（微生物学专业论文）模拟昆虫中肠环境对球孢白僵菌孢子的影响.pdf

致谢 值此毕业论文完成之际，首先要感谢我的导师冯明光教授对我的悉心关怀和指 导。他为我的成长倾注了无数的心血，为我的发展指明了前进方向。从论文的选题、 设计、撰写、修改直至顺利完成，都凝聚着他的辛苦和汗水。冯老师渊博的知识、 严谨的科学态度和忘我的敬业精神令我钦佩，并将使我日后受益匪浅。 特别感谢应盛华副教授在实验设计、实施和论文撰写中给予的宝贵建议和详尽指 导，使我在遇到困难时能够迎难而上，顺利完成论文。同时感谢陈春副教授在工作 和学习上对我的诸多帮助；感谢单乐天师兄在生测实验阶段给予的详尽指导；感谢 施卫兵、陆平、邹根、黄宝福、黄志宏、李均、金少锋、周湘师兄和秦毅、刘倩师 姐给予的照顾；感谢同窗好友宋婷婷、王正亮、王晓晓以及本实验室的谢雪钦、朱 凤香、王晓慧、姚世莉的帮助；感谢好友洪岚、雷丽赞、俞萍萍、蔡日梅、陈庆娟 深厚的友情及关心帮助。两年来，他们与我朝夕相处、学勉与共，陪伴我度过了这 段美好的时光，他们的启发与帮助将使我受益终身。 谨向所有为我营造良好工作氛围和提供热情帮助的人们致以诚挚的谢意! 最后，我怀着歉疚的心情向深爱我的父母、家人表示衷心感谢。在实验初期遇到 很多困难，精神压力很大，是父母的支持和信任让我度过精神上的困境；也感谢我 即将读大学的弟弟，他的理解和信任让我勇敢；感谢我的爷爷奶奶，他们是我奋进 的动力。正是他们的理解和支持使我能够j e a n 完成学业，希望我的顺利毕业能为他 们带去一些慰藉。 僧明华 2 0 0 8 年5 月 于杭州嗦金港 摘要 作为重要的昆虫病原真菌，球孢白僵菌( b e a u v e r i ab a s s t a n a ) 4 艮难通过口器摄 入经肠壁侵染寄主，但其机理不明。本研究首先筛选出一株稳定表达绿色荧光蛋 白的球孢白僵菌遗传转化菌株，然后模拟昆虫中肠环境处理其两种孢子，采用流 式细胞术检测处理后孢子荧光强度的变化以反映孢壁的受损程度，并用扫描电子 显微镜观测处理后孢壁表面形态，最后测定处理后两种孢子的萌发率以反映对孢 子活力的影响。主要内容和结果分述于下： 遗传转化菌株的生物学筛选从六个转化子菌株中筛选出能代表野生型菌 株生理生化特征的高效表达绿色荧光蛋白的菌株。测定六个转化子菌株的分生孢 子荧光强度强弱，结果显示b b 2 8 6 0 g 6 是最优的荧光强度最强的菌株。耐热力测 定结果显示，菌株b b 2 8 6 0 g 6 、b b 2 8 6 0 g 1 2 和b b 2 8 6 0 g 4 在热胁迫后的残存活孢 率均在5 5 以上，孢子耐热力极强。测定b b 2 8 6 0 g 0 、b b 2 8 6 0 g 1 、b b 2 8 6 0 g 6 和 b b 2 8 6 0 g 8 四个菌株的菌落生长情况，b b 2 8 6 0 g 1 的菌落面积显著较低，其他三 个菌落面积差异不显著。用b b 2 8 6 0 g 0 、b b 2 8 6 0 0 6 和b b 2 8 6 0 g 8 这三株菌进行 对桃蚜的生物测定，结果表明三个菌株的孢子悬液对桃蚜的剂量效应与时间效应 都极显著，b b 2 8 6 0 g 6 与b b 2 8 6 0 g 0 的时间效应值接近，杀蚜效应接近。综合各 项生物学筛选指标，最终选取b b 2 8 6 0 g 6 菌株为最终的研究对象。 模拟昆虫中肠环境对分生孢子的影晌配置单一或者复合的模拟昆虫中肠 消化液，使b b 2 8 6 0 g 6 分生孢子悬浮于其中，恒温水浴后，采用流式细胞术测定 其荧光强度的变化情况，结果显示：不同浓度的蛋白酶k 、胰蛋白酶、链霉蛋自 酶e 、纤维素酶处理后均引起被检荧光强度的上升，并呈现先上升后下降的趋势。 a 淀粉酶、蜗牛酶、葡萄糖苷酶、昆布多糖酶处理组只引起被检荧光强度的轻微 变化，并呈现出下降趋势。经两种复合酶模拟消化液处理后，两种复合酶液均引 起被检荧光强度的下降，然而下降幅度有所差异：蛋白酶k 和纤维素酶引起孢 子荧光强度降低8 2 1 ，胰蛋白酶和纤维素酶导致3 7 - 4 3 的下降幅度。在 p h5 1 1 范围内，两种复合酶液处理后孢子的相对荧光强度有所下降，分别为对 照的5 3 7 2 和7 7 一9 7 。电镜照片显示荧光强度上升的处理组孢子壁表面蛋 白纹路模糊，孢壁变薄；而荧光强度下降的处理组孢壁部分结构不完整，甚至出 现孔洞。 测定经不同的模拟消化液处理后的分生孢子萌发率，结果显示，单一酶模拟 消化液处理后分生孢子萌发率出现不同程度的降低，胰蛋白酶引起萌发率下降幅 度最大( 3 l ) 。p h 5 1 1 条件下用两种复合酶模拟消化液处理分生孢子，萌发率均 出现大幅度的降低。胰蛋白酶和纤维素酶组合引起萌发率下降3 0 9 8 ，蛋白酶 k 和纤维素酶组合引起萌发率下降2 1 9 1 。 模拟昆虫中肠环境对芽生孢子的影响采用同分生孢子相同的样品处理方 法，使模拟昆虫中肠消化液作用于b b 2 8 6 0 g 6 芽生孢子，流式细胞术检测结果显 示：不同浓度的蛋白酶k 、胰蛋白酶、链霉蛋白酶e 、纤维素酶处理后均引起被 检荧光强度的上升，但随浓度增大上升趋势变化不明显；经昆布多糖酶和a 一淀粉 酶处理后，荧光强度呈现先升高后下降的趋势；而经蜗牛酶、葡萄糖苷酶处理后， 随浓度升高被检荧光强度呈下降趋势。