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微生物利用甘蔗糖蜜发酵产多不饱和脂肪酸的研究 摘要 多不饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ，p u f a s ) 是指含两个或两 个以上双键且碳原子数为1 6 2 2 的直链脂肪酸，主要有亚油酸( l i n o l e i ca c i d ， l a ) 、丫一亚麻酸( 丫l i n o l e n i ca c i d ，g l a ) 、花生四烯酸( a r a c h i d o n i ca c i d ， a r a ) 、0 【一亚麻油( q l i n o l e n i ca c i d ，a l a ) 、廿碳五烯酸( e i c o s a p e n t a e n o i ca c i d ， e p a ) 和廿二碳六烯酸( d o c o s a h e x a e n o i ca c i d ，d h a ) 等。多不饱和脂肪酸大 多数是生物活性物质的前体，尤其是对智力发育、心血管病等有良好效果。 此外p u f a s 还可用作食品添加剂、营养配方、健康辅料以及保健品等。微生 物所具有的营养简单、生长繁殖快、易变异、可工业化大规模培养的优点 决定了利用微生物生产油脂是一条开发新油源的良好途径。目前国内外研 究通常利用葡萄糖、淀粉和蔗糖等作为碳源生产多不饱和脂肪酸。作者试 图从土壤中筛选出以甘蔗糖蜜为碳源，发酵生产多不饱和脂肪酸的菌株， 并对菌株进行诱变育种，发酵条件，代谢调控，油脂的分离提取和富集等 方面进行研究，以及利用气相色谱进行油脂组成和含量鉴定分析。本研究 的结果如下： l 、利用苏丹黑b 染色和测定多不饱和脂肪酸碘值的方法，从土壤中筛 选出一株适合用甘蔗糖蜜为原料生产多不饱和脂肪酸的霉菌l b l 。对l b l 菌 株进行形态特征、生理特征分析及5 8 sr d n a 基因两侧的内转录间隙进行序 列分析推断该菌株为反屈毛霉属( 胁c 卯朋删淞) 。 2 、以土壤筛选到的反屈毛霉l b l 为出发菌株，通过6 0 c o 辐射复合l i c l 诱变，进行富含多不饱和脂肪酸菌株的选育。菌种的筛选主要以含脂量以 及碘值的高低作为选择菌株的依据，筛选到一株不饱和脂肪酸高产菌株 m r - l o ，较原始菌株总脂含量增加3 5 4 2 ，碘值增加3 6 5 6 ，p u 认s 增加 4 3 7 6 。将筛选出的菌株分别进行遗传稳定性测试表明，菌株经过五次转 代培养，具有较好的遗传稳定性。 3 、在反屈毛霉l b l 发酵条件优化的实验中，探讨了不同碳源：葡萄糖、 蔗糖、淀粉以及p d a 等对发酵的影响。从结果和糖蜜的成分分析以及经济 角度考虑，糖蜜可以作为发酵生产多不饱和脂肪酸的碳源，且糖蜜的最佳 浓度为1 5 。同时确定尿素为最佳氮源，最佳c 烈比为3 5 1 。通过单因子试 验和正交实验，得到发酵生产不饱和脂肪酸的最佳培养条件为：培养温度 2 5 ，摇床转速1 6 0 叩m ，培养时间5 天。在上述条件下，反屈毛霉l b l 发酵 可得生物量、总脂量和p 切1 a s 产量分别达到1 2 5lg l ，7 1 3g l 和5 7 4 叽。 4 、在反屈毛霉l b l 发酵代谢调控中，在发酵过程中补加十八醇、十六 醇和正丁醇前体物，得出补加十六醇可以提高菌丝的油脂和不饱和脂肪酸 含量。在发酵2 4 小时后补加1 5 的十六醇，可获得最大的油脂含量8 2 4g l ； 碘值1 1 3 8 4 ，p i j l 认s6 9 6g l 。 培养基中添加适量浓度金属离子m 矛+ 可以提高菌丝多不饱和脂肪酸的 产量，当m g s 0 4 在2 0 一3 0 姗o l l 范围内，生物量、油脂含量、碘值及p l 1 a s 随m g s 0 4 的增加而增加。当m 9 2 + 浓度为3 0m m o l l 时，油脂含量6 6 2g l ； 碘值1 0 9 1 0 ，p u a s5 1 6g l 。高于3 0n u n o l l 时，生物量、油脂含量、碘值 及p 切、a s 有所下降，说明高浓度的金属离子对发酵生产有抑制作用。 在培养中添加适量的维生素可以提高油脂中p 认s 的含量，但对生物量 影响不大。维生素b ，和维生素b 6 作为油脂生物合成过程中合成酶的辅助因 子，在不饱和脂肪酸的形成起到重要作用。维生素的添加量也有一定的影 响，随添加维生素浓度的增加，油脂的碘值和p 1 a s 有所增加，维生素b l 添加量为o 2 0m 舭较为合适，而维生素b 6o 2 5m m l 为适宜，说明高浓 度维生素对不饱和脂肪酸的积累有利。 代谢调控中低温老化是增加不饱和脂肪酸产量的一种有效方法，反屈 毛霉l b l 在5 储存1 5 天后，油脂含量由5 天的5 1 8g l 到5 7 2g _ l ，p l 玎认s 由3 3 7g l 到4 6 0g l 。利用低温和老化的共同作用可以提高不饱和脂肪酸 的含量。 5 、在石油醚萃取，正己烷萃取和盐酸水解乙醚抽提等三种油脂分离提 取方法中，采用盐酸水解乙醚抽提方法为本研究油脂提取方法，多不饱和 脂肪酸富集部分采用尿素包合冷冻结晶法进行。