（植物学专业论文）含笑属3个种花香形成和释放及化学成分的研究.pdf

福建农林大学硕七学位论文 摘要 木兰科m a g n o t i a c e a e 含笑属m i c k e l i al i n n 约5 0 种，分布于亚洲南部和东南部。 中国有3 8 种，现广植于长江流域以南各地，以云南为最多。该属植物是我国南方常 见的绿化林木和重要的观赏植物，其花是提取香精和害制花茶的重要原料。目前，国 内研究者已陆续对白兰、含笑和黄兰花被片的精油成分进行了分析。但对释香浓烈的 含笑属花被片的香气形成、释放机理以及花被片生长发育过程中香精油化学成分的变 化等方面的研究未见报道。为探讨含笑属花被片香气的形成及释放机理，以确定在生 产上花的最佳采摘时期，本研究应用光学显微镜、扫描电镜、透射电镜及色谱技术对 含笑属3 个种( 白兰、含笑和黄兰) 花被片的基本结构，香气形成、释放过程中细胞 内含物质的变化进行了研究。主要研究结果可归纳如下： ( 1 ) 颗粒状内含物与香气的关系 本研究结果表明，在花被片的发育过程中，基本薄壁组织细胞中的颗粒状内含物 随着香气的形成、释放而明显增多和减少，最后解体。由此可以推测：这些颗粒状内 含物与花被片香气相关联。为了探讨这些颗粒的性质，还进行了透射电镜观察，结果 表明，这些颗粒状内含物很可能是香气的前体物、能量的贮存器或酶体系。 ( 2 ) 香气的形成、挥发部位及挥发途径 光镜和扫描电镜横切面观察发现，3 个种花被片基本薄壁组织细胞中存在大量的 颗粒状的细胞内含物，其中，第1 i i 时期整个基本薄壁组织细胞充满大小不等的颗粒，； 推测花被片基本薄壁组织细胞是形成香气物质的场所。在花被片中分布有油细胞，油 细胞也是形成挥发性香气的场所。 这些颗粒状物质从基本薄壁组织细胞向表皮细胞外扩散，表皮细胞间隙和表皮细 胞的垂周壁也是其散发香气的途径；上表皮的各部位( 包括气孔) 具有比下表皮各部 位更多的颗粒状物质。 ( 3 ) 香精油化学成分的组成及变化 应用固相微萃取气质联用法提取和分析香精油化学成分发现，不同种的花被片 其香气化学成分各不相同，但都含有萜类、酯类、醇类、酮类化合物。同一种花被片 的不同发育时期，其香精油化学成分、总峰面积及各化学成分的峰面积各不相同。说 明香精油化学成分与花被片的生长发育时期密切相关。3 4 种第期花被片所检测到 的化学成分的种类较多、峰面积最大，这与扫描电镜观察到的颗粒状物质的变化规律 福建农林大学硕士学位论文 一致。 ( 4 ) 花被片的最佳采摘时间 通过感官、光镜、电镜观察以及气质联用分析结果得知，第1 i i 期颗粒状物质最多， 第期颗粒状物质大部分从薄壁细胞内向表皮细胞外散发，香气成分含量最多，香气最 浓；由此推测花被片基本薄壁组织中颗粒状细胞内含物尚未大量挥发的第1 i i 期是窨制 花茶或提取香精油的最佳采摘时期。 关键词：含笑属花香颗粒状细胞内含物化学成分 2 福建农林大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h e r ea r ea b o u t5 0s p e c i e si nm i c k e l i al i n n i nm a g n o t i a c e a ea n dt h e ya r ed i s t r i b u t i e d i nt h es o u t ha n ds o u t h e a s to fa s i a 38s p e c i e si nc h i n aa r ep l a n t e di nt h es o u t ho fy a n g t z e r i v e rb a s i na n dm o s to ft h e md i s t r i b u t e di ny u nn a np r o v i n c e t h ep l a n t si nm i c k e l i a l i n n a r et h ec o m m o ng r e e n i n ga n di m p o r t a n te n j o y m e n tt r e e si nt h es o u t ho fo u rc o u n t r y t h ef l o w e ri sa ni m p o r t a n tr a wm a t e r i a lo ff l a v o re s s e n c ee x t r a c t i n ga n dt e ap r o c e s s i n g n o w , t h ee s s e n t i a lo i li np e r i a n t ho fm a l b ad e m a l b ad c a n dm a l b ad e w e r e a n a l y z e db yd o m e s t i cr e s e a r c h e r s b u tt h em e c h a n i s mo ff r a g r a n c ef o r m i n ga n dr e l e a s i n g i np e r i a n t ho