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产有机磷农药降解酶菌株的筛选及酶学性质研究 摘要 本论文以受农药污染的土壤为实验材料，以敌敌畏为唯一碳源，经过富 集培养、驯化、分离和纯化，筛选出七株产胞内有机磷农药降解酶的菌株， 其中编号为o p d 7 的菌株的酶活力最高。对o p d 7 菌株的发酵产酶条件进 行研究，得到的最佳培养基配方为：1 5 葡萄糖，1 多6 蛋白胨，0 2 m g s 0 4 7 h 2 0 ，0 5 0 6 0 k h 2 p 0 4 ，0 5 n a 2 h p 0 4 ，p h7 0 ；最佳产酶条件为： 接种量1 ，培养温度3 7 6 c ，摇床转速1 8 0 r p m ，摇瓶装液量l o o m l ( 2 5 0 m l 三角瓶) 。在此优化条件下培养2 4 h ，该菌产生的有机磷农药降解酶酶活力 为2 3 8 u m l ，是未优化前的1 2 倍。 对o p d 7 菌株所产的有机磷农药降解酶的酶学性质进行了研究，结果表 明：该酶的酶促反应的最适温度为4 2 c ，最适p h 值为7 0 ，p h 稳定范围 为6 - 8 ，在低于4 7 时稳定； m g “、b a “、m n 2 + 对该酶有激活作用， z n 2 + 、 c u 2 + 贝j l 有较强的抑制作用，对有机磷农药降解酶的专一性研究表明，o p d 7 菌株所产的酶不仅能降解敌敌畏，还能降解乐果、氧化乐果、乙酰甲胺磷、 甲胺磷。 蔬菜、瓜果类食品，由于虫害多，经常超量施药，造成农药残留超标 现象严重，用本研究所获得的有机磷农药降解酶来作用于受有机磷农药污 染的蔬菜，只需2 0 分钟即可分解蔬菜表面9 8 以上的有机磷农药残留。 关键词：敌敌畏有机磷农药降解酶筛选发酵条件酶学性质 s c r e e n i n go fp r o d u c i n go r g a n o p h o s p h o r u s h y d r o l a s es t r a i n sa n dc i l 姒c t e r i z a ! n o no ft h e e n z y m e i th a sb e e nk n o w nt h a t o r g a n o p h o p h a t e c a nb ed e g r a d e d b y s o m e m i c r o o r g a n i s m s b yu s i n g d i c h l o v o sa st h es o l ec a r b o ns o u r o = ，7 o r g a n o p h o p h a t e - - d e g r a d i n gs t r a i n sw e r ei s o l a t e d f r o mt h ep e s t i c i d e p o l l u t e d s o i l ，a n do n eo fw h i c h ( s t r a i no p d 7 ，e n z y m ea c t i v i t yi s1 9 6 u m 1 ) w a ss e l e c t e d f o rf u r t h e r s t u d y , t h eo p t i m a l f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o r p r o d u c i n g o r g a n o p h o s p h o r u sh y d r o l a s eb ys t r a i no p d 7w e r ed e t e r m i n e d t h eo p t i m a l c o m p o s i t i o no ff e r m e n t a t i o nm e d i u mi sa sf o l l o w ：g l u c o s e1 ，5 ，t r y p t o n e1 ， m g s 0 4 7 h 2 00 2 ，k h 2 p 0 4o 5 ，n a 2 h p 0 40 5 ，p h 7 0 t h eo p t i m a lv o l u m e o fi n o c a x l u mi sl ，c u l t i v a t i o nt e m p e r a t u r ei s3 7 4 c ，a n dt h eo p t i m a ls h a k i n g s p e e di s1 8 0 r p mw h e n2 5 0 m lf l a s kc o n t a i n sl o o m lm e d i u m u n d e rt h e s e c o n d i t i o n sf o r2 4 h ，t h ea c t i v i t yo fo r g a n o p h o s p h o r u sh y d r o l a s er e a c h2 3 8u m l j u s