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谷氨酰胺高产菌株发酵特性及其差异蛋白质组研究 摘要 谷氨酰胺是一种重要的氨基酸，它不仅具有重要的生理意义，同时也是一种 极有发展前途的新药，因此谷氨酰胺的研究、开发和应用具有重要的意义。 谷氨酰胺高产菌株c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u mg 3 2 在高铵盐浓度下可以过 量积累谷氨酰胺，并且随着铵盐的增加，谷氨酰胺的的产量逐渐增加，而谷氨酸 的产量却相应降低，这表明该菌株胞内的氮代谢及调控行为和标准株 c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m1 3 0 3 2 有很大的差异，我们希望利用双向电泳，分析 差异蛋白表达找到c g l u t a m i c u mg 3 2 对外界铵离子水平改变应答方面的差异， 同时结合对有机酸的测定，加深对该菌氮代谢的认识。 通过对不同铵离子水平下的发酵数据分析，高铵离子水平下，菌株的生长速 率以及糖代谢速率，谷氨酸的产率低于低铵离子水平，而谷氨酰胺的产率则要高 于低铵离子水平。 谷氨酸脱氢酶g l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s e ( g d h ) 、谷氨酰胺合成酶g l u t a m i n e s y n t h e t a s e ( g s ) 、谷氨酸合酶g l u t a m a t es y n t h a s e ( g o g a t ) 是氨同化途径中的重要 酶。研究了不同氮源水平下三种酶的比酶活变化情况。结果显示在高氮源条件下 g s 以及g o g a t 的比活力反而要高于低氮源条件下，改变p h 对三个酶的比活 力并没有明显影响。g d h 的比活力很高，这表明了g d h 在联系碳代谢和氮代 谢方面的重要作用。 分析g 3 2 在高氮和低氮培养基上的差异蛋白图谱，g 3 2 在高氮情况下糖酵 解途径受到抑制，磷酸戊糖途径p p p 途径加强，三羧酸t c a 循环酮戊二酸前面 的途径加强，而酮戊二酸后面的苹果酸脱氢酶加强，延胡索酸水化酶减弱，乳酸 脱氢酶表达上升，细胞生长相关蛋白的表达明显低于低氮情况下，其它氨基酸代 谢途径中的蛋白也相应上调，在发酵后期，应对环境压力的蛋白上调，暗示此时 由于还原氧的增加导致细胞衰亡。 对谷氨酰胺合成酶基因g l n a ，g l n a 2 以及中心调控因子a m t r 的测序结果表 明，与标准菌株c g l u t a m i c u m l 3 0 3 2 相比，g l n a 虽然有7 个核苷酸突变，但其编 码的蛋白仅仅是第4 7 位的氨基酸由i l e 变为v a l ，对酶活影响不大，而g l n a 2 由 于存在两个插入突变，因此所编码的蛋白与标准菌株大为不同，而且可能影响与 其处于同一操纵子上的g l n e 的表达。a m t r 有五个核苷酸发生了突变，其编码的 i v 山东大学硕士研究生论文 蛋白质则有四个氨基酸发生了变化，这些突变很可能导致a m t r 蛋白对菌株的氮 代谢基因转录的抑制被削弱。 关键词：谷氨酰胺；谷氨酸脱氢酶；谷氨酰胺合成酶；谷氨酸合酶；差异 蛋白质组；g l n a ，g l n a 2 ，a m t r v 谷氨酰胺高产菌株发酵特性及其差异蛋白质组研究 a b s t r a c t g l u t a m i n e ，a ni m p o r t a n ta n du s e f u la m i n oa c i d ，n o to n l y h a si m p o r t a n t p h y s i o l o g ys i g n i f i c a n c e ，b u ta l s oi sap r o s p e c t i v en e w m e d i c i n e c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u mg 3 2c o u l de x c e s s i v e l ya c c u m u l a t eg l u t a m i n e w h e nt h ea m m o n i u mc o n c e n t r a t i o ni sh i g hw h i l et h ep r o d u c t i o no fg l u t a m a t e d e c r e a s e sr e s p e c t i v e l y t h i sr e s u l td e m o n s t r a t e dt h a tt h en i t r o g e nm e t a b o l i s ma n dt h e m e t a b o l i cr e g u l a t i o no ft h i sm u t a n ta r et r e m e m d o u s l yd i f f e r e n tf r o mt h es t a n d a r d s t r a i nc o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m13 