fm i c k e l i al i n n a n dt h ec h a n g e so fc h e m i c a lc o m p o n e n t si ni t se s s e n t i a lo i l d u r i n gt h ep r o c e s so fp e r i a n t hd e v e l o p m e n ta n dg r o w t ha r en o tr e p o r t e d i no r d e rt od i s c u s s t h em e c h a n i s ma n df i n dab e s t s t a g e t o p i c kt h e f l o w e ri n p r o d u c t i o n ，o p t i c a l m i c r o s c o p e ( o m ) ， s c a n n i n g e l e c t r i c m i c r o s c o p e ( s e m ) ，t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( t e m ) a n dc h r o m a t o g r a mt e c h n o l o g yw e r eu s e dt os t u d yt h eb a s i cs t r u c t u r e ， t h ec h a n g e so fc e l li n c l u s i o ng r a i n sd u r i n gt h ep r o c e s so ff r a g r a n c ef o r m i n ga n dr e l e a s i n g o ft h r e es p e c i e s ! sp e r i a n t hi nm i c k e l i al i n n 蝴a l b ad c m f i g o ( z o u r ) s p r e n g , a n dm c h a m p a c al i n n ) t h er e s u l t sw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： ( 1 ) t h er a l a t i o n s h i pb e t w e e nc e l li n c l u s i o ng r a i n sa n df r a g r a n c e t h er e s u l ts h o w e dt h a tc e l li n c l u s i o ng r a i n si nt h eb a s i cp a r e n c h y m ac e l l si n c r e a s e d a n dd e c r e a s e dd i s t i n c t l ya l o n gw i t ht h ed e v e l o p m e n to fp e r i a n t h ，a n dd i s o r g a n i z e da tl a s t ， f r o mw h i c hi tc o u l db es p e c u l a t e dt h a tt h e r ew e r er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc e l li n c l u s i o ng r a i n s a n df r a g r a n c ef o r m a t i o n i no r d e rt od i s c u s st h ec h a r a c t e ro ft h eg r a i n e s ，t h e yw e r e o b s e r v e du n d e rt e m ，t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e ym i g h tb eo ft h ep r e c u r s o ro ff r a g r a n c e ， r e s e r v eo r g a no fe n e r g yo re n z y m es y s t e m ( 2 ) t h ep o s i t i o no ff r a g r a n c ef o r m a t i o na n dr e l e a s i n ga n d i t sr e l e a s i n gr o u t e f r o mt r a n s v e r s es e c t i o no ft h ep e r i a n t ho b s e r v e db yo pa n ds e m ，t h e r ew e r em a n y c e l li n c l u s i o ng r a i n si nt h eb a s i cp a r e n c h y m ac e l l so ft