t1 2f o l da sb e f o r e t h ec h a r a c t e r i z a t i o no ft h eo r g a n o p h o s p h o r u sh y d r o l a s ef r o mo p d 7w a s s d u d i e d i tw a sf o u n dt h a tt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ea n dp hf o rt h ee m z y m e a c t i v i t yw a s4 2 ca n dp h7 0r e s p e c t i v e l y t h ee n z y m ew a ss t a b l ew i t h i np h6 - 8 a n du pt o4 7 0 ca tp h7 0 s o m em e t a li o n sl i k em 9 2 + , b a 2 + m n “h a v ep o s i t i v e e f f e c to nt h ee n z y m e ，w h i l eo t h e rm e t a li o n s ，s u c ha sz n 2 + ，c u 2 + ，s l i g h t l yi n h i b i t t h e e n z y m e t h ee n z y m ec a nn o to n l y d e g r a d ed i c h l o r v o s ，b u t a l s o a c e p h a t e ，m e t h a m i d o p h o s ，d i m e t h o a t ea n do m e t h o a t e i no r d e rt op r o t e c tc r o p sf r o mi n s e c t s ，p e s t i c i d e sh a v eb e e n u s i n gi nf r u i t s a n dv e g e t a b l e s ，a sar e s u l t ，t h er e s i d u a ll e v e l so fp e s t i c i d e so nm a n yf r u i t sa n d v e g e t a b l e sa r ev e r yh i g h 。t h ep e s t i c i d e so nv e g e t a b l e sw e nd e g r a d e db yu s i n g t h ec r u d eo r g a n o p h o s p h o m sh y d r o l a s e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec r u d e o r g a n o p h o s p h o r u sh y d r o l a s e c o u l d e f f e c t i v e l yd e g r a d eo r g a n o p h o s p h o r u s p e s t i c i d e s k e y w o r d s ：d i c h l o r v o s ；o r g a n o p h o s p h o r u sh y d r o l a s e ；s c r e e n i n g ； f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ；c h a r a c t e r i z a t i o no fe n z y m e 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的 成果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位 发表或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发 表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研 究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：- 矿辞钣- 7年f 月z 莎日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务： 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注磷，并在解密后遵守此规定) 论文作者签钳罗啦伐导师签名：冲绷徊7 年月咖 广西大学硕士学位论文 产有机磷农药降解酶菌株的筛选及酶学性质研究 1 1 有机磷农药概述 第一章前言 农药是人类投放于自然界的一类数量大、毒性广的化学物质。长期以来，害虫防治 主要依赖于化学杀虫剂。