（微生物学专业论文）木糖转化乙醇代谢途径在酿酒酵母工业菌株中的建立.pdf

原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所 取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重 要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识 到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：日期：至翌鱼垡 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他 复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：至塑导师签名：选日期：竺竺兰竺 山东大学博士学位论文 木糖转化乙醇代谢途径在酿酒酵母工业菌株中的建立 摘要 随着7 0 年代的两次石油危机的出现，寻找可再生性的替代能源已成为维持 人类社会可持续发展的紧迫任务。燃料酒精被公认为最有发展前景的可再生清洁 能源之一。酒精生产再次受到人们的关注。自然界中含有丰富的植物纤维资源， 而目前只有3 - 4 的植物纤维资源被有效地利用。木糖是木质纤维素水解物中含 量仅次于葡萄糖的一种单糖。对木糖的生物转化生产乙醇是实现木质纤维素生物 转化生产乙醇的关键环节。构建不仅能利用葡萄糖而且能利用木糖生产乙醇的代 谢工程菌已成为当前转化木质纤维素类生物质生产燃料酒精的研究热点之一。 酿酒酵母是传统上食品及化工工业的最佳生产菌株，在工业生产应用中有上 百年历史的酒精发酵菌种，具有许多优良特性。然而酿酒酵母菌缺乏转化木糖生 成木酮糖的酶而不能利用木糖，但能利用木糖的异构体形式木酮糖。因此， 我们通过代谢工程( m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ) 手段，在用于乙醇生产的酿酒酵母 工业菌株中引入木糖代谢的关键酶基因，在酿酒酵母工业菌株中开辟木糖代谢途 径，并得到了能发酵木糖产生乙醇的工程菌株。本文的主要研究内容为： 酿酒酵母工业菌株，其遗传背景、生长特征及内在的生理生化特征与实验室 菌株有很大不同。首先，工业菌株往往没有常规酵母转化子筛选的营养缺陷型标 记，只能利用某些显性标记，例如g 4 1 8 和c u “。其次，转化技术上也与对实验 室菌株的转化有所不同，因此需要建立酵母工业菌株转化体系。本文通过敏感度 实验测定了g 4 1 8 和c u z * 作用于三株酿酒酵母工业菌株s k - 1 、s p s c 一1 、n a n 一2 7 的最低抑菌浓度，发现三株菌对g 4 1 8 的敏感性差别很大，g 4 1 8 作用于s p s c - 1 酒精酵母的最低抑菌浓度达到7 5 0 陷，m l ，对s k - 1 酿酒酵母的最低抑菌浓度只有 l o o _ l t g m a 。同株菌在不同的培养基上对铜离子的耐受性相差也很大，s p s c l 酒 精酵母在y e p d 培养基上可以耐受1 5 m m o l lc u “，但在y n b 基本培养基上只 可以耐受l m m o l l c u “。对工业菌株酿酒酵母进行醋酸锂法转化的系列条件做了 研究，确定o d 6 0 0 值o 8 1 0 时是最佳细胞收获时间，转化子先在完全培养基上 生长6 h 再涂布( 3 4 1 8 选择平板可以大大提高转化子的数量。通过改进的原生质 体转化法，使含铜抗性基因的质粒k b 8 0 6 成功转入工业酵母菌株s p s c 一1 和 4 山东大学博十学位论文 n a n 一2 7 中，初步解决了工业菌株转化难的问题。 为了实现外源基因在工业酿酒酵母中的稳定表达，需要利用同源重组将外源 基因整合到酵母工业菌株染色体上，y i p 5 是最常用的整合载体，然而它的拷贝 数很低限制了外源基因的表达量。酿酒酵母r d n a 在酵母基因组中有1 0 0 - - 2 0 0 个重复单元，以此为整合位点可以提高外源基因的拷贝数，因此我们以y i p 5 为 骨架构建了带有酿酒酵母r d n a 片段、p g k 强启动子及g 4 1 8 抗性基因的多拷贝 整合载体p y m i k p 。通过对p y m i k p 遗传特性的研究，证实了这是一类用于对 工业菌株进行基因工程改造的较理想载体。鉴于显性选择标记g 4 1 8 抗性基因对 真核生物酵母菌的广泛适用性和不同酵母菌r d n a 结构基因有很高的同源性，这 类载体可望成为一种酵母表达系统通用载体。 在真菌中，木糖转化为木酮糖的反应是在依赖n a d p h 的木糖还原酶( x y l o s e r e d u c t a s e ，x r ) 作用下，将木糖还原为木糖醇，然后在依赖n a d 的木糖醇脱氢 酶( x y l i t o ld e h y d r o g e n a s e ，x d h ) 作用下，转化木糖醇为木酮糖。接着木酮糖经 木酮糖激酶( x y l u l o k i n a s e ，x k ) 磷酸化形成5 一磷酸木酮糖，这步酶促反应是木 糖代谢的限速步骤之一。因此我们将来自毕赤氏酵母p i c h i as t i p i t i s 的木糖还原酶 基因( x y l l ) 、木糖醇脱氢酶基因( x y l 2 ) 和酿酒酵母自身的木酮糖激酶基因 ( x k s l ) 连接到已构建的单拷贝整合载体p y i k 和多拷贝整合载体p y m i k 上。 p g k 和a d h l 启动予均为酿酒酵母组成型强启动子，而p g k 启动子的表达效力 比a d h l 启动子强。将x y l l 基因置于乙醇脱氢酶启动子a d h l 控制下，将x y l 2 基因置于磷酸甘油激酶启动子p g k 控制下，从而控制木糖还原酶和木糖醇脱氢 酶基因的表达量，减少因木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的辅酶不能相偶联，细胞内 氧化还原失衡所致的木糖发酵中的木糖醇积累。