（微生物学专业论文）产耐酸性α淀粉酶菌株的筛选、发酵条件及酶学性质研究.pdf

摘要 近年来，随着淀粉质原料深加工工业的发展，一些淀粉原料深加工工艺需要在 较低的p h 条件下进行。耐酸性泓淀粉酶的出现，采用新的酶法工艺，对于降低原 料消耗、提高工业生产废品的利用和处理等领域，具有极大的应用潜力和开发前景。 本研究旨在获得耐酸性舡淀粉酶的产生菌株，并对该菌株的发酵条件及酶学性质进 行研究。 从淀粉厂的土壤中筛选到一株产耐酸性小淀粉酶的菌株z y 8 。此菌株具有较高的 产酶能力，根据该菌株的培养特征、形态学特征初步鉴定为黑曲霉。 研究了液态产酶培养基和培养条件对z y 8 菌株产酶的影响。适宜的液态发酵培 养基为：可溶性淀粉5 0 9 r t , 、柠檬酸氢二铵2 0 9 ，l 、k h 2 p 0 4 3 9 i 、c a c ho 1 9 t , 、 f e s 0 4 7 h 2 00 0 1 9 l 、m g s 0 4 7 h 2 01 9 l ：适宜的培养条件为；起始p h 4 0 、培养温 度3 0 以及最佳接种量为2 ，z y 8 菌株在此条件下培养7 2 h ，耐酸性舡淀粉酶的 活力达到1 9 8 6u m l ，比优化前提高了1 8 倍。 研究了固态产酶培养基和培养条件对z y 8 菌株产酶的影响。适宜的固态产酶培 养基为：2 5 0 m l 的三角瓶中麸皮5 9 、可溶性淀粉0 5 9 、黄豆粉o 5 9 ，用营养盐 ( k i 1 2 p 0 42g t , ，n h 4 p 0 45g t , ，n a c ile e l ，m g s 0 4 7 h 2 0lg l ) 调节培养基起始湿 度为7 0 。适宜的培养条件为：培养基初始含水量为7 0 ，起始p h 4 0 、温度3 5 。c 、 接种量为5 以及培养时间为4 2 h 。 对z y 8 菌株固态发酵曲中耐酸性洳淀粉酶的浸提条件、粗酶制备工艺的条件进行 了研究。最佳浸提条件为：培养好的发酵曲按l ：3 加入p h 值5 0 左右、3 5 温水，浸泡 3 h 。浸提液在4 c 、p h 4 0 4 5 条件下与无水乙醇混合成乙醇体积分数为7 0 的溶液中 静置沉析，离心后于4 0 低温干燥。采用该工艺进行粗酶的制备，产品综合回收率在 7 0 以上，产品酶活力为1 5 0 5 7 u r a g 。 耐酸性舡淀粉酶反应的最适p h 值为4 0 ，最适温度为7 0 。该酶具有较强的热稳 定性和酸稳定性，在9 0 ( 2 下处理3 0 m m 残余酶活性为5 0 2 ；在4 0 、p h 2 5 范围内分 别处理1 h ，剩余酶活力仍达8 5 - 9 6 。s d s - p a g e 结果显示，酶的相对分子量约为 5 6 k d 。n o n d e n a t u r i n g - p a g e 泳出现1 条活性亮带。可溶性淀粉溶液经该耐酸性甜淀 粉酶水解后，其反应产物的薄层层析结果表明此酶水解淀粉生成葡萄糖和麦芽糖等低 聚糖。酶学特性表明该酶有很好的应用前景。 关键词：黑曲霉，耐酸性洳淀粉酶，发酵，浸提 a b s t r a e t w 曲t h ed e v e l o p m e n to fs t a r c hp r o c e s s i n gi n d u s t r y , m o l ea n dm o r es t a r c hp r o c e s s i n g t e c h n o l o g i e sn e e da - a m y l a s ew h i c hc o u l dk e e ps t a b l eu n d e rl o wp h c o n d i t i o n s as p e c i a l e n z y m e , a c i d - r e s i s t a n ta - a m y l a s e c a nb eu s e di ns t a r c hp r o c e s s i n gu n d e rl o wp h 1 1 l e a p p l i c a t i o no ft h ee n z y m ec a ni m p r o v ea n dm o d i 鸟t h es t a r c hp m c e s s i n g ，r e d u c et h ec o s t o f t h ep r o d u c t i o na n dh e l pt os o l v et h e i rd i s p o s a la n dp o l l u t i o np r o b l e m se t c n 坞o b j e c t i v e o f t h i ss t u d yw a st h es e l e c t i o no f s u i t a b l ea c i d - r e s i s t a n ta - a m y l a s e - p r o d u c i n gs t r a i n , s t u d i e s o nf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa n da c i d - r e s i s t a n ta - a m y l a s ep r o p e r t i e s 1 1 ”s t r a i nz y 8p r o d u d n ga c i d - r e s i s t a n ta - a m y l a s ew a si s o l a t e df r o ma c i d i cs o i l d e a ras t a r c hp r o c e s s i n gf a c t o r y ms t r a i nh a dh i 曲a b i l i t yt op r o d u c ea c i d - r e s i s t a n t a - a m y l a s e a 洲d i n g t oa n a l y s i so f t h ec u l t u r ec h a r a c t e r i s t i c sa n dm o r p h o l o g y , t h es t r a i n c o u l db ei d e n t i f i e da sa s p e r g i l l u sn i g e r t h el i q u i ds t a t ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no fz y 8w a so p t i m i z e d , a n dt h eo p t i m a l m e d i u mc o n _ c a i n e ds o l u b l es t a r c h5 0 9 化a m m o n i u mc i t r a t ed i b a s i c2 0 9 化k i - 1 2 p 0 4 3 9 l ， c a c l 20 1 9 lf e s 0 4 7 h 2 0o 0 1 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 0l g 几；1 1 l eo p t i m a li n i t i a lm e d i u mp h , c u l t u r et e m p e r a t u r ea n di n o c u h m ss i z ew a s4 0 3 0 ca n d2 r e s p e c t i v e l y t 1 圮a c t i v i t y o fa c i d - r e s i s t a n ta - a m y l a s ec o u l dr e a c h1 9 8 6 u m la n 盱c u l t u r e di nt h eo p t i m i z e d c o n d i t i o nf o r7 2 h , w h i c hw a s1 8t i m e sh i g h e rt h a np r e o p t h n i z e dc u l t u r ec o n d i t i o n 1 1 1 es o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no f z y 8w a sa l s oo p t i m i z e d n 璩r e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ，t h eo p t i m a lm e d i u me n n t a i n e dw h e a tb r a n5 9 , s o l u b l es t a r c h0 5 9 ，y b e 觚0 5 9 , s a l ts o l u t i o n ( i n 1 2 p 0 42 班，n h 4 p 0 45g l ，n a c l1g l ，m g s 0 4 7 i - 1 2 0lg ：l ) 1 4 m li n 2 5 0 m lf l a s k , 1 1 坞o p t i m a li n i t i a lm e d i u mp h , i n i t i a lm o i s t u r e c u l t u r et e m p e r a t u r ea n d i n o c u h m ss i z ew e r e4 0 ，7 0 ，3 5 ，a n d5 r e s p e c t i v e l y 硼 1 ec r u d ea c i d - r e s i s t a n t a - a m y l a s ep r e p a r a t i o nw a s o b t a i n e db ys o l i ds t a t e f e r m e n t a t i o no fz y 8s t r a i n , t h ee x t r a c tc o n d i t i o n sa n do r u d ee n z y m ep r o d u c et e c h n o l o g i e s w e r es t u d i e d 硼o p t