经两种复合酶模拟消化液处理后，胰蛋白 酶和纤维素酶组合导致荧光强度上升8 - 4 8 ，随酶液浓度的上升，荧光强度上 升幅度增大；蛋白酶k 和纤维素酶组合则随酶液浓度上升荧光强度上升幅度减 小( 1 0 3 ) ，1 浓度甚至引起被检荧光强度下降1 5 。在p h5 1 1 范围内，两 种复合酶模拟消化液处理后孢子的相对荧光强度有所上升，分别为对照的 2 1 4 1 3 5 倍和1 0 1 1 3 6 倍。扫描电镜观测结果显示蛋白酶处理后芽生孢子表面 未出现明显变化，而糖苷酶类处理后孢子表面不再光滑平整，被消减而变得不平。 测定经不同的酶液处理后的分生孢子萌发率，结果表明，单一酶模拟消化液 处理后芽生孢子萌发率出现不同程度的降低。其中，昆布多糖酶引起萌发率下降 幅度最大( 3 0 ) 。p h 5 1 1 条件下胰蛋白酶和纤维素酶组合引起萌发率下降 4 9 7 8 ，蛋白酶k 和纤维素酶引起萌发率下降4 3 6 7 。 综上所述，本研究主要测定了模拟昆虫中肠消化液处理后球孢白僵菌的两种 孢子荧光强度及萌发率的变化情况，结合扫描电镜的观测结果，说明了昆虫肠道 中的各种酶和酸碱度对孢子壁有不同程度的消减和损伤，揭示了抑制孢子萌发的 关键肠道因子，为杀虫机理的研究提供了线索。 关键词：球孢白僵菌，分生孢子，芽生孢子，模拟昆虫中肠消化液，荧光强度， 萌发率，流式细胞术，扫描电子显微镜 2 1文献综述 1 1 球孢白僵菌的生物学 球孢白僵菌( b e a u v e r i ab a s s i a n a ) 是最常见的昆虫病原真菌，属于半知菌亚门 ( d e t e r o m y c o t i n a ) 、丝孢纲( h y p h o m y c e t e s ) 、丝孢目( h y p h o m y c e t a l e s ) 、丛梗孢科 ( m o n i l i a c e n o ) 、白僵菌属( b e a u v e r i a ) ，可侵染1 5 个目中1 4 9 科的7 0 0 余种昆虫及 6 科的1 0 余种蜱螨( 蒲蛰龙和李增智，1 9 9 6 ) 。球孢白僵菌常见侵染体有分生孢子、 芽生孢子、茵丝体三种形式。其中，分生孢子呈球形，直径约在2 - 3 - t m ，是球孢 白僵菌最常见的侵染体，其表面丰富的蛋白肌束层具有很强的疏水性，是吸附昆 虫体壁时的关键性因素，对杀虫毒力有一定的影响( b o u c i a s ，1 9 8 3 ) 。芽生孢子在 菌体生长环境中营养缺乏时候大量产生，孢壁较分生孢子较薄，呈球状或者棒状， 生活力弱，表面蛋白的种类和疏水性远小于分生孢子( h o l d e r k e y h a n i ，2 0 0 5 ) ， 但在昆虫体内生长时能吸收大量的水分并产生有毒的红色卵孢霉素，该毒素是昆 虫致死的重要因素之一( 洪华珠和杨红，1 9 9 7 ) 。 球孢白僵菌孢子只有在适宜的条件下才能萌发和生长。其生活温度范围是 0 - 4 0 c ，最适温度在2 2 2 6 c 。湿度对于分生孢子的萌发极为重要，最适条件是 9 4 的相对湿度和2 8 的温度，以1 0 0 的湿度最为适宜，9 0 以下则不利于孢子 的萌发，过于干燥对孢子的生活力有不良影响；不同光质对分生孢子产生不同的 效应，一般的散射阳光对白僵菌孢子的萌发有促进作用，可提高萌发率4 。5 倍多。 不同的酸碱度对球孢白僵菌的孢子萌发有不同的影响，分生孢子在p h 3 0 9 4 间均 能萌发，p h 2 4 或是p i l l 0 0 则不萌发，以p h 4 4 时的萌发率最高，萌发也最快( 洪 华珠和杨红，1 9 9 7 ) 。在自然条件下，球孢白僵菌一般通过体壁侵染害虫，这种侵 染能力是力学原理和酶共同作用的结果，侵染过程包括昆虫体壁上的孢子附着、 萌发及芽管伸长，伴随着芽管胞外酶及机械作用而穿透昆虫体壁，菌丝继而在寄 主血腔中快速大量繁殖，寄主终因体内营养耗尽和充满菌体而变僵死亡( 翟锦彬 等，1 9 9 5 ；c l a r k s o n & c h a m l e y ，1 9 9 6 ) 。 这种侵染方式是昆虫病理学者所熟知的，目前学术界不存在昆虫病原真菌非 体壁侵染寄主的观点。然而从现有报道的实验中所使用的方法及其结果看，存在 着咀嚼式口器昆虫经口腔摄入病菌孢子而被感染的可能性，例如用带菌饵料饲虫 观察死亡。对于咀嚼式口器害虫，例如迁徙蚱蜢( m e l a n o p l u ss a n g u i n i p e s ) ，昆虫 3 病原真菌可以通过口器摄入方式感染寄主。但是这种方式作用下，球孢白僵菌的 致死效应下降，半致死时间延长，并且摄入的部分孢子未萌发就排泄而损失( 冯 明光，1 9 9 7 ) 。因此，提高球孢白僵菌侵染体在昆虫肠道中的存活和萌发率将有利 于增强其肠道感染的能力，为增强其对咀嚼式口器昆虫的毒力提供新的途径和线 索，但目前罕见相关研究报道。 1 2 昆虫中肠环境概述 昆虫中肠被认为是病原微生物与寄主互作的重要场所，是细菌、病毒等病原 物入侵虫体的重要靶标( s o b e r 6 n ，2 0 0 7 ；m e a de t a l ，1 9 8 8 ) 。然而，不同寄主昆虫的 中肠液酸碱度和酶系组成差异很大，不同目昆虫幼虫的中肠液性质差异很大( 邵 宗泽和喻子牛，2 0 0 2 ) 。