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华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 高产纳豆激酶菌株的筛选及其酶学性质的研究 摘要 纳豆激酶( n a t t o k i n a s e ，n k l 是日本传统发酵食品纳豆在发酵过程中由纳豆枯 草芽孢杆菌( 踟c f f 沁s u b t i l i sa a n o ) 产生的一种有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶。研究 表明，n k 具有很强的溶解血栓功能，与目前临床所用的尿激酶、链激酶等溶栓 药物相比，n k 具有安全性好，易被人体吸收，作用直接迅速，药效持续时间长， 可由纳豆枯草芽孢杆菌直接发酵生产因而造价低廉等优点因此许多学者预言， n k 将是一种很有潜力的新型溶栓药物。 本论文通过对原始菌株进行紫外诱变、纤维蛋白平板初筛、摇瓶发酵复筛的 方法筛选出一株高产n k 的纳豆枯草芽孢杆菌b s n - 3 菌株，并对b s n - 3 菌株所 产n k 的分离纯化及理化性质等展开了系列研究。 通过计算紫外照射芽孢的致死率，确定诱变时间为4 m i n 。通过纤维蛋白平 板筛选和酪蛋白平板筛选结果的比较，发现酪蛋白平板筛选结果并不可靠。 通过单因素实验和正交实验研究了液体发酵产n k 的最佳条件。结果表明优 化培养基组成为：胰蛋白胨6 9 l ，木糖3 0 9 l ，k 2 i - i p 0 4 3 i h ol g l ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 2 9 l 。适宜培养温度为3 0 1 2 ，p h 8 0 ，培养时间7 2 h 。在优化条件下，用纤维蛋 白平板法测得b s n - 3 菌株的酶活为1 1 2 0 i u m l 。 通过研究b s n 3 菌株的生长曲线和产n k 时间的关系，研究了b s n 3 菌株 产n k 的产酶动力学，结果表明：n k 的合成类型是滞后合成型。 b s n - 3 菌株发酵液4 8 0 0 r r a i n 离心1 0 r a i n ，上清液用4 5 的硫酸铵盐析沉淀 部分杂蛋白，离心后，上清液用5 0 的硫酸铵盐析沉淀n k ，再用c m - 5 2 层析， 得到电泳纯的n k 。n k 的总收率为3 9 ，提纯倍数为1 0 3 选用纤维蛋白平板法作为检测n k 溶纤活性的方法，进行了一系列的理化性 质测定，结果表明： n k 水溶液在5 0 以下对温度不敏感，可以常温保存。 该酶在p h 3 o ，1 1 o 范围内稳定。 不同的金属离子对n k 酶活的影响不同，z n 2 + 和h 9 2 + 会抑制酶活。低浓度的 c u 2 + 不影响酶活，高浓度的c u 2 + 会抑制酶活。 高产纳豆激酶菌株的筛选及其醇学性质的研究 不同物质对n k 的热稳定性作用不同，其中3 7 0 0 的明胶对酶的保护作用最好。 以上研究结果，可以为n k 的生产，为该酶的保藏、运输等提供科学的依据， 使n k 能尽早开发为溶栓药物。 关键词：纳豆激酶；筛选；发酵；分离纯化；优化；理化性质；纳豆枯草芽孢 杆菌 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 s c r e e n i n g s t r a i n s p r o d u c i n gh i g h n a t t o k i n a s e a c t i v i t y a n d c h a r a c t e r a z a t i o no fn a t t o k i n a s e a b s t r a c t n a t t o k i n a s e 呷pw a saf i b r i n o l y t i ce n z y m et h a tw a se x t r a c t e df r o mat r a d i t i o n a l f e r m e n t e df o o do fj a p a n n kw a sas e r i n ee n z y m ep r o d u c e df r o mb a c i l l u ss u b 矗l i s n a t t o i tw a sr e p o r t e dt h a tn kh a ds 仃o n gt h r o m b a s t i cf u n c t i o n c o m p a r e dw i t ht h e t h r o m b o l y t i em e d i c i n e ss u c ha su r o k i n a s ea n ds t r e p t o k i n a s e n kw a ss a f e r , e a s i e rt o b ea b s o r b e db yb o d yb e c a u s eo fi t sl o wm o l e c u l a rw e i g h t , a n di th a dm m ed i r e c ta n d m