但是，长期大面积使用化学农药引起的农药残留、害虫抗药性 增加、生态被破坏和环境被污染等问题日益严重。据统计，美国每年因施用化学农药造 成的直接和间接经济损失高达1 1 0 亿美元。我国化学农药的使用量是世界平均用量的 2 5 倍，其中高毒农药使用量约占使用总量的3 0 ，2 0 0 5 年我国的农药产量为1 0 0 万吨， 而有机磷农药占整个农药的6 0 1 1 j 。 在有机磷农药中8 0 以上是剧毒有机磷农药( 甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷、久 效磷、敌敌畏等) ，仅甲胺磷的使用量一年就高达6 5 万吨，其它大吨位的有机磷农药 还有乐果、氧化乐果和辛酸磷等。握国家环保局2 0 0 4 年发布的信息，农药残馨污染已 被列为环境污染重点治理的工程之列。虽然国家己出台有关措施限制甲胺磷、对硫磷、 甲基对硫磷、久效磷、磷胺等五种高毒有机磷农药的生产与销售，但是由于有机磷农药 的长期超量施用，致使耳兹有机磷农药的污染是农业生产环境中最严重的污染源之一， 因此有机磷农药残留污染的治理己成为环境污染治理工作的重中之重。在这种情况下， 如何有效地避免农药残留对环境及人类的损害已成为人类亟待解决的重要问题。 1 ，1 1 有机磷农药的性质 有机磷农药是含磷的有机化合物，毒性较大，它的种类十分繁多。现在世界上有机 磷农药的种类达几百种1 2 有机磷农药大多数属于酯类，含有三个磷酯键，所以常被称为 磷酸三酯，一般难溶于水( 乐果、敌百虫除外) ，易溶于有机溶剂，对动植物体内胆碱酯 酶的有很强的抑制作用，它也易受酶的作用而水解，一般有机磷被分为两种类型一种 是磷通过双键与氧结合( p = o ) ，如甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏等；另一种是磷通过双键 与硫结合( p - - s ) ，如对硫磷、甲基对硫磷、辛硫磷、水胺硫磷等【引。有研究表明，如果有 机磷中的一个磷酸酯键被水解将大大降低其毒性，以对硫磷为例，将使其毒性降低1 0 0 倍1 4 1 。因此，破坏有机磷的磷酯键是降低有机磷农药毒性行之有效的方法。 广西大学硕士学位论文产有机磷农药降解酶菌株的筛选及酶学性质研究 1 1 2 有机磷农药的发展概况 1 9 3 6 年，德国g s c h r a d e v 首先致力于合成有杀虫活性的有机磷化合物，他主要以 n ，n 一二烷基氨基磷酸基为原料，先后合成了八甲磷和特普，1 9 4 4 年合成了至今仍然 使用的优良杀虫剂对硫磷。对硫磷虽然对哺乳动物的毒性很高，但在防治害虫上的应用 十分广泛。美国氰胺公司于1 9 5 2 年发现了对哺乳动物低毒的杀虫剂马拉硫磷；1 9 5 1 年 德国拜尔公司合成了另一类具有内吸杀虫活性的内吸磷。此后二十多年间，对硫磷迅速 发展成为世界性药剂，甲基对硫磷、苯硫磷、敌百虫、氯硫磷等一系列有机磷杀虫剂相 继问世，这是有机磷农药的快速发展时期，后来又进一步开发出内吸性有机磷农药如乐 果、氧化乐果等。据统计，1 9 9 8 年世界农药的销售额由1 9 5 0 年的5 亿美元增加到3 1 0 多亿美元，近5 0 年增长了6 1 倍。2 0 0 1 年世界农药的销售额将为3 3 8 3 亿美元，其中除 草剂为1 6 0 1 亿美元，占4 7 3 2 ；杀虫剂为8 7 9 亿美元，占2 5 9 8 ；杀菌剂为5 9 8 亿 美元，占1 7 6 ；杀线虫剂、熏蒸剂为5 1 5 亿美元，占1 5 2 。1 9 9 6 年以后出现的抗虫 害作物、耐除草剂作物分别为6 3 亿美元和1 1 8 5 亿美元，占1 8 6 和3 4 2 ；化学农药 产业的发展对人类的生产和生活发挥了巨大作用。 1 1 3 有机磷农药在农业生产中的作用 农药是现代农业中防治病、虫、草害的有效的植保措施之一，具有见效快、使用简 便、经济等优点。据专家估计，在农药上每投资一元，可以得到数元或数十元的经济效 益，使用农药可以使病、虫、草、鼠的危害损失减少到当年总产量的三分之一左右嘲。 据联合国粮农组织的调查，全世界每年被病虫草害夺去的谷物收成占2 0 4 0 ，经济损 失达1 2 0 0 亿美元，全世界通过植物保护增加的粮食产量中，8 0 是依靠农药l “。在我国， 以1 9 9 5 年为例，当年通过农药防治，挽回粮食5 4 0 0 万吨，减少直接经济损失6 0 0 多亿 元，投入产出比为1 ：8 1 6 r l 。为我国以占世界7 的耕地面积养活着世界2 2 的人h ， 作出了巨大贡献。农药的作用如此显著，所以世界各国普遍利用农药来进行植物保护工 作。因此，2 1 世纪的农业仍离不开农药，农药在2 1 世纪将继续发展，据2 0 0 3 年统计， 以有机磷农药即甲胺磷、甲基对硫磷、乐果、马拉硫磷、敌百虫、敌敌畏、氧化乐果、 对硫磷、毒死蜂等为代表的农药，仍然占据我国农药的主导市场。 2 广西大学硕士学位论文 产有机磷农药降解酶菌株的筛选及酶学性质研究 1 1 4 有机磷农药的毒理机制 1 1 4 i 有机磷农药与乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 的反应 现在对有机磷农药的作用机理己经非常清列s , 9 l ：有机磷农药进入昆虫体内后，在神 经突触部位与a c l l e 发生了亲电磷酸化反应。