研究表明当混合酸：乙醇： 尿素= l ：1 5 ：7 5 时，富集效果最佳。在此条件下富集，微生物油脂中的 碘值从原来的9 1 2 0 提高到1 0 2 4 5 ，油脂的不饱和度提高了1 2 3 5 。 6 、采用菌体直接进行油脂的甲酯化方法，通过气相色谱分析油脂和不 饱和脂肪酸的组成和含量。通过样品和标品气相色谱出峰及保留时间的对 照，利用面积归一化计算，得出菌株的油脂含量为7 1 3g l ，不饱和脂肪酸 含量达到5 7 4g l 。其中油脂中多不饱和脂肪酸的组成及含量为：油酸8 8 5 m g l ，亚油酸8 2 5m g l 、y 亚麻酸1 3 5 2m g l 、q - 亚麻酸1 7 6m g l 、花生 四烯酸5 6 7m g l 、廿碳五烯酸4 6 7m g l 、廿二碳六烯酸3 4 8m g l 。 i i i 7 、价格低廉的甘蔗糖蜜含有丰富的糖类、氮源、无机盐及维生素等物 质，可代替葡萄糖、蔗糖和淀粉等作为微生物发酵生产多不饱和脂肪酸的 原料。 关键词：多不饱和脂肪酸甘蔗糖蜜筛选鉴定 反屈毛霉l bl诱变育种 发酵条件代谢调控色谱分析 s t u d yo fp o l y u n s a t u r a t e df a t t y a c i d s p r o d u c t i o nw i t hm i c r o o r g a n i s mb ys u g a r c a n e m o l a s s e sf e r m e n t a t i o n a b s t r a c t p o l y u n s a t u r a t e df 狮a c i d s ( p u f a s ) a r em e a n t t h es t r a i g h ts t r a mf a 蚵a c i d s w i t l lt w oo rt w om o r ed o u b l eb o n d sa n dl6 2 2c a r b o na t o m s ，m a i n l yi n c l u d i n g l n o l e n i ca c i d ( l a ) ，丫一1 i n o l e n i ca c i d ( g l a ) ，a r a c h i d o n i ca c i d ( a r a ) ，a 。1 i n o l e n i c a c i d ( a l a ) ，e i c o s a p e n t a e n o i ca c i d ( e p a ) a n dd o c a s d h e x a e n o i ca c i d ( d h a ) m o s to ft h e ma r et h ep r e c u r s o r so f b i o l o g ya c t i v es u b s t 觚c e ，w h i c hh a v es h o w e d b e n e f i c i a le 归f e c t s e s p e c i a l l y o n a i d i n g b r a i n d e v e l o p m e n t a n d t r e a t i n g c a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e f u r t h e m o r e ，p if f a sa 聆a l s ou s e da sf o o da d d i t i v e ， n u t r i t i o nr e c i p e ，s u p p l e m e n ta n ds a n i 谢a nf o o d s ，e t c m i c m o 唱a n i s mp o s s e s s m o r eu n e x 锄p l e da d v a n t a g e st h a no t h e rb i o l o g y s u c ha ss i n l p l en u t r i t i o n ，h i 曲 r e p r o d u c t i o n ，e a s yv a r i a t i o n ，c o s m i c a l l yi n d u s t r i a lc u l t i v a t i o n ，t h e r e f o r e ，w h i c h d e t e m i n e dt h a ti ti sap o t e m i a l 印p r o a c ht op r o d u c el i p i d sb ym i c r o o r g a n i s m a s 、e 、e uk n o w n ，i nm et r a d i t i o nc u l t i v a t i o nm e t h o d s ，g l u c o s e ，s t a r c h 甜l d s u c r o s ew e r eo f k nu s e da sc a r b o ns o u r c e si nt h ep r o d u c i n go fp