h et h r e es p e c i e s sp e r i a n t h t h e y w e r ef u l lf i l l e di nt h eb a s i cp a r e n c h y m ac e l l sa tt h ei i is t a g e f r o mi tw ec o u l ds p e c u l a t e t h a tt h eb a s i cp a r e n c h y m ac e l l sw e r et h ep o s i t i o no ff r a g r a n c ef o r m a t i o n m a n yo i lc e l l s d i s t r i b u t e di nt h eb a s i cp a r e n c h y m aw e r ea l s ot h ep o s i t i o no ff r a g r a n c ef o r m a t i o n 3 福建农林大学硕士学位论文 t h e s eg r a i n sw e r ed i f f u s e df r o mb a s i cp a r e n c h y m ac e l l st ot h ee x t e r i o ro ft h e e p i d e r m a lc e l l s s t o m a sw e r et h em a i n l yc h a n n e l s i n t e r c e l l u l a rs p a c ea n da n t i c l i n a lw a l lo f e p i d e r m a lc e l l sw e r ea l s ot h e i rd i f f u s i o nr o u t i o n s t h ep o s i t i o n so nt h eu p p e re p i d e r m i sh a d m o r eg r a i n st h a nt h el o w e re p i d e r m i s ( 3 ) c h e m i c a lc o m p o n e n t sa n dc h a n g e so fe s s e n t i a lo i l c h e m i c a l c o m p o n e n t s o fe s s e n t i a lo i lw e r ee x t r a c t e da n d a n a l y s i s e db y s p m e g c m s c h e m i c a lc o m p o n e n t sw e r ed i f f e r e n ta m o n gd i f f e r e n ts p e c i e s ，b u ta l lo f t h e mc o n t a i n e dt e r p e n e ，e s t e r s ，a l c o h o l sa n dk e t o n ec o m p o u n d s t o t a lp e a ka r e aa n de v e r y c o m p o n e n t sp e a ka r e aw e r ea l s od i f f e r e n ta td i f f e r e n ts t a g e so ft h es a m es p e c i e ，w h i c h s h o w e dt h a tt h e r ew e r ec l o s er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc h e m i c a lc o m p o n e n t ya n ds t a g e so f p e r i a n t hd e v e l o p m e n ta n dg r o w t h t h et r e n dw a st h es a m ea st h eg r a i n s o b s e r v e db ys e m ( 4 ) t h eb e s th a r v e s t i n gs t a g eo ft h ep e r i a n t h f r o mt h es e n s o r y ，t h er e s u l t sb yo p ，s e m ，e ma n ds p e m - g c m s ，t h eq u a n t i t yo f c e l li n c l u s i o ng r a i n sw a st h em o s ta tt h ei i is t a g e ，a tt h ei vs t a g e ，m o s to ft h eg r a i n sw e r e r e l e a s i n gf r o mb a s i cp a r e n c h y m ac e l l st ot h ee x t e r i o ro ft