首先，有机磷农药向a c h e 活性中心上的 丝氨酸羟基进攻，形成复合体；其次，复合体分解形成磷酰化胆碱酯酶，酶的活性受到 抑制；最后，磷酸化胆碱酯酶水解，释放出磷酸酯，胆碱酯酶活性恢复。由于最后一步 反应极其缓慢，事实上酶的活性极难恢复，造成乙酰胆碱在突触的大量积累，乙酰胆碱 是传递兴奋的物质，突触后膜受体将受到反复的激活作用，延长了动作电位在后膜上不 断的向下传导，从而干扰了昆虫神经冲动的正常传导。这种干扰作用诱导产生一种神经 毒素，最后导致昆虫的死亡。 有机磷农药除了能抑制a c h e 外，还能抑制其它酶系如神经毒性酯酶，目前己知许 多种有机磷农药如敌敌畏、敌百虫和甲胺磷等都曾先后报道引发规模不等的迟发性神经 毒性【1 m 1 3 】 1 1 4 2 有机磷农药与受体的作用 昆虫神经受体是许多杀虫剂的作用靶标，其中有a c h 受体、r 氨基丁酸受体等。a c h 受体又分为烟碱乙酰胆碱受体( n a c h r ) ，覃毒碱乙酰胆碱受体( m a c h r ) 乘i 覃毒酮样受体 三种【1 4 1 。a c h e 和n a c h r 都位于神经肌肉和脑部烟碱连接点的突触处，a c h e 受抑制后 影响n a c h r 的功能。有机磷化合物可直接抑制n a c h r 。研究有机磷化合物对n a c h r 离子通道结合的影响，发现s o m a b 和e c h o t h i o p h a t e 在微摩尔每升浓度下，作为激活剂可 诱导受体脱敏。当v x 作为该通道的一种强阻断剂时，可增强受体的脱敏作用。有机磷 化合物对m a c h r 的直接作用已通过抑制实验证实，m a c h r 可分为两个亚型，研究发 现m 2 亚型受体对有机磷化合物最敏感，m 2 受体对有机磷杀虫剂的亲和性要低于对神经 毒剂的亲和性。 1 1 5 有机磷农药对环境的影响 为了对付病虫害，降低经济损失，每年全世界要生产农药几百万吨。目前，世界有 机磷农业的商品已经达到了上百种。我国是一个农业大国，同时也是一个农药生产和使 用的大国，1 9 9 0 年己占世界第二位，约占世界总产量的十分之一，有机磷农药达到了 3 0 多种，包括杀虫剂、杀菌剂、除草剂，我国农药的生产量每年在1 0 0 万吨以上，其中 3 广西大学硕士学位论文产有机磷农药降解酶菌株的筛选及酶学性质研究 各种农药中杀虫剂是占首位的，杀虫剂中，有剧毒的有机磷农药占7 0 ，我们国家每年 使用的农药的面积是“亿亩次，一般情况下农药的有效利用率仅为2 0 3 0 ，大部分飘 浮在空气中或降落在地面，后者又大部分进入土壤、水体、生物体内，通过食物链形成 危害。水田中施用的农药几乎有9 0 左右都散落在农田，破坏土壤的微生物、使土壤的 土质结构发生变化，造成农业生产的减产，同时随着农药进入水源中又会污染水源，造 成生态平衡的破坏。总的来说，我国有机磷农药的危害有下列几点： 首先是危害人类健康，引发人畜中毒。国家统计局的资料表明，我国每年因化学农 药中毒致死的入数为7 0 0 0 1 0 0 0 0 人，1 9 9 5 年仅2 7 个省、市发生农药中毒事故4 8 3 7 7 起， 其中死亡3 2 2 4 0 人。据卫生部统计，1 9 9 9 年全国食物中毒4 9 9 9 人，其中死亡1 0 3 人； 每年发生畜禽中毒死亡的事件更是层出不穷，此起彼伏，司空见惯，无法统计。化学农 药己成为人畜一种新的“杀手”。 第二，农畜产品污染，残留严重超标。据农业部环保科研所2 0 0 4 年的调查，我国 农畜产品化学农药污染程度触目惊心。2 4 个省市自治区残留超标率高达1 8 5 ，超标产 品总量为6 5 0 万吨。污染超过国家卫生标准的蛋类占3 3 1 ，蔬菜类占2 2 1 5 ，水果类 占1 8 7 ，肉类占1 7 6 ，粮食类占1 7 4 ，奶类占6 2 。农业部农药检定所2 0 0 5 在 北京某大型农副产品批发市场的农药残留抽检中，抽查1 0 5 个样品，有8 个严重超标， 超标率7 6 ，其中一个大白菜样品中，高毒甲胺磷含量高达6 9 m g k g ，为国家标准的 7 0 0 倍。 第三，产品出口受阻，对外贸易不畅。农药残留超标还严重影响了农产品在国际市 场的竞争力，目前越来越多的农药残留限量标准正成为国际食品、农产品贸易的绿色壁 垒，在农产品贸易中起着重要影响作用【1 5 j 。中国农产品在国际市场上具有广阔的前景， 但常因农药残留超标被拒收，严重影响了中国农产品在国际市场的竞争力1 1 6 1 。2 0 0 1 年 以来出口日本的小白菜敌敌畏超标和冷冻菠菜毒死蝉超标等事件导致日本对中国蔬菜 入境检查更加严格，延长了通关时间，对保鲜和速冻蔬菜出口不利，经济损失巨大【堋。 受到欧盟、美国、日本相继实施农产品进口安全新规定，我国的农产品出口大幅下滑。 第四，病虫抗性增加，农药用期缩短。