x c c ) 、辣椒斑点病菌( xc a m p e s t r i sp v v e s i c a t o r i a , x c v ) 、水稻 条斑病菌o r y z a ep v o r y z i c o l a , x o o c ) 等。根据xo r y z a e 和xc a m p e s t r i s 在卵磷脂活性、 丙酸钠利用、菌体全蛋白、脂肪酸侧链类型、寄主植物种类、寄生方式和致病表型等方 面的差异，认定x o o 是禾本科植物上的模式植物病原细菌【5 】。 1 1 2 水稻黄单胞菌水稻致病变种分子遗传学研究进展 目前在世界范围内，水稻黄单胞菌水稻致病变种已经有两个菌株完成了全基因组序 列测定，分别是物dk a c c1 0 3 3 l ( 韩国) 【6 1 和x o om a f f3 1 1 0 1 8 ( 日本) 7 1 。这两个菌株 基因组的比较显示，二者具有很高的相似性，但是基因的比对分析发现，在效应物和插 入序列的容量上存在差异( 表1 1 ) ，这可能与病原菌的寄主特异性和进化机制有关。基 于病原菌和寄主植物的基因组信息，我们可以更有效的深入了解植物与病原菌的相互作 广西大掣蝎页士掌位论文水稻黄单胞菌水稻致病交种x r v a 基因的调控功能分析 用以及物种进化的机制。 表1 1 且锄两个已测序菌株的一般特征比较 t a b l e1 1 c o m p a r i s o no f g e n e r a lf e a t u r e sb e t w e e nt h et w o x a n t h o m o n a s o r y z a ep v o r y z a eg e n o m e a ) ：n u m b e ro fi n c o m p l e t ec o p i e si si np a r e n t h e s e s 该菌的研究，主要集中在致病相关基因的研究上。x o o 与致病相关的基因包括以f 几类：决定病原菌在非寄主植物上产生过敏反应和在寄主水稻上具有致病性的h r p ( h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s ea n dp a t h o g e n i c i t y ，h r p ) 基斟6 8 6 1 ；编g qe p s ( e x t r a e e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s ，e p s ) 的舻册基因【1 r l ；控制e p s 合成的馏心基因f 1 8 1 、产生可扩散信号因子 ( d i f f u s i b l es i g r l a lf a c t o r , d s f ) 的僻穗因【1 9 1 、编码双组分调控蛋白【2 0 1 的基因，它们同 属于同一基因簇即致病因子调控( r e g u l a t o r yp a t h o g e n i c i t yf a c t o r , r p j ) 基因簇内；与病原菌 与植物相互识别有关的无毒基i 园( a v i r u l e n c eg e n e ，a v r ) ( 6 , 2 1 , 2 2 ) ； 以及胞外酶类编码基因、 鞭毛( f l a g e l l a ) 编码基因、趋化因子( c h e m o t a x i s ) 编码基因、与黄色素产生有关的9 妇基 因阿等。 2 广西大掌硕士掌位论文 水稻黄单胞菌水稻致病变种x r v a 基因的调控功能分析 1 2 致病性调控基因的研究进展 1 2 1h r p 基因的调控 在植物病原细菌中，型分泌系统是由h r p 基因编码的。许多革兰氏阴性植物病原 细菌在敏感寄主上的致病性以及在抗性寄主或非寄主植物上引起的过敏反应 ( h y p e r s e n s i t i v er e a c t i o n , h r ) 是受h r p 基因控制的【2 4 1 。大多数h r p 基因成簇存在，长度 一般在1 8 - 4 0 k b ，在染色体上形成所谓的“致病岛”( p a t h o g e n i c i t yi s l a n d p a l ) 1 2 5 】，也 有一些h r p 基因分散在染色体上，如水稻黄单胞菌的调控基因h r p g 、h r p x 等。