o r ep e r s i s t e n te f f e c to nt h r o m b o s i s a n di tw a sm o r ei m p o r t a n tt h a tn kc o u l db e o b t a i n e d b yf e r m e n t a t i o n w i t ht h ee f f e c to fb a c t e r i a , w h i c hw o u l dl o w e rt h e p r o d u c t i o nc o s t c o n s e q u e n t l y , m a n ys c i e n t i s t sb e l i e v e dt h a tn k c o u l db cu s e da sa n e w f i b r i n o l y t i cm e d i c i n e b s n - 3s t r a i nb e l o n g i n gt ob a c i l l u ss u b t i l i ao 垃砌) 、“t hh i g hn ka c t i v i t yw a s s c r e e n e dt h r o u g ht h eu v - i n d u c e dm u t a t i o n , f i b r i n o g e np l a t ea n ds h a k e f l a s kl i q u i d f e r m e n t a t i o ni nt h ep a p e r - i n t e n s i v es t u d i e so nt h ep u 6 f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f n kw e r ec o n d u c t e di nt h i st h e s i s i tw a s4m i n i t e st oi n d u c e8 p o r e so nt h eb a s eo fs p o r ef a t a l i t yr a t e o nt h eb a s eo f c o m p a r i s i o no fr e s u l t sf r o mf i b r i n o g e np l a t ea n dc a s i np l a t e ，i tw a si n d i c a t e dt h a t r e s u l t sf r o mc a s i np l a t ew a sn o tc r e d m l e t h eo p t i m i z a t i o no fn kl i q u i df e r m e n t a t i o nw a si n v e s t i g a t e dt h r o u g hs i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t sa n do r t h o g o n a lt e s t si nt h i sp a p e r t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e o p t i m a lf e r m e n t a t i o nm e d i u mw a st r y p t o n e6 9 n , x y l o s e3 0 9 儿k 2 1 - 1 p 0 4 3 h 2 01 9 几 m g s 0 4 7 h 2 00 2 ：e l , t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o n t i m ew a s7 2 h , t h e o p t i m a l f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ew a s3 0 c ，t h eo p t i m a lp hw a s8 0 u s i n gt h i so p t i m i z a t i o n , e n z y m ea c t i v i t yo fs t r a i nb s n - 3c o u l dr e a c h1 1 2 0 1 u m l n kp r o d u c t i o nk i n e t i c sw a ss t u d i e dt h r o u g hs t u d y i n gt h er e l a t i o nb e t w e e nt h e g r o w t hc u l n eo fs t r a i nb s n - 3a n dt h et i m eo fp r o d u c t i o nn k t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a t 壹主垫里塑堕堕堡竺堕堡垦基堕兰堡堕塑! 