随着农药使用时间的延长、用药次数的重复 和增加，一个防治效果尚好的化学农药，几年以后，效果越来越差，需要不断加大剂量， 甚至加大剂量也无济于事。这就是病菌和害虫对这种农药产生抗性。据报道，对农药已 产生抗性的害虫，在2 0 世纪5 0 年代初不到1 0 种，而到9 0 年代末已经增加到5 2 0 种； 同时产生抗性的频率越来越高，时间越来越短。在五六十年代，一个农药使用8 - 9 年害 4 广西大学硕士学位论文产有机磷农药降解酶菌株的筛选及酶学性质研究 虫有抗药性，7 0 年代缩短到6 7 年，8 0 年代4 _ 5 年，而9 0 年代，只要2 - 3 年了。农药 使用寿命观显缩短了，必须开发新的农药品种，无疑增加了生产的成本秘企业的再投资， 对资源和能源都是一种浪费。另外5 0 种农作物，1 1 3 种杂草也对农药产生了极大抗药性。 此外，有机磷农药还大量杀伤了害虫的天敌，打击了非靶有益生物目标，破坏了生态平 衡，引起了害虫再度猖獗；污染了大气、水域、壤环境，产生了公害，与入的生存环 境不和谐，与自然不相容。 1 2 微生物治理法处理受有机磷农药污染的环境 有机磷农药消除方法有物理法，化学法和生物法。传统的物理方法( 包裹、焚烧和 掩埋) 和化学方法( 包括氧化、还原和水解) 成本高，可能产生新的污染物，且作用相对较 慢【“。 微生物治理方法又称为微生物恢复、微生物清除或微生物再生，是利用生物的生命 代谢活动减少环境中有毒有害物质的浓度或使其完全无害化，从而使污染的土壤环境能 部分地或完全地恢复到原始状态。它与微生物净化有一定的差别，微生物治理着重强调 人为控制条件下的生物利用，微生物净化着重于生态系统中生物的自发清除过程。 微生物对农药的作用方式微生物对农药的作用分为两类；一类是微生物直接作用于 农药，大多由酶促反应引起，也称为微生物的农药代谢；另一类是微生物的活动改变了 化学和物理环境而间接作用于农药。微生物对农药的降解作用主要是通过一系列水解方 式进行，由于大多数农药带有卤素、氨基、硝基及其他各种取代物等。这些取代基的种 类和数量往往会影响农药的微生物可降解性。微生物对农药的代谢有以下几种； ( 1 ) 矿化作用：矿化是有机化合物在环境中完全分解为无机产物，即彻底降解。 以供试农药为唯一碳源来培养微生物时可见到某种微生物群体的增长。而且这种增长与 培养液中农药降解的加快有明显的相关性。说明存在着矿化作用。由于矿化作用能使农 药彻底降解，避免产生对环境潜在威胁的中间产物，因而是农药生物降解的最理想的方 式【1 9 1 。 ( 2 ) 共代谢作用：共代谢是微生物以某种底物为碳源生长时，能同时代谢某些化 学物质，但这些微生物不能以这些化合物为碳源，它对这类物质的代谢只是部分改变其 结构，产生与母体相近似的中间产物，结果是农药的转化，并非完全降解。在自然条件 下，共代谢所产生的中间产物往往可被其它微生物种群或物理、化学因子所降解。共代 广西大学硕士学位论文产有机磷农药降解酶菌株的筛选及酶学性质研究 谢在农药的微生物代谢过程中十分常见，因而是微生物作用于农药的重要方式。 ( 4 ) 生物的浓缩或积累作用微生物菌体细胞通过吸附或吸收的过程积聚环境中的 残留农药，微生物菌体对农药的吸收最初是被动吸收，许多农药是亲脂的，很容易与细 胞膜的类脂结合，这一过程则与微生物代谢活动有关，而且农药在被吸收的过程中也可 能被转化。 有机磷农药可以为微生物提供磷或硫元素，也可以作为碳源以供微生物生长，目前 研究得最清楚的是对硫磷及对氧磷的水解过程。对硫磷无论作为碳源或磷源水解产物是 一样的，产生二乙基硫代磷酸酯和对硝基苯酚，在昆虫或其它高等动物体内，对硫磷迅 速被单氧化酶转化为其磷酸盐同系物对氧磷，农药毒性主要来自于对氧磷，对氧磷对人 也有毒，但毒性稍轻，因为人体内产生的酶可以水解芳香磷键。对硫磷对不同生物的相 对毒性取决于将对硫磷氧化为对氧磷和酯酶的水解作用之间的平衡。在细菌中这种氧化 反应只存在于少数代谢途径中。对硫磷或对氧磷水解产物进一步的代谢还未深入研究， k e r t e s z 等设想了水解产物的代澍途径，反应产生单酯，最终产生无机磷酸枯。 微生物治理方法有着物理治理方法和化学治理方法无可比拟的优越性。其优点主要 表现在以下几个方面： ( 1 ) 处理费用低。其处理成本只相当于物化方法的二分之一到三分之一； ( 2 ) 处理效果好，无毒、无残留，不会造成二次污染，不破坏植物生长所需要的土壤 环境； d b j l a b 3 0 8 4 4 1 1b a c i l l u sp u m i l u sg e n ef o r1 6 sr r n a ，p a r t i a ls e q u e n c e s t r a i n t u t l 3 4 6 l e n g t h = 1 5 1 0 s c o r e = 2 9 0 2b i t s ( 1 4 6 4 ) 。 