u f a s ，w h i c h w i hn e e d1 1 i g h e rc o s t w et r i e dt oa c h i e v et h em i c r o o 玛a n i s mw i t hb o t hh i 曲 v b i o m a s sp r o d u c t i v i t ya n d1 1 i g hl i p i dc o n t e n t 7 i h eo b je c t i v e so ft h i sr e s e a r c hw e r e t oi r l v e s t i g a t et h ep o t e n t i a lf o r 如n g a lp r o d u c t i o no fu n s a t u r a t e df l a t t ya c i d sb y u s eo fs c r e e n e ds t r a i n ，a n dt od e t e r m i n et h ef e a s i b i l i 够o fu s i n gs u g a r c a n e m o l a s s e sa ss u b s t r a t e sf o rt h e 几n g a l f e n n e n t a t i o n p r o c e s s s t u d i e so f f e m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，t h el i p i dc o n t e n ta 1 1 dc o l p o s i t i o no fm es t r a i nw e r e i n c l u d e di nt h er e s e a r c h t h er e s u l t so b t a i n e dw e r ea sf o l l o w i n g ： 1 as t r a i nn a m e dl b1p r o d u c i n gp o l y u n s a t u r a t e df i a 仕y a c i d sw i t l l s u g a r c a n em o l a s s e sw a ss c r e e n e df o r ms o i ls a m p l e sb yt h em e t h o d so fs u d a n b l a c kbs t a i na n dt h ed e t e m i n a t i o no fp u r s i o d i n ev a l u e b a s e do nt h eg r a s s m o 印h o l o g i c a la n dp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dt h es e q u e n c es i m i l a r i t yo f r i b o s o m a ld n a i t s ，t h es t r a i nw a si d e n t i f i e da s 朋h c d r 陀c 甜w 螂s p 2 ah i 曲y i e l d i n gm u t a n t 朋孔r 陀c 扰州螂m r - 1op r o d u c i n gp u r sw a s s u c c e s s 如l l yo b t a i n e dw h e nt h eo r i g i n a ls t r a i n 朋锄r 坨c 甜w 螂l b 1w a st r e a t e d b y6 0 c oa n dl i c la sc o m p o u n dm u t a g e n ， a n db ym es c r e e n i n gm e t h o do ft o t a l 1 i p i dc o n t e n ta n di o d i n ev a l u e t h et o t a ll i p i dc o n t e n t ，i o d i n ev a l u ea n dp u f a s p r o d u c t i o ni i lm r - 1 oc u l t i v a t i o ni ns h a l ( i n gn a s kw a s35 4 2 ，3 6 5 6 狮d 4 3 7 6 h i g h e rm a n t 1 1 a ti 1 1 也eo r i g i n a ls t r a i nl b1 ，r e s p e c t i v e l y - t h em u t a n t s h o w e ds t a b l eg e n e t i cp r 叩e 啊，a r e rp a s s g e n e r a t i o nt e s t sf o r5t i m e s 3 s t u d i e sw e r ec a 玎i e do u to nt h e f e n l l e n t a t i v e p r o d u c