0 3 2 w et r i e dt of i g u r ei to u tt h er e s p o n s eo f c g l u t a m i c u mg 3 2 t od i f f r e n ta m m o n i u mc o n c e n t r a t i o n su t i l i z i n gp r o t e o m ea n a l y s i s i nt h i sp a p e r g l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s e ( g d h ) ，g l u t a m i n es y n t h e t a s e ( g s ) ，g l u t a m a t e s y n t h a s e ( g o g a t ) h a sb e e nc o n s i d e r e da st h em a j o ra m m o n i aa s s i m i l a t o r ye n z y m e s i nc o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m c h a r a c t e r i s t i c so ft h et h r e ee n z y m e si nd i f f e r e n t n i t r o g e ns o u r c ew e r ee x a m i n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea l lt h r e ee n z y m e s f r o m et h ec e l l si nm e d i u ma th i g hn i t r o g e nl e v e lw e r ee n h a n c e da n dc h a n g eo fp h h a dn oe f f e c to nt h es p e c i f i ca c t i v i t i e so ft h et h r e ee n z y m e s t h ea c t i v i t yo fg l u t a m a t e s y n t h a s ec h a n g e dg r e a t l yi nd i f e r r e n tn i t r o g e n s o u r c e i ts h o w e dt h a tg l u t a m a t e d e h y d r o g e n a s ea n dg l u t a m a t es y n t h a s ew e r et h ei m p o r t a n te n z y m e si nn i t r o g e n m e t a b o l i s m g d hi st h ek e ye n z y m e ，w h i c hi sr e l a t e dt oc a r b o nm e t a b o l i s mw i t h n i t r o g e nm e t a b o l i s m , a n di ti sv e r yf l e x i l e c o m p a r e dt ocg l u t a m i c u mg 3 2g r o w i n gi nm e d i u ma tl o wn i t r o g e nl e v e l ，t h e m e t a b o l i s mo fb a c t e r i ai n o c u l a t e di nm e d i u ma th i g nn i t r o g e nl e v e la p p a r e n t l yt u r n e d t oa n o t h e rd i r e c t i o n ：t h eu t i l i t yo fg l u c o s ef a s t e n e d ，p p pp r o c e s se n h a n c e d ，t c a c i r c u l a t i o nb e f o r ea c e t o n ed i c a r b o x y l i ca c i ds t r e n g t h e n e d ，b u te n z y m e so ft c aa f t e r a c e t o n ec a r b o x y l i ca c i da c td i f f e r e n t l y , s o m eo ft h e me n h a n c e dw h i l es o m ew e a k e n e d t h ep r o t e i n sr e l a t e dt ot h eg r o w t ho fc e l l sa r ed r a m a t i c a l l yl o w e r a tt h ee n do f f e r m e n t a t i o n ，t h ep r o t e i n sf u n c t i o nt od e