塞 t h et y p eo fn - ks y n t h e s i z i n gw a sl a gs y n t h e s i z i n g t h ec u l t u r el i q u i dw a sc e n t r i f u g a l i z e da t4 8 0 0 f r a i nf o r1 0r a i n ，t h e na m m o m u m s u f f a t ew a sa d d e di n t ot h es u p e r n a t a n tt oaf i n a lc o n c e n t r a t i o no f4 5 t op r e c i p i t a t e t h eo t h e r s a f t e rc e n t r i f u g a t i o n ，a m m o n i u ms u l f a t ew a si n e a s e dt o5 0 t og e tn k t h ea “5 2w a su s e dt op u r i f yn k e n z y m er e c o v e r yw a s3 9 d u r i n gp u r i f i c a t i o n a n de n z y m ef o l dw a s1 0 3 t h ef i b r i n o l y s i sa c t i v i t yo fn kw a sd e t e r m i n e da n dc h a m d c 功盟t i o no fn k w a s a n a l y z e di nt h et h r o m b o l 灿e x p e r i m e n ti nv i t r o r e s u l t si n d j c a t e d ： n ki n l i q u i d w a sn o ts e n s i t i v et ot e m p e r a t u r eb e l o w5 0 1 2a n dc o u l db e c o n s e r v e da tr o o mt e m p r e t u r e n kw a ss t a b l ew h e np hw a sb e t w e e n3 0a n d1 1 0 呦o fd 询h e mi o n so nn ks t a b i l i t yw a sv a r i o u s z n 2 + a n dh 9 2 + c o u l dc d u l p l e , s s n ka c t i v i t v c u 2 + i nl o wc o n c e n t r a t i o nc o u l dn o ts u r p r e s sn ka c t i v i t y , b u tc u z + i n h i g hc o n c e n t r a t i o nc o u l ds u r p r e s sn ka c t i v i t y e f f e c to fd i f f e r e n tm a t e r i a l so nn ks t a b i l i t yw a sv a r i o u sw h e nn k w a sh e a t e d i t w a sf o u n dg l u t i ni n3 c o n c e n u a t i o np r o t e c t e dn k b e s t t h ep r e s e n ts t u d yp r o v i d e db a s i ci n f o r m a t i o nf o rt h ep r o d u c t i o no fn k i ta l s o c o n t r i b u t e dt ot h ep r e s e r v a t i o na n dt r a n s p o r t a t i o no fn i cn k w a sp r o v e dt ob ea p o t e n t i a ld r u gc a n d i d a t ef o r t h et z e a t m e n ta n dp r e v e n t i o no ft h r o m b u s k e yw o r d s ：n a t t o k i n a s e ；s c r e e n ；f e r m e n t a t i o n ；p u r i f i c a t i o n ；o p t i m i z a t i o n ； 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 缩略语表 v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特另4 加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料，指导教师对 此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究蝴：孱功保 帆z 呷年f 月7 甘 槲张冷彬渖签2 啷毳畦 鼽刖1 日撕鼽砷幽7 日 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 第一章文献综述 血液中存在相互拮抗的凝血系统和纤溶系统，两者保持着动态平衡。