如鳞翅目幼虫中肠液呈碱性( p h 8 0 1 0 5 ) ，其主要的中肠消 化酶是以胰蛋白酶( t r y p s i n ) 为主的丝氨酸蛋白酶( s e r i n ep r o t e a s e ) ( x u & q i n ，1 9 9 4 ； l e e & a n s t e e ，1 9 9 5 ；o r t e g oe ta 1 ，1 9 9 6 ) 和以淀粉酶( a m y l a s e ) 、纤维素酶 ( c e l l u l a s e ) ( j o r d a oe ta 1 ，1 9 9 9 ；n a k o n i e c z n ye ta 1 ，2 0 0 6 ；t e r r ae ta 1 ，1 9 8 5 ) 为主的糖 苷酶。许多鳞翅目幼虫中肠液中皆含有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶( c h y m o t r y p s i n ) 、 弹性蛋白酶( e l a s t a s e ) 、羧肽酶a ( c a r b o x y p e p t i d a s ea ) 、羧肽酶b ( c a r b o x y p e p t i c h a s e b ) 、亮氨酸氨肽酶( 1 e u c i n ea m i n o p e p t i d a s e ) ( c h r i s t e l l e re ta 1 ，1 9 9 2 ；x u & q i n ，1 9 9 4 ) 和0 【淀粉酶( 0 【a m y l a s e ) 、p 淀粉酶( 1 3 - a m y l a s e ) 、糖苷酶( g l y c o s i d a s e ) ( a z e v e d oe ta 1 ， 2 0 0 3 ；f e r r e i r ae la 1 ，1 9 9 8 ) 、葡萄糖苷酶( d i l l o n & k o r d y , 1 9 9 7 ) 。在多食性和食果 性幼虫中肠液中弹性蛋白酶的活性最高( c h r i s t e l l e re ta 1 ，1 9 9 2 ) 。然而，烟芽夜蛾 ( h e l i o t h i sv i r e s c e n s ) 肠液有较高的胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶活性，而弹性蛋白 酶的活性较低( j o h n s t o ne ta 1 ，1 9 9 5 ) 。不同蛋白酶在幼虫肠道中的空间分布也不 同，如茎蛀夜蛾( s e s a m i an o n a g r i o i d e s ) d f l 肠内胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋 白酶、羧肽酶b 主要分布在中肠前段围食膜与肠壁的间隙内；而氨肽酶和羧肽 酶a 则主要分布在围食膜外部空间内( o a e g oe ta 1 ，1 9 9 6 ) 。除了主要的几种糖苷 酶外，草地贪夜蛾( s p o d o p t e r af r u g i p e r d a ) 中肠消化道中还发现有a 乳糖苷酶 ( a g a l a e t o s i d a s e s ) ( g - r o s s m a n n & t e r r a , 2 0 01 ) 。 大多数鞘翅目幼虫中肠液为中性或略偏酸性( p h6 5 - 7 o ) ，其主要消化酶是半 胱氨酸蛋白酶和纤维素酶、淀粉酶为代表的一系列的糖苷键水解酶。例如两星瓢 虫似砌加b i p u n c t a t a ) 幼虫和成虫中肠液的p h 分别为6 0 和5 5 ，主要蛋白酶为半胱 4 氨酸蛋白酶( w a l k e re ta 1 ，1 9 9 8 ) ：一种天牛幼虫( r h a g i u mi n q u i s i t o r ) 的d ? 肠液p h 5 5 7 0 ，含有较高的纤维素酶和葡聚糖酶活性( z v e r l o v ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。也有少数鞘 翅目幼虫中肠液略偏碱性( p n7 0 7 5 ) ，其主要蛋白酶为胰蛋白酶( 如褐新西兰肋 翅鳃角幼虫( c o s t e l y t r az e a l a n d i c a ) ( c h r i s t e l l e r & s h a w , 19 8 9 ) 。而马铃薯甲虫 ( l e p t i n o t a r s ad e c e r r d i n e a t a ) 肠液虽为酸性( p n5 5 6 5 ) ，但含有胰凝乳蛋白酶、 羧肽酶a 、亮氨酸氨肽酶( n o v i l l oe ta l ，1 9 9 7 ) 。双翅目、半翅目幼虫中肠液呈弱碱 性，也是以胰蛋白酶( s i d e n - k i a m o se ta 1 ，1 9 8 9 ) 矛1 纤维素酶( n a k a s h i m ae ta 1 ， 2 0 0 2 ) 、淀粉酶、葡萄糖苷酶( j a e o b s o n & s c h l e i n ，2 0 0 0 ；z e n g & c o h e n , 2 0 0 0 ) 为主。 