t i o n o f p o l ”m s a m r a t e df a t t ) ，a c i du s i n g 朋h c d 厂舰“w 螂l b 1 w i t l ls u g a u r c a n em o l a s s e s w i md i f f e r e n tc u l t u r ec o n d i t i o n si r e s t i g a t e di ns h a k ef l a s l ( s ，t 1 1 er e s u l t so fl 6 4 ( 4 3 ) o r t h o g o n a le x p e r i m e n t si n d i c a t e dt h a t 、h e n 朋h c d 厂理c “w 珊u 3 1w a s c u l t i v a t e da t2 8o cf o r5d a y sw i t h16 0 印m ，t h ey i e l do ft o t a ll i p i dc o n t e n tw a s 7 13g l ( b ym a s s ) w i t l ll5 s u g a r c a n em o l a s s e s0 h - 6 o ) t h ee f f e c to f c a r b o na 1 1 d n i t l o g e n s o u r c e0 np u f a sp r o d u c t i o nw a sa l s ot e s t e dmt h e s e e x p e r i m e n t s m o l a s s e sa n du r e aw e r eu s e 凡lf o r 朋五c a 矿愆c z 舢z 岱l b1t oe n h a n c e t h ep u f a s p r o d u c t i o n ，a n dt h ee f f e c t sw e r ec o m p a r a b l e 4 t h el i p i dc o n t e n ta n dp l ，f a sp r o d u c t i o no f n l y c e l i a lw e r ei n c r e a s e do n c u l t i v a t i o no fl b1w i ma d d i t i o n a lf e e d i n go fc e 够la l c o h o l ，b u tt h es a m er e s u l t s w e r en o to b s e r v e dw h e nf e e d i n g o c t a d e c y la l c o h o l 锄dn b u 锣la l c o h 0 1 a r e rt h e g u sw a sc u l t i v a t e dw i t ha d d i t i o n a lf e e d i n go f1 5 c e 够la l c o h o lf o r2 4h o u r s ， t h em a x i m a l 锄o u n to fl i p i d s ，i o d i n ev a l u ea n dp u f a s ( 8 2 4g lo fl i p i d s ， 11 3 8 4o f i o d i n ea n d6 。9 6 9 lo f p l y f a s ) w a so b t a i n e d 。 a d d i n ga p p r e c i a t ec o n c e n t r a t i o nm 9 2 + ( 2 0 3 0 m m o l lm g s 0 4 ) t om e d i u m c o u l dp r o m o t em eb i o m a s s ，l i p i d sa n dp u f a sa c c u m u l a t i o n t h eo p t i m a l a d d i t i o nc o n c e n t r a t i o nw a s3o m m o l lm g s 0 4 ，、h i c h6 6 2 9 lo f l i p i d s ，10 9 10 o fi o d i l l ea n d5 16g lo fp u f a sw e r eo b t a i n e d h o w e v e rt l l e 向n g u sg r o w t h w e r ei n m b i t e db yh i g h e rm 9 2 + c o n c e n t r a t i o n ( 3o m m o l lm g s 0 4 ) a d d i n ga p p r e c i a t e 锄o u n tv i t a m i nt om e d i u ma l s oc o u l di n c i e a s e dp l 7 f a s c o n t e n ti nl i p i d s ，b u th a dl i t t l ee f r e c t so nb