g r a d ef r e eo x g e nw e r ee n h a n c e d ，w h i c h i m p l yt h a ti t so x y g e nf r e er a d i c a lt h a td a m g e t h ec e l l st os t o pt h ef e r m e n t a t i o n t h r e ek e yg e n e sg l n a ，g l n a 2a n da m t rw e r ec l o n e da n ds e q u e n c e d t h er e s u l t s s h o w e dt h a to n l yt h e4 7 t ha m i n oa c i do ft h eg l u t a m i n es y n t h a t a s eii ncg l u t a m i c u m g 3 2c h a n g ef r o mi l et ov a l ，w h i c hc o u l d n tc h a n g et h ep h y s i o l o g i c a lf u n c t i o no f i t t h e r ea r et w og a p sh a p p e n e di ng l a 2a n di tp r o b a b l yt oc h a n g ei t sf u n c t i o nw h i l ei t 山东大学硕士研究生论文 a l s oh a st h ep o s s i b i l i t yt ow e a k e nt h et r a n s c r i p t i o no fa n o t h e rr e g u l a t o r yg e n eg l n e t h ec e n t r a lr e g u l a t o r yf a c t o ra m t rh a sf o u ra m i n o - a c i dc h a n g e sw h i c hc o u l d i n f l u e n c et h ew h o l en i t r o g e nr e g u l a t o r ym e c h a n i s mo ft h i sb a c t e r i u m k e yw o r d s ：g l u t a m i n e ；g l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s e ；g l u t a m i n es y n t h e t a s e ； g l u t a m a t es y n t h a s e ；p r o t e o m i c s ；g i n d ；g l n a 2 ；a m t r v 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：l 岛 _l 形乡 、 日 期： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人 授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 一：眸一名： 日期： q 一6 ，屯 山东大学硕士研究生论文 第一章前言 从l e h r n a n na n dn e u m a n n l8 9 6 年第一次发现棒杆菌( l e h m a n ne ta l ，18 9 6 ) 至u 现 在已经有6 0 多个棒杆菌种被鉴定。这类菌细胞呈多形态、直或曲( 常为棍棒形) 杆状( c o r y n e ：希腊文中为“棒”) ，通常不运动。在最新的细菌分类和遗传分类 系统中，和c o r y n e b a c t e r i a c e a e ，m y c o b a c t e r i a c e a e ，n o c a r d i a c e a e ，g o r d o n i a c e a e ， t s u k u m u r e l l a c e a e ，d i e t z i a c e a e 亚目同属a c t i n o m y c e t a l e s 目( s t a c k e b r a n d te ta 1 ， 1 9 9 7 ) 。棒杆菌亚目包括棒杆菌科( 棒杆菌属t u r i c e l l a ) 、分支杆菌科( 分支 杆菌属) 、诺卡氏菌科( 诺卡氏菌属和r h o d o c o c c u s ) 、u o r d o n i a c e a e ( g o r d o n i a ) 、 t s u k u m u r e l l a c e a e ( t s u k u m u r e l l a ) 、d i e t z i a c e a e ( d i e t z i a ( s t a c k e b r a n d te ta l ，19 9 7 ) 。 这里面相当一部分是植物、动物及人的致病菌。给人们的卫生健康和工农业生产 带来很大的危害。 在这一类菌中谷氨酸棒杆菌c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m 具有重要的生物工 程应用价值。