此外，蜚蠊目昆虫( 如美洲大蠊) 中肠消化道液除了普遍具有的几种糖苷酶外，还 具有罕见的昆布多糖酶活性( g e n t ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 1 3 真菌的细胞壁组成 细胞壁是细胞的最外层结构单位，它集中了细胞3 0 左右的干物质，同时坚 固的胞壁保持了细胞的形状。真菌细胞壁的主要成分是己糖或氨基己糖构成的多 糖链，如几丁质、脱乙酰几丁质、纤维素、葡聚糖、甘露聚糖等。此外还有蛋白 质、类脂、无机盐等。葡聚糖既是单细胞真菌( l e s a g e & b u s s e y , 2 0 0 6 ) 也是丝状真 菌等多数真菌的结构多糖( i s h i b a s h ie ta 1 ，2 0 0 4 ；s c h o f f e l m e e re ta 1 ，1 9 9 9 ) 。例如， 轮枝菌( v e r t i c i l l u m f u n g l c o l a ) 细胞壁的中性糖含量为4 8 7 ，不仅包括相当含量的 葡聚糖，而且含有较低分子量的甘露糖半乳糖葡萄糖聚合物 ( g l u c o g l a c t o m a n n o s e ) ( c a l o n j i ee ta 1 ，2 0 0 0 ) 。几丁质是除酵母外绝大多数丝状真菌 细胞壁的主要成分，占细胞壁干重的1 0 3 0 ( r a me ta 1 ，2 0 0 4 ) 。有些丝状真菌细 胞壁还包含一些壳聚糖，一些种类中壳聚糖甚至比几丁质还多，如鲁氏毛霉的菌 丝中壳聚糖占细胞壁干重4 - 8 ( w h i t ee t a l ，1 9 7 9 ；c h a t t e r j e ee t a l ，2 0 0 5 ) 。 不同纲的真菌细胞壁成分是不相同的，但所有真菌的细胞壁都有纤维状组分 和无定形组分。纤维状部分包括几丁质和纤维素，都是由1 3 ( 1 - - - 4 ) 多聚物形成的 微纤维，使孢壁坚固。无定形组分包括蛋白质、甘露糖和p ( 1 3 ) 、1 3 ( 1 - - 6 ) 、a ( 1 - 4 ) 葡聚糖，常混杂在纤维网中或纤维网的外部。以粗糙脉孢霉为例，采用专一 酶降解特异性的孢壁多聚物，用电镜观察胞壁各层化学组分，由外到内依次为： ( 1 ) 无定形葡聚糖，厚度约8 7n m ，( 2 ) 糖蛋白形成的粗糙的网，厚度约4 9n m 。( 3 ) 蛋白质层，约9n m 。( 4 ) 放射状排列的几丁质纤维丝，可能还有蛋白，厚约1 8n m 。 另外，在衰老的菌丝和孢子表面常出现一些附加的物质，最常见的组分是黑色素 和脂肪。黑色素是由酚化合物的氧化作用和聚合作用产生的，然后掺入胞壁中。 脂肪常聚在胞壁的内层( 周与良和邢来均，1 9 8 6 ) 。 真菌细胞壁作为细胞与外界环境的中介，在细胞的代谢活动中具有举足轻重 的生物学功能。它调节细胞内外的物质交换，并参与细胞的免疫应答和细胞识别 等一系列生物学过程。葡聚糖是真菌细胞壁多糖的主要成分，发挥多种生物学功 能，其中最重要的是结构功能。由中度分枝的p 葡聚糖构成的三维网状结构在很 大程度上决定了细胞壁的机械强度( k i se ta 1 ，2 0 0 2 ；p 6 r e z & r i b a s ，2 0 0 4 ) 。葡聚糖 组分化学性质及相应生物学功能对于真菌的生理生化功能非常重要，且具有多样 化特点( m a u b o n e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。葡聚糖和几丁质构建了细胞壁的骨架，蛋白质则赋 予细胞壁充分的活力，甘露聚糖等蛋白质复合物填充在细胞壁上，是细胞壁主要 的功能分子，负责完成细胞壁的各种生理功f l 邑( m a r c i l l ae ta 1 ，1 9 9 8 ) ，在真菌整个 生命周期中扮演着重要角色。根据溶解特性，真菌细胞壁甘露糖蛋白分为三类， 即通过氢键结合的s d s 可抽提蛋白、通过二硫键结合的琉基试剂可抽提蛋白， 以及通过共价键与胞壁葡聚糖结合的蛋e t ( d a m v e l de ta 1 ，2 0 0 5 ) 。胞壁蛋白质尤其 与葡聚糖共价结合的甘露糖蛋白，在表达、分泌以及在细胞壁上的定位各不相同， 表现出的功能也呈多样化。葡聚糖结合甘露糖蛋白参与酵母多种生物学功能，如 吸附凝集、热激反应、酶以及维持细胞形态等，详尽的综述见k i se ta 1 ( 2 0 0 2 ) 。 鉴于真菌细胞壁的重要生理作用，球孢白僵菌孢子壁上的糖类及蛋白类物质 能否成为昆虫中肠消化酶的作用底物而被消化降解，从而失去相应的生理功能， 尚有待研究。 1 4 流式细胞术的原理及在微生物学中的应用 流式细胞术( f l o wc y t o m e t e rm e a s u r e m e n t ，简称f c m ) 是一种对细胞的物理 或化学性质，如大小、内部结构、d n a 、r n a 、蛋白质和抗原等进行快速测量 并可分类收集的高技术，它综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力 学、细胞化学等各门学科。其主要原理为：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制 的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和 荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根 据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达9 9 。