x k s l 基因置于磷酸甘油激酶启 动子p g k 控制下。得到重组质粒p y i k 一1 2 3 和p y m i k - 1 2 7 。 在细菌中，木糖代谢途径是在木糖异构酶( x y l o s ei s o m e r a s e ，x i ) 的作用下， 转化木糖为木酮糖。将来自于嗜热细菌t h e r m u st h e r m o p h i l u s 的木糖异构酶基因 ( x y l a ) 和酿酒酵母自身的木酮糖激酶基因( x k s l ) 连接入单拷贝整合载体p y i k 和多拷贝整合载体p y m i k 。将x y a 、x k s l 基因都置于组成型强启动子p g k 启 动子控制下，得到重组质粒p y i k 一1 1 2 和p y m i k 一1 1 4 。 经a p a i 、s t u i 酶切重组质粒p y i k 一1 2 3 、p y i k 一1 1 2 使其线性化后转化入酿酒 5 山东大学博上学位论立 酵母工业菌株n a n 一2 7 和实验室菌株h 1 5 8 中。在含g 4 1 8 和以木糖为唯一碳源 的y p x 平板上筛选转化子。得到含有单拷贝木糖代谢基因的重组酵母菌 n a n - 1 2 3 、h 一1 2 3 、n a n 一1 1 2 和h 一1 1 2 。在r d n a 片段内部，用h p a l 酶切重组质 粒p y m i k 一1 2 7 和p y m i k 1 1 4 ，使其线性化后转化入酿酒酵母工业菌株n a n 一2 7 和实验室菌株h 一1 5 8 中。在含g 4 1 8 和以木糖为唯一碳源的y p x 平板上筛选转 化子。通过提高g 4 1 8 浓度，增加筛选压力，并经过木糖生长测定进行二次筛选， 得到含有多拷贝木糖代谢基因的重组酵母菌n a n 一1 2 7 、h - 1 2 7 、n a n 一1 1 4 和 h 一1 1 4 。经稳定性实验，证明重组菌在无选择压力的y e p d 培养基中培养1 4 6 个 小时后，仍有9 6 左右的细胞能在含g 4 1 8 的y p x 平板上生长。重组菌在无选 择压力的培养基中培养后，经酶活测定，木糖还原酶( x r ) 、木糖醇脱氢酶( x d h ) 、 木糖异构酶( x i ) 、和木酮糖激酶( x k ) 均在酿酒酵母中得到活性表达。表明外 源木糖代谢基因稳定存在于重组菌株中。r d n a 介导的含有多拷贝木糖代谢基因 的重组酵母菌的各酶酶活均高于含有单拷贝木糖代谢基因的重组酵母菌，表明 r d n a 的引入导致外源基因多拷贝整合入酵母染色体中，外源基因的表达量得到 提高。 将所构建酿酒酵母重组菌在氧气限量的条件下，进行木糖葡萄糖共发酵实 验。重组菌的生长情况和宿主菌没有明显区别，表明外源基因的引入对重组菌的 生长没有影响。发酵产物进行h p l c 分析，结果表明各重组菌都能利用木糖产生 乙醇。其中，以酿酒酵母工业菌株为宿主菌，多拷贝整合木糖还原酶( x r ) 基 因、木糖醇脱氢酶( x d h ) 和木酮糖激酶( x k ) 基因的酿酒酵母重组菌n a n 一1 2 7 利用木糖生产乙醇的效果最优。对木糖的利用最高可达1 8 4g l ，较宿主菌提高 了2 倍，乙醇产量最高可达7 , 9g l ，较宿主菌提高3 9 。由此在酿酒酵母实验 室菌株和工业菌株中分别建立了细菌和真菌的两条木糖代谢途径。经过比较，发 现由r d n a 介导的多拷贝整合木糖代谢酶基因的重组菌对木糖的利用和乙醇的 产生都高于单拷贝整合木糖代谢酶基因的重组菌。并且以酿酒酵母工业菌株为宿 主菌的重组菌对木糖的利用和乙醇的产生高于以实验室菌株为宿主菌的重组菌， 乙醇的产生速度也较实验室酿酒酵母重组菌快，表明不同遗传背景的宿主菌对构 建利用木糖生产乙醇的工程菌有重要的影响。 尽管构建的重组菌能利用木糖生产乙醇，但是对木糖的利用和乙醇的产量仍 6 山东大学博士学位论文 离工业生产的需求有一定距离。首先木糖的运输阻碍了重组菌对木糖的利用；其 次，分解木糖最初两步是在x r 及x d h 作用下的酶促反应，这两步反应的辅酶 ( n a d p h 和n a d + ) 不能偶联，引起细胞内的氧化还原不平衡，导致木糖醇的 积累，降低了乙醇的产量。虽然超表达木酮糖激酶( x k ) 基因，促进了乙醇的 生成，但是仍不能消除细胞内的氧化还原不平衡。 木糖异构酶直接完成木糖到木酮糖的转化，不需要任何辅酶，被认为是构建 利用木糖酿酒酵母代谢工程菌株的便利途径。但是由于来自嗜热细菌的x i 最适 反应温度过高而在常规发酵温度下酶活相对低，使得木糖不能有效的转化为木酮 糖。因此，需要进一步对嗜热细菌木糖异构酶进行诱变，使其在酿酒酵母发酵温 度下仍具有较高酶活。 关键词：代谢工程，酿酒酵母工业菌株，整合质粒，转化体系，木糖，木糖醇 乙醇 7 坐查盔堂堕主兰焦堡塞 e s t a b l i s h m e n to f ax y l o s et o e t h a n o l m e t a b o l i cp a t h w a yi na n i n d u s t r i a ls t r a i no f a b s t r a c t w i t ht h ea d v e n to ft h e “o i lc r i s i s ”i nt h e1 9 7 0 s ，t h ei m p o r t a n c eo fa l t e r n a t i v e e n e r g y s o u r c e sg a v eb i n h 的i n i t i a t i v e s a sa s t e pt os o l v et h i sp r o b l e m t h ea d d i t i o no f e t h a n o lt o g a s o l i n e ，w h i c hr e d u c e se m i s s i o n o fc a