i o m a s s a st h ec o f a c t o ro fs y n t h a s e ， v i t a m i l lb la n db 6h a di m p o r t a n tf u n c t i o ni nt h ef o n n a t i o no fp u f a si nt h e b i o s y m h e s i sp r o c e s so fl i p i d s w i t 量lt h ei n c r e a s eo fv i t 锄i n ，t h ei o d i l l ea n d p 切f a sp r o d u c t i o nh a s 铲e a ti n c r e a s e t h eo p t i m a la d d i t i o na m o u n tw a so 2 0 m 灿o f b la n do 2 5m m lo f b 6 v h i ti sw o r t hn o t i n gt h a tl o w t e m p e r a t u r ec u l t i v a t i o n a n da g i n go ft h e h a r v e s t e dm y c e l i aw e r ee m c i e n tm e t l l o d st oa c c u m u l a t em y c e l i ap u f a s t h e p 切後sp r o d u c t i o na n dl i p i dc o n t e n tr e a c h e dt o4 6 0 9 l 舶m3 3 7 9 la n dt o 5 7 2 9 l 舶m5 18 9 l ，r e s p e c t i v e l y ，m e nl b 1w a sc u l t i v a t e df o r5d a y sa n d w h e nt h em y c e l i aw e r ea l l o w e dt os 胁df o ram n h e r1 5d a y sa t5 5 t h ep r o p o r t i o no fa l c o h o la n du r e ai nt h es e p a r a t i o no fp u f a sw a s s t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tw h e nm i x e d 脚a c i d s ：u r e a ： a l c o h o l 2 1 ：1 5 ：7 5 ，t h ee n r i c he 疏c tw a so p t i m a l u n d e rt h ec o n d i t i o n ，t h ei o d i n ev a l u e r a i s e dt o1 0 2 4 5 仔o m9 1 2 0 ，a n dp u f a sc o n t e n ti nl i p i d sw a s i i l c r e a s e d1 2 3 5 6 t h ea n a l y s i so f f - a t t ya c i di nt o t a ll i p i d so f l blw a sc o n d u c t e db yu s i n ga g a sc h r o m a t o g r 印ha n a l y s i s ar a p i dt r a n s m e t h y l a t i o nw a s 印p l i e d i nt h i ss t u d y ： t h ed r y 朋孔c d 尸彤c “川甜sw e r ed r i e c t l yt r a n s m e t h y l a t e d r e l a t i v ep e r c e n t a g e so f f 狮a c i d sw e r ec a l c u l a t e d 行o mp e a ka r e a s f a c t y a c i d sw e r ei d e n t i f i e db y c o m p 2 l r i s o nw i m t h er e t e n t i o nt i m eo fr 气匝s t a n d a r d s t h ep u f aw a su pt o 5 7 4g l 锄o n gt h et o t a ll i p i d ，w h i c hw a sc o m p o s e d o f8 8 5m g lo l e i ca c i d ，8 2 5 m g ll i n o l e m ca c i d ( l a ) ，1 35 2m g l 丫一l i r l o l e n i ca c i d ( g l a ) ，1 7 6m g l a 1 i n o l e l l i ca c i d ( a l a ) ，56 7m g l a r a c h i d o n i ca c i d ( 触认) ，4 6 7m g