当心血管 内膜损伤，血流缓慢以及血液凝固性增高就可打破这种平衡，发生凝血过程，导致 血液在心血管腔内凝固，形成血栓( 魏民，1 9 9 9 ) 。 血栓疾病是一类严重危害人类健康和生命的疾病，包括心血栓、脑血栓、肺栓 塞和末梢动静脉血栓等常见疾病。其中静脉血栓发生率每年为0 1 - 0 3 ( w w w w h o i n t c h p w r i g h t _ c c n l r e s c n ) 。根据w h o 的报告，动脉粥样硬化血栓性疾病 居全球总死亡率的第一位，达到2 8 7 。我国的心肌梗死和脑卒的年发病率分别为 1 0 9 1 0 万人和( 1 2 0 - 1 8 0 ) 1 0 万人。深静脉血栓( d e e pv 锄惦t h r o m b o s i s ，d v t ) q a 8 0 无 临床表现，5 0 以上的肺栓塞( p u l m o n a r yt h r o m b o e m b o l i s m ，r e ) 无明显临床症状。静 脉血栓栓塞( v e n o u st h r o m b o e m b o l i s m ，v t e ) 后的高危患者广泛分布在各个学科0 血管内外科、骨科、肿瘤科、妇产科、外科) ；p e 缺乏特异的i 临床表现，大面积p e 可以卒死为临床表现形式；p e 和d v t 的误诊率极高；影响心房颤动患者预后的主要 因素是血栓栓塞，尤其是脑栓塞并发症( 胡大一，2 0 0 4 ) 。因此世界各国都致力于研 究开发治疗血栓性疾病的药物。 1 1 溶栓剂 国内外常用的溶栓剂主要有以下几种，见表1 1 ( 韩启德和文允镒，1 9 9 7 ) 。 表1 1常用溶栓剂的特点 t a b l e1 1c h a r a c t e r i s t i co ff l b r i n o l y t i ca g e n t sc o m m o n l yu s e d 注：s k 链激酶，i r k 屎激酶，a p s a c 酰化纤溶酶原s k 复合物，f r o - u k 尿激酶原，t - p a 组织型纤溶酶原激 活因子 ( 1 ) 链激酶( s t r c p t o k i n a s e ，s k ) 是一种由c 组p 一溶血链球菌产生的外源性激活 因子，分子量为4 7 k d 。链激酶首先和纤溶酶原结合形成一个激活因子复合物，该复 高产纳豆激酶菌株的筛选及其酶学性质的研究 合物再催化循环中的纤溶酶原而溶解血栓。s k 具有抗原性和致热源性( c o l l e ne ta l ， 1 9 9 4 ) ( 2 ) 尿激酶( u l o k i n a s e ，u k ) 由人肾小管细胞产生，可从尿中提供，分子量为 3 4 k d 。它的基因已被克隆，通过基因工程可生产重组u k 。u k 可直接催化纤溶酶原 生成纤溶酶。u k 无抗原性，u l 【和s k 不仅能激活凝血块表面的纤溶酶原，溶解血栓， 而且可以激活循环中的纤溶酶原，溶解血中的凝血因子v 、凝血酶原、纤维蛋 白原，从而产生全身性纤溶状态( s t u m pe ta 1 。1 9 8 6 ) 。 ( 3 ) 酰化纤溶酶原s k 复合物( a n i s o y l a t e dp l a s m i n o g e ns t r e p t o k i n a s ea c t i v a t o r c o m p l e x ，a p s a c ) 是用现代生物工程技术，将s k 和纤溶酶原结合在一起。再被 乙酰化而成。a p s a c 不易被循环中的酶所降解，当它与纤维蛋白结合，发生去乙酰 化，成为有活性的酶激活剂，使纤溶酶原激活成纤溶酶，其作用约为s k 的1 0 倍( l i a n dc o l l e n ，1 9 9 1 ) ( 4 ) 尿激酶原( p r o - u k ) 可经d n a 重组技术制得，也是一种相对血凝块选择性 溶栓剂，在无凝块时，对内源性纤溶系统无影响。有凝块时，由于凝块部位在正常 情况下会产生小量纤溶酶，这些纤溶酶足以把p r o u k 转变成u k ，后者促进凝块局部 产生更多的纤溶酶，使凝块溶解( s t u m pe ta 1 ，1 9 8 6 ) 。 ( 5 ) 组织型纤溶酶原激活因子( t i s s u e - t y p ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r , t - p a ) 是一种 新的溶栓剂。分子量5 6 k d ，有单链t 晰口双链t - p a 两种，目前常用的是重组单链t p a 。 t - p a 是d 然血凝块选择性纤溶酶原激活因子，不易和循环中纤溶酶原结合。而对纤维 蛋白有较高亲和力。它能和血凝块表面的纤维蛋白结合成t 队纤维蛋白复合物，此 复合物容易和纤溶酶原结合，在凝块表面使纤溶酶原激活成纤溶酶，进而溶解血凝 块( 【j a n d c o l l e n ，1 9 9 1 ) 。因为它不激活循环中的纤溶酶原，而且凝块表面形成的 纤溶酶进入循环可被血中的a 2 抗纤溶酶迅速灭活，而不产生全身性纤溶状态。 ( 6 ) 蛇毒制剂安克洛酶为马来西亚蛇毒中分离的蛋白水解酶，可降低血液 纤维蛋白原使血液趋于低凝状态。本药有弱抗原性，一般连续给药3 周，继续给药可 能发生免疫反应。我国自蛇毒中提取多种酶制剂。去纤酶和精制蝮蛇抗栓酶分别从 尖吻蝮蛇蛇毒和江浙蝮蛇蛇毒中提取。国内临床用于治疗血栓，由于缺乏统一的质 控标准，疗效也不一致( 韩启德和文允镒，1 9 9 7 ) 。 这些药物在防治心脑血管栓塞性疾病方面发挥了重要的作用，并产生了显著的经 济效益。但是，现有溶栓剂有明显的缺陷，归纳为以下4 个方面( 王柏生和孙玲，2 0 0 2 ) ： 2 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 ( 1 ) 出血出血是溶栓剂最常见的并发症。目前临床常用的溶栓剂，包括对纤维 蛋白有选择性的t - p a ，在治疗剂量下均可引起出血，严重的颅内出血发生率约为 o 5 ，全身性出血发生率5 ，经心导管冠状动脉内给药高达1 0 以上。 ( 2 洫管再闭塞a j v i i 患者经溶栓治疗冠状动脉再通后，由于再形成血栓而堵塞 血管，发生率为5 - 3 0 。 ( 3 1 过敏反应多见于s k 治疗者。 ( 4 ) 溶栓无效单用或并用溶栓药，包括新型溶栓t - p a ，仍有2 5 的患者无效。 因此，开发新型的抗血栓药物成为当前重要研究课题之一。目前在纳豆激酶 ( a a t t q ，n 目的研究中发现，可以弥补以上这些缺陷。 最初是从日本传k i a a s e n kn k 统食品纳豆中提取出来的具有溶解血栓的一种酶类，因其与尿激酶、链激酶等溶血 栓药物具有相同的功能，故被命名为n k ，但从其性质和结构上来看，应属于蛋白 酶类。比之现用于临床的溶血栓药物，n k 具有安全性好，作用迅速且持续时间长， 可由纳豆菌发酵生产而造价低廉以及口服易吸收等特点“寸利和杨志兴，1 9 9 5 ；董明 盛等，2 0 0 1 ) 。因此，国内外学者认为n k 极有可能成为新一代抗血栓药物( 须见洋 行，1 9 9 1 ；f u t i j a ，1 9 9 5 ) 。在日本作为血栓溶解剂的n k 年总销售额达1 0 0 亿日元， 可见其在医疗保健上的重要地位( 徐仲等，1 9 9 8 ) 。 1 2 纳豆激酶的研究进展 纳豆是日本传统的大豆发酵食品。新鲜的纳豆色泽金黄，口感酥软，用筷子挑 起时。有很长很长的丝状黏液物质。纳豆中含多种有益物质。纳豆中含大量的v k i 纳豆中还含有超氧化物歧化酶( s o d ) 和过氧化氢酶等，是人体氧自由基的清除剂， 起到防癌、抗癌、延缓衰老的作用；纳豆有很强的抑菌作用，纳豆祜液中含有吡啶 二羧酸对痢疾志贺氏菌、大肠杆菌o ：h 1 5 7 、伤寒沙门氏菌等均有强烈的杀菌功效 ( 徐速和梁金钟，2 0 0 4 ) 。 1 9 0 5 年，日本学者尺村发现纳豆中的枯草杆菌( b a c i l l u s s u b t i l e ) 有使纳豆拉丝的 独特特性，提出将其单独作为一“种”，命名为纳豆芽孢杆菌( b a c i l l u s n a t t o s a w a m u r a ) ， 后被h o s o i ( 2 0 0 0 ) 命名为b a c i l l u ss u b f i l i s 研口抛) 。但s m i t h 等研究纳豆芽孢杆菌的生 理生化特征后，认为其生理学性质及其它性质与枯草杆菌相同，目前国际上还未把 纳豆芽孢杆菌列为独立的菌种，但习惯上仍称之为纳豆杆菌( 宋永生等，2 0 0 4 ) 。生 产纳豆的原始菌株为枯草芽孢杆菌，传统制作方法是用经热处理消毒的稻草提供以 高产纳豆激酶菌株的筛选及其酶学性质的研究 枯草芽孢杆菌为主的混合菌种进行自然发酵生产，现在多用纯种法进行生产( 陈波 等，2 0 0 2 ) 。纳豆的工业化制造工艺f 鞠洪荣，2 0 0 0 ) ：大豆原料一洗净一浸泡一蒸煮 一按种纳豆菌一装盒一发酵一熟成一制成品。 1 2 1 纳豆激酶的发现 1 9 8 0 年须见洋行教授( d ls u m j ) 在芝加哥大学时把纳豆放了- - d 部分在人工血 栓( 纤维蛋白) 平板上，发现纳豆逐渐溶解了血栓。1 9 8 6 年d r s u m i 首次在日本农业 化学协会中报告了他的这一发现( w w b u y n a n 嘣n a s e ，c o m ) 。 1 9 8 7 年须见洋行教授进一步研究，发现在纳豆的发酵过程中，纳豆芽孢杆菌会 产生一种丝氨酸蛋白酶，经过纯化后测定其等电点为8 6 0 3 ，分子量为2 7 ，7 2 8 d ， 由2 7 5 个氨基酸构成单链结构蛋自质，具有很强的血纤维蛋白溶解能力，其溶解血 栓能力可能超过当时己知的溶血栓药物，d r s u m i 将纳豆与尿激酶二者名称加以结 合，把相应的纤溶酶命名为n 】“须见洋行，1 9 9 1 ) 。n k 在酶分类学上称枯草杆菌素 n a t ( s u b t i l i s i nn 竭或枯草杆菌素b s p ( s u b t i l i s i nb s p ) ( t e t s u m e i ，2 0 0 1 ) 。 1 2 2 纳豆激酶的纯化制备 目前n k 的纯化制备有多种方法，大部分方法的共同点在于采取硫酸铵分步盐 析纳豆芽孢杆菌发酵液离心后的上清，不同点在于采用的硫酸铵浓度不同，以及层 析时所用的层析材料不同。