r b o nm o n o x i d ea n du n b u r n e d h y d r o c a r b o n st h a tf o r ms m o g ，h a sw i d e l yb e e ne n f o r c e di nr e c e n ty e a r s t h ed e m a n d f o rb i o e t h a n o lh a st h e r e f o r ei n c r e a s e d t h e r ei sa b u n d a n c eo f l i g n o c e l l u l o s i em a t e r i a l s i nt h en a t u r e ，h o w e v e r o n l y3 - 4 o fl i g n o e e l l u l o s i cm a t e r i a l sa r eu t i l i z e d d - x y l o s ei s t h em o s ta b u n d a n tm o n o s a c c h a r i d ei n l i g n o c e l l u l o s eh y d r o l y s a t e s a f t e r g l u c o s e c o n s e q u e n t l y ，e t h a n o l i cf e r m e n t a t i o no fx y l o s ei so fm a j o rc o n c e r nf o rt h ee f f i c i e n t u t i l i z a t i o no fl i g n o c e l l u l o s i ch y d r o l y s a t e st o p r o d u c ef u e l e t h a n o li nt h er e c e n t2 0 y e a r s s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e h a sb e e n t r a d i t i o n a l l y u s e di n p r o d u c i n ge t h a n o l ， w h i c hh a sa c q u i r e dq u a l i t i e ss u c ha sh i g he t h a n o lp r o d u c t i v i t y ，t o l e r a n c et op r o c e s s h a r d i n e s s ，t o l e r a n c et of e r m e n t a t i o n b y p r o d u c t s a n d i s ，t h e r e f o r e ，p r e f e r r e d f o r e t h a n o lp r o d u c t i o nf r o mc r o p s h o w e v e r ，印p l y i n gsc e r e v i s i a ef o rf e r m e n t a t i o no f l i g n o c e l l u l o s i ch y d r o l y s a t e sh a st h ed r a w b a c kt h a ti tc a n n o tn a t u r a l l yu t i l i z ex y l o s e ， o n l yi t s i s o m e rx y l u l o s e m e t a b o l i ce n g i n e e r i n gc a nb eu s e dt oe x t e n dt h es u b s t r a t e r a n g ef o rg r o w t ha n dp r o d u c tf o r m a t i o no fa no r g a n i s m i nt h i ss t u d y ，g e n e se n c o d i n g e n z y m e sf o rx y l o s em e t a b o l i s mh a v eb e e ni n t r o d u c e di n t oa ni n d u s t r i a l s t r a i no f s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e t h ex y l o s em e t a b o l i cp a t h w a yw a se s t a b l i s h e di n t h e i n d u s t r i a ls t r a i no fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e t h er e c o m b i n a n ts t r a i n sh a v et h ea b i l i t y o fu t i l i z a t i o nt h ex y l o s et o p r o d u c ee t h a n 0 1 t h em a i no b j e c t i v e so ft h i sr e s e a r c ha r ea s f o l l o w s ： t h ew i l dt y p ey e a s t s ，f o re x a m p l et h ei n d u s t r i a ly e a s ts t r a i n ，a r em o r e c o m p l e x i n t h eg e n e t i cb a c k g r o u n d ，g r o w t hc h a r a c t e r sa n