包被细胞的液流称为 6 鞘液，所用仪器称为流式细胞计。该技术的特点首先是快速，可在短时间内得到 大量数据；其次能进行多参数测量，以获得参数间大量的相关信息；最后能依据 信息，对细胞群体的各种亚群进行分类收集，即分选( 宋平根，李素文，1 9 9 2 ) 。 很多待检样品需要经过酶解消化成单细胞，悬浮后经适当的荧光染料染色等 一系列复杂的处理步骤后才能进行流式细胞仪的检测。而微生物细胞悬浮简单， 易于进行荧光染色且细胞分裂方式简单，所以很容易制作流式细胞术检测样品。 在发酵工业中，f c m 主要用于检测发酵液和发酵产品中细菌总数、活菌数目和 死菌数目( l a p l a c ee ta 1 ，1 9 9 3 ；g u n a s e k e r ae ta 1 ，2 0 0 0 ；m a l a e r i n oe ta 1 ，2 0 0 i ) 。在 医学微生物领域，f c m 主要应用于临床细菌的检测和药敏试验等方面( k u s u n o k i e ta 1 ，2 0 0 0 ；k i r ke ta 1 ，1 9 9 8 ；s u l l e re ta 1 ，1 9 9 9 ) ，在环境微生物的检测中，f c m 与荧光原位杂交技术相结合，已成为研究微生态系统中细菌群落结构的一个非常 有效的手段( j o a c h i m s t h a le ta 1 ，2 0 0 4 ；j o n a t h a ne ta 1 ，2 0 0 0 ；s t o p ae ta 1 ，2 0 0 0 ) ，另 外还有f c m 用于细菌鉴定方面的报道( k i m e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。有关f c m 在真菌检测 方面的报道多见于发酵工业和酿造行业，通过细胞周期、胞内物含量等方面的研 究对发酵和储存过程进行实时监测，从而为生产和存储工艺的优化提供理论依据 ( d e e r ee ta 1 ，1 9 9 8 ；s f i e n ce ta 1 ，1 9 9 9 ) 。f c m 在霉菌应用方面的报道较少，但仍有 科学家利用f c m 技术从花粉样品中分选植物病原菌的孢子( d a ye ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 流式细胞术作为一种日渐成熟的技术，已经深入到微生物学研究的各个领域， 目前对生防真菌的研究鲜有使用该技术，然而由于流式细胞术的灵敏快速分选特 点，它很可能为这一大类真菌的研究提供新的技术方法。 1 5 扫描电子显微镜简介及在微生物学中的应用 扫描电子显微镜( s c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p e ，s e m ) 于2 0 世纪6 0 年代问世， 用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品 表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的 表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经 光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子 束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面 发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电 子束的轰击下发出次级电子信号( 马金鑫和朱国楷，1 9 8 5 ) 。 7 对生物样品进行扫描电镜观察，样品的制备极其关键。由于生物样品具有生 物活性、含水量高，所以很难进行较为彻底的干燥，由于扫描电镜观测室内的高 真空环境，故而这些不能彻底干燥的样品很容易发生凹陷，不能保持原貌，影响 观测结果。目前最常用的干燥法为真空冷冻干燥或是临界点干燥，相比而言后者 更加适用于生物样品，这种干燥法特别适用于含水生物样品，当液体处于临界状 态时，消除了物相界面，表面张力等于零，在此条件下使样品干燥，能够保持样 品的结构不产生变形。 鉴于扫描电子显微镜对孢子表面结构的超显微功能，目前已有越来越多的研 究者利用这一技术进行微生物表面精细形貌和结构的观察和分析研究。从七十年 代起，就有报道利用扫描电子显微技术来观测真菌孢子表面形态和结构，例如观 察粗糙脉胞菌( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 孢子壁表面，发现由棒状的肌束蛋白单层紧密 排列，偶有重叠( d e m p s e ye ta 1 ，1 9 7 9 ) 。小麦印度腥黑穗病菌( t i l l e t i ai n d i c a ) 孢壁 的棒状肌束层明显不同于其他真菌，由超细微的长度仅有2 4 0n l l l 的棒状蛋白组成 ( g a r d n e re ta 1 ，1 9 8 3 ) 。