i m u me x t r a c tc o n d i t i o nw s st h a tt h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t i o n sw o r e d i p p e di n3t i m e sv o l u m eo f w a t e ra st h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t i o n sa t3 5 ca n dp h 5 0f o r3 h o u r s 1 1 e x t r a c ts o l u t i o no b t a i n e db yf i l t r a t i o nw a sm i x e dw i t ha l c o h o la n dt h ef i n a l c o n c e n t r a t i o no fa l c o h o lr e a c h e dt o7 0 a f t e rc e n t r i f i c a t i o n , 1 1 圮r e f i n e ds o l i dw a sd r i e d a t4 0 c u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o a s ，t h et o t a lp r o d u c ty i e l dw a sa b v e7 0 ，a n dt h e a c t i v i t yo f a c i d - r e s i s t a n ta - a m y l a s ew a s1 5 0 5 7 u m g 。 t h es t u d yo f t h ee n z y m ep m p e r t i e ss h o w e d0 1 a to p t i m a lp hv a l u ea n dt e m p e r a t u r ew e r e4 0a n d7 0 c ， r e s p e c t i v e l y t h ee n z y m ew s ss t a b l eu n d e rp h 2 o 5 0 a n dt h er e s i d u ee n z y m ea c t i v i t yw a s5 0 2 u n d e r 9 0 f o r 3 0 m i n t h er e s i d u ea c t i v i t y w a s 8 5 - - 9 6 a f t e r t h e b n z y m c w a s k e p t a t 4 0 c 、p h 2 5 f o r1h ar e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h ta b o u t6 5 k da p p e a r e di ns d s p a f _ 匾t h ec l e a rz o n c0 1 1ab l u e b a c k g r o u n dw a sa p p e a r e di nn o n d e n a t u r i n g - p a g e ；t h er e s u l t so ft h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y d e m o n s t r a t et h a tt h ep r o d u c t sf r o ms t a r c hc a t a l y z e db yt h ee n z y m ea l - eg l u c o s e 、m a l t o s ea n do t h e r o l i g o s a c c h a r i d e t h i se n z y m es h o u l db ec l a s s i f i e da s 龇e n d o e n z y m e t h ep r o p e r t i e so ft h e e n z y m ei m p l yi th a sg o o dp c o s p e c to f u s e i nt h ef u t u r e k e yw o r d s ：a s p e r g i l l u sn i g e r ，a c i d - r e s i s t a n ta - a m y l a s e , f o r m e n t a t i o n , e x c a c t i o n m 独创性声明 本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽 农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名： 翘空盈 签字日期：一年6 月u 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文件， 允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 。 