另外病 原菌的h r p 基因簇也有不在染色体上的，如茄青枯假单胞菌的h r p 基因簇是位于大质粒 二。 零蔷瑟p 8 l 积a n t c 。e m l l 嘲 茳z = 匦竖z z 互：互刁8 a c li m 霸糟甜螨 图1 1 黄单胞菌属和茄科雷尔氏菌i i i 型分泌系统 基闪调控模利2 6 l f i g 1 1 m o d e l so ft y p ei i is e c r e t i o ns y s t e m ( t 3 s s ) g e n er e g u l a t i o n i nx a n t h o m o n a sa n dr a l s t o n i a s o 肠班彤“耽册f 2 6 j 1 ，p r h l r 操纵子编码p r h l 及p d 诹蛋白 2 ，p r h r 蛋白位于细菌细胞内膜 3 ，p r h a 蛋白位于细胞外膜接收植物细胞壁信号 并传递信号给p d 嘏 4 ，p f h r 激活p r h l 5 ，p r h i 激活p r h j 的转录 6 ，p r h j 激活h r p c 的转录 7 ，p h c a 在转录后水平上抑制慨p g 的表达 8 ，n r p 6 在x a n t h o m o n a ss p p 中激活h r p x 的转录， 在r a l s t o n i as o l a n a c e a r u m 中激活h r p b 的转录 9 ，h r p x 和h r p b 激活p i p h r p 框启动子 在植物病原细菌中，依据所含h r p 基因的相似性、操纵子结构、调控系统的差异等， 可将h r p - 基因簇分为两类，黄单胞菌与茄科雷尔氏菌( r a l s t o n i as o l a n a c e a r u m ) 的卸基 因簇同属一类f 2 7 1 ，其调控模式如图1 1 所示。黄单胞菌属中，型分泌系统的结构基因 和一些效应物基因的表达是受h r p g 和办椹因的编码产物调控的，这两个基因不仅存在 f x o o 中，也存在于肠拜日屁c 中。办伊g 和办搬一对重要的调控蛋白，它们调控包括h r p 广西大掌硕士学位论文水稻黄单胞菌水稻致病变种x r v a 基因的调控功能分析 基因簇在内的许多致病相关基因【2 8 】。h r p g 是双组分调控系统o m p r 家族的一个应答调控子 1 2 9 1 ，磷酸化的h r p g 推测是调控其他堪因调控子h r p x l 幂j 表达。n r p x 属于a r a c i 周控子家 族，通过转录激活其他雠因和编码效应蛋白( 即经由三型分泌系统分泌) 的基因的 表达瞄，3 们。一些被h r p x 调控的基因具有一致的核酸序列t t c g c n 1 5 一t t c g c 即p i p ( p l a n t i n d u c i b l ep r o m o t e r ) b o x 【1 6 3 1 1 ，p i pb o x 在鉴定受h r p x 调控子调控的候选基因尤其 是编码效应蛋白的基因方面是一种有效的工具。桃c a m p e s t r i sp v v e s i c a t o r i a 中，h r p b ， h r p c , h r p d , h r p f 这_ 四个转录起始位点附近存在p i p b o x ，实验证明这四个转录单位是受 h r p x v ( x c v 的h r p x - 基因) 调控的i 硎，而位于j i i p 基因簇最左边f f g h r p a 基因的诱导却不依 于h r p x v 【3 2 l 。在物d 中，虽然还没有这样的报道，但是已经证实h r p x o ( x o o 的h r p x - 基因) 突变体的致病性和过敏反应的丧失可以被来自于xc a m p e s t r i sp v c a m p e s t r i s 的h r p a c 互 补恢复。相反，h r p x o 同样可以恢复xc a m p e s t r i sp v c a m p e s t r i s 和xc a m p e s t r i sp v a r m o r a c i a e 的无致病性的突变体。因此，可以说h r p x 基因的功能是相同的，这种功能的 相似性也许可以扩展到其他的xc a m p e s t r i s 致病变种，已经检测过其他的致病变种的该 基因是高度保守的f 3 0 l 。 