dp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r sc o m p a r i n g 8 山东大学博士学位论文 w i t ht h el a b o r a t o r ys t r a i n s ot h et r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo fy e a s ti n d u s t r i a ls t r a i ni s n e e d e db ee s t a b l i s h e d f i r s to fa l l ，i n d u s t r i a ls t r a i n sc a no n l yu s ed o m i n a n ts e l e c t i o n m a r k e rg e n e s ，f o re x a m p l eg 4 1 8o rc u “，b e c a u s ei n d u s t r i a ls t r a i n sl a c ka u x o t r o p h i c m a r k e r sf o r g e n e t i cm a n i p u l a t i o n s s e c o n d l y , t h e r e a r es o m ed i f f e r e n c e so f t r a n s f o r m a t i o nt e c h n o l o g yb e t w e e ni n d u s t r i a la n dl a b o r a t o r y s t r a i n s s e n s i t i v i t yo f t h r e ei n d u s t r i a ls t r a i n s ，s k 一1 、s p s c 一1 、n a n 一2 7 ，t og 4 1 8a n dc u 2 + w e r et e s t e d t h e s e n s i t i v i t yo ft h r e es t r a i n st og 4 1 8w a sv e r yd i f f e r e n t s p s c 一1a l c o h o ly e a s ts t r a i n h a dt h em o s te n d u r a n c et og 4 1 8a n dc o u l dg r e wi nm e d i u m h a v i n g7 5 0 9 9 m l g 4 1 8 s k 一1w a st h ew e a k e s ta n di tc o u l d n t g r o ww h e nm e d i u mh a dg 4 1 8e x c e e d i n g 1 0 0 i t g m l t h e s a m es t r a i nh a dd i f f e r e n te n d u r e n c et oc u “o nd i f f e r e n tm e d i a s p s c 一1a l c o h o ly e a s tc o u l de n d u r e1 5 m m o l lc u 2 + i nt h ey e p dm e d i u mb u ti to n l y c o u l de n d u r el r n m o l lc u “i nt h ey n bm e d i u m w h e nt r a n s f o r m e db yl i a c ，t h e b e s tc e l lg r o w t ht i m eo fi n d u s t r i a is t r a i nw a so d 6 0 00 8 - 1 0a n dg r o w i n gf o r6h o u r s o nc o m p l e t em e d i u mb e f o r et r a n s f e r r e dt og 4 1 8s e l e c t i o np l a t ec o u l di n c r e a s et h e n u m b e ro ft r a n s f o r m a n t s s p h e r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o nm e t h o dw a sm o d i f i e d t h e t r a n s f o r m a t i o ns y s t e m sf o rt h et h r e ei n d u s t r i a ly e a s ts t r a i n sw e r ee s t a b l i s h e d t h e d e v e l o p m e n to ft h et r a n s f o r m a t i o ns y s t e m sf o rt h e t h r e ei n d u s t r i a ly e a s ts t r a i n si s e s s e n t i a lf o ri m p r o v i n gt h ey e a s ts t r a i n sb ym e t a b o l i ce n g i n e e r i n g - t h es t r a t e g yf o rd i r e c ti n t e g r a t i o no fat a r g e tg e n ei n t ot h eh o s tc h r o m o s o m ei s a ne f f e c t i v em e t h o df o rt h es t a b l ee x p r e s s i o no ff o r e i g ng e n e si nt h ei n d u s