学位论文作者签名：童衄 签字日期：o 年6 月够日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通信地址： 指导教师签名：茎篷型i 签字日期：0 年6 月g 日 电话： 邮编： 文献综述 淀粉酶是能催化淀粉和糖原水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一类酶的 总称，在淀粉糖工业、食品工业以及酿酒行业中被广泛应用【n 。淀粉酶是最早用于工 业化生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。早在1 9 1 5 年法国b o i d c 等开始用枯草杆菌生产细菌淀粉酶，并用于纺织品退浆。1 9 5 9 年日本采用淀粉酶和糖 化酶进行淀粉的液化和糖化，确定了酶法制造葡萄糖浆的工艺【2 1 ，随着淀粉酶应用领 域的不断扩大，淀粉酶的生产显示出了越来越重要的地位。 不同种类的淀粉酶水解淀粉会生成不同的糖类产物，根据水解淀粉的作用方式， 淀粉酶可分为a - 淀粉酶、p - 淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶。b 淀粉酶是从淀粉的 非还原性末端切下一分子的麦芽糖，又被称为糖化酶，其产物还原性末端葡萄糖单位 碳原子为b 构型；葡萄糖淀粉酶是从底物非还原末端顺次水解旷l ，4 糖苷键和分支的 a - 1 ，6 糖苷键，生成葡萄糖。异淀粉酶是只水解糖原或支链淀粉分支点的旷1 ，6 糖苷键， 切下整个侧枝；a 淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、 糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为a 构型，同时该酶能使淀 粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶。 根据静淀粉酶性质的不同，可以把弘淀粉酶分为耐热性鼬淀粉酶、耐碱性a 淀粉 酶、耐盐性一淀粉酶和耐酸性c t - 淀粉酶，其中，耐酸性口淀粉酶是在低酸性条件下能 水解淀粉的a 一淀粉酶。自1 9 6 3 发弼a a s p e r g i l l u sn i g e r 可以产耐酸性a 淀粉酶以来，许多 国家都对其展开了研究唧。随着淀粉加工工艺条件的改变，酶制剂行业也必须不断更 新和完善淀粉酶的种类以满足工业生产的需要，耐酸性洳淀粉酶的开发势在必行。凭 借其特有的耐酸性，耐酸性小淀粉酶可广泛应用于饮料的发酵、青贮饲料的生产、药 物的生产、工业副产品的加工以及工业生产废品的利用和处理等领域【4 棚。耐酸性洳 淀粉酶作为一种极端环境淀粉酶，也越来越受到人们的注意，随着其分子组成、酶学 性质的更加清晰，其利用价值也日益被人们所认识。 1 1 耐酸性洳淀粉酶的来源 早在1 9 6 3 年，日本的研究者y a s u j im i n o d a 等人就发现可以用真菌生产耐酸性洳 淀粉酶，以后欧洲、美国、中国等国家都对耐酸性a 淀粉酶进行了研究【3 4 1 。芬兰的 研究者制备了用于高麦芽糖浆生产的耐酸性肚淀粉酶，其最适p h 为5 0 ；日本的研究 者用白曲霉生产一种耐酸性a 淀粉酶，最适p h 为3 5 ，适用于烧酒制备中淀粉原料的 加工；江南大学工业生物技术教育部重点实验室从淀粉加工厂的酸性土壤中筛选得到 一株野生菌，鉴定为b a c i l l u ss t e o r o t h e r m o p i l i u s ，该菌株能生产两种酸性淀粉酶，其最 适p h 分别为4 5 和5 0 1 6 j ；南京理工大学生命科学学院得到一株青霉菌株产酸性d 淀粉 酶的最适p h 为4 4 【舯。根据文献报道，目前耐酸性a - 淀粉酶大多来源于微生物，产该酶 的微生物主要是芽抱杆菌和曲霉。 l ，2 耐酸性洳淀粉酶的研究现状 1 2 1 耐酸性a 淀粉酶的理化性质 1 2 1 1 耐酸性伽淀粉酶的作用机理 耐酸性静淀粉酶与中性静淀粉酶对淀粉的作用机制相似，不同的是中性a 淀粉酶 最适p h 值一般为缸7 ，水解淀粉时必须控制溶液在该p h 值范围内才能维持中性a 淀粉 酶的酶活性；而耐酸性旺淀粉酶最适p h 值一般为4 5 ，能直接应用于淀粉的深加工工 业中。在酸性条件下，耐酸性a 淀粉酶以随机方式切断淀粉分子内的伽1 ，4 葡萄糖苷 键，水解淀粉的终产物主要是麦芽糖、低聚糖、含a - 1 ，6 葡萄糖苷键的糊精，这些产 物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为洳构型。 1 2 1 2 酸性a 淀粉酶的耐酸性 耐酸性弘淀粉酶的酸稳定性明显高于中性弘淀粉酶。一般中性a 淀粉酶的最适p h 为6 7 ，耐酸性a 淀粉酶的最适p h 为4 巧。据报道b a c i l l u sa c i d o c a i d a r i u 所产生的耐酸 性洳淀粉酶的最适p h 可达2 0 t 1 0 1 。