扫描电镜技术也用来研究杀虫真菌( 如：球孢白僵菌) 表面 肌束蛋白( b i d o c h k ae ta 1 ，1 9 9 5 ) 及其介导的孢子对昆虫体表的吸附能力( b o u e i a s 甜a ，1 9 8 8 ) 。 1 6 本文的研究内容及意义 综上所述，球孢白僵菌两种主要的侵染体分生孢子和芽生孢子在进入昆虫中 肠环境之后，酸碱度和消化酶是否影响到其细胞结构和生物活性，从而使体内侵 染途径终止或者减弱，尚未有深入的研究阐明。为此，本研究首先筛选出一株能 稳定表达绿色荧光蛋白的球孢白僵菌遗传转化菌株，然后模拟昆虫中肠环境处理 其孢子，用流式细胞仪检测孢子绿色荧光强度的变化情况，用以反映模拟消化液 对孢子产生的影响；其次，用扫描电子显微镜观察孢子表面结构，比较处理前后 表面蛋白及结构，推测不同种模拟消化液的作用方式和特点；最后，结合模拟消 化液处理后孢子萌发情况，阐明孢子在昆虫中肠内生物学活性的改变。 本研究是有关昆虫中肠环境对生防真菌孢子结构和生物活性影响的深入阐 述，以期为增强生防真菌在寄主肠道中的存活和侵染力提供生物学依据。 8 2 具遗传标记的球孢白僵菌转化菌株的生物学筛选 对微生物菌株的多项生物学特征性指标进行综合评定，筛选出最适应用或者 研究的特定菌株，这就是生物学筛选的基本思想。环境温度不仅影响孢子的萌发 生长，还影响孢子的稳定性。在1 5 。c 以下和3 5 。c 以上的环境中，白僵菌孢子的发 芽和生长均受抑n ( l u z & f a r g u e s ，1 9 9 7 ) ，炎夏高温甚至完全阻止孢子萌发( 见梁 宗琦和叶育昌，1 9 9 4 ) ，从而影响菌丝生长( o u e d r a o g oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 、侵染速率( 许 寿涛等，2 0 0 2 ) 和毒力( 刘银泉等，2 0 0 0 ) 。因此，具有一定的耐热性成为生防真菌 是否可以投入应用的关键性指标。毒力是评价生防真菌的另一重要指标，目前主 要以半致死时间和半致死浓度来评价毒力的高低，同种生防真菌，半致死时间和 半致死浓度越低，杀虫效率越高，效果越好。此外，还应考虑筛选出具有产业化 价值的适于发酵生产的菌株。 球孢白僵菌b b 2 8 6 0 对多种蚜虫均表现出较高毒力( f e n g & j o h s o n ，1 9 9 0 b ； f e n ge ta 1 ，1 9 9 0 a ；d o r s c h n e re ta 1 ，1 9 9 1 ) ，对螨卵也有强杀作用( s h i & f e n g ，2 0 0 4 ) ， 已被开发成真菌杀虫剂用于防治温室粉虱( f e n ge ta 1 ，2 0 0 4 a ) 及茶小绿叶蝉( f e n g 刃a 1 ，2 0 0 4 b ；p ue ta 1 ，2 0 0 5 ) ，以该菌为遗传转化标记的出发菌株，转入绿色荧光 蛋白基因，随机选取六株转化子。以荧光蛋白为报告基因的菌株在昆虫病理学等 方面有许多潜在的应用，然而野生菌株生物学特性是否受外源基因的影响值得关 注和评价。因此，筛选高表达绿色荧光蛋白遗传转化菌株，并评价其耐热力、毒 力等生物学特性的变化，是本章研究的中心内容。 2 1 材料和方法 2 1 1 供试菌株 球孢白僵菌b b 2 8 6 0 g 0 野生型菌株分离自麦二叉蚜( f e n g & j o h s o n , 1 9 9 0 b ) ； b b 2 8 6 0 g 1 、b b 2 8 6 0 g 2 、b b 2 8 6 0 g 4 、b b 2 8 6 0 g 6 、b b 2 8 6 0 g 8 、b b 2 8 6 0 g 1 2 均为菌 株b b 2 8 6 0 g 0 绿色荧光蛋白基因的遗传转化菌株( y m ga n df e n g ，2 0 0 6 ) 。均在萨氏 培养基s d a y ( 葡萄糖4 、蛋白胨1 、酵母粉l 和琼脂2 ) 上培养产孢，2 0 。c 保存。 2 1 2 分生孢子的制备 将低温保存的系列转化予取出接种于萨氏培养基( 4 葡萄糖、1 蛋白胨、1 9 酵母粉，英文简称s d a y ) 斜面，在2 5 1 活化培养7d 。取斜面上分生孢子转 接到直径9c m 的s d a y 平板上，相同条件下继续培养7d ，将产孢平板置于3 1 恒温箱中烘干2 4h ，刮下平板表面的孢子粉进行常温真空干燥，将干燥孢子粉保 存于4 c 冰箱中待用。 2 1 3 不同菌株的荧光强度筛选 利用流式细胞仪( b dc o r p o r a t i o n ，f a c sc a l i b u r ) 检测b b 2 8 6 0 g 0 ( 野生型) 、 b b 2 8 6 0 g 1 、b b 2 8 6 0 g 2 、b b 2 8 6 0 g 4 、b b 2 8 6 0 g 6 、b b 2 8 6 0 g 8 、b b 2 8 6 0 g 1 2 的平均 荧光强度( m e a nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i o n ，m f i ) ，参数设置如下：激发光源4 8 8n m ( 激 发4 9 5n m ，吸收51 0n m ) ，在荧光1 通道( f l l ) 检测荧光强度。 