l e i c o s 印e n t a e n o i ca c i d ( e p a ) ，3 4 8m g ld o c o s a h e x a e n o i ca c i d ( d h a ) e t c 7 t h es u b s t r a t ef o rt h ef e n l l e n t a t i o np r o c e s sw a ss u g a r c a n em o l a s s e s s u g a r c a n em o l a s s e sh a dau m q u ea d v a n t a g ef o rr i c hn u t r i t i o nw h i c h c o n t a i n i n g r i c hs u g a r n i t r o g e n ，n i t r o g e ns a l t sa n dv i t 锄i n ，a n dh a sac o n s i d e r a b l yl o w e r c o s t k e yw o r d s ：p 0 1 ”n s 栅a t e df i a 晦a c i d s ( p u f a s ) ；s u g a r c a n em o l a s s e s ； s c r e e n i n g a n di d e n t i f i c a t i o n ；朋k c d ，-陀c 甜舢sl b 1 ； m u t a t i o n b r e e d i n g ； c u l t u r eo p t i m i z a t i o n ； m e t a b o l i cc o n t r d l ；a n a l y s i so fg c 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和 相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本 论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也 不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个 人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名 钞肛月上同 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的自仃提下，学校可以公和论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 函i 时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名 印翩躲缘勃昂h 拥 微生物利用甘蔗糖蜜发酵产多不饱和脂肪酸的研究 第一章绪论 油脂与人类日常生活的关系越来越密切，它不但是维持生命的重要营养物质，也是 工业生产的重要原料。传统的食用油脂，主要来源于动植物，在当今工业生产不断发展 以及世界人口数量不断增多的情况下，油脂呈现了供不应求的趋势。尤其是不饱和脂肪 酸，随着人们对其生理功效( 降血脂，降糖，健脑，益智等) 的深入了解u 引，寻求富 含不饱和脂肪酸的新油源，以弥补动植物油源的不足成为当前的研究热点。而且利用产 脂微生物合成多种不饱和脂肪酸是开发新油源的良好途径，因为微生物具有营养简单， 生长繁殖迅速，易进行遗传育种，可工业化大规模培养等优点p ，4 。 1 1 多不饱和脂肪酸的研究概况 人类早已发现微生物细胞中有油脂的存在，微生物油脂的研究始于第一次世界大战 期间，德国为了解决当时的油源的缺乏而利用产脂内孢霉生产油脂，以解决粮食不足的 问题。随后，美国对微生物生产油脂也做过研究工作。直到第二次世界大战前夕，德国 科学家筛选到了适于深层培养的菌种，并开始在德国进行工业化生产。日本、德国、美 国等国目前已有商品菌油面市【5 一。我国在这领域的研究开发较晚，国内九十年代初开 始有微生物油脂生产的研究报道，目前研究集中在菌种的筛选、发酵工艺条件优化等方 面忉。 多不饱和脂肪酸( p 0 1 y u i l s a t u r a t e df a 蚵a c i d s ，p u f a s ) 是指含两个或两个以上双键且 碳原子数为1 6 2 2 的直链脂肪酸，包括y 亚麻酸( g a i i 皿al i n o l e m ca c i dg l a ) 、花生四 烯酸( 加粥址d o i l i ca c i da a ) 、廿碳五烯酸( e i c o s 印e n t a e n o i ca c i de p a ) 和廿二碳六烯酸 ( d o c o s a l l e x a e n o i ca c i dd h a ) 等，根据距脂肪酸中性末端( ( i ) 端) 的第一个双键位置 的不同，p u f a s 可分为n 6 和n - 3 两大系列，其中m 6 系列是由亚油酸( l a ) 衍生而来的， 主要有y 亚麻酸、花生四烯酸等：而n 3 系列则由q 亚麻油衍生而来，包括d h a 、e p a 竺【8 】 寸。 