t r i a ls t r a i n o fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a h o w e v e r , m o t o t i c a l l yh i g h l ys t a b l ey e a s ti n t e g r a t i n g p l a s m i d s ( y i p ) a r ea r en o ta d e q u a t ef o rb i o t e c h n o l o g i c a la p p l i c a t i o n ，w h e r eh i g h p r o d u c ty i e l di st h ep r i n c i p a la i m ，b e c a u s e t h e i rc o p yn u m b e ri sv e r yl o w r d n al o c u s c o n s i s t so f1 5 0 2 0 0 t a n d e m l yr e p e a t e dc o p y o fr d n au n i ti nt h e 量c e r e v i s i a e g e n o m i c ，s o t h a tt h ef o r e i g n g e n e sc o u l d b ei n t e g r a t e di nh i g hc o p yn u m b e r i n t ot h e 量 c e r e v i s i a eg e n o m i c w ec o n s t r u c t e da ni n t e g r a t i n gv e c t o rp y m i k pc o n t a i n i n g a r d n ap o r t i o na sa h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n s e q u e n c e t oo b t a i n m u l t i c o p y i n t e g r a n t sa n dp g k lp r o m o t e ra n dt e r m i n a t o r ，a n dw i t ht h eg 4 1 8r e s i s t a n c eg e n e ( k a n m x ) a s d o m i n a n ts e l e c t i o nm a r k e r t h i si n t e g r a t i n gv e c t o ri sa ni d e a lv e c t o rf o r c o n s t r u c t i o no ft h eg e n e t i c a l l ye n g i n e e r e d 量c e r e v i s i a et h a tu s e di n d u s t r i a ls t r a i na s 9 山东大学博士学位论文 t h eh o s t i nt h en a t u r e a i l yx y l o s e u t i l i s i n gy e a s t ，t h ef i r s tt w oe n z y m a t i cs t e p si n x y l o s e m e t a b o l i s ma r e c a t a i y s e db yn a d p h d e p e n d e n tx y l o s er e d u c t a s e ( x r ) a n d n a d + _ d e p e n d e n tx y l i t o ld e h y d r o g e n a s e ( x d h ) x y l o s ei s f i r s tr e d u c e db yx rt o x y l i t o l ，w h i c h t h e no x i d i s e d b yx d ht ox y l u l o s e t h e nx y l u l o k i n a s e c o n v e y s x y l u l o s et ox y l u l o s e5 一p h o s p h a t e t h ex y l la n dx y l 2g e n e ，w h i c he n c o d ex y l o s e r e d u c t a s e ( x r ) a n dx y l i t o ld e h y d m g e n a s e ( x d h ) f r o m p i c h i as t i p i t i s ，a n dt h ex k s l g e n e ，w h i c he n c o d e sx y l u l o k i n a s e ( x k ) f r o msc e r e v i s i a e ，w e r el i g a t e di n t ot h el o w c o p yo fi n t e g r a t i n gp l a s m i dp y i ka n dt h em u l t i p l ec o p i e so fi n t e g r a t i n gp l a s i n i d p y m i k t h ep g k a n da d h l p r o m o t e r sa r es t r o n ga n d c o n s t i t u t i v ep r o m o t e r s ，o f t e n u s e df o rh e t e r o l o g o u s g e n ee x p r e s s i o n t h ep r e s e n c eo ft h ea d h ls q u e n c em