在早期的研究中，日本的y a s u j im i n o d a ，m o t o oa r a i 等研究者对彳n i g e r 生产的两种伽淀粉酶进行了比较，其中中性a _ 淀粉酶在p h 2 2 时完 全失活，在p h 3 o 时，酶活仅有4 ，在p h 4 0 时，残余酶活5 8 【9 l ：而耐酸性洳淀粉酶 在p h l 8 时，酶活5 8 ，在p h 2 2 时，酶活为8 7 ，p h 3 0 时，酶活为9 0 。由此可见， 耐酸性旺- 淀粉酶的酸稳定性明显高于中性a 淀粉酶。但是，与中性a 淀粉酶相比，耐 酸性a 淀粉酶对碱性条件更为敏感。 对于耐酸性a - 淀粉酶在酸性环境中仍能保持其活性的问题许多研究者很感兴趣。 通过对酶蛋白的氨基酸分折，发现耐酸性a 淀粉酶的酸性和碱性氨基酸的含量比中性 静淀粉酶少3 0 。人们推测酶蛋白的耐酸性与其在低p h 条件下的带电性有关。当d h 低于等电点时，碱性氨基酸残基带有正电荷，大量正电荷相互排斥，导致蛋白质结构 松散，从而影响催化中心的活性。如果酶蛋白中的酸性和碱性氨基酸的含量较低，则 带电量较小，p h 的变化对酶活的影响不大。所以含有较低带电氨基酸可能是耐酸性洳 淀粉酶具有酸稳定特性的原因。 1 2 1 3 耐酸性旺淀粉酶的耐热性 耐酸性a 淀粉酶的热稳定性高于普通的中性a 淀粉酶。一般来说，普通的中性洳 淀粉酶的最适反应温度为3 0 - - 4 0 c ，而大多数的酸性小淀粉酶的最适反应温度为5 0 - , 6 0 ，其耐热性明显优于普通的中性洳淀粉酶。江南大学筛选得到的b s t e o r o t h e r m o p i l i u s 在发酵过程能产生两种耐酸性a 淀粉酶它们的最适反应温度均为6 0 c 1 6 1 。 1 2 1 4 金属离子对耐酸性舡淀粉酶稳定性的影响 2 研究表明，c a 2 + 和n a + 能激活中性洳淀粉酶的活力。c a 2 + 对中性a 淀粉酶活有促 进作用，但耐酸性a 淀粉酶对c a 2 + 的依赖似乎比较小，产自a 疗自弦，的耐酸性洳淀粉酶 的酶活为3 7 u m l ，添加微量的c a 2 + 后，酶活为2 8 u m l ，反而有所降低；h 矿、v b 2 + 这两种重金属离子对彳k a w a c h i i 产生的两种耐酸性洳淀粉酶有显著的抑制作用【3 】。 1 2 1 5 耐酸性昏淀粉酶分子性质 四川大学的张文学等人在对白曲中耐酸性a 淀粉酶的分离纯化中，获得了分子量 分别为8 5 ，0 0 0 和1 0 4 ，0 0 0 的两种酸性洳淀粉酶组分a 和b ，这两种耐酸性a 。淀粉酶均为含 有较多糖链的糖蛋白，且能被枯草杆菌蛋白酶( s u b t i l i s i n ) 适度降解“川2 】。表l 表明， 这两种耐酸性舡淀粉酶n - 末端1 0 1 2 残基的氨基酸序列与黑曲霉的耐酸性洳淀粉酶n 末端氨基酸序列极为相似。m i k a m i 等人对4 k a w a c h i i 研究发现该菌也能产生两种耐酸 性a 一淀粉酶组分i 和i i ，它们的分子量分别为1 0 4 ，0 0 0 和6 6 ，0 0 0 ，等电点分别是4 2 5 和 4 2 0 ，比一般的中性小淀粉酶的等电点低，例如现在研究和应用较多的b s u b t i l i s 细菌舡 淀粉酶，其等电点约为5 0 。 裹1 三种酸性十淀粉酶n _ 末端每基酸序列比较 t a b 1c o m p a r i s o no f n - t e r m i n a la m i n oa c i ds e q u e n c eo f t h r e ea c i da - a m y l a s e 洼t 一囊示未谢定 1 2 2 产耐酸性加淀粉酶的微生物的筛选 产耐酸性d - 淀粉酶微生物的筛选方法和一般小淀粉酶产生菌的筛选方法相同，所 3 不同的是筛选产耐酸性a - 淀粉酶菌株时需要采用酸性培养基。 1 2 2 1 筛选培养基的制备 用于筛选产耐酸性a 淀粉酶微生物的培养基一般为含淀粉的酸性固体培养基，在 微生物培养前必须先对固体培养基灭菌，以防杂菌的污染，灭菌条件为1 2 1 ，2 0 m i n 左右。在高温和酸性条件下，琼脂和淀粉几乎完全水解，这将导致培养基不能凝固， 并且遇碘液将不会显蓝色。在制备筛选用固体培养基时，可以先在自然p h 条件下灭 菌再用h c i 调节p h 至酸性来避免这种情况的发生。 1 2 2 2 耐酸性伽淀粉酶产生菌的筛选方法 和一般a 淀粉酶产生菌的筛选方法相类似，采用固体培养基培养、肉眼观察淀粉 水解圈的方法。产耐酸性m 淀粉酶的单菌落将其周围淀粉水解，喷洒稀碘液后，在其 周围就形成一个透明水解圈，挑选有水解圈的单菌落划线分离，纯化所需菌株。但是 这种方法的缺点是容易造成菌株的死亡，并且碘还可使微生物的酶失活并对菌体的生 理特征有影响嘲；o m e f f l l l 等人以丽玛斯醇亮蓝r b b ( r e m a z o lb r i l l i a n tb l u e ) 与淀粉结合 的方法，分离纯化产淀粉酶的生产菌株。该方法用在以r b b 一淀粉为底物的琼脂平板 上，可快速有效的筛选分解淀粉的微生物【”】；江南大学生物技术中心的徐良玉等研究 了更为简单有效的大量分离纯化淀粉酶生产菌株的方法，以可溶性淀粉为底物配制固 体培养基，然后低温处理( 4 ) 平板培养物，产淀粉酶的菌株其菌落周围的培养基由 白色变成灰色且透明。