谷氨酸棒杆菌在轻工业生产特别是氨基酸发酵行业有广泛的应用。 谷氨酸棒杆菌最早在1 9 5 7 年由k i n o s h i t a 和他的同事分离获得。现在每年超过 1 0 0 0 0 0 0 吨的谷氨酸和超过5 6 0 0 0 0 吨的赖氨酸及一些其他氨基酸和核苷酸由该 菌及其突变株生产( a n d r e a se ta l ，2 0 0 3 ) 。鉴于其重要的理论意义和在工业上的 应用，从上世纪六十年代开始，人们就开始研究该菌的氨基酸合成途径及中心代 谢网络。随着各种新技术的出现及对理性设计改造菌株的需求，近年来，对谷氨 酸棒杆菌的研究热度有回升趋势。研究的方向也拓展到基础领域，比如说研究该 菌的细胞壁结构、转运过程、渗透调节等等。同时建立了该菌的全局分析方法如 代谢流量分析、代谢组学分析、转录组学分析和蛋白质组学分析。谷氨酸棒杆菌 是具有重要生物工程价值的微生物中研究得非常全面的菌。另外，由于该菌操作 安全，对该菌的研究结果可以应用到一些致病菌中( c o r y n e b a c t e r i u md i p h t h e r i a e m y c o b a c t e r i u ml e p r a e ，及m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s ) 。 谷氨酰胺是近年来我国正在发酵生产产业化的一个新产品，也是近五十年来 营养学领域发现的最重要的营养物质之一，在人类生命活动中起着重要的作用。 它不仅是一种重要的生化试剂，同时也是一种极有发展前途的新药( d a r m a u ne ta l ， 19 8 6 ；k u s u m o t o2 0 0 1 ；o s h i m ae ta l ，19 6 3 ；n a k a n i s h ie ta l ，19 7 5 ；y a m a d ae ta l ，19 7 9 ； 谷氨酰胺高产菌株发酵特性及其差异蛋白质组研究 n a b ee ta 1 1 9 8 0 ，1 9 8 1 ；n a b ea n dc h i b a t a1 9 8 1 ；t s u c h i d ae ta l ，1 9 8 7 ) 。在细胞的氮代 谢过程中，谷氨酰胺处于中心位置。围绕着高产谷氨酸谷氨酰胺深入进行谷氨 酸棒杆菌具有重要的理论和实践意义。我们课题组通过多年定向诱变筛选得到一 株可过量积累谷氨酰氨并且可耐受高氨盐浓度( 耐硫酸氨最高浓度为1 0 左右) 的谷氨酸棒杆菌突变株cg l u t a m i c u mg 3 2 ，这为我们下一步实验提供了很好的 素材。初步研究结果表明：微生物耐受如此高的铵盐浓度并不多见，在c g l u t a m i c u mg 3 2 中很可能存在着一条不被我们所熟知的跟氨转运相关的途径。首 先，介绍一些关于c g l u t a m i c u m 氮代谢的研究现状。其次，介绍一下蛋白质组 学的概念和现状。最后，介绍蛋白质组学中最重要的研究方法高分辨率双向 凝胶电泳。 1 1c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m 氮代谢的研究现状 氮代谢是生命体中最重要的代谢。氮代谢是所有生物体内最基本的、最重 要的代谢之一，了解氮代谢以及氮代谢与整个细胞代谢网络的关系有助于我们从 本质上理解掌握生命的代谢现象氮元素既是细胞中最重要的结构物质，又是生理 代谢中最活跃、无处不在的重要物质酶的主要成分，所以氮元素对细胞的 代谢和生长有重要作用。对细菌来讲其可利用作为氮源的化合物非常广泛，从简 单的无机含氮化合物如四氧化二氮、硝酸盐类到复杂的化合物如像组氨酸、精氨 酸这样的氨基酸及核苷类化合物如胞嘧啶等。事实上在所有细胞中谷氨酸和谷氨 酰胺是生物合成反应中氮的主要供体。有两种主要途径将氨同化为谷氨酸和谷氨 酰胺，其分别是g s g o g a t 途径和g d h 途径( t e m p e s te ta l ，1 9 7 0 ) 。 对所有生物来讲，氨的跨膜转运是一个非常重要的过程，在细菌、古菌、真 菌、和植物中是由a m t 家族中a m t m e p 蛋白来完成的，而在动物细胞中则是 由r h 因子来实现的( a m a u dje ta l ，2 0 0 4 ) 。氨在细菌中含量丰富，但是有些细 胞却不能耐受这种物质，比如说大脑细胞，许多神经疾病都是因为接触过多的氨 气所致。所以说细胞获取或者处理氨的能力关乎细胞的生死存亡( s h a h r a me t a l ，2 0 0 4 ) 。a m t 家族蛋白具有非常相似的氨基酸序列和蛋白通道功能，现在越来 越受到人们的关注。从上世纪六十年代人们就开始研究cg l u t a m i c u m 中氨的同 2 山东大学硕士研究生论文 化作用和谷氨酸、谷氨酰胺代谢相关的酶。但直到1 9 9 0 s 中期，基于分子生物 学的发展，人们才开始研究氨的转运机制和代谢调节机制。 细菌可以利用的作为n 源的化合物非常广泛，从简单的无机含n 化合物如 四氧化二氮、硝酸盐类到复杂的化合物如氨基酸像组氨酸、精氨酸及核苷类化合 物如胞嘧啶。n 代谢的同化途径可以分为两个等级，一是从胞外获取n 的途径， 二是生物合成胞内含n 化合物途径。