（植物学专业论文）灰花纹鹅膏四种肽类毒素的分离纯化、结构鉴定与毒性分析.pdf

摘要 本论文利用高效液相色谱系统分离纯化了4 种鹅膏肽类毒索并 运用质谱、紫外光谱等技术进行了结构鉴定，利用高效液相色谱技术 对中毒病人体液中的a a m a n i t i n 进行了检测，同时对分离的3 种肽类 毒素进行了毒性分析。研究结果如下： 1 从灰花纹鹅膏菌中分离纯化出了4 种肽类毒素，并用环肽检 测、紫外光谱和质谱对4 种肽类毒素进行了初步鉴定，其中3 种为三 羟鹅膏毒肽( a m a n i n ) 、二羟鬼笔毒肽( p h d ) 、一羟鬼笔毒肽( p h n ) ， 另外1 种的分子量为l1 4 5 4 6 3 6d a ，是否为新毒素需进一步确定。 2 3 种肽类毒素的毒性分析结果如下：a m a n i n 为慢作用毒素， 对小自鼠的l d 5 0 为5 6 5 p g k g 一，小白鼠中毒死亡时问为3 - 7 天，中 毒后期能引起肝脏萎缩，同时能能显著抑制绿豆种子胚根的增长； p h d 、p h n 为快作用毒素，对小白鼠的l d 5 0 分别为2 0 0 0 9 9 k g 1 和 1 5 0 0 9 9 虹，小白鼠中毒死亡时间均为2 - 4 小时，都能引起肝脏肿 大充血，p h d 能抑制绿豆种子胚根的伸长。 3 用e l i s a 方法对a m a n i n 和p h i ) 进行了生物活性筛选，结 果表明：它们对p p l 、p a l 1 、c d c 2 5 、c a t - k 和c a t - b 无抑制作用。 4 建立了一种快速检测鹅膏菌中毒患者体液中的n a m a n i t i n 的 方法。其回归方程为：y - - 2 3 4 9 8 4 5 8 9 x - 1 8 9 5 9 8 9r = 0 9 9 5 8 。其中 为进样量( 弘g ) ，y 为峰面积，r 为相关系数，进样在0 0 1 0 0 1 0 0 i _ t g 的范围内与峰面积呈良好线性关系。并应用该方法临床检测了鹅膏中 毒患者体液中的a m a n i t i n 的含量，其含量范围是0 0 9 4 p g m l q 0 4 8 9 i t g m l 一。 5 对一起灰花纹鹅膏引起中毒的患者的肝功能实验综合指数( h i b t ) 进行了分析，其分析结果与临床症状吻合。 关键词：灰花纹鹅膏菌，肽类毒素，检测分析，结构鉴定，毒性分析 a b s t r a c t f o u rk i n d so fm a i na m a n i t a p e p t i d et o x i n sw e r ei d e n t i f i e db ym e a l l s o f r p h p l c ，m s ，u v s p e c t r o g r a p h t h e m e t h o do fr p h p l c d e t e r m i n a t i o no fa l p h a - a m a n i t i ni nt h e b o d yf l u i dh a db e e nd e v e l o p e d m e a n w h i l et h et o x i c i t yo ft h r e ek i n d so fm a i np e p t i d et o x i n sh a db e e n a n a l y s e d t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w i n g s ： 1 f o u rk i n d so fm a i np e p t i d et o x i n sw e r ep u r i f i e da n dp r e l i m i n a r y d e t e r m i n e d b ym e a n so fr p - h p l c ，u vs p e c t r o g r a p h a n dm sf r o m a m a n i t af u l i g i n e a t h r e eo ft h e m a r e a m a n i n ，p h a l l o i d i n ( p h d ) a n d p h a l l o i n ( p h n ) t h e m o l e c u l a r w e i g h to f t h el a s to n ei sl1 4 5 4 6 3 6d a 2 。t h et o x i c i t yo f p e p t i d et o x i n sw e r ea sf o l l o w i n g ：a m a n i ni ss l o w f u n c t i o nt o x i n ，t h ew h i t em o u s e sl d s oi s 5 6 5 1 g k 分1 ，t h ed e a t ht i m eo f t h ew h i t em o u s ei s3 - 7d a y s ，t h el a t e rp e r i o d o f p o i s o n i sa b l et oc a u s et h e l i v e rt ow i t h e r a tt h es a m et i m ei tc a n r e m a r k a