不同研究人员分离纯化n k 的方法见表1 2 。 4 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 表1 2 分离纯化n k 的方法 t a b l e1 2m e t h o d so fp u r 晦i n gn k 从表1 2 可以看出：朱健辉等提纯步骤较少，酶回收率和提纯倍数均较高，所 用层析材料也不贵，是纯化n k 比较好的方法。熊晓辉等提纯步骤少，酶回收率和 提纯倍数均较高，但所用的层析材料是昂贵的疏水材料。高大海等提纯步骤较少， 酶回收率和提纯倍数均较高，但用到昂贵的分离纯化系统a k t a e x p l o r e r1 0 0 。范强 等提纯步骤多，分离时间长。白震等提纯方法的酶回收率和提纯倍数均较高，但步 骤复杂，所用层析材料也较多，并用到了昂贵的疏水材料。h u 等的提纯方法与传统 方法相比，过程缩短8 一l o h ，得率提高5 0 ，但所用仪器较贵。y a n g 等用表面联有 对氨基苯的磁性多聚甲基丙烯酸甲酯直接从纳豆芽孢杆菌发酵液中纯化n k ，纯化 过程只用4 0 m i n ，纯化倍数为8 7 ，得率达8 5 ，与传统方法相比，该纯化过程大大 高产纳豆激酶菌株的筛选及其酶学性质的研究 缩短，是一种很好的分离方法。 1 2 3 纳豆激酶的一级结构f 郝淑凤等，2 0 0 2 ) 1 9 9 3 年须见洋行等用反向h p l c 层析法分离出n k 并测定了它的氨基酸序列， 发现n k 由2 7 5 个氨基酸组成，呈单链结构，无二硫键。与根据n a d a m u r a 等测定的 核苷酸序列推导出的氨基酸序列完全一致。其氨基酸序列如图1 1 所示。 1 0 2 03 04 05 0 a q s v p y g i s q ( a p a i h s o g y t g s n 、礓a 硝v s g m s s h p d i n v l i g g a s f 6 0 7 09 01 0 0 v p s e t n p y q dg s s h g t h v a g t i a a l n n s i gv i 以v a p s a s l y a v k v l d s t g 1 1 01 2 01 3 01 4 01 5 0 s g q y s w i i n gi e w a i s n n m dv i n m s i f p tg s t a l k t v v dk a v s s c i v v a 1 6 01 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 a a a g n e g s s gs t s t v g y p a k y p s t i a v g a vn s s n q r a s f ss v g s e l k v m a 2 1 02 2 02 3 0 2 4 02 5 0 p g v s i q s t u g g t y g a y n g ts m a t p i t v a g aa a l i l s k h p tw t n a q v r d r l 2 6 02 7 0 e s l = f t y ig n sf y y g k g l i n w0 a a a 0 图1 1n k 的氨基酸序列 f i g 1 1a l n m oa c i ds e q u e n c eo f n k 1 2 4 纳豆激酶的三级结构( z h e n g e ta 1 ，2 0 0 5 ) n k 的活性部分在a s p 3 2 、h i s 甜和s e r 2 2 1 ，与底物结合部位在s e r l 2 5 ，l e u l 2 6 ，g l y l 2 7 处 n k 和枯草杆菌蛋白酶b p n ( s u b t i l i s i n b p n ，s b ) ，枯草杆菌蛋白酶c a n s b e 唱( s u b t i l i s i n c a r l s b e r g ，s c ) ，枯草杆菌蛋白酶e ( s u b t i l i s i ne ，s e ) ，枯草杆菌蛋白酶s a v i n 瓶e ( s u b t i l i s i n s a v i n a s e ，s s ) 篚j 功能相似，序列相似性分别为8 4 9 ，6 7 8 ，9 8 9 和6 2 9 2 ，并且 它们催化域的相似性达9 9 。z h e n g 等以已知的s b ，s c ，s e ，s s 的三维结构为模板， 通过计算机程序模拟出了n k 与h d v l k - p n a ( s u b i ) 结合的三维结构，见图1 2 。 6 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 虱1 2 用a u t o d o c k 3 0 5 模拟h d v l k - p n a ( s u b l ) 结合到n k 的活性中心 h g 1 , 2s u b l d o d 卿! t o a c t i v e c e n t e r o f n k ( m o d d c l ) u s i n g a u t o d o c l o 0 5 1 2 5 纳豆激酶的基因结构 n a k a m u r a ( 1 蚴对一株纳豆芽孢杆菌b a c i l l u sn a t t on c 2 - 1 中的n k 基因进行了 研究，报道了包括调控顺序在内的n k 全基因序列。