该方法不具有破坏性，不需要预先接种菌落，能直接发现和分 离可分解利用淀粉的微生物，利用淀粉琼脂平板还能快速验证淀粉酶的耐酸性l l 引。 1 2 3 高产菌株的选育 为了简化在工业生产中耐酸性n - 淀粉酶的提取纯化工艺，减少副产物糖化酶和 转移酶的干扰，欧洲的研究者对4 以自弊r 进行x - 射线照射n t g - 诱变，使其生产糖化酶 和转移酶的路径被堵塞，只能生产耐酸性a 淀粉酶。既提高了产量又方便了产物的提 取【3 4 】。 除了使用物理化学方法诱变以外，日本的研究者将o k a w o e h h 的酸性d 淀粉酶基因 克隆到原菌株中，增加其基因表达，所得到的转化株产酶能力是原来的3 5 倍。美国 的研究者将此口a c i d o c a l d a r i u s 的酸性a 淀粉酶基因克隆到芽孢杆菌和乳酸杆菌中，得 到高产菌株，其产物用于淀粉液化和青贮饲料的生产。 1 2 4 耐酸性舡淀粉酶的生产 1 9 6 2 年，日本研究人员指出黑曲霉生产耐酸性a 淀粉酶的最适p h 为4 0 ，若使培 养初期的p h 为4 0 ，后期的p h 升为5 5 ，并将温度由2 8 c 降到2 0 ，可以得到最高产量 【1 5 l 。1 9 7 5 年，郑大声采用黑曲霉n r r l 3 3 7 固体培养时，耐酸性n 淀粉酶在较低温度 ( 2 5 ) 和酸性环境下形成，摇瓶培养时，最适p h 为4 0 ，耐酸性舡淀粉酶的出现迟于中 4 性舡淀粉酶和糖化酶。在日本，采用液体发酵提取耐酸性a 一淀粉酶的研究发现，当霉 菌体内贮存的多糖糖源含量开始下降并有象糊精类的诱导物产生时，耐酸性旺- 淀粉 酶开始产生；当霉菌体内贮存的多糖糖源含量开始上升时，耐酸性伽淀粉酶的产生 受到抑制。 日本研究者用爿蛔，卯翮进行液态与固态发酵生产耐酸性洳淀粉酶，实验发现， 固态发酵的产酶量明显高于液态发酵。在液态发酵试验中，产酶受到培养基中葡萄糖 浓度的影响，高浓度葡萄糖会对产酶有一定抑制作用，当向培养基中流加葡萄糖时， 浓度过高会抑制产酶；但在固态发酵中，葡萄糖似乎对产酶没有抑制作用，当菌体中 糖原含量降低时，培养基中较高的葡萄糖浓度并不影响酶的生成。研究者推测在液态 发酵中菌体中糖原含量的降低和培养基中葡萄糖的浓度共同控制着菌株的产酶，而在 固态发酵中菌株的产酶仅受菌体中糖原含量的影响。有关耐酸性衅淀粉酶的生产控制 体系还需进一步研究。 1 2 5 酶$ 1 j | j j 的制备 耐酸性a 淀粉酶的制备和中性淀粉酶的制备方法大体一致。诺维信公司的耐酸性 弘淀粉酶一种外观为黑褐色的液体酶，该酶生产工艺比较简单，只需将除去菌丝体的 发酵液，在3 0 c , - - 4 0 c 用降膜蒸发器蒸发浓缩到所需要的酶活力单位，然后加入稳定 剂即为成品。 1 2 6 耐酸性i f , 淀粉酶的分离纯化 为了得到纯化的耐酸性a 淀粉酶，人们研究了许多的方法，如用( n 1 4 ) 2 s 0 4 、丙 酮沉淀、乙醇沉淀；通过将酶液在p h 2 5 和3 7 条件下处理可以除去酸不稳定性m 淀 粉酶；可以用丙酮重结晶和葡聚糖凝胶s e p h a r o s e o - 5 0 过滤进一步对酶进行纯化；也 有研究者用葡聚糖凝胶s e p h a r o s e g - 2 5 过滤，然后用s e p h a m s e q 快速流色谱分析得到纯 化的酶1 3 1 。在欧洲的一项耐酸性弘淀粉酶的纯化专利中使用了一种简便、经济的酶纯 化技术i 阍，先将酶液调p h l q ，然后加热保温一段时间使其中的糖化酶失活，最后除 去变性的糖化酶。纯化的酶可用于淀粉的液化，也可以被固定化处理。高新的纯化技 术为耐酸性舡淀粉酶在工业上的应用提供了前提条件。 1 3 耐酸性泓淀粉酶的应用 耐酸性叶淀粉酶可以在低p h 条件下液化淀粉，用于酸性环境中淀粉原料的加工。 在白酒的生产中，原料的糖化和发酵都是在强酸条件下进行的。白酒发酵醪p h 为 3 2 4 3 ，在此环境中中性静淀粉酶活性很低，原料中6 5 的淀粉大约有1 2 不能被利 用，而耐酸性a 淀粉酶在此条件下的活性较高，酸稳定性好。耐酸性a 淀粉酶的应用 提高了原料的加工率以及发酵阶段原料的分解利用率，减少了原料的浪费。 由爿o r y a e 生产的一种耐酸性真菌淀粉酶，能切割淀粉链中的a - 1 ，4 键，产物为麦 芽糖，发酵度可提高2 。5 。在啤酒生产中，该酶制剂可在糖化锅中加入，也可在 发酵罐中加入，以提高啤酒发酵度例。 味精厂对淀粉水解糖液的质量要求是十分严格的。从糖化效果、经济性及满足谷 氨酸发酵产高酸的要求等方面考虑，一般选用淀粉含量高、酸性低的淀粉原料。加工 工艺的p h 为4 6 4 8 ，添加耐酸性a 淀粉酶可使原料液化完全。在较低p h 条件下液化 淀粉，可减少副产物异麦芽糖的生成。 新近出现的耐高温酸性a 淀粉酶b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s ，适用的液化p h 值可 以降低到5 0 ，这种酶被应用于麦芽糖工业中。