e x p e c t = 0 0 i d e n t i t i e s = 1 4 6 4 1 4 6 4 ( 1 0 0 ) ，g a p s = 0 1 4 6 4 ( 0 9 6 ) s t r a n d = p l u s p l u s q u e r y5 s b j c t 2 6 q u e r y6 5 s b j c t8 6 q u e r y1 2 5 s b j c t1 4 6 q u e r y1 8 5 s b j c t2 0 6 a c g c t g g c g g c g t g c c t k 醚k c a t g e k g t c g a g c g g a c a g a a g g g a g c t t g c t c c c g g a6 4 | | | | | | | | | l | | | i | | | | | i | | i | i | i f | | a c g c t g g c g g c g t g c c t 从t a c a t g c 从g t c g a g c g g a c a g a a g g g a g c t t g c t c c c g g a8 5 t g t t a g c g g c g g a c g g g t g a g t 从c a c g t g g g t a a c c t g c c t g t 从g a c t g g g a t a a c t c1 2 4 | | | | | i | | l | l | i li | i1 1i i | l | | | i i1 | | | | 1i i i t g t t a g c g g c g g a c g g g t g a g t 从c a c g t g g g t a a c c t g c c t g t 从g a c t g g g a t 从c t c1 4 5 c g g g 从a c c g g a g c t a a t a c c g g a t a g t t c c t t g a a c c g c a t g g t t c a a g g a t g 从a g a c1 8 4 i l l i ii l f ll | | | j | | | | ll l | | | | i | c g g g a a a c c g g a g c t a a t a c c g g a t a g t t c c t t g a a c c g c a t g g t t c a a g g a t g a 从g a c2 0 5 g g t t t c g g c t g t c a c t t a c a g a t g g a c c c g c g g c g c a t t a g c t a g t t g g t g a g g t 从c g g2 4 4 l | f li | | | | | | | | | | | | | i i | l | | | i i | | | 6 6 t t t c g g c t g t c a c t t a c a g a t g g a c c c g c g g c g c a t t a g c t a g t t g g t g a g g t 从c g 62 6 5 广西大学硕士学位论文产有机磷农药降解酶菌株的筛选及酶学性质研究 q u e r y2 4 5c t c a c c a a g g c g a c g a t g c g t a g c c g a c c t g a g a g g g t g a t c g g c c a c a c t g g g a c t g a g3 0 4 | | l | i il | i f | i | i | li f | | | | | | | | j | | | | | | | | | i | i s b j c t 2 6 6c t c a c c a a g g c g a c g a t g c g t a g c c g a c c t g a g a g g g t g a t c g g c c a c a c t g g g a c t g a g3 2 5 q u e r y3 0 5a c a c g g c c c a g a c t c c t a c g g g a g g c a g c a g t a g g g 从t c t t c c g c 从t g g a c g a 从g t c3 6 4 i | i | l ii | | | | | l ii | | | | | | | | i | | i | | | | li ii i | ll | | ii i | | i1 1 | i l | 1 s b j c t3 2 6 a c a c g g c c c a g a c t c c t a c g g g a g g c a g c a g t a g g g 从t c t t c c g c 从t g g a c g a a a g t c3 8 5 q u e r y3 6 5t g a c g g a g c 从c g c c g c g t g a g t g a t g 从g g t t t 、t c 6 g a t c g t 从a g c t c t g t t g t t a g g4 2 4 | | | | | | f | | | | i | i | i | l | i l i | ii ji s b j c t3 8 6t g a c g g a g c 从c g c c g c g t g a g t g a t g a a g g t t t t c g g a t c g t a a a g c t c t g t t g t t a g g4 4 5 q u e r y4 2 5g a a g a a c 从g t g c a a g a g t 从c t g c t t g c a c c t t g a c g g t a c c t 从c c a g a a a g c c a c g g4 8 4 | | i i | | | i i | i i i1 1 | | | 1 1l f i | l | 1 s b j c t4 4 6g 从g 从c a a g t g c 从g a g t 从c t g c t t g c a c c t t g a c g g t a c c t 从c c a g a a a g c c a c g g5 0 5 q u e r y4 8 5c t 从c t a c g t g c c a g c a g c c g c g g t a a t a c g t a g g t g o c 从g c g t t g t c c g g a a t t a t t g5 4 4 | | | | i | s b j c t5 0 6c t a a c t a c g t g c c a g c a g c c g c g g t a a t a c g t a g g t g g c a a g c g t t g t c c g g a a t t a t t g5 6 5 q u e r y5 4 5g g c g t a a a g g g c t c g c a g g c g g t t t c t t a a g t c t g a t g t g a a a g c c c c c g g c t c a a c c g g6 0 4 | | i | j | | | | s b j c t5 6 6g g c g t a a a g g g c t c g c a g g c g g t t t c t t a a g t c t g a t g t g a a a g c c c c c g g c t c a a c c g g6 2 5 q u 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t t c g g g g a c a g a g t g a c1 0 2 4 | | | ii f | i i | l | | l | | | | | | l ll | | | | | | | | | i s b j c t9 8 6a g g t c t t g a c a t c c t c t g a c 从c c c t a g a g a t a g 删t c c c t t c g g g g a c a g a g t g a c1 0 4 5 q u e r y1 0 2 5 a g g t g g t g c a t g g t t g t c g t c a g c t c g t g t c g t g a g a t g t t g g g t t a a g t c c c g c 从c g a1 0 8 4 | | | | i l | | i | i | | | | i i | | | | ii | i | | i | | i l | i s b j c t l 0 4 6a g g t g g t g c a t g g t t g t c g t c a g c t c g t g t c g t g a g a t g t t g g g t t 从g t c c c g c a a c g a 1 1 0 5 q u e r y l 0 8 5g c g c 从c c c t t g a t c t t a g t t g c c a c - c a t t c a g t t g g g c a c t c t a a g g t g a c t g c c g g t g 1 1 4 4 l | | | | | i | | | | | l li | | | s b j c t l l 0 6g c g c 从c c c t t g a t c t t a g t t g c c a g c a t t c a g t t g g g c a c t c t 从g g t g a c t g c c g g t g1 1 6 5 o u e r y l l 4 5a c a a a c c g g a g g 从g g t g g g g a t g a c g t c a a a t c a t c a t g c c c 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