b l ys u p p r e s st h eg r o w t h o f t h em u n gb e a ns e e dr a d i c l e ；p h d ，p h na r eq u i c k - a c t i o nt o x i n s ，t h ew h i t e m o u s e sl d s oi s2 0 0 0 肛g k 9 1a n d1 5 0 0 p g k g r e s p e c t i v e l y t h ed e a t h t i m eo ft h ew h i t em o u s ei s2 - 4h o u r s ，a l lc a nc a u s et h el i v e rt u r n e de s c e n t h y p e r e m i a ，p h dc a ns u p p r e s st h ee l o n g a t i o no ft h em u n gb e a ns e e d r a d i c l e 3 a m a n i na n dp h i ) w e r es c r e e n e di nb i o l o g i c a l a c t i v i t yw i m t h e e l i s am e t h o d ，w h i c hs h o w e dn o i n h i b i t o r y a c t i o nt op p 1 ，p a l 一1 ， c d c 2 5 c a t ka n dc a t - b 4 t h er p h p l cm e t h o df o rt h er a p i dd e t e r m i n a t i o no fc t a r n a n i t i n i nt h e b o d y f l u i do fp a t i e n t sc a u s e d b yp o i s o n o u s m u s h r o o mw a s d e v e l o p e d t h er e g r e s s i o ne q u a t i o nw h i c h w a su s e dt oi n d e n t f yt h et r a c e a l p h a - a r n a n i t i n ，w a sy = 2 3 4 9 8 4 5 8 9 x - 1 8 9 5 9 8 9r = 0 9 9 5 8 x r e p r e s e n t t h e i n j u r eq u a n t i t y ( p g ) ，yr e p r e s e n tt h ep e a ka r e a ，r e p r e s e n tt h ec o r r e l a t i o n i i c o e f f i c i e n t ，t h er e s u l ts h o w t h a ts t a n d a r dc b r v ew a sl i n e a ri nt h e r a n g e o f 0 0 1 0 0 1 0 0 p g t h e d e t e r m i n a t i o nm e t h o dw a sc o n v e n i e n t ，s e n s i t i v e ， a c c u r a t ea n ds u i t a b l ef o rt h ed e t e r m i n a t i o no fa a m a n i t i ni nt h eb o d y f l u i do fp a t i e n t sc a u s e d b yp o i s o n e o u s m u s h r o o m a l p h a - a m a n i t i n c o n t e n tw a ss u r v e y e di nt h ep a t i e n tb o d yf l u i d ，i t sc o n t e n ts c o p ew a s 0 0 9 4 “g m l - i _ 0 4 8 9p g m l 1 ，t h i sm e t h o dh a ds o m e r e f e r e n c ev a l u e f o rt h ed i a g n o s i sa n dt h et r e a t m e n t 5 t h el i v e rf u n c t i o ne x p e r i m e n t c o m p o s i t ei n d e x ( h i b t ) o f s o m e p a t i e n t sc a u s e db yp o i s o n o u sm u s h r o o m w a s a n a l y z e d ，t h er e s u l ts h o w e d t h a ti ta c c o r d a n c e dw i t ht h ec l i n i c a lr e s u l t k e yw o r d s ：a m a n i t af u l i g i n e a ，p e p t i d e s ，d e t e r m i n a t i o n ，s t r u c t u r e i d e n t i f i c a t i o n ，t o x i c i t y i i l 1 引言 鹅膏菌是属于真菌门、层菌纲、伞菌目、鹅膏菌科、鹅膏菌属 0 m a n i t a ) 的一类高等担子菌。