h ee p i d e r m a lc e l l s ；t h ec o n t e n to f c h e m i c a lc o m p o n e n t sw a st h em o s ta n dt h ef r a g r a n c ew a st h es t r o n g e s t f r o mt h i si tc o u l d b es p e c u l a t e dt h a tt h ei i is t a g ew h i c ht h eg r a i n sa l m o s th a d n tr e l e a s e dy e tw a st h eb e s t s t a g et of l a v o re s s e n c ee x t r a c t i n ga n dt e ap r o c e s s i n g k e yw o r d ：m i c k e l i al i n n ，f r a g r a n c e ，c e l li n c l u s i o ng r a i n s ，c h e m i c a lc o m p o n e n t 4 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 高华q 日期： 沙箩l 1 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位( 毕业) 做作者亲笔签名：高耸匀 日期 矽7 ，6 m 指导教师亲笔签名： 救 日期：加7 ：，易 福建农林太学硬士学位论文 第一章引言 1 含笑属3 种花概述 木兰科m a g n o t i a c e a e 含笑属m i c k e l i al i n n 约5 0 种，分布于亚洲南部和东南部， 包括印度和斯里兰卡、中国西南部和东南部、日本南部和印度尼西亚等地【1 。i 。中国 有3 8 种，现广植于长江流域以南各地【8 ”，以云南最多啡“】。常见的有白兰、黄兰、 含笑、云南含笑、乐昌含笑、深山含笑、野含笑、紫含笑、多花含笑、金叶含笑等【1 2 1 。 1 1 白兰( m n 加d e ) 别名：黄桷兰、白缅桂、把兰。 原产喜马拉雅地区，落叶乔木。 形态特征：盆栽通常3 - 4 m 高也 有小型植株。树皮灰白，单叶互生，青 绿色，革质有光泽，长椭圆形。花白色 或略带黄色，花瓣肥厚，长披针形，有 浓香，花期长，6 1 0 月开花不断。如冬 季温度适宜，会有花持续不断开放，只 是香气不如夏花浓郁。( 图l - 1 ) 黔 f i 9 1 - 】吖a h a d c 用途：白兰株形直立有分枝，落落大方。在南方可露地庭院栽培。北方盆栽 可布置庭院、厅堂、会议室。中小型植株可陈设于客厅、书房。 白兰花还可用于熏 制花茶，它和茉莉花、珠兰花、代代花被称为中国四大著名花茶【1 w 。据有关资料记 载，纯粹的白兰花茶“外形条索紧结重实，色泽墨绿尚润，香气鲜浓持久，滋味浓厚 尚醇，汤色黄绿明亮，叶底嫩匀明亮”，其中的玉兰香高香花茶是潮州凤凰单枞十大 香型茶之一。作为一种香料植物，白兰花还可以兼做香料和药用。从中提取出的香 精油与干燥香料物质，可调配各种花香香精、化妆香精、香水等【1 1 ；还能够用于饮食 及医疗。不仅白兰花提取物能够药用，整个花也可以直接入药，对于慢性支气管炎、 虚劳久咳、前列腺炎等效果极佳。 1 0 古笑( m f i g o t l m u r ) s p r e n g ) 别名：香蕉花、含笑梅。木兰科含笑属常绿灌木。 形态特征：株高3 - 5m 。树皮灰褐色，芽、小枝、叶柄、花梗都密被锈色平伏毛， 花单生叶腋、淡黄色，边缘常紫红色，开放时，花瓣不完全张开，半开半含，像掩口 祖t 表# 大学磺士学位论文 而笑，故称作含笑” ，花期3 4 月，花香浓郁，似香蕉味。果卵圆形，9 月果热( 图 果同期，每年2 次，为6 7 月和9 - 1 0 月 ( 图1 - 3 ) 。 f 1 - 3 m d 删p 删l i n n 用途：美化、绿化：黄兰树形挺拔，枝叶青翠茂密，花芳香浓郁，常被佩戴于 胸前，极具观赏价值；其幼苗常用作繁殖其他木兰科树种的砧术，适生能力很强。 造林：黄兰较耐荫，与马尾、西南桦等种混交造林，可形成生态价值高的人工林分， 有涵养水源和改良环境的作用。 用材：黄兰木材轻软，材质优电，为造船、高级家 具的珍贵用材。香料及药用：黄兰的花和叶可提制浸膏及芳香油 2 0 1 ，用于配制高级 香型化妆品，其香味独具一格：根可入药能祛风湿、润喉止痛。、 福建农林大学硕士学位论文 2 国内外研究现状 对释香浓烈的含笑属的挥发油成分的研究始于1 9 8 6 年【2 l 】，国内研究者已陆续对 大叶含笑叶【2 2 1 、多花含笑叶【2 3 】、金叶含笑叶【2 4 1 的精油成分进行了分析。对白型2 5 2 7 1 、 含笑【2 8 。3 1 】、黄型3 2 1 花被片的精油成分也进行了分析。但在花茶加工领域，有关于鲜 花香气形成的前体物质、形成部位、挥发途径，以及花被片生长发育过程中香精油化 学成分的变化方面，研究还不多。 