事实上在所有细胞中谷氨酸和谷氨酰胺是 生物合成反应中n 的主要供体。有两种主要途径将氨同化为谷氨酸和谷氨酰胺， 其分别是g s g o g a t 途径和g d h 途径，它们催化的反应如下： g d h n h 3 - i - a l p h - k e t o g l u t a r i ca c i d + n a d p h + i - i + 啼g i u t a m a t e + n a d p + g s n h 3 + g l u t a m a t e + a t p g l u t a m i n e + a d p + p i g o g a r g l u t a m i n e + 2 - o x o g l u t a r a t e + n a d p h + 旷一2g l u t a m a t e + n a d p g s 和g o g a t 组成谷氨酸循环。 n g iu t a m in e 2 一o x o g lu t a r a t e c o n 1 年h 2 早h 2 c h n i c o o c o o l 早h 2 早h 2 c h n l c o oh a t p g iu l ：f l m a t 8 c o o h g i u t a m a t e n a d ( p l h 2 e f e r r e i e c l o xn i r 8 d u c e d l 图1 1 谷氨酸合成循环 f i g1 1t h eg l u t a m t es y n t h a s ec y c l e g s g o g a t 途径每生成1 0m o l 的谷氨酸要比谷氨酸脱氢酶同化氨途径多 消耗l m o la t p ，所以一般认为低氨浓度且细胞能荷充足的情况下g s g o g a t 途 3 谷氨酰胺高产菌株发酵特性及其差异蛋白质组研究 径对氨的同化和谷氨酰胺库的调控具有重要的作用，当氨和磷酸盐浓度充足及细 胞能荷受限时则g d h 途径发挥作用( m e r r i c ke ta l ，1 9 9 5 ) 。 ，n 心 o x o g l u t a r a t e - ( g d h 卜g l u t a m a t e 、一一， 图1 2 大肠杆菌中氮代谢调节机制( a n d r e a se ta l ，2 0 0 3 ) f i g 1 2 t h em e c h a n i s mo f n i t r o g e nm e t a b o l i s mr e g u l a t i o ni ne c o l i 当环境中氨浓度处于高水平情况下，氨主要以氨气的形式以扩散方式进入到 细胞内( k l e i n e r e t a l ，1 9 9 3 ) 。当扩散不能满足菌体需要时，氨离子转运蛋白a m t b 被诱导表达( s o u p e n ee ta l ，1 9 9 8 ) 。进入到细胞中的氨首先被g d h 固定，当胞 内氨离子浓度低于l m m o l 1 时，主要由同氨离子亲合力高的g s g o g a t 途径取 代g d h 途径来同化氨。每同化l m o l 氨，g s g o g a t 途径比g d h 途径多消 耗1 m o l 的a t p ，为了避免能量的浪费，当胞外氨浓度较高时，g s g o g a t 途 径受到抑制。此时g s 也必须保持一定的活力以满足细胞对谷氨酰胺的需求。 g s 在酶活和酶量两个水平上受到调节。大肠杆菌中通过腺苷酰化转移酶( a t a s e ) 对g s 腺苷酰化和去腺苷酰化完成对g s 活力的调节。完全或部分腺苷酰化的 酶是低活性的，只有全部脱腺苷酰化的酶才是高活性的( a n d r e a se ta l ，2 0 0 3 ) 。 a t a s e 活性受pi i 蛋白的控制( a r c o n d e g u ye ta l ，2 0 0 1 ) 。pi i 蛋白是一种信号传递 4 山东大学硕士研究生论文 蛋白( n i n f ae ta l ，2 0 0 0 ) 。尿苷酰化转移酶( u 胁e ) 通过胞内谷氨酰胺的浓度来 感受氮源水平。在胞内谷氨酰胺的存在抑制了u t a s e 催化p i i 蛋白尿苷酰化， 激活了u t a s e 催化pi i u m p 脱尿苷酰的活力，p 未被修饰说明氮源充足，p 被尿苷酰化修饰说明氮源匮乏。在尿苷酰化后的p i i 蛋白作用下，a t a s e 催化谷 氨酰胺合成酶脱腺苷酰化，表明细胞处于低氮水平下，g s 活力得到增强。相反， 没有被尿苷酰修饰的pi i 蛋白不能帮助a t a s e 催化谷氨酰胺合成酶脱腺苷酰化， 表明细胞处于高氮水平下，g s 活力受到抑制。 p i i 蛋白也把胞内氮水平信号传递给双组分信号传导系统n t r b n t r c 。 n t r b n t r c 在氮代谢过程中调节相关基因的表达。p i i 蛋白可以与n t r b 结合， 它们结合后n t r b 磷酯酶活力下降而激酶活力上升，导致n t r c 被磷酸化，受n t r c 调控的氮代谢相关基因被表达。n t r c 的磷酸化与否取决于胞内谷氨酰胺浓度并 通过尿苷酰化与脱尿苷酰化的p i i 蛋白与n t r b 的作用来实现。