通过c a b i ( 2 0 0 5 ) i t 真菌数据库检索， 全世界已记录l1 3 7 个分类单元，是一个世界性分布的大属，在菌物 学文献中已为我国记载了近1 0 0 种( 含亚种、变种和变型) 鹅膏菌【2 1 。 由于误食蘑菇而引起的中毒事件在世界各国普遍发生，其中绝大多数 的蘑菇中毒死亡事故是由鹅膏菌引起的1 3 , 4 】。在欧洲、美国【5 ，6 ，7 1 、南非 引、马来西亚【9 1 、墨西哥【1 0 】、澳大利亚【1 和印剧1 2 1 等国家和地区均有 因蘑菇中毒而引起死亡的记载，其中在欧洲和北美主要蘑菇中毒中 9 5 的死亡事故是毒鹅膏( a p h a l l o i d e s ) 所致【1 3 】。近年来在中国南方 一些地区频频发生因误食毒蘑菇而中毒死亡的事件，张志光4 l 等调 查发现导致中毒死亡的蘑菇主要是鹅膏菌属( a m a n i t a ) 中的一些种 类，其中主要有灰花纹鹅膏菌( a m a n i t a f u z i g i n e a ) 和致命鹅膏( a e x i t i a l i s ) 等【i 纠。鹅膏菌中的致死毒素主要是鹅膏肽类毒素，人们对 于鹅膏肽类毒素的研究已有1 0 0 多年的历史，目前己基本弄清了它们 的化学结构与性质、产生该类毒素的蘑菇种类、该类毒素的分析检测 方法、以及该类毒素中毒症状和机理并且找到了一些比较有效的治疗 方法。 1 1 鹅膏肽类毒素的种类、化学结构及性质 最早由德国f r e i b e r g 大学h e i n r i c hw i e l a n d 指导其学生r a a b ，j r e n x ，l y n e n ，u r i c hw i e l a n d 在1 9 3 0 年开始研究慢作用毒素【l 6 1 7 l ，至 1 9 3 7 年，他们在毒理实验和抽提实验中注意到三类毒存在，但在定名 上只确定为快作用毒素和慢作用毒素，并获得了快作用毒素结晶。二 战以后，t h e o d o r w i e l a n d ( 1 9 4 9 ) 【l8 】接着工作，取得了不少成果。最 初所有的鹅膏毒肽和鬼笔毒肽都是从欧洲的a p h a l l o i d e s 中分离出来 鉴定的，毒伞素是从欧洲的鳞柄白毒鹅膏( a 访r 口) 中分离出来的 ( w i e l a n d ，1 9 8 6 ) t 引。目前根据其氨基酸的组成和结构可把鹅膏肽类毒 素分为鹅膏毒肽( a m a t o x i n s ) 、鬼笔毒肽( p h a l l o t o x i n s ) 和毒伞素 ( v i r o t o x i n s ) 三类，并且已分离鉴定的天然毒素有2 2 种【1 9 l 。它们都 是环肽化合物，由氨基酸组成，其中大多数氨基酸是l 型构象，一些 氨基酸以氧化形式( 羟基化) 出现。如天冬氨酸、脯氨敬、亮氨酸、 异亮氨酸等。这些环肽毒素的共同特征是含有在吲哚环的2 位接有一 个硫原子的色氨酸残基，鹅膏毒肽和鬼笔毒肽是双环肽，以吲哚环2 位上形成的2 键硫基横跨连接。 1 1 1 鹅膏毒肽( a m a t o x i n s ) 鹅膏毒肽是类双环八肽的碳环骨架的结构式见图1 - 1 菌褶 菌托 菌盖 菌柄 菌托基部，在菌盖、菌褶、菌环和菌柄中的含量较高， a m a t o x i n s ( a a m a i n t i n ，f ；- a m a n i t i n ，y - a m a n i t i n ) 占3 2 2 - 4 5 8 ， p h a l l o i t o x i n s ( p h a l l a c i d i n ，p h a l l i s a c i n , p h a l l i s i n ，p h a l l o i d i n , p h a l l o i n ) 占5 4 2 6 7 8 ；而在菌托和菌托基部，a m a t o x i n s 只占1 9 2 2 1 4 ， p h a l l o t o x i n s 占7 8 6 8 0 8 。p h a l l o t o x i n s 的含量从菌环_ + 菌褶一菌盖一 菌柄一菌托一菌托基部依次增加，总的鹅膏毒素含量在2 0 5 1 7 4 4 m g g - 1 干子实体之间。p i q u e r a s r e n ( 1 9 8 6 ) 【4 0 】认为幼子实体比成熟的 子实体的毒素含量低。根据w i e l a n d ( 1 9 8 6 ) 1 3 】的数据统计结果表明： 欧洲的毒鹅膏( a p h a l l o i d e s ) 中a a m a i n t i n ，1 3 - a m a n i t i n ，y - a m a n k i n 的 含量分别是2 。2 ，2 6 ，0 4m g 。g d 干重，而北美洲的毒鹅膏 ( a p h a l l o i d e s ) 中a a m a i n t i n ，1 3 - a m a n i t i n ，7 - a m a n i t i n 的含量依次为1 6 ，1 7 ， 0 7 m g g - 1 干重。 