1 2 2 致病因子调控基因 r p f 基因在染色体上也是成簇存在的，该基因簇中部分r p f 基因的功能已经鉴定【2 0 3 3 3 s l ，其中包含编码双组分调控系统成员的，刀c 和，加基因。双组分调控系统在植物病 原菌中是普遍存在而且相当保守的调控模式，在许多情况下，双组分调控系统是可以帮助 病原菌更好的利用寄主植物生存。 典型的双组分调控系统由两个蛋白质成员组成，一是感受蛋白( s e n s o rp r o t e i n ) ，通 常是跨膜蛋白；一是调节蛋白( r e g u l a t e o rp r o t e i n ) ，通常位于细胞质内，它们来自于同 一个蛋白质家族。在x c c 中，毒性因子的合成和生物膜的形成是受双组分调控系统( 包 含具有h i ) 一g y p 功能域的调节蛋白r p f g 和与其同源的感受蛋白r p f c 以及作为细胞信 号媒介的d s f 因子) 正向调控的。已有研究表明，r p f g r p f c 双组分调控系统涉及d s f 因子的感知和信号传导【3 射。d s f 即不饱和脂肪酸c i s - 11 m e t h y l d o d e c e n o i ca c i d ，其主要 组分是由r p y r 基因编码的叭，细胞间d s f 信号的传导涉及由调控子r p 船的h d g y p 功能域促使的第二信使c - d i g m p 的转换1 2 0 1 ，这是一个新的c d i g m p 磷酸二脂酶。其中， 通过r p f c 感知d s f ，致使c d i g m p 的水平降低，随后影响到生物膜的形成或解离和 4 广西大掌硕士掌位论文 水稻黄簟胞菌水稻致病变种x r v a 基因的调控功戴墨矿析 胞外酶及胞外多糖的合成。虽然偬伊、r p f l 2 、r p j g 的突变体在毒力、毒性因子合成、生 物膜形成方面的表型是相似的，但是也不能排除d s f 也可以被x c c 中的其他受体识别 或者r p 佗可以识别其他环境中外加的d s f 。通过序列分析发现，r p f d s f 系统也存在于 物d 和x a c 以及相关的x y l e l l a 属d p 6 , 3 9 , 4 0 1 。 双组分调控系统被认为可以感知信号分子并适时开启调控病原菌治病相关基因的 表达。细菌间就是通过这种信号物质进行相互间的信号交流，引起同类细菌盼大量聚集， 信号分子的浓度也随之升高，当达到信号域值时，就会开启调控病原菌包括胞外酶、i i i 型分泌系统的组分和h r p 基因等致病基因的表达，生物膜的形成，质粒的转移等过程， 这种信号分子的调控现象称为群体感应。 1 2 3 其他调控基因 有研究表明，x o o 中的护办基因负向调控h r p g 的表达，但是该调控是直接的还是间 接的仍不清楚【8 j 。t r h 是g - n t r 调控子家族的成员，这一家族的转录调节子包括激活子， 抑制子及同时激活和抑制多种细菌操纵子的分子【4 l j 。在x o o 中，砌基因被定位在远离 h , p 基因簇和h r p 调控基因却g 和h r p x o 的位点上，但是在r s o l a n a c e a r u m 中，p r h 基因被定位在毗邻却基因簇的地方。事实上，t r h 基因被定位在i i 型分泌系统的基因 簇附近，预示着该基因可能涉及其他h r p 基因的表达，尤其是构建i i 型分泌系统的基因 的表达，然而，在t r h 基因突变体中，胞外纤维素酶( 该酶是经由i i 型分泌系统分泌的) 的活性没有改变 s l 。 细菌转录调控子m a r r 家族涉及包括致病性在内的许多细胞行为，在植物和动物病 原菌中，m a r r 家族成员调控对不同环境的适应性和毒性因子的表达等 4 2 ，4 3 1 。目前，有 七个m a r r 家族成员已经被证明在微生物致病性方面具有重要作用【郴引。在xc a m p e s t r i s p v c a m p e s t r i s 中，h p a r 编码一个假定的m a r r 家族的调控子，该基因涉及h r 、致病性、 胞外酶的产生等，实验证明，h p a r 属于忉g 和h r p x 调控子，并且m p x 通过h p a r 基 因调控胞外酶的产生】。 