高浓度的酮戊二 酸( o x o g l u t a r a t e ) 抑制pi i 蛋白和n t r b 的结合，低浓度的酮戊二酸促进pi i 蛋 白和n t r b 的结合( a n d r e a se ta l ，2 0 0 3 ) 。cg l u t a m i c u m 中氮代谢调节机制与大 肠杆菌中的有一定差异。 7 w n i - i m 叱 n 1 嗍d 嘲删e 嗍肭- ( g o h 卜d 嘲删e 、_ - p ， 图1 3 谷氨酸棒杆菌中氮代谢调节机制( a n d r e a se ta l ，2 0 0 3 ) f i g 1 3 t h em e c h a n i s mo fn i t r o g e nm e t a b o l i s mr e g u l a t i o ni nc g l u t a m i c u m 谷氨酰胺高产菌株发酵特性及其差异蛋白质组研究 首先对于cg l u t a m i c u m 来说其膜上至少有两个氨离子转运蛋白a m t ( j a k o b ye ta l ，1 9 9 9 ) 和a m t b ( j a k o b y ，e ta l ，2 0 0 0 ) 负责氨离子的转运。根据对 cg l u t a m i c u m 摄氮速率的分析，在膜上很可能存在另一还不被人们所知的氨离 子转运蛋白( m e i e r - w a g n e re ta l ，2 0 0 1 ) 。在cg l u t a m i c u m 中不存在象e c o l i 那 样的n 仰n t r c 双组分信号传导系统调控氮代谢相关基因的表达。取而代之的 是全局转录调控因子a m t r ( m e i e r - w a g n e re ta l ，2 0 0 1 ) ( n o l d e ne ta l ，2 0 0 1 ) 。受到 a m t r 调控的基因包括a m t b 、g l n k 、g l n d 、g l n b d 、g l n a ，分别编码a m t b 、g l n k 、 u t a s e 、g o g a t 、g s ( j a k o b y e ta l ，2 0 0 0 ) ( s h i i oe ta l ，1 9 7 0 ) ( n o l d e ne ta l ，2 0 0 1 ) 。 在cg l u t a m i c u m 中，谷氨酰胺不是胞内氮水平的信号因子，在此过程中到底是 哪种代谢产物或者是外源因子负责将胞内氮水平传递给u t a s e 现在还不知道。 c g l u t a m i c u m 中没有pi i 蛋白，与其功能相似的是g i n ( ，g l n k 不参与a t a s e 活 性的调节( j a k o b y ，1 9 9 9 ) ，a t a s e 调节g s 活性的信号因子现在也不是很清楚。 在cg l u t a m i c u m 中将g d h 缺失发现，g d h 对菌体的生长和谷氨酸的产生都不 是必需的( b o r m a n n e 1k h o l ye ta l ，1 9 9 3 ) ( t e s c he ta l ，1 9 9 8 ) 。因此推测在c g l u t a m i c u m 中有可能还存在另一条代谢途径产生谷氨酸以完成g s g o g a t 的 循环。 对氨转运蛋白的研究有助于我们了解氨中毒引起的威胁生命的疾病的分子 基础，并且能为设计治疗这些疾病的药物提供模板；对安全的模式菌氮代谢的调 控机制研究结果可以用于其相似致病菌上面。比如与白喉杆菌( c d i p h t h e r i a e ) ； cg l u t a m i c u m 是一种重要的氨基酸、核苷酸生产菌，对该菌氮代谢的研究有助 于我们最大限度发挥该菌的发酵生产能力。在对氮代谢研究领域的文献分析和实 际实验中，我们注意到，氮代谢涉及到全局性代谢网络的问题。氨的转运、g s 的二级偶联调节、氮源水平信号的传导等涉及到的蛋白、小分子有十几种，而这 些因子的相互作用都是在短时间内顺序完成的。以往局限于研究某个基因然后观 察基因与功能一一对应之问关系的方法在解决像“氮代谢”这样的系统问题时遇 到了困难。运用蛋白质组学、代谢组学的方法和技术来研究氮代谢过程将提供给 我们一个新的思路。运用蛋白质组学可以分析在不同条件下几百个蛋白质的差异 表达情况，结合转录分析、酶活分析及代谢物分析有助于我们精确了解代谢网络 的调控情况。 6 山东大学硕士研究生论文 1 2 蛋白质组学的概念和现状 耗资3 0 亿美元，测序工作量达3 0 亿碱基对的人类基因组计划( h u m a n g e n o m ep r o j e c t ，h g p ) 深刻影响和改变了生命科学研究的重心，预示着基因组 时代的到来。从1 9 9 5 年，流感嗜血杆菌基因组序列首次被破译后，大量的微生 物基因组被测序，但这仅仅是理解有机物功能的一个起点。在基因组时代，许多 d n a 序列信息提供了相关基因组的结构和功能。然而，对基因产物( m r n a 和 蛋白质) 的理解是理解生物功能的一个不可缺少的部分。对于基因表达产物是否 或何时被翻译、基因产物的相应含量、翻译后修饰的程度、基因剔除或过表达的 影响、胞内网络对周围环境的应答等这些问题，仅靠d n a 序列不能给出满意的 回答。