2 1 4 分生孢子耐热力的筛选 悬浮各菌株孢子粉5m g 于1m l l0 0 1 t w e e n - 8 0 水溶液中，随机取1 0 0 止 孢子悬液于装有lm l 孢子萌发液( 含2 蔗糖和0 5 蛋白胨) 的1 0 “试管中，震 匀后4 8 恒温水浴4 5r a i n ，立即取出并在2 5 1 下振荡( 9 0r m i n ) 培养2 4h 。 用血球计数板显微镜观察计数各个试管中孢子的萌发率，并以未经水浴的相同萌 发液中的孢子萌发率作为对照( c k ) 。各菌株的耐热力每次测定各菌株设3 个重 复。 2 1 5 不同耐热力菌株的菌落生长观察 选取4 株( 包括野生型菌株b b 2 8 6 0 g 0 ) 易于平板生长但是耐热力明显不同的菌 株在2 5 下进行生长速率测定。将各菌株的干燥孢子粉用0 0 1 t w e e n - 8 0 分别 配成l x l 0 6 个m l 的悬液，使直径2 5m n l 的滤纸圆片浸没于孢子悬液中，取出置 于萨氏平板中央进行接种( 俞佳，2 0 0 6 ) 。2 5 c 恒温培养7 d 后，每隔2 4h 描画出各 平板上菌落的形状，扫描后根据像素和分辨率计算实际菌落面积，作为参试菌株 的菌落生长指标。实验设3 个重复。 2 1 6 耐热菌株的生物测定 孢子粉的制备接种b b 2 8 6 0 g 0 ( 野生型) 、b b 2 8 6 0 g 6 、b b 2 8 6 0 g 8 孢子粉于萨 氏培养液，2 5 c 振荡( 1 5 0r m i n ) 培养4 8 7 2h ，所获种子液与灭菌并适度熟化的大 米混合均匀，摊于直径1 5c m 的培养皿中，2 59 c 固相发酵产孢8d ，发酵产物在 3 1 下通风干燥4 8h 后过2 0 0 目标准筛，收集的孢子粉经常温真空干燥1 2h 后 贮于2 0 。c 冰箱备用，所有孢子粉的活孢率均不低于9 0 。 i o 供试桃蚜试虫全部采用采用桃蚜的无翅成蚜，虫龄控制在最后一次蜕皮后不 超过2 d 。将无翅成蚜3 0 头一组移至直径9c m 的甘蓝圆片上，在温湿可控培养 箱内( 2 3 士2 ，1 2 l ：1 2 d ) 任其繁殖2 4h ，然后除去成蚜，新产若蚜原处饲养至4 龄 时，每4 0 头一组分别移至直径新的甘蓝圆片上继续饲养，所有蚜虫完成最后一 次蜕皮后即用于以下接种实验。 生物测定每个菌株对桃蚜的生物测定均采用标准喷塔法接种( r ee ta 1 ， 2 0 0 5 ；顿玉慧等，2 0 0 3 ) 。用0 0 1 t w e e n 8 0 的配置成浓度梯度为1 0 8 、1 0 7 及1 0 6 个m l 孢子悬液，以无菌水作为对照处理( c k ) ，每剂量重复三次。喷茵前先将 一盖玻片平放在培养皿叶片上，收集沉降的孢子以将叶片及虫体上的孢子附着量 标准化为孢子数m m 2 。接种从对照、低浓度至高浓度，将载有蚜虫和叶片培养 皿置于自动喷塔( s p r a yt o w e r , b u r k a r ds c i e n t i f i c l t d ， u x b r i d g e ，m i d d x ，u k ) 的载物 台上，在1 7k g c m 2 的喷雾压 力下将1 0m l 无菌水( c k ) 或 孢子悬液( 剂量处理) 自喷头由 上而下喷到载物台上，沉降5 s e c 之后取出培养皿，加盖后 置于光照培养箱 ( 2 5 士1 ，1 2 l ：1 2 d ) 中饲养观 察，逐日定时记录死亡蚜虫 数。蚜尸在2 5 2 下保湿培养， 根据体表长出的菌物特征确 认有效侵染致死。 数据分析所获各菌株对 桃蚜的生侧数据采用时间剂 量死亡率模型方法( 唐启义和 冯明光，2 0 0 2 ) 进行模拟分析， 再用拟合的剂量效应和时间 港厂 _ i 砉别 雩k 一j 哇圃1 = 肼| 5 蔚 ：l 。j 哇田 哇田 圆 i ：j量i o k _ 。l 到l 罨田 图2 1 流式细胞仪测定不同菌株的荧光强度 f i g 2 1f l u o r e s c e n ti n t e n s i t yo fb b gs e r i e si s o l a t i o n se o n i d i a f r o mf l o wc ) ，t o m e t e r 效应参数估计随时间变化的致死中浓度( l c 5 0 ) 及其9 5 置信区间。分析均采用 d p s 数据处理系统软件。 2 2 结果与讨论 2 2 1 强绿色荧光蛋白表达菌株的筛选 b b 2 8 6 0 g 0 ( 野生型) 、b b 2 8 6 0 g 1 、b b 2 8 6 0 g 2 、b b 2 8 6 0 g 4 、b b 2 8 6 0 g 6 、 b b 2 8 6 0 g 8 、b b 2 8 6 0 g 1 2 菌株制备的孢子悬液通过流式细胞仪的检测，在f l l h 通道下每1 0 0 0 0 个孢子的平均荧光强度( m f i ) 分别为6 8 、5 3 9 、5 3 4 、4 2 9 、1 2 8 9 、 4 9 、6 7 4 ，其波谱图及相关参数如图2 1 ，其中b b 2 8 6 0 g 0 ( 野生型) 与b b 2 8 6 0 g 8 的平均荧光强度较低，可认为其不发荧光，或者只存在一些胞内荧光。