在我国的酿酒等工业的淀粉原料加工 过程中多要经过液化和糖化两个阶段，在使用时通常小淀粉酶需要与糖化酶配合使 用，依次对淀粉原料进行液化和糖化处理，整个过程中控制浆液的p h 值是一个关键 因素。通常从磨坊出来的淀粉浆料p h 值为5 5 左右，而目前广泛应用的高温小淀粉酶 最：i 舌p h 值为6 o “2 ，在p h 5 o 以下酶活性很低，同时大量使用的糖化酶作用最适p h 值 为4 2 5 0 ，所以在淀粉液化和糖化过程中需要来回调整p h 值。由于酸碱的先后加入， 提高了浆液中的离子浓度，增加了后续工艺的复杂程度并造成污染。如果能够在淀粉 加工过程中使用耐酸性d 淀粉酶，使淀粉液化和糖化在同一个p h 条件下进行，将简化 淀粉的加工工艺，节约试剂的消耗，降低产品的加工成本。 我国是一个农业大国，淀粉深加工工业是一个庞大的工业体系。酶的品种不断更 新和完善，如耐酸性c t 淀粉酶的产生和应用，为淀粉质原料的深加工提供了更好的条 件，并开创了新的酶法工艺，对于提高收得率、降低消耗、提高产品质量、增加效益， 特别对于节约工业用粮起到了重要作用。 6 1 引言 1 1 研究价值和意义 耐酸性静淀粉酶是在酸性条件下水解淀粉的酶类，其最适p h 在4 0 左右。自从日 本研究者y a s u j im i n o d a 等人用黑曲霉生产耐酸性舡淀粉酶以来1 4 1 ，各国都对耐酸性洳 淀粉酶进行了研究。目前，丹麦、美国、日本等国家均有耐酸性m 淀粉酶的发酵产品。 在我国，2 0 世纪7 0 年代时郑大声等人用a 嘲弘r 进行酸性a 淀粉酶的发酵研究 3 j 。2 0 世 纪9 0 年代时，中科院微生物研究所的科研人员研究了嗜热真菌t h e r m o m y o e s l a n u g i n 埘产耐酸性甜淀粉酶的特性【1 9 1 。目前，国内四川大学、江南大学等单位也已 开展了这方面的研究嘛8 1 1 惦1 4 , 2 0 i ，但均未见工业产品问世。 在我国的传统的发酵工业中，大多采用a - 淀粉酶和糖化酶的协同应用来分解淀粉 质原料。发酵时微环境多低于p h 5 0 ，一般为4 0 。由于起协同作用的a 淀粉酶的最适 p h 为6 左右，在p h 4 o 以下易失去活性，因而在酿造发酵中使用最适p h 4 0 的耐酸性小 淀粉酶，对酿造工业降低劳动强度、增加原材料的利用率、提高生产效益等方面都会 起到促进作用。 1 2 本课题解决的问题 本课题希望通过筛选得到耐酸性叶淀粉酶的产生菌株，对其产酶条件、酶的制备 条件及酶学性质进行研究。实验具体内容包括： i 、产耐酸性a 淀粉酶菌株的筛选； 2 、产酶菌株的鉴定； 3 、菌株发酵条件的优化； 4 、酶的制备： 5 、酶学特性的研究。 7 2 材料与方法 2 1 试验材料 2 1 1 样品的来源 采集于安徽省肥西县淀粉厂的土壤。 2 1 2 培养基 ( 1 ) 富集培养基l ) ：可溶性淀粉2 0 9 、k n 0 32 9 、m g s 0 4 7 h 2 01 2 9 、k h 2 p 0 42 7 9 、 青霉素5 x 1 0 4 单位、链霉素5 x 1 0 4 单位、p h 3 0 。 ( 2 ) 分离培养基( g l ) ：可溶性淀粉2 0 9 、k n 0 32 9 、m g s 0 4 7 1 2 01 2 9 、k h 2 p 0 42 7 9 、 琼脂1 5 - 2 0 9 、p h 3 0 。 ( 3 ) 鉴定培养基( g ，l ) ：采用察氏培养基，蔗糖3 0 9 ，n a n 0 32 0 9 ，m g s 0 4 7 8 2 00 5 ， k c l0 5 9 ，f e s 0 40 0 l g 。 ( 4 ) 产孢子培养基( g ，l ) ：马铃薯2 0 0 9 、蔗糖( 或葡萄糖) 2 0 9 、琼脂1 5 2 0 9 、p 8 自然。 ( 5 ) 液态产酶基础培养基( g 儿) ：可溶性淀粉4 0 9 、拧檬酸铵1 0 9 、k h 2 p 0 43 9 、c a c h 0 1 9 、f e s 0 4 7 h 2 00 0 1 9 、m g s 0 4 。7 i - 1 2 0l g ( 6 ) 固态产酶基础培养基：2 5 0 m l 的三角瓶中5 9 麸皮、5 m l 营养盐溶液( k h 2 p 0 4 2g l 、n h 4 n 0 35g l 、n a c llg l 、m g s 0 4 7 h 2 01g l ) 2 1 3 主要试剂的配制 ( 1 ) 酶活测定使用的试剂 3 0 碘化钾溶液：碘化钾1 5 0 9 溶解于水3 5 0 m l 中，保存在褐色试剂瓶中， 避免阳光直射； 2 5 硫酸溶液：硫酸1 2 5 9 溶于水3 7 5 m l 中； 0 0 5m o l l 硫代硫酸钠溶液：将定量分析用的0 1m o l l 硫代硫酸钠母液5 0 0 m l 煮沸过的冷却水稀释，所得溶液的总体积为1 0 0 0 m l 。配制好后，应进行标定，求出 浓度校正系数f 值； i m o l l 乙酸一乙酸钠缓冲溶液( p n 5 o ) ：将l m o l l 乙酸钠溶液加入到i m o l l 的 乙酸溶液中。调p h 到5 o ； 可溶性淀粉溶液o h5 o ) ：将可溶性淀粉( 试剂级) 在1 0 5 。