1 3 删s 相关蛋白的研究 h - n s 同源蛋白通常有很低的序列一致性，且在许多革兰氏阴性细菌中均存在。显 广西大掌司既b 学位说譬赶才增黄单胞菌水稻致病变种x r v a 基因的调控功能分析 微分析显示尽管序列一致性的很低，但它们经结构组装后，却具有相似的d n a 结合特性 酬。所有的h n s 类蛋白在结构上是相似的：这个蛋白包含c 末端的d n a 结合功能域和n 末端寡聚功能域，这两个功能域是通过一个灵活的连接区域分开的r 珏习。在h n s 1 i k e 蛋白中，c 末端功能域是最保守的区域，序列保守性和疏水簇的分布暗示着其二级结构 和三维结构在c 末端部分是相似的。各种h - n s 类蛋白的这种相似性促使我们认为它们的 d n a 结合特性是相似的，比如可以优先结合到6 肠启动子区域【5 s , 5 9 1 ，已有实验证实这一 推测l 删。在e c o l i 中，h - n s 核酸相关蛋白的n 末端功能域主要是c 【一螺旋，该蛋白是以二 聚体形式存在【6 1 , 6 2 】，在此基础上，二聚体具有自身相互作用并形成大的寡聚体的能力f 6 3 ， 6 4 1 o h n s 是一个全面的细菌代谢调控子，已知的h - n s 相关基因被p h 、同渗容摩、温度 等环境因素调节，而h - n s 本身可能涉及复制、重组、转座、染色体d n a 的压缩等生物 学过程【6 5 - 6 9 1 。在肠细菌群以及紧密相关的细菌如e r w i n i ac h r y s a n t h e m i 和h a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e r 仁该类基因已被鉴定。在e c o l i 中，h n s 核酸相关蛋白被认为在细菌染色质组 装中起重要作用【5 4 1 ，影响着许多环境调节基因的转录【6 5 】。在e r w i n i ac h r y s a n t h e m i 中， h - n s 在该菌毒性因子合成方面是二个重要的组分1 7 0 ) 。在s a l m o n e l l ae n t e r i c as c r o v a r t y p h i m u r i u m 中，h - n s 被认为是通过限制i 矾a 聚合酶与d n a 的结合而有规则的沉默某些 基因的表达，h n s 可以紧密的结合到富含a t 的d n a 区段，暗示着h - n s 可能与肠细菌获 取外源基因紧密相关【7 。通过理论分析( 如二级结构预测、d n a 结合功能域模式) 和实 验结果表明，b o r d e t e l l ap e r t u s s i s 菌株的b p h 3 蛋白，r h o d o b a c t e rc a p s u l a t u s 菌株的h v r a 蛋白，ec o l i 菌株的s t p a 蛋白均属于相同的d n a 结合蛋白家族。用s i l i c o 分析显示，这个 家族也包含足s p h a e r o i d e s 菌株的s p b 蛋白，x a n t h o m o n a sd ，) 珊菌株的x r v a 蛋白，v i b r i o c h o l e r a e 菌株的v i c h 蛋白等【删。 1 4 本研究的目的和意义 本研究是在本实验室已经构建好的突变体菌株，以及初步的表型检测的基础上， 对x r v a 基因做进一步的表达分析。在之前的表型检测中发现，该基因的整合突变体和 过量表达菌株在水稻上的致病性都显著降低，而且该基因在相关菌株中还未见有相关的 报道。因此希望通过对这个基因的表达调控分析，了解该基因自身的表达情况、对其他 基因表达的调控情况以及其他调控基因与该基因的调控关系。了解了这些基因之间的调 6 广西大掌硕士学位论文 水稻黄单胞菌水稻致病变种灯谢基因的调控功能分析 控关系，有利于我们更清楚的认识该菌与致病相关基因的表达调控情况，进而通过干扰 病原菌与寄主植物之间的信号识别与传导来控制其对寄主植物的感染。 7 ! 