此外，m r n a 水平的测量并不能完全揭示细胞调节，且蛋白质的样品较 m r n a 稳定，蛋白质和m r n a 之间的相关系数仅为0 4 - 0 5 ，还存在转录后加 工、翻译调节以及翻译后加工等。故而，“基因组时代”的迅猛发展同时激起了人 们对“后基因组时代”中蛋白质组研究的需求。 蛋白质组( p r o t e o m e ) 的概念最先由m a r cw i l k i n s ( w i l k i n se ta l 。1 9 9 5 ) 提出， 指由一个基因组( g e n o m e ) ，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质( p r o t e i n ) 。该学 科是以细胞或组织内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象，在蛋白质肽谱 图和物种全基因组序列的基础上发展起来的。蛋白质组的概念与基因组的概念有 许多差别，它随着组织、甚至环境状态的不同而改变。在转录时，一个基因可以 多种m r n a 形式剪接，并且同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰。所以 一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物，蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超 过基因组的数目。蛋白质组学集中于动态描述基因调节，对基因表达的蛋白质水 平进行定量的测定，鉴定疾病、药物对生命过程的影响，以及解释基因表达调控 的机制。蛋白质组学研究的一个基本方面就是对于一个生物系统两个不同状态间 蛋白质表达水平差异的鉴定，比如，正常状态的于疾病状态的细胞核组织之间的 对比，这通常被称为差异显示或比较蛋白质组学。作为一门科学，蛋白质组研究 并非从零开始，它是已有2 0 年历史的蛋白质( 多肽) 谱和基因产物图谱技术的一 种延伸。多肽图谱依靠双向凝胶电泳( t w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ，2 d e ) 和进一步的图象分析；而基因产物图谱依靠多种分离后的分析，如质谱技术、氨 基酸组分分析等。关于具体技术方法将在下面详细介绍。 7 谷氨酰胺高产菌株发酵特性及其差异蛋白质组研究 1 3 高分辨率双向凝胶电泳技术 蛋白质组研究的发展是以双向电泳技术作为核心的。双向电泳由o f a r r e l ( o f a r r e l l ，1 9 7 5 ) 于1 9 7 5 年首次建立并成功地分离约1 0 0 0 个e c o l i 蛋白，并 表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化。双向凝胶电泳( t w od e m e n t i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s ，2 d e ) 是指第一向等电聚焦( i s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，i e f ) ，完全 根据蛋白质等电点来区分蛋白；第二向s d s p a g e ，根据蛋白质分子量来分离蛋 白质。根据第一向等电聚焦条件和方式的不同，将双向凝胶电泳分为三种系统： i s o - d a l t 、n e p h g e 和i p g - d a l t ( h u m p h e r y - s m i t he ta l ，19 9 7 ) 。i s o - d a i t 系 统是在聚丙烯酰胺凝胶中进行，两性电解质在外加电场作用下形成梯度。 n e p h g e 即非平衡p h 梯度电泳，主要用于分离碱性蛋白质，电泳展开时间相 对比较短。目前广泛应用的i p g d a l t 技术，第一向采取的是1 9 8 2 年发明的 i p g ( b i e l l q v i s te ta l ，1 9 8 2 ) ，即现在实验室常用的预制胶条，在聚丙烯酰胺胶内 共价连接了一种化合物i m m o b i l i n e ( 固定化电解质) ，该化合物为丙烯酰胺的衍 生物，含有不同的缓冲液的成分，具有产生p h 梯度的作用，不同的i m m o b i l i n e 产生不同的p h 梯度。现有的预制胶有线性和非线性p h 两种，可以根据实验目 的选择使用，线性p h 胶便于观察蛋白质的分布；非线性胶有利于更好地分离胶 条p h 中间范围的蛋白质。按p h 范围分为宽p h 范围和窄p h 范围，前者多用 于全蛋白的分离和分析，后者可更好地有选择性地分离目标蛋白。该技术的发明 克服了前两种等电聚焦方法的缺点，以其溶解性高，上样量大，有统一的电导率 和缓冲能力，重现性高等优点，而成为目前应用最为广泛的方法。目前，随着技 术的飞速发展，已能分离出1 00 0 0 个斑点( s p o t ) 。当双向电泳斑点的全面分析成 为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行。 经过2 d e 后，绝大多数蛋白质会根据各自的分子量和等电点分离开，从而 在2 d e 胶上看出所有蛋白质表达的信息。