a y e n h a n c et h ee x p r e s s i o no ft h eg e n ec o n t r o l l e db yt h ep g k p r o m o t e r t h ex y l lg e n e i su n d e rt h ec o n t r o lo fa d h p r o m o t e ra n dt e r m i n a t o r , x y l 2i su n d e rt h ec o n t r o lo f p g k p r o m o t e ra n dt e r m i n a t o r h i g h e rs p e c i f i c a c t i v i t i e so fx d ht h a nx rw e r e o b t a i n e di nt h e 只c e r e v i s i a es t r a i n s i ti sp o s s i b l et or e d u c et h ex y l i t o lf o r m a t i o nb y p r o d u c em o r ex d h t h a nx r x k s li su n d e rt h ec o n t r o lo fp g kp r o m o t e ra n d t e r m i n a t o r t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r en a m e d p y i k x y l 2 3a n dp y m i k x y l 2 7 ， r e s p e c t i v e l y i nt h eb a c t e r i a ，d x y l o s ei s o m e r a s ec a t a l y s e st h er e v e r s i b l ei s o m e r i z a t i o no f d x y l o s et od x y l u l o s e x id o e sn o tr e q u i r er e d o xc o f a c t o r s a n dc a n n o tg e n e r a t e c o f a c t o ri m b a l a n c e d u r i n ga n a e r o b i cx y l o s e u t i l i z a t i o n t h eg e n ef o rx y l o s ei s o m e r a s e ( x y a ) f r o mt h e r m u st h e r m o p h i l u sa n dt h ee n d o g e n o u sg e n ee n c o d i n gx y l u l o k i n a s e ( x k s l ) w e r el i g a t e di n t ot h el o wc o p y o f i n t e g r a t i n gp l a s m i dp y i k a n dt h em u l t i p l e c o p i e so fi n t e g r a t i n gp l a s m i dp y m i k ，r e s p e c t i v e l y t h ex y a a n dx k s lg e n e sa r e u n d e rt h ec o n t r o lo fp g k p r o m o t e ra n dt e r m i n a t o r t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r e n a m e d p y i k x y l l 2 a n dp y m i k x y l l 4 ，r e s p e c t i v e l y t h ep l a s m i dp y m i k - x y l2 3w a sl i n e a r i z e dw i t ha p a ia n dp y l k - x y 一1 1 2w a s l i n e a r i z e dw i t hs t u l ，w h i c hg e n e r a t eh o m o l o g o u se n d st oi n i t i a t ei n t e g r a t i o n t h e s e w e r et r a n s f o r m e di n t ot h ei n d u s t r i a ls t r a i no fsc e r e v i s i a en a n 2 7a n dl a b o r a t o r y s t r a i no fs c e r e v i s i a eh 一1 5 8 t r a n s f o r m a n t sw e r es e l e c t e do ny p xp l a t e st h a th a v e l n 坐蔓奎兰堕主兰堡笙苎 x y l o s ea st h es o l ec a r b o ns o n r c ea n dt h a tc o n t a i n e dg 4 1 8 ，r e s u l t i n gi nr e c o m b i n a n t s t r a i n sn a n 1 2 3 、h 一1 2 3 、n a n 一1 1 2a n dh - 1 1 2 c o n m i n i n g t h ex y l o s em e t a b o l i z i n g g e n e sw i t hal o wc o p yn u m b e nt h ep l a s m i dp y m i k - x y l 2 7a n dp y m i k - - 11 4w a s l i n e a r i z e dw i t hh p a it ot a r g e ti n t e g r a t i o nt ot h er d n a r e g i o ni nt h eg e n o m eo ft h e y e a s th o s ts t r a i n t h e s ew e r et r a n s f o r m e di n t ot h ei n d u s t r i a ls t r a i no f & c e r e v i s i a e n a n 一2 7a n d l a b o r a t o r ys t r a i no f 丘c e r e v i s i a eh 一1 5 8 t r a n s f o r m a n t sw e r e s e l e c t e do n y p x p l a t e st h a th a v ex y l o s ea st h es o l ec a r b o ns o u r c ea n dt h a tc o n t a i n e dg 4 1 8 t o i n c r e a s et h ec o n c e n t r a t i o n so fg 4 1 8 p r o v i d sas t r o n g e rs e l e c t i v ep r e s s u r e ，w h i c hm a y h a v el e dt oh i g h e r c o p yn u m b e r s f u r t h e rs c r e e n i n gw a sp e r f o r m e db ym e a s u r i n g t h e b i o m a s sf o l l o w i n g g r o w t ho ny p x ，r e s u l t i n g i nr e c o m b i n a n ts t r a i n sn a n 一1 2 7 ，h 一1 2 7 ， n a n 一11 4a n dh 一11 4c o n t a i n i n gm u l t i p l ec o p i e so ft h ex y l o s em e t a b o l i z i n gg e n e s m o r e o v e r , a b o u t9 6 o fc e l l sw e r es t i l la l i v eo ny p x p l a t e sc o n t a i n i n gg 4 1 8a f t e r 1 4 6ho fg r o w t hw i t h o u ts e l e c t i o np r e s s u r e t h e 曼c e r e v i s i a er e c o m b i n a n t sw e r e g r o w n i ny e p dw i t h o u tg 4 1 8a n dt h e ye x p r e s s e dx r ，x d ha n dx ka c t i v i t i e s t h i s i n d i c a t e st h a tr e c o m b i n a n ts t r a i n sa r es t a b l ea n de x p r e s s i o n so ft h eg e n e sw e r en o tl o s t o v e rt i m e t h es p e c i f i ca c t i v i t i e so fx y l o s em e t a b o l i z i n ge n z y m e si nt h er e c o m b i n a n t s t r a i n s b yr d n ai n t e g r a t i o n w e r e h i g h e r t h a nt h er e c o m b i n a n ts t r a i n s b y u r a i n t e g r a t i o n t h i si n d i c a t e st h a tt h er d n a r e s u l t si ni n t e g r a t i o no fm u l t i p l ec o p i e so f t h e x y l o s em e t a b o l i z i n gg e n e s a n de n h a n c e d e x p r e s s i o n l e v e lo ft h e x y l o s e m e t a b o l i z i n g x y l o s eg l u c o s ec o f e r m e n t a t i o n so ft h e 曼c e r e v i s i a er e c o m b i n a n ts t r a i n sw e r e p e r f o r m e du n d e r0 2 一l i m i t e dc o n d i t i o n s t h er e s u l t ss h o wt h a tt h eg r o w t hc u r v e sf o r t h o s et h r e es t r a i n sa r eq u i t es i m i l a r t h i si n d i c a t e st h a tt h ei n t r d u c e df o r e i g ng e n e sa r e n o te f f e c tt h eg r o w t ho fr e c o m b i n a n ts t r a i n s t h ea m o u n t so fs u b s t r a t e st h a t