2 1 精油 2 1 1 精油涵义 精油( e s s e n t i a lo i l ) ，商业上称“芳香油，【3 3 1 ，医药上称- t 挥发油( v o l a t i l eo i l ) ”， 是一种具有一定挥发性的油状液态物质【3 4 1 ，可以从植物的含香部位采用物理方法( 如 水蒸气蒸馏、萃取、压榨、吸收等) 从原料中分离出来。 精油成分在化学上可分为以下几类： 萜类是植物精油中含量最多的一种成分，是由异戊二烯单元组成的化合物及其衍 生物，根据碳原子的数量又可分为单萜、倍半萜、双萜等，前两者占多数。单萜类具 镇痛、杀菌消毒、抗病毒、消炎、镇静等作用；倍半萜类具镇痛、杀菌消毒、抗炎症、 镇痉、降血压、弛缓等作用。 醇类是精油中的第二大成分，由单萜形成的醇类杀菌效果不错、也能增强免疫力。 由倍半萜形成的醇类，可化解在循环系统中的滞留物，有强壮作用，能促进心脏的循 环机能和提高肝脏的机能。 酚类也是精油的成分之一，有很强的杀菌消毒、抗感染、愈伤、促进消化、利 尿、祛痰、激发免疫机能等作用。但在高浓度的情况下，会对皮肤产生不良刺激。 醛类是具有强烈香气的化合物，和醇类具有同样的抗感染作用，有安抚中枢神经、 抗炎等疗效，但因对皮肤有刺激作用。 酮类是羰基与两个碳基结合的化合物总称。植物中的酮多是脂肪族酮以及含有芳 香基的芳香族酮。具有镇痛、抗凝血、抗炎症、愈伤、促进消化、激发免疫机能、弛 缓等作用。 酯类是精油中的有机酸和醇类发生反应生成的。酯的作用比较温和，基本没有危 险，一般具有抗炎、抗痉挛以及平抚神经系统、治疗皮肤发疹的作用。 7 福建农林大学硕士学位论文 2 1 2 精油提取 ( 1 ) 溶剂直接提取法有些精油易溶于水或加热易分解，不能采用水蒸气法来 提取，如茉莉、香蕉和金合欢等。采用相似相溶原理，用低沸点的、且能很好溶解精 油成分的有机溶剂，如石油醚、苯、酒精等，在室温下渗漉，再蒸出溶剂，得到称之 为浸膏的固体或半固体物，这一原理公布于1 8 3 5 年【3 5 1 。有固定萃取、转动萃取、搅 拌萃取、逆流萃取、浮滤萃取和加热回流萃取六种萃取方式。该法经济简便，目前被 香料工业广泛采用。 ( 2 ) 水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法【3 6 】指将含有挥发性成分的药材与水共同蒸馏， 使挥发性成分随水蒸气一并馏出，经冷凝分取挥发性成分的浸提方法。该法适用于具 有挥发性、能随水蒸气蒸馏而不被破坏、在水中稳定且难溶或不溶于水的药材成分的 浸提。提取时又可分以下几种方法：水中蒸馏法、直接蒸气蒸馏法、水上蒸馏法、减 压或压蒸气蒸馏、水扩散蒸气蒸馏等。在植物性天然香料生产方法中，水蒸气蒸馏法 是最常用的一种，植物精油的成分，其沸点通常在1 5 0 3 0 0 ，常压下均有一定的挥 发性，在加热条件下，可随水蒸气一起蒸馏出来，精油成分不溶于水，馏出物中的油 与水极易分开。此法的特点是设备简单，容易操作，成本低，产量大。 ( 3 ) 同时蒸馏萃取法是由l i k e n s 和n i c k e r s o n 在1 9 6 6 年发展起来的【3 7 1 ，该法 突出特点是将样品的水蒸气蒸馏和馏分的溶剂( 乙醚) 萃取两个步骤合二为一，此外， 同时蒸馏萃取法具有良好的重复性和较高的萃取量，它在1 0 。6 级浓度范围内对大多数 有机化合物仍有定量的提取率，该方法是一种全组分香精油制备方法。 ( 4 ) 超临界c 0 2 萃取技术超临界c 0 2 萃取法是2 0 世纪8 0 年代以来的一种新 颖分离技术，到了2 0 世纪9 0 年代有了较快的发展。由于c 0 2 安全性能好，对大多数 物质的溶解性能好，萃取出的天然香料品质极为优良，所以此法用做天然香料的萃取 剂已有代替有机溶剂的趋向，并成为一种节省能源、保护环境的化工分离方法。但另 一方面，由于其萃取过程是在高压条件下进行的，技术含量高，必须在合适的萃取条 件下进行操作，因此，此技术在应用上也受到了限制。汪洪武【2 8 】采用超临界c 0 2 萃取 方法提取含笑挥发油，得油率达到3 7 5 ，超临界c 0 2 萃取方法为提取含笑挥发油的 理想方法。 ( 5 ) 微波辐射诱导萃取法( m i c r o w a v e a s s i s t e de x t r a c t i o n 或m a e ) 微波辐射 诱导萃取植物性天然香料是工业微波应用的新成就。早在1 9 9 1 年，j e a n 等在对熏衣 福建农林大学硕士学位论文 草油进行微波提取时就获得了比水扩散技术多2 5 的乙酸芳樟酯和9 1 的芳樟醇 【3 8 1 。该方法与常规蒸馏法和萃取法相比，所得产品品质好、色泽浅、质地纯，而且微 波辐射诱导萃取具有高效率、高选择性、不会破坏天然热敏性物质等优点。 ( 6 ) 吸附法吸附通常是指气相中的某些成分被吸附剂吸取的现象，包括两 种形式，一种是非挥发溶剂吸附法，另一种是固体吸附剂吸附法。工业上应用固体吸 附剂吸附法最广泛的吸附剂是硅胶及活性炭。其中，吸附法中的树脂吸附法应用也比 较广泛。2 0 世纪8 0 年代中后期，中科院华南植物所采用易脱附的x a d 4 树脂做吸附 剂成功地抽吸了白兰花、黄兰花的顶空挥发成分，分别获得了鲜花的头香精油样品。 ( 7 ) 固相微萃取( s o l i dp h a s em i s c r o e x t r a c t i o n ，s p m e )它是加拿大w a t e r l 0 0 大学j p a w l i s z y n 研究小组于1 9 9 0 年提出的一种新型无溶剂样品预处理技术【3 9 】，它通 过采用装在注射器内的石英纤维表面上的特殊固相涂层，对样品组分进行萃取和富 集，其操作简单，成本低，效率高，选择性强。此外，它还可方便地与气相色谱等分 析仪器连用，将样品萃取，富集和进样检测合为一体，可大大提高分析速度和分析方 法的灵敏度。目前，此技术在分析花的挥发油化学成分方面得到广泛应用，如栀子花 4 0 】、桂花、枇杷花【4 2 】和姜花 4 3 删等。 ( 8 ) 固相微萃取技术工作条件的选择及优化： 萃取头的选择 萃取头的选择由欲萃取组分的分配系数、极性、沸点等参数共同确定【4 5 。4 8 1 。由于 不同固定相所构成的萃取头对物质的萃取吸附能力是不同的，萃取头的选择包括2 个方面，固定相的种类和固定相的厚度。 一般而言，萃取头固定相的厚度在1 0 1 0 01 t m 4 9 ，5 0 】之间。按照聚合物的极性固定 相涂层可分为3 大类，一类为极性涂层，另一类为非极性涂层，第三类为中等极性 混合型涂层，其中1 0 0l x m 聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 萃取头适合萃取小分子挥发性非极 性物质。 萃取时间的确定 萃取时间主要指达到或接近平衡所需要的时间。影响萃取时间的因素主要有萃取 头的选择、分配系数、样品的扩散系数、顶空体积、样品萃取的温度等。萃取开始时 萃取头固定相中物质浓度增加得很快，接近平衡时速度极其缓慢，因此萃取过程中不 必达到完全平衡，因为平衡之前萃取头涂层中吸附的物质量与其最终浓度就已存在一 9 福建农林大学硕士学位论文 个比例关系，所以在接近平衡时即可完成萃取过程，视样品的情况不同，萃取时间一 般为2 6 0m i n 4 9 ，5 1 1 。 萃取温度的确定 萃取温度对吸附采样的影响具有双面性，一方面，温度升高会加快样品分子运动， 导致液体蒸汽压的增大，有利于吸附，尤其对于顶空固相微萃取( h s s p m e ) ；另一方 面，温度升高也会降低萃取头吸附分析组分的能力，使得吸附量下降。实验过程中还 要根据样品的性质而定，一般萃取温度为4 0 9 0 * c t s o , 5 1 】。 样品的搅拌程度 样品经搅拌后可以促进萃取并相应地减少萃取时间，特别对于高分子量和高扩散 系数的组分。一般搅拌形式有磁力搅拌、高速匀浆、超声波来进行搅拌等方式。 萃取方式、盐浓度和p h 效应 s p m e 的操作方式有两种，一种为顶空萃取方式，另一种为浸入萃取方式。实验 中采取何种萃取方式主要取决于样品组分是否存在蒸汽压，对于有蒸汽压的组分可以 采用顶空方式来萃取。在萃取前往样品中添加无机盐可以增加萃取头固定相对分析组 分的吸附。此外调节样品的p h 值可以降低组分的亲脂性，从而大大提高萃取效率。 2 1 3 精油成分分离鉴定 ( 1 ) 影响气相色谱分析结果的因素 色谱柱的选择： 色谱柱柱管材料和表面活度、固定相的选择、涂敷液膜厚度、柱长和柱内径对色 谱柱的性能都有很大影响。p h i l i pj m a r r i o t t 等【5 2 1 认为如果要将精油成分很好的分离的 话，最重要的一点是要考虑色谱柱的极性。因为对于一个非极性色谱柱，它是根据成 分的沸点来分离峰的，但对于含氧化合物和纯碳氢化合物它们都有着相似的沸点，因 而对于像精油这样含有很多成分的样品来讲，样品的洗脱范围是会限制在狭窄的保留 时间内，它会导致峰的叠加，分离不开。而对于极性较高的色谱柱，它可以通过使较 高极性的成分延长保留时间而使得峰的洗脱时间增加，各个成分因此得以分离。 因此在本实验中使用弱极性的h p 5 ( 3 0m x 0 3 2m m x 0 2 5 岬) 弹性石英毛细管 柱。 载气的选择： 根据分离效率，检测器的适应性和灵敏性，载气的物理化学性能来选择载气。常 l o 福建农林大学硕士学位论文 用的有氮气、氦气和氢气，其中氦气性能较好。 色谱柱程序升温： 毛细管柱柱温程序升温的优点：对于沸点范围宽的样品可以缩短其分析时间；可 以利用溶剂效应、冷阱捕集或溶质浓缩技术来减少由于样品体积过大时进样缓慢造成 的影响；保留值的重现性较好；改善样品的检测限。 初温：选择依据：样品组成成分的挥发性，一般初温都选择低于样品中主要挥发 组分的馏出温度；固定相的粘度，初温就应高于固定相的凝固温度。 终温：根据固定相和样品的稳定性以及样品中大部分挥发组分的沸点来选择。 加热速率和升流速率：在程序升温毛细管气相色谱仪中，一般使用的流量较低。 因此加热速率与流量的比值都比较高，加热速率对保留值强的组分的保留时间影响 大。从分辨率的角度来看，加热速率对流量的比值愈小则分辨率愈高。在毛细管气 相色谱中只需用较小的加热速率就可保持最佳分辨率 5 3 1 。 ( 2 ) 气质联用技术( g c m s ) 在含笑属花的精油成分分析上研究进展 随气相色谱柱分离效能的不断提高，含笑属中花的香气成分分离技术得到不断发 展。