c 干燥4h 后称量计 算含水量。然后，根据可溶性淀粉的含水量称取o ，5 哩( 折干) 的可溶性淀粉。缓慢加 入到沸水5 0 m l 中，煮沸5 m i a ，用自来水冷却后，加入1 m o l l 乙酸乙酸钠缓冲溶液 ( p h 5 0 ) 5 m l 。用水定容至1 0 0 m l ； 费林试剂：铜溶液( 硫酸铜3 4 6 6 9 溶解在水中，定容至5 0 0 m l ) ，酒石酸钾钠 碱溶液( 酒石酸钾钠1 7 3g 和氢氧化钠5 0g 溶解在水中，定容至5 0 0 m e ) ，使用前，精 确地取等体积的铜溶液和碱液充分混合。 ( 2 ) 蛋白质含量测定使用的试剂 标准蛋白质溶液：精确称取牛血清蛋白( b s a ，分析纯) 1 0 m g ，加蒸馏水溶解， 转入1 0 0 m l 干净的容量瓶中并精确定容，配置成1 0 0 p g m l 的标准蛋白工作母液， 置于4 c 冰箱中保存备用。 考马斯亮蓝g - 2 5 0 液：精确称取考马斯亮蓝g - 2 5 01 0 0 r a g 溶于5 0 m l 9 5 乙 醇中，再加入l o o m l8 5 ( w v ) 磷酸盐缓冲溶液，然后再用蒸馏水定溶至1 0 0 0 m l 即 可配制成考马斯亮蓝g 2 5 0 液。 ( 3 ) s d s p a g e 使用的试剂 凝胶贮液：2 0 0 m l j 毙杯中，称取3 0 9 a c t ( 丙烯酰胺) 、o 8 9b i s ( 双叉丙烯酰胺) ， 加双蒸水至1 0 0 m l ，于4 c 下保存； 4 分离胶缓冲液( 1 5 m o l l t r i s - h c l ，p u s 8 ) ：t r i s1 8 2 9 溶解于4 0 m l 蒸馏水中， 4 m l1 0 s d s ，用1 m o l l 的h c l 调节溶液p h 为8 8 ，定容至1 0 0 m l 。定容后溶液p h 应接 近8 8 ，放冰箱中保藏； 4 堆积胶缓冲液( 1 0 m o l lt r i s - h c i ，p h 6 8 ) ：t r i s1 2 1 0 9 溶解予5 0 - - 6 0 蒸馏水 中，4 m l1 0 s d s ，用l m o l l 的h c l 调节溶液p h 为6 8 ，定容至1 0 0 m l 。定容后溶液p h 应接近6 8 ，放冰箱中保藏； 1 0 的过硫酸铵：过硫酸铵0 5 9 ，溶解定容于5 m l 蒸馏水中； 5 缓冲液( 1 0 m l ) ：6 0 m m o l lt r i s h c i ，p h 6 8 ；2 5 丙三醇；2 s d s ； 1 4 4 m m o l l1 3 巯基乙醇；具体配方如下表， 袭2 - is d s - p a g e 上样缓冲液配方 t a b 2 - 1c o m p o s i t i o n s o f l o a d i n g b u f f e r f o r s d s - p a g e 蒸馏水 1 o m o l l t r i s - h c l , p h 6 8 丙三醇 1 0 s d s 1 3 巯基乙醇 1 溴酚蓝 电极缓冲液( 2 5 m m o l lt r i s ，1 9 2 m m o l l 甘氨酸，o 1 s d s ，p h 8 3 ) ：t d s3 0 9 ， 甘氨酸1 4 4 9 ，s d s1 0 9 用蒸馏水溶解后定容至l l ，该溶液的p h 为8 3 左右，应放 置冰箱中保存，使用时如有沉淀，3 t c 溶解后再用； 9 札 札 札 札 札 札 蚴 ：宝 铋 抽 ：虿 m 染色液：o i g 考马斯亮蓝r - 2 5 0 溶解于1 0 0 m l 甲醇和冰醋酸的混合水溶液中； 退色液：水甲醇冰醋酸，但不加考马亮蓝r - 2 5 0 。退色液需要用磁力搅拌器 搅拌1 0 h 以上方可使用； ( 4 ) n o n d e n a t u r i n g - p a g e 使用的试剂 凝胶贮液：2 0 0 m l 烧杯中，称取3 0 9a c r ( 丙烯酰胺) 、0 8 9b i s ( 双叉丙烯酞胺) ， 加双蒸水至1 0 0 m l ，于4 下保存； 4 分离胶缓冲液( 1 5 m o l lt r i s h c i ，p h 8 8 ) ：t r i s1 8 2 9 溶解于4 0 m l 蒸馏水中， 用1 m o l l 的h c l 调节溶 , t f p h 为8 8 ，定容至1 0 0 m l ，放冰箱中保藏； 4 堆积胶缓冲液( 1 0 m o l lt r i s - h c l ，p h 6 8 ) ：t r i s6 0 9 溶解于4 0 m l 蒸馏水中， 用1 m o l l 的h c i 调节溶液p h 为6 8 ，定容至1 0 0 m l ，放冰箱中保藏； 1 0 的过硫酸铵：过硫酸铵o 5 9 ，溶解定容于5 m l 蒸馏水中； 5 样缓冲液( 1 0 m l ) ：3 1 2 5 m m o l lt r i s h c i ，p h 6 8 ；5 0 丙三醇；0 0 5 溴 酚蓝。具体配方如下表， 衰2 - 2n o n d e n a t m i n g