b b 2 8 6 0 g 6 的平均荧光强度是其他发荧光的菌株的2 倍，中值( m e d i a n ) 达9 4 8 ，明显高于其 他菌株，而其他发光菌株的中值从3 4 6 4 8 3 不等，b b 2 8 6 0 g 6 菌株显然是最优的 能够稳定表达绿色荧光蛋白基因的菌株。 2 2 2 分生孢子耐热力筛选 b b 2 8 6 0 g 系列6 菌株经热胁迫后，孢子活孢率从强到弱依次为： b b 2 8 6 0 g 6 b b 2 8 6 0 g 1 2 b b 2 8 6 0 g 4 b b 2 8 6 0 g 8 b b 2 8 6 0 g 1 b b 2 8 6 0 g 2 b b 2 8 6 0 g 0 如图2 2 所示，热胁迫后分生孢子的残存活孢率在各个菌株间差异极显著 ( f 6 , 5 6 = 7 3 4 ，p 0 0 1 ) ，各菌株的平均残存活 孢率范围为2 5 5 7 6 ，这说明各转化子 菌株耐受4 5 m i n4 8 热胁迫的能力方面差 异极大。菌株b b 2 8 6 0 g 6 、b b 2 8 6 0 g 1 2 和 b b 2 8 6 0 g 4 在热胁迫后的残存活孢率均在 5 5 以上，说明它们的孢子耐热力极强。 2 2 3 不同耐热力菌株的菌落生长比较 建 造 藿 0124681 2 菌株( 勘gs e r i e s ) 图2 2 不同菌株分生孢子的耐热存活率 f i g 2 2t h es u r v i v a li n d i c e so ft h eb b g s e r i e si s o l a t i o n sc o n i d i a e r r o rb a r s ：s d 表2 1 不同耐热力菌株的菌落生长情况( 单位：嗍2 ) t a b l e 2 1t h eg r o w t ha r e ao f 4i s o l a t e so fb b 2 8 6 0 gs e r i e s 注；小写字母表示同一培养时间不同菌株菌落面积的显著 胜差异( t u r k e y sh s d ，p 0 0 5 ) 1 2 从耐热力强、较强和弱的球孢白僵菌菌株中选出易于在s d a y 平板上生长 的菌株b b 2 8 6 0 g 0 、b b 2 8 6 0 g 1 、b b 2 8 6 0 g 6 和b b 2 8 6 0 g 8 进行在2 5 温度下菌株 生长观察，结果如表所示。四菌株在2 5 下的生长均表现良好，第7 天的菌落 面积差异极显著( f 3 。6 = 9 8 ，p 0 0 1 ) ，其中b b 2 8 6 0 g 0 、b b 2 8 6 0 g 6 和b b 2 8 6 0 g 8 菌 落面积差异不显著( 4 6 8 4 8 1m m 2 ) ，菌株b b 2 8 6 0 g 1 的菌落面积显著较低( 3 6 3 m m 2 ) 。四菌株在前5 天生长的菌落面积差异不显著，在第6 天开始，b b 2 8 6 0 g 1 明显落后于其他3 株菌株，第7 天则相差异进一步加大。 2 2 4 生物测定 3 株菌株：b b 2 8 6 0 g 0 ( 野生型) 、b b 2 8 6 0 g 6 、b b 2 8 6 0 g 8 处理桃蚜的累计死 亡率观察值见图2 3 。生测数据用时间剂量死亡率模型模拟，在模型模拟异质 性( h o s m e r - l e m e s h o w ) 检验中，b b 2 8 6 0 g 0 ( 野生型) 、b b 2 8 6 0 g 6 、b b 2 8 6 0 g 8 三个 转化子的h - l 统计量( 分组卡方值) 分别为1 0 6 ( d f - - - - 8 , p = 0 2 2 ) ，1 2 6 ( d f = - 8 , p = 0 1 2 ) ， 1 6 5 ( d 乍1 0 , p = 0 0 8 ) ，均显著小于a = 0 0 5 水平下的临界值。这说明所拟合模拟不 存在明显异质性，拟合良好。模型参数和) ! j 后估计值的，检测均达极显著水平 ( 尸 o 0 1 ) ，表明3 个菌株对桃蚜的剂量效应与时间效应都极显著。3 菌株的剂量 效应参数分别为1 1 0 、0 9 6 、1 6 7 ，说明在相同的孢子剂量下，b b 2 8 6 0 g 8 的 杀蚜活性优于b b 2 8 6 0 g 0 ( 野生型) 与b b 2 8 6 0 g 6 。3 菌株都在接种后第5 天的时间 效应参数最大( 3 8 4 ，3 6 3 ，4 9 2 ) ，表明此日是蚜虫死亡的高峰日，b b 2 8 6 0 g 0 ( 野生 型) 与b b 2 8 6 0 g 6 的时间效应值接近，说明杀蚜效应接近；b b 2 8 6 0 g 8 则最大，说 明其在三者中的杀蚜效应最优。 q ，_ 一印r ，r p - _ o _ _ o ， 图2 3 桃蚜在不同转化子水悬液喷雾的不同附着量( 孢子数m m 2 ) 下的累计死亡率( 菌株：a ： b b 2 8 6 0 g 0 ；b ：b b 2 8 6 0 g 6 ；c ：b b 2 8 6 0 g 8 ) f i g 2 3c u m u l a t i v em o r t a l i t y ( b a t ：s d ) o f 彪p e r s i c a ei n d i v i d u a l sa t t a c h e dw i t hd i f f e r e n t c o n c e n t r a t