g c m s 的应用，使分离出的香气组分可以得到快速鉴定，同时结合核磁共振、 红外、紫外多种鉴定方法及k o v a t s 保留指数、程升指数等辅助定性方法，使鉴定的 结果更准确。 刘波静【2 5 】在分析白兰花中挥发性化学成分中通过n i s t 9 8 谱库自动检索获得初 步鉴定结果，根据所得质谱图，与美国e p a n i h 质谱图集的标准谱图进行对照，再 结合相关文献进行人工图谱解析，来确认其化学成分。这与汪洪武【2 8 】分析含笑花精油 所用方法基本一致。 钟瑞敏等【5 4 】采用气相色谱质谱联用技术结合k o v a t s 保留指数( k i ) l y 较法，对毛 桃木莲、乳源木莲、乐昌含笑、金叶含笑和深山含笑等5 种木兰科芳香植物精油进行 了化学成分对比鉴定。结果表明，这种方法与单纯质谱匹配度的方法相比，大大提高 了组分化学物质鉴定的准确性。 2 1 4 精油成分定量方法 对花的香气成分的大多数研究中，主要侧重于对其香气组分进行定性鉴定，通常 采用峰面积归一法对各组分含量粗略定量。汪洪武等分析含笑花精油是通过 s h i m a d z ug c m ss o l u t i o n 数据处理系统，按照峰面积归一法进行定量分析，然后求出 福建农林大学硕士学位论文 挥发油中各化学成分的相对质量分数。 2 2 含笑属花的精油组分的变化 ( 1 ) 含笑属不同种的花被片的香气物质，其香气组成存在差异 刘扬岷掣2 6 】等对白兰花的香气成分进行了分析，认为：白兰花香气的主要成分为 l - 芳樟醇。孙凌峰【2 2 】对大叶含笑的精油成分进行分析，其主要化学成分是橙花叔醇 ( 1 2 8 3 ) 、石竹烯( 1 0 1 1 ) 、金合欢醇( 8 1 7 ) 等。 ( 2 ) 不同季节，花香物质的主要成分与含量的变化 汪洪武等 3 0 1 采用g c m s 对冬季、春季、夏季3 个季节的含笑花被片的挥发油的 化学成分进行了分析。发现不同采摘季节，含笑花被片的挥发油萃取率和挥发性成分 的相对含量不同。其原因在于生长季节不同，则气温、水分、光照会有变化，冬季采 摘的花鉴定出来的挥发性成分是最多的。 ( 3 ) 不同制备分析方法所得的香气物质成分亦存在差异 刘扬岷等2 6 1 等采用固相微萃取分析白兰花香气成分时，得出香气的主要成分是 l 芳樟醇( 3 3 2 0 ) ，d 一大根香叶烯( 1 5 6 3 ) ，2 甲基丁酸甲酯( 1 0 9 0 ) ，6 榄香 烯( 6 8 2 ) 等。刘波科2 5 】等采用同时蒸馏萃取法提取白兰花香气成分，h p 5 柱和 s u p e l c o 1 0 1 0 柱上用气质联用法检测，含量高的组分分别为芳樟醇为7 0 2 1 和 7 2 3 3 ，2 甲基丁酸甲酯为4 1 1 和3 9 6 ，2 甲基丁酸乙酯为2 2 8 和2 7 3 等。李 吉来等【2 7 】采用水蒸气蒸馏法分析白兰花挥发油的成分，得到的主要成分为芳樟醇，占 挥发油峰总面积的7 5 0 4 。刘艳清掣3 2 1 采用水蒸气蒸馏法、超临界萃取法、微波辅 助提取法与超声波辅助萃取法等4 种提取方法提取黄兰挥发油，结果从挥发油中分别 鉴定出3 6 、3 5 、2 5 和2 6 种化合物，发现不同提取方法所得的4 种挥发油化学成分有 所不同。 汪洪武等 2 9 】用微波萃取方法提取含笑花挥发油，鉴定出2 9 种化合物。其中大栊 牛儿烯b 为含笑的最主要成分，丁香烯的质量分数也较高。 典灵辉掣3 1 1 用水蒸气蒸馏法提取含笑花的挥发油并进行分析，鉴定出3 4 种成分， 主要成分为p 一榄香烯、 z 】2 3 环丙基7 降蒈基 醋酸甲酯、丫一榄香烯、香桦烯等。 2 3 精油的释放机理 探明含笑属花释香机理，对香料生产投料时间和花茶加工付窨时间具指导作用 【5 5 】。 1 2 福建农林大学硕士学位论文 2 3 1 精油形成的前体物质 郭素枝等【5 5 】应用光学显微镜和扫描电镜对含笑属中白兰花开放过程中花被片结 构的变化进行了观察，结果表明，颗粒状细胞内含物在花被片开展的不同时期，数量、 形态及存在部位不同可以推断白兰花被片颗粒状细胞内含物可能是主要香气释放前 体物质。 同样作为窨制花茶的重要赋香植物，含笑属花的香气前体物质的研究较少，而茉 莉花的香气物质研究的就比较多。张丽霞等【5 6 】发现，在茉莉花瓣细胞中含有大量的颗 粒，其中以上表皮细胞中颗粒数量最多，下表皮细胞中次之，基本薄壁组织细胞中最 少，在茉莉花释香过程中，颗粒数量明显减少，最后解体。由此推测，这些颗粒与荣 莉花香气的形成相关联。 张丽霞掣5 7 1 发现茉莉花瓣细胞中存在电子密度较低、体积较大的颗粒和电子密度 较高、体积较小的颗粒( 分别简称为g l 和g h 颗粒) ，并在g h 颗粒周围存在清晰的晕 圈；在茉莉花释香过程中，两种颗粒在形态上均发生明显的变化，推测g l 颗粒可能 是白色体，是茉莉花香气前体物或能量物质的贮存器，g h 颗粒可能为溶酶体，香气 物质的形成是g i 和g h 颗粒相互作用的结果。 2 3 2 精油的形成、挥发部位及途径 植物花的基本薄壁组织细胞能产生香气物质。