查竺竺主竺位论文水稻黄单胞菌水稻致病变种x r v a 基因的调控功能分析 一一 ：= 二： 2 1 材料 2 1 1 菌株 第二章材料与方法 x a n t h o m o n a so r y z a ep v o r y z a e 1 3 7 5 1 g x n l 2 8 0 g x n 2 0 8 8 g x n 3 0 8 8 w i l dt y p e s m 7 2 1 3 7 51 ：p k m l8 x r v a 本实验室 g x n l 2 8 0 ：p l x r v a本实验室 枷y 突变体 1 3 7 5 1 ：p k m l 8 h r c v 2 1 2 培养基及所用抗生素 2 1 2 1 培养基 ( 1 ) o b 培养基：y x o o 的液体培养 p o l y p e p t o n e t r y p t o n e s u c r o s e s o d i u mg l u t a m a t e l m e t h i o n i n e k 2 h p 0 4 k h z p 0 4 n h 4 c l 2 0 0 9 5 o g 1 0 o o g 1 0 0 9 0 1 0 9 o 7 2 9 0 2 8 9 1 o o g 8 本实验室 本实验室 广西大竺竺士掌位论文水稻黄单胞菌水稻致病变种x r v a 基因的调控功能分析 一一 ： m g c l 2 6 h 2 0 f e 2 + - ( e d t a ) p h 7 0 ( 2 ) o a 培养基：用于x o o 的固体培养 o b + i 5 琼脂粉 1 0 0 9 l p p m ( 3 ) l b 培养基：用于e c o l i 的液体培养 t r y p t o n e y e a s te x t r a c t n a c l 水 p h 7 0 l o g 5 9 5 9 1 l ( 4 ) l a 培养基：用于e c o l i 的固体培养 l b + 1 5 琼脂粉 ( 5 ) x o m 2 培养基：x o o 的诱导培养基( 诱导h r p 基因的表达) 7 3 1 葡萄糖l ， d ，l 一甲硫胺酸 6 7 0 p m 味精 k h 2 p 0 4 m n s 0 4 1 0 m m 1 4 7 m m 4 0 1 u n 广西大学硕士掌位论文 水稻黄单胞菌水稻致病变种x r v a 基因的调控功能分析 b a c t o y e a s te x t r a c t 5 9 n a c i o 5 9 加去离子水8 0 0 m l 溶解。加入2 5 0 m mk c l 溶液l o m l ( 在l o o m l 去离子水中溶解 1 8 6 9k c l 配制成2 5 0 m mk c l 溶液) ，用5 mn a 0 h ( 约0 2 m l ) 调p h 到7 o 。在使 用前加入5 m l 经灭菌的2 m o l lm g c l 2 溶液( 在9 0 m l 去离子水中溶解1 9 9m g c l 2 定 容到1 0 0 i i l l ) 。用去离子水补足到1 0 0 0 m l 。 ( 7 ) s o c 培养基 s o b 灭菌后降温至6 0 。c 下，加入2 0 m l 经除菌的l m o l l 的葡萄糖溶液( 在9 0 m l 去离子水中溶解1 8 9 葡萄糖，待糖完全溶解后，定容到l o o m l 灭菌) 。 2 1 2 2 抗生素 抗生素的储存浓度及使用浓度见表2 1 ，配好的抗生素应于4 c 保存。 表2 1 抗生素的储存浓度及使用浓度 t a b l e2 1a n t i b i o t i c sa n di t su s e dc o n c e n t r a t i o n 2 1 3 常用溶液及缓冲液 常用溶液及缓冲液均用超纯去离子水配制，然后经高压湿热灭菌，1 5 磅英寸2 下维持2 0 分钟。 i mt r i s h c h1 mt r i s 用浓h c i 调节至所需p h 值。 t e 缓冲液：1 0m mt f i s h c l ( p h 8 0 ) ，l m mn a 2 e d t a 。 0 5 x t b e ：4 5m mt r i s - b o m t e ，l m me d t a ( p h 8 o ) l o 水稻黄单胞菌水稻致病变种x r v a 基因的调控功能分析 lx t a e ：4 0 m mt r i s - a c e t a t e ，im me d t a ( p h 8 o ) 上样缓冲液：1 5 ( w v ) f i c o l l 4 0 0 ( 聚蔗糖) ，0 1 ( w v ) 溴酚蓝，4 0 r a m n a 2 e