n k 基因以g t g 为起始密码子， 随后是1 1 4 3 b p 组成的阅读框，编码信号肽、前肽、成熟肽在内的共3 8 1 个氮基酸。 结构基因的3 味端为连续的三个终止密码子t a a 、t a g 、t a a 。终止密码子之后一 段序列可形成茎环结构，即p 因子非依赖性终止顺序。起始密码子上游- 1 7 b p 处为核 糖体结合位点a a a g g a g 。s d 序列上游是一a ：t 含量高达7 2 的转录调控区域。 但在此区域尚未找到与己知枯草杆菌启动子相类似的保守序列。n k 的基因结构可 参见n c b i 网站( w w w n c b i n l m n i h g o v ) 。 1 2 6 纳豆激酶的溶栓机制 1 2 6 1 纤溶系统( 姚泰，2 0 0 0 ；韩启德和文允镒，1 9 9 7 ) 人体血液系统中有纤维蛋白溶解系统( 简称纤溶系统) 。纤溶系统包括纤维蛋白 溶酶原( p l a s m i n o g e n ，简称纤溶酶原，或血浆素原) 、纤溶酶( p l a s m i n ，又称血浆 素) 、纤溶酶原激活物与纤溶抑制物。纤维蛋白溶解的基本过程分为两个阶段，既纤 溶酶原的激活与纤维蛋白的降解，该系统各种成分间的作用可概括为图1 3 。 7 高产纳豆激酶菌株的筛选及其酶学性质的研究 内皮细胞 占 激肽释放肽 卜a 删物 t p au - p a ：= 2 2 2 2 3 尿激酶原 j 卜p a l 1 呻l 占占 纤溶酶原2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 = 2 2 2 2 = = = = 2 一纤溶酶 i4 一a 2 抗纤溶酶 l4 _ 一0 2 巨球蛋白 寺 纤维蛋白( 原) c = = = ： 纤维蛋白降解 图1 3 纤溶系统 1 j矾b r i o i y t i cf f s n m 注：一 催化作用亡= = = = = = ： 变化的方向c 抑制作用 t p 组织纤溶酶原激活物n 帕犀激酶型纤溶酶原澈活物p m - 1 t 纤溶酶原澈活物抑制剂1 1 2 6 2 纳豆激酶的溶栓机制 ( 1 ) 纳豆激酶的直接溶栓作用 n k 为一种丝氨酸蛋白酶，具有水解纤维蛋白的作用。n k 具有严格的限制性酶 切位点，其主要酶切位点在k 杜- t y r 之间，其次在s e t - h i s 位点间，较微弱水解g l u h i s 和h i s k u 位点( 须见洋行，1 9 9 1 ) 。因此n k 可直接作用于交联纤维蛋白血栓的上 述氨基酸位点使纤维蛋白水解成可溶性的小分子，达到溶解血栓的目的。 ( 2 ) 纳豆激酶刺激血管内皮细胞产生t p a t - p a 可激活体内的纤溶酶原，形成纤溶酶，纤溶酶可将已形成纤维蛋白栓子溶 解。同时t - p a 的活性又受到p a i - 1 的抑制，借以调控纤溶酶的作用，保证体内纤溶系 统的正常机能。t - p a 在体内是由血管内皮细胞产生并分泌到血液中，其半衰期极短， 仅为和8 m i n ( 须见洋行，1 9 9 1 ) 。当人口服n k 之后，定时取血，用e u s a 检测法 ( y o s h i k a z u ，1 9 9 4 ) 测定不同时间内，血液中t - p a 含量的变化。测定结果表明，血 液中t p a 含量随着时间变化而发生从低到高，然后从高至低的变化。由此可见，口 服n k 可刺激血管内皮细胞产生内源t p a ，增加t p a 含量，由t p a 激活纤溶酶原转变 成新的纤溶酶，溶解血栓，起到溶栓治疗作用。 8 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 ( 3 ) 纳豆激酶催化尿激酶原转变成尿激酶的作用 须见洋行( 1 9 9 6 ) 等研究发现，n k 可激活体内尿激酶原转变为尿激酶，尿激酶是 溶栓剂，普遍用于各种血栓病治疗中。尿激酶也是一种纤溶酶原激活剂，激活纤溶酶原 转变为纤溶酶，从而增加内源纤溶酶，增加体内溶栓作用。 ( 4 ) 纳豆激酶通过降解p a i 1 调节溶栓作用 日本学者u r o n o ( 2 0 0 1 ) 等发珊n k 在体外具有降解p a i 1 的作用。p a l 1 是体内 调控纤溶系统平衡的主要因子。它通过降解i - p a 来调节体内纤溶酶原被激活为纤溶 酶的作用。n k 降解和失活p a l - 1 的功能，可以调控p a l 一1 ，t - p j 岈口纤溶酶与纤维蛋白的 平衡关系，改变体内的溶栓作用。 1 2 7 纳豆激酶酶活的测定 1 2 7 1f l i o n 酚法 f l i o n 酚法系依据经典的测定枯草芽孢杆菌蛋白酶活性方法建立。原理是在一定 温度和p h 条件下，蛋白酶水解酪蛋白底物，产生含有酚基的氨基酸( 如酪氨酸、色 氨酸等) ，在碱性条件下，f l i o n 酚试剂极不稳定，易被酚类化合物还原成钼蓝与钨 蓝，根据蓝色的深浅测定6 8 0 h m 处的吸光度可以推断酶活性的大小。