有实验表明，花瓣( 或花瓣类似结 构如花被片等) 的基本薄壁组织或一些特殊的表皮细胞内可以产生含挥发性香气成分 的不溶性的淀粉复合物或其它储藏物质【5 8 5 9 硎。对不同释香阶段离体茉莉花瓣的光 镜与扫描电镜观察也表明茉莉花释香过程中具有大量颗粒状细胞内含物，并在释香过 程中，颗粒数量逐渐减少，最后解体【5 6 】。郭素枝等【5 5 】发现，白兰花挥发性香气的前体 物在基本薄壁组织细胞中产生，通过扩散作用输送到表皮细胞，最后通过表皮细胞的 垂周壁、表皮细胞的细胞间隙以及气孔释放出来。 对紫茉莉( m i r a b i l i s j a t a p a ) 、金鱼草( a n t i r r h i n u mm a j u s ) 等植物的花瓣( 或花瓣类似 结构如花被片等) 的研究表明【5 8 5 9 1 ，香气产生部位( o s m o p h o r e ) 仅为花瓣( 或花瓣类似结 构如花被片等) 的局部特定区域，这些区域的表皮细胞或基本薄壁组织细胞特化。 油细胞也是植物花的精油储存的场所，油细胞是植物体内呈单细胞分布的分泌结 构，在木兰科植物中，普遍具有油细胞是该科植物的解剖学特征。其油细胞含芳香油， 有重要的经济价值【6 1 1 。蔡霞等6 2 ，6 3 1 利用超薄切片和透射电镜研究了玉兰( m a g n o l i a 福建农林大学硕士学位论文 d e n u d a t ad e s r ) 和鹅掌楸 l i r i o d e n d r o nc h i n e n s e ( n e m s l ) s a r g e n t 】的油细胞，结果表 明：其挥发油在油细胞的细胞质和质体内合成。目前，木兰科植物花中油细胞的分布， 特别是含笑属植物花被片中油细胞的分布的报道较少。 2 3 3 花的最佳采摘时期 对芳香植物花的最佳采摘时期的研究报道表明，大多数从花中提取精油的芳香植 物以在接近盛花末期香味最浓时采收。例如，玫瑰花【“】的含油量在花开至呈半杯状， 花蕊黄色时含油量最高；桂花【6 5 】在9 、1 0 月开花飘时采收最佳；艾菊6 6 1 在盛花期采收 最佳。但由于不同芳香植物在花的生长发育过程、精油成分、代谢途径上存在着不同， 所以采收时期花的发育状态和精油含量的关系也各不相同。郭素枝等冈发现，白兰花 开放过程中花被片颗粒状细胞内含物最早大量出现在花的苞片刚脱落，花被片黄白 色，即将开放的第1 i i 时期的基本薄壁组织细胞中，因此，白兰花开放过程的第1 i i 时期 可以确定为其花茶加工过程中鲜花的最佳采摘时间。 3 存在问题 ( 1 ) 含笑属植物花的香气物质的前体有待于研究 研究含笑属植物花的香气物质的前体，可以在自然环境与条件受限的情况时进行 人为的控制，通过增加香气前体物质或者提高酶的活性的方法，来提高香气物质的生 成量。含笑属植物花的香气化合物的形成途径应是多样化的，决非一类酶，一类前体 物相互作用的结果，这些有待深入研究 ( 2 ) 含笑属植物花的香气物质的形成、挥发部位及途径有待于探索 花瓣是鲜花香气存在的主要部位，花瓣细胞是香气形成的场所，含笑属植物花的 香气释放过程中解剖结构的变化是其香气形成机理的重要组成部分。探索含笑属植物 花的香气物质的形成、挥发部位及途径，可以在花茶窨制过程中，为香气物质更好地 释放，吸附到茶坯上提供理论依据。 ( 3 ) 含笑属植物花的采摘季节和采摘时期有待于进一步确定 由于不同季节，不同开放时期采摘的含笑属植物花所含的香气物质的组分及挥发 量可能不同，因此季节和时期的选择，对于精油的提取率的高低和窨制花茶品质的好 坏是至关重要的。这就要求我们充分了解含笑属植物花的开放吐气习性，摸索一个含 笑属植物花的最佳采摘季节和采摘时期。 1 4 福建农林大学硕士学位论文 4 本项目的研究内容与意义 4 1 研究内容 ( 1 ) 含笑属植物花被片发育过程的细胞结构变化 以花被片为实验材料，在花开的不同时期取样，采用光学显微技术、扫描电镜技 术、透射电子显微镜技术研究种间及发育过程花被片的结构差异，以及薄壁细胞内含 物质的变化。 ( 2 ) 含笑属3 个种花香形成、香气释放的研究 采用光学显微技术、扫描电镜技术、透射电子显微镜技术研究不同时期、不同种 间花被片香气形成、挥发部位、释香过程中细胞内含物的变化规律。 ( 2 ) 香精油成分提取与分析 提取与分析含笑属3 个种花被片各时期香气化学成分。比较不同种、同种不同时 期花被片香气化学成分及含量变化。 4 2 研究意义 通过研究含笑属植物花被片细胞内含物在发育不同阶段的超微结构变化；了解香 气形成、挥发部位，揭示花被片香气释放的机理；同时，通过分析3 个种花的香气成 分及含量随着花的生长发育及释香过程的变化，以及种间花的香气的含量及组成成分 差异，来寻找含笑属植物花被片提取精油和窨制花茶的最佳采摘时期。 1 5 幡建农林大学曛士学位论文 第二章材料与方法 1 材料 术兰科( m a 掣a o l i a e e a e ) 吉笑属3 个种植物：自兰( ma l b a d c ) 、含笑( 肛 妒) s p r e n g ) 、黄兰( 腻c h a m p a c al i n n ) 的花被片被采集作为实验材料a 样品采集地为 福建农林大学