2 d e 主要应用于蛋白质的表达模式的 比较，任何两个样品可以通过2 d e 进行比较，2 d e 胶上的某个点的出现和消失 可以为不同蛋白质的表达提供信息，某个点的深浅又可以提供蛋白质表达量的差 异。蛋白质表达模式可以用整个器官作为样品，也可以用细胞株、组织或者体液 等作为样品。2 d e 另外一个应用是细胞蛋白质表达谱图，例如可用于微生物的 蛋白质谱图( c a s h ，2 0 0 0 ) ，细胞器蛋白质谱图( j u n ge ta l ，2 0 0 0 ) 等。一块2 d 胶 8 山东大学硕士研究生论文 可以表现出上千种的蛋白质( s h e v c h e n k oe ta l ，1 9 9 6 ) ，所以2 d e 是蛋白质组学 的一个非常有力的工具。 此外，2 d e 可以显示某些经过翻译后修饰的蛋白质，蛋白质经过修饰后其 电荷性质会发生改变，例如蛋白质的磷酸化修饰，通常蛋白质的磷酸化形式和去 磷酸化形式在双向电泳后可以发生相互转变，单一的磷酸化蛋白在2 d e 胶上表 现为多个点( l e w i se ta l ，2 0 0 0 ) 。另外，2 d e 可以追踪m r n a 剪接后表达的不 同蛋白质。 1 4 蛋白鉴定方法 e d m a n 测序法是第一个出现的鉴定蛋白质的技术，通过对蛋白质的降解来 测定蛋白质的氨基酸序列( e d m a n , 1 9 4 9 ) 。上个世纪七十年代诞生的微量测序技 术是一个重大的突破( a e b e r s o l de ta l ，1 9 8 1 9 8 8 ) ，微量测序技术的建立使得蛋 白质鉴定的灵敏度提高到了皮摩尔的数量级，该技术在双向电泳s d s p a g e 胶 上的应用，直接导致了第一个2 d e 数据库的建立( c e l i se ta l ，1 9 8 7 ) 。在蛋白质 鉴定中一个最重要的进展是质谱技术的建立( a n d e r s e na n dm a n n ，2 0 0 0 ) ，蛋白质 组学的研究也由于生物质谱技术的出现取得了突飞猛进的进展，作为蛋白质组学 三大支撑技术之一的现代质谱技术，在蛋白质和肽段的鉴定、定量和结构阐述等 方面起着重要的作用。 质谱仪的基本原理为：使用软电离技术使经酶切后的蛋白质肽段或完整蛋白 质带上电荷，然后通过它们质核比的差异使其得到分离并检测出其质量。质谱仪 通常包含3 部分，即离子源、质量分析器和检测器。质谱仪中最重要的部件是 质量分析器，它决定了质谱仪的灵敏度、分辨率、质量精确度、可测分子质量范 围等重要参数。常见的质量分析器有飞行时间( t i m eo fl i g h t ，t o f ) 、四极杆 ( q u a n d r u p l e ) 、离子肼( i o n t r a p ，i f ) 和傅里叶变换离子回旋共振质谱仪 ( f o u r i e r t r a n s f o r mi o nc y c l o t r o nr e s o n a n c em a s ss p e c t r o m e t r y ，f t i c rm s ) 。根 据这些基本装置的不同有以下几种质谱技术： 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( m a l d l t o fm s ) 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( m a t r i xa s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o nt i m eo ff u g h tm a s ss p e c t r o m e t r y ，m a l d i t o fm s ) 技术最早是由德 9 谷氨酰胺高产菌株发酵特性及其差异蛋白质组研究 国科学家k a r a s 和h i l l e n k a m p 等建立的( k a r a se ts l ，1 9 8 8 ) ，m a l d i 质谱一般 和飞行时间( t o f ) 质量检测器联用，通过脉冲式的离子化技术，使蛋白质或肽 分子渗入到低分子质量的晶态基质中，后者吸收激光脉冲的能量后发生气化，同 时使蛋白质或肽分子荷电进入气相，在气相呈分散状态的这些荷电分子进入“离 子室”之后即能作进一步的质量检测和分析。 由h e n z e l 等提出的肽质量指纹图谱( p e p t i d em a s sf i n g e rp r i n t i n g ，p m f ) 是目前蛋白质组研究较为常用的方法( h e n z e le ta l ，1 9 9 3 ) ，基本原理是用酶( 最 常用的是胰酶) 对2 d e 分离的蛋白在胶上或膜上于精氨酸或赖氨酸的c 2 末端 处进行断裂，断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量，最常用的质谱分析方 法即m a l d i t o fm s 。由于各种蛋白质的氨基酸序列( 一级结构) 不同，蛋白 质被酶解后产生的肽段序列也各异，同一时间获得所有肽段分子质量而形成一个 肽段分子质量图谱，这一图谱对蛋白质应该是专一而特异的，因此称为肽质量指 纹图谱( p m f ) 。所