自1 9 2 9 年亚油酸( l a ) 被确认为必须脂肪酸以来，对其缺乏所引起的机体损伤进 行了广泛的研究。5 0 年代，由于强调血清胆固醇升高与冠心病的关系，玉米油( 富含n 6 微生物利用甘蔗糖蜜发醇产多不饱和用 肪酸的研究 p u f a s ) 成为研究降低血清胆固醇措施的主要研究对象【9 】。虽然当时也发现沙丁鱼油( 富 含n - 3p u f a s ) 除有降低血清胆固醇作用外，仍然没有考虑用n - 3 p u f a 作为防治心血管病 的佐剂1 0 1 。7 0 8 0 年代，对a a 衍生的前列腺素的代谢和功能进行了深入研究【1 1 1 。同时研 究发现鱼油中的n 3 p u f a s 有抗炎、抗血栓形成和增加出血时间等作用，补充n - 3p u f a s 可取代细胞膜中的部分r l - 6p u f a s l l 2 】。9 0 年代是研究p u f a s 基因调控及有重要发现和在 体内平衡的重要生理意义进展很快并用于实践的时期【1 3 】。加拿大是第一个提出n - 3 和n - 6 p i j l l a s 推荐膳食供给量的国家，不少公司将鱼油开发成产品出售。英国正在研究制订婴 儿配方食品的d h a 添加标准 1 4 1 。 不饱和脂肪酸具有抗衰老、降低血脂、减少体脂、抗癌抑癌、提高智力和视力、抑 制过敏性反应和由此引起的炎症等有特殊功效，一些先进发达的国家已先后将多不饱和 脂肪酸列作为新型的药物或食品添加剂使用【l5 1 。目前，国际上研究生产多不饱和脂肪酸 方兴未艾，技术发展方向是生产高纯度、高稳定性的多不饱和脂肪酸产品。多不饱和脂 肪酸还可用作食品添加剂( 营养强化剂) 、医药原料、精细化工和其它的生物制品的基 础原料等【1 6 j 。 国际上提取多不饱和脂肪酸的最新技术是超临界萃取技术，但缺乏相应的配套技 术，产品基本停留在复合成份水平，纯多不饱和脂肪酸含量一般小于3 0 【1 7 】。近年来国 内陆续公布用各种原料提取多不饱和脂肪酸的产品，从项目投资规模、产品形式和可能 的生产技术看，大多数规模小、含量低( 有些只是含有q 一亚麻酸的油品) 。因为高纯度 的多不饱和脂肪酸在功效方面明显优于复合成份的多不饱和脂肪酸，亦无任何副作用， 所以研发高含量高稳定性的多不饱和脂肪酸产品是该领域技术的发展趋势。国外提取高 纯多不饱和脂肪酸的技术目前仍处在实验室研究阶段，进入工业化生产尚需时日【1 8 】。 p u f a s 以其独特的生物活性，已引起世界各国的高度重视。近年来，日、美等国已 开发出系列p u f a s 药品及保健食品。我国在这一领域的研究起步较晚，尤其在p u f a s 分 离纯化技术方面，与国外先进水平相比还存在一定的差距【1 9 j 。低温结晶法、尿素包合法 是目前工业上常用的p u f a s 分离纯化方法，它们虽然具有投资少、工艺简单等优点，但 采用这些方法难以获得高纯度的p u f a s ，且产品收率低。采用分子蒸馏法、吸附分离法、 超临界流体萃取法分离纯化p u l 认s 在日本已达到工业规模，国内一些研究单位也正在开 展这方面的研究并取得了很大进展【2 0 】。 目前，已有很多国家研究利用微生物发酵产生p u f a s 。采用微生物发酵生产油脂， 最早开始于二战时期面临枯竭的德国。8 0 年代初，利用微生物发酵生产p 切认这一领域 2 微生物利用甘蔗糖蜜发酵产多不饱和脂肪酸的研究 引起了世界各国的极大兴趣，其中，日本、英国、加拿大、美国等的研究最为活跃【2 l 】。 1 2 微生物产脂肪酸的种类及其生理功能 微生物发酵过程所产生的油脂，在组成成分上类似植物油，甚至具有比动植物油脂 更符合人体需要的高营养油脂。主要包括中性油脂、游离脂肪酸、类脂物及不皂化物， 尤其具有高不饱和脂肪酸，其中亚油酸、y 一亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二 十二碳六烯酸等多不饱和脂肪酸具有特殊的生理功能2 2 】【2 3 】【2 4 】。 1 2 1 亚油酸( i n o i e ；ca c i dl a ) 亚油酸是人体必需脂肪酸，通过人体的6 去饱和酶的作用可以转化为人体必需的 y 一亚麻酸。亚油酸能促进幼儿生长发育，防止和减轻老年人的动脉粥样硬化1 4 j 。尽管 这类油脂在植物中较为普遍存在，但植物中亚油酸含量达7 0 以上的只有葵花油和红花 油【2 5 1 。据报道利用产脂的内孢霉菌工业化生产富含油酸、亚油酸的油脂，微生物油脂中 油酸、亚油酸二者含量可占总脂量的6 5 7 8 。而且熔点、折射率、比重、酸价、过氧 化值、皂化值、碘值等物理化学特性的分析结果与植物油接近1 4 j 。 1 2 2 t 一亚麻酸( g l a ) g l a 天然存在量很少，在一般的天然油料植物中并不存在，只有乳脂和特殊的野生 植物种子中含量较高。g l a 与人体健康很有关系，是人体中合成前列腺素( p g ) 等具有强 烈生理活动的自身调节物质的前体，如前列腺素e ，具有阻止血液中胆固醇积累，防止 血小板凝集，保护急性心肌缺血，抑制动脉硬化斑块形成等多种重要的生理功能【2 6 j 。