用标准的不同 梯度浓度的酪氨酸溶液作标准曲线。蛋白酶活性单位的定义是4 0 ，p h 7 5 的条件下。 l m i n 水解酪蛋白产生概酪蛋白所需的酶量为1 个酶活性单位，p a u g 表示。此法简单 易行，可同时测多个样品，成本低，但需严格控制酶解时间，且不能完全表示为纤 溶酶活性( 李晶，2 0 0 3 ) 。 1 2 7 2 纤维蛋白平板法 这是改进的a s t r u p ( 1 9 5 2 ) 方法，先制备纤维蛋白平板，然后将待测酶液和标 准尿激酶液滴于平板上，3 7 c 恒温放置1 8 h ，测其溶纤圈直径，以其乘积( 衄n 2 ) 表示 酶活或计算出相当于尿激酶活力的单位数( 向梅等，2 0 0 2 ) 。这是目前最常用的纤溶 酶溶栓活性测定方法，也是最早用于n k 溶栓活性测定方法之一( s u m i ，1 9 8 7 ) 。此 法简便易行，可同时测定多个样品。但由于溶解圈面积完全是表观值，受恒温孵育 时间影响很大。当恒温时间增加时，对应值会显著减少，因此，对恒温时间的控制 十分重要。与n k 精制产品相比，粗酶活性测定受孵育时间影响更大，这可能是受粗 酶中杂质的影响( 谢秋玲，2 0 0 0 ) 。 9 高产纳豆激酶菌株的筛选及其酶学性质的研究 1 2 7 3 纤维蛋白块溶解时间法( c l o tl y s i st i m e ，c l 0 测定标准品u k 不同活力单位对等量纤维蛋白的溶解时间，以活力单位溶解时间 作图，测出n k 的溶解时间后，即可从标准曲线中计算出相当于u k 的单位数( 宋磊等， 2 0 0 2 ) 。此法迅速快捷，分辨率较大，适于粗酶的活性测定，但由于需要精确判断反 应时间，所以不太适合灵敏度要求较高样品的活性测定，也不便于同时测定多个样 品( 谢秋玲，2 0 0 0 ) 。 1 2 7 4 四肽底物法 在四肽底物s u c - a l a - a l a - p r o p h e p n a 溶液中加入n k ，在3 7 c 水浴中温浴i m i n ， 测定单位时间1 勾4 1 0 n m 处光吸收的变化( 原敏夫，1 9 9 6 ) 。n k 的活性定义为；l m i n 水解四肽底物时生成功峭基苯胺的n k 量为1 u 。此法简便迅速，但不能完全反映其 纤溶活性，其纤溶活性与所测得的蛋白酶活性之间有无相关性有待进一步实验。 1 2 7 5 酶联免疫吸附法( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 将n k 特异性的单克隆抗体吸附在微孔板上，用b s a p b s 冲洗并封堵未被吸附的 部位，加入删品，使其与单克隆抗体结合，再加入连有过氧化氢酶的多克隆抗体 与h 结合。然后加入新配制的底物溶液和h 2 s 0 4 ，测定4 9 0 r i m 处吸光度( y o s h i k a z u ， 1 9 9 4 ) 。此法灵敏度很好，但操作复杂，成本高。 1 2 8 纳豆激酶的生物活性 在食用纳豆的人的血浆中观察到纤维蛋白溶解活性，其活性在进食2 - 8 h 后逐渐 提高( k u m a d a ，1 9 9 4 ) 在m 鲫臣用者的血中观察优球蛋白溶解时f 司( e u g l o b u l i nl y s i s t i m e ，e l t ) 、优球蛋白的纤溶活性( e u g l o b u l i nf l b r i n o l y f i ca c t i v i t y ，e f a ) 以及纤维蛋 白降解产物( 丘b r i d e g r a d a t i o np r o d u c t s ，f d p ) 的变化发现，e l t 大大降低，而e f a 提 高，且在口服后第4 d 达到最高，并可维持到第8 d ：同时f d p 在口服后第1 d 即迅速达 到最高值。可见n k 不仅作用迅速，而且维持时间长。在n k 口服后还发现，血中的 t - p a 量逐渐升高，在第4 d 达到最高，是末服用时的1 4 倍。表明n k 不仅自身具有溶血 栓作用，还可以促进组织内t p a 的合成，具有双重作用。n k 的药理试验发现，实验 组的狗在口服5 h 后，血栓完全溶解，而服用安慰剂的对照狗则无溶栓现象( 须见洋 行，1 9 9 1 ) 。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 2 9 纳豆激酶溶血栓的高效安全性 s u m i ( 1 9 9 9 泼表了对小鼠进行大剂量喂服n k 的毒性研究报告，结果并未发现畸 变现象；日本上千年食用纳豆的历史也说明了n k 的安全性。动物血栓模型研究表明， 等摩尔的n k 和纤溶酶的血管再通率分别为6 2 0 与1 5 8 ，即n k 的纤溶活性是纤溶 酶的4 倍f f u j i t a ，1 9 9 5 ) 。而n k 的纤维蛋白原水解活性却远低于纤溶酶和尿激酶，与 t p a 基本相同。这提示n 在发挥纤溶作用时，不易引起出血倾向。 1 2 1 0 高产纳豆激酶菌株的筛选及液体发酵研究 生产n k 的传统方式是固体发酵，但因产率低、劳动强度大等缺点，己被逐渐淘 汰。现在普遍采用的是液体发酵，尤其在菌种筛选和液体发酵条件的优化等方面国 内