而 g l a 缺乏会抑制p g 的合成，从而引起血压升高、动脉硬化、血栓形成、糖尿病、风湿 病、肥胖症和皮肤老化等疾病【27 。此外，g l a 还能改善过敏性皮炎、胶原病、多发性皮 肤硬化症、酒精中毒等功能【2 引。1 9 9 0 年h a y a s h i 等利用a h 1 0 9 a 鼠肝癌细胞进行实验， 发现g l a 具有抗癌活性以及在体外g l a 对血清白蛋白的抗癌作用【2 9 】。所以g l a 具有极其 重要的生物活性及营养与医疗方面的应用价值。 g l a 传统上主要从月见草种子油中提取，但是月见草种子的来源受气候、产地等因 素的影响，远远满足不了市场的需求【3 0 】。而微生物发酵法生产却不受原料等限制，精练 成本也较低。在这方面的研究日本已走在前面，19 8 5 年o s 锄as u z u l 【i 等【3 l 】对深黄被孢霉、 微生物利用甘蔗糖警 发酵产多不供蚜口脂肪酸的研究 葡萄色被孢霉、拉曼被孢霉和矮地被孢霉进行了葡萄糖浓度为6 0 4 0 0 9 l 的高浓度碳源 发酵培养，菌体油脂含量达3 5 7 0 ，g l a 含量为3 l l 。1 9 8 7 年蓑岛良一等利用雅 致小克银汉霉发酵生产g l a ，其含量达1 8 左右1 3 引。自1 9 8 6 年以来，英国的s e l b yf a c t o r ) r o fs t i 翟eb i o c h e m i c a l s 、日本出光化学公司等已将发酵的g l a 产品投放市场，产品主要 应用于医药、保健食品、功能性饮料和高级化妆品p 3 。 我国上海工业微生物研究所在5 0 0 l 发酵罐中用m 1 0 2 菌株发酵生产g l a ，g l a 的含量 达到8 。1 9 9 3 年，南开大学生物系利用深黄被孢霉为出发菌株，经紫外诱变得到变异 菌株，在1 0 l 罐中发酵产生g l a 时，油脂含量达4 4 7 ，其中g l a 含量达9 4 4 1 3 4 j ；1 9 9 8 年福建师范大学生物工程学院以深黄被孢霉a s 3 3 1 4 1 0 为出发菌株，经紫外、硫酸二乙 醇、亚硝基胍复合诱变处理后，进行了6 0 m 3 罐三级发酵，菌体油脂含量高达7 9 2 1 3 5 j 。 1 2 3 花生四烯酸( 从) 花生四烯酸传统上来自鱼油，但含量极低，一般少于0 2 ( w w ) 。a a 与二十碳五 烯酸( e p a ) 时花生酸代谢的重要中间产物，它们在营养学、医学上的地位为世人瞩目， 这主要是由于二十碳酸代谢产物具有调节脉管阻塞、血栓、伤口愈合、炎症及过敏等生 理功能【3 6 】。1 9 9 0 年b u m o v a 等发现几株被孢霉能富集二十碳三烯酸( d g l a 又称二高y 一亚麻酸) 和a a ，并且在一定条件下生产e p a 。8 0 年代以来，d g l a 、a a 含量高的微 生物油脂相继在日本、英国、法国、新西兰等国投入工业化生产，日本、英国已有a a 发酵产品投入市场【3 7 1 。国内朱法科等以一株被孢霉为出发菌株，通过紫外诱变得到一株 a a 高产菌，以葡萄糖为碳源时a a 得率达0 8 3 9 l 。研究还指出：培养不同时间的菌丝 ( 3 d 5 d ) 在室温下老化1 5 d ，菌丝体中总脂含量由1 8 3 0 上升至3 6 4 1 ；菌丝 体中a a 的含量则由1 1 一2 6 上升至2 6 3 7 【邛j 。 1 2 4 二十碳五烯酸( e p a ) 和二十二碳六烯酸( d h a ) e p a 和d h a 属于一3 多不饱和脂肪酸( p u f a s ) ，能有效的降低血脂、胆固醇，提 高高密度脂蛋白，抑制血小板凝集，预防和治疗动脉粥状硬化、血栓形成及高血压。同 时，d h a 是大脑髓质的重要组成部分，因此能明显改善血栓性痴呆，高脂糖尿病的症状， 对免疫系统疾病( 如风湿性关节炎、红斑狼疮等) 具有缓解作用，治疗气喘、关节炎、 周期性偏头痛、肾炎等；并提高青少年智商，增强中老年人的记忆力，提高孕妇、胎儿 4 广西大掌博士掌位论文微生物利用甘蔗糖蜜发酵产多不戗蚜口脂肪酸的研究 及新生儿的身体素质，促进胎儿和新生儿的大脑发育【3 9 】【4 0 】【4 1 】【4 2 】。研究还表明d h a 是脑 细胞线粒体、微粒体和突触体的基本元件，直接影响人的生长发育，对于改善大脑机能、 提高记忆力和学习能力【4 3 】。此外，e p a 和d h a 对保护视力、对增强视网膜反射能力有很 好的功效【4 4 1 。但人体自身不能合成e p a 和d h a ，只能从食物中摄取，大自然中除深海鱼 油中含量胶丰富外，其它食物中含量都很低。目前一3 p u f a 的商业来源是海洋鱼油， 鱼油中( - ) 一3 p u f a 的构成与含量随鱼种类、季节、地理位置等变化。若能根据微生物的 脂肪酸代谢合成途径，致使微生物产生大量的e p a 和d h a ，那么其前途将无可限量【4 5 1 。 1 9 8 8 年s h 妇i z u 等人提出高山被孢霉是生产e p a 的一个潜在来源，在1 2 的低温下生 长时，可以积累1 5 以上的e p a 【4 6 】。n l r a u s t o c h y t r i u m a l 】r e u m 则是一种海生真菌，d h a 含