1 3 2 灰花纹鹅膏菌( a f u l i g i n e a ) 中肽类毒素的种类及分布 我国鹅膏菌种类丰富，杨祝良( 2 0 0 2 ) 【4 i 】的研究表明，欧洲的毒 鹅膏( a p h a l l o i d e s ) 、白毒伞( a v e r n a ) 、鳞柄白毒伞( a v i r o s a ) 三种毒鹅膏菌在我国很可能没有分布，我国的很多种类包括几种剧 毒鹅膏菌都是东亚所特有的。陈作红等( 2 0 0 3 ) 【4 2 】利用高效液相色谱 ( h p l c ) 技术对产于我国的2 8 种鹅膏菌的主要肽类毒素( 鹅膏毒肽 和鬼笔毒肽) 进行了检测分析，并和采于欧洲( 德国) 的毒鹅膏( a p h a l l o i d e s ) 作对照，结果表明：灰花纹鹅膏、致命鹅膏、黄盖鹅膏白 色变种和欧洲毒鹅膏所含毒素种类多、含量高，其子实体菌盖部位主 要毒素总量分别达到1 2 5 8 6 7 1 t g g - 1 、8 1 5 2 8 嵋g 、1 0 5 8 2 p g g 、 7 4 5 2 8 “g 牙1 干重子实体。包海鹰等( 2 0 0 2 ) ”副利用h p l c 对分布于 我国长白山的1 0 种鹅膏菌中的0 【a m a i n t i n ，1 3 - a m a n i t i n 和p h a l l o i d i n = 种 主要鹅膏毒肽进行了分析。 湖南师范大学真菌研究室对灰花纹鹅膏菌含有主要毒素的种类 及毒素分布情况进行了检测。李东屏博士( 1 9 9 7 ) 【4 4 】利用h p l c 澳t 得 灰花纹鹅膏菌中主要含有a - a m a n i t i n 、d a m a n i t i n 、p h a l l a c i d i n 、p h a l l i s i n 、 p h a l l o i d i n 和p h a l l o i n 等六种毒素，并对灰花纹鹅膏菌的四个部位即菌 盖、菌柄、内菌幕、外菌幕和担孢子的不同毒素的含量进行了比较， 发现总毒素含量由高到低依次为菌盖、菌柄、内菌幕、外菌幕和担孢 子；胡劲松( 2 0 0 3 ) 4 5 1 也认为灰花纹鹅膏菌主要有以上六种毒素， 同时发现灰花纹鹅膏菌的毒素以鹅膏毒肽( a m a t o x i n s ) 为主，而鬼 笔毒肽( p h a l l o t o x i n s ) 的相对含量从菌盖、菌柄到菌托依次增加，并 且用核磁共振技术对c 【a m a n i t i n 、1 3 - a m a n i t i n 的结构进行了鉴定。张晓 元博士( 1 9 9 9 ) 【4 6 j 认为灰花纹鹅膏菌中含有。【a m a n i t i n 、l b - a m a n i t i n 、 a m a n i n 、a m a n i a m i d e 、p h a l l i s i n 、p h a l l o i d i n 、p h a l l o i n 署口p h a l l i s a c i n 等八 种毒素，同时分别对不同地区的灰花纹鹅膏菌的菌盖、菌柄和菌托与 基部的八种毒素的含量进行了测定；曹福祥博士( 2 0 0 1 ) 1 4 7 1 认为灰花 纹鹅膏菌主要肽类毒索有五种即a a m a n i t i n 、3 - a m a n i t i n 、p h a l l o i d i n 、 a m a n i n 和p h a l l o i n 。 李东屏博士( 1 9 9 7 ) 4 4 1 发现子实体在不同发育阶段( 从“针头期” 到成熟期) ，其毒素含量总的趋势是愈成熟其毒素含量愈高；胡劲松 ( 2 0 0 3 ) 4 5 1 认为不同发育阶段子实体的毒素含量变化较大，以菌盖尚 未充分展开，内菌幕即将破裂时的毒素含量最高( 2 3 7 9 3 3 1 x g g 。1 ) ， 在凋零时急剧降低( 4 6 7 4 9 p g g - 1 ) 。总的来说，大部分的研究是从 分析毒素的种类和含量的角度入手的，从结构鉴定的角度研究得比较 少。 1 4 中毒症状和机理 1 4 1 中毒临床症状表现 含有鹅膏肽类毒素的蘑菇引起的中毒症状明显表现出四个阶段： 潜伏期( 8 1 2 h ) ，误食鹅膏菌后，一般发病较慢，有6 1 2 h 的 潜伏期，也有病例到2 0 h 后才出现中毒症状，这一点对于诊断具有很 高的价值，因为大多数其它低毒蘑菇食用后2h 以内就表现出症状； 胃肠炎期( 8 4 8h ) ，潜伏期过后出现恶心、呕吐、腹痛、“霍 乱型”腹泻等肠胃症状；假愈期( 4 8 - 7 2h ) ，胃肠期过后，症状 消失，近似康复，1 2d 内无明显易见症状；内脏损害期( 7 2 9 6 h ) ，假愈期过后，患者重新出现腹痛、带血样腹泻等症状，病情迅速 恶化，出现肝功能异常和黄疽，肝肿大，这种损害可通过肝脏酶血清 浓度、谷氨酸草酰乙酸转氨酶( g o t ) 、谷氨酸丙酮酸转氨酶( g p t ) 和乳酸脱氢酶( l d h ) 的变化来进行诊断，随着这些酶活性的增 加，血凝性被严重扰乱，引起内出血是不一样的，最后导致肝、肾、 心、脑、肺等器官功能衰竭，5 8d 病人死亡。 1 4 2 中毒机理 鹅膏菌所含三类肽类毒素所引起的中毒性质和机理是不一样的， 鹅膏毒肽( a m a t o x i n s ) 是慢作用毒素，食后2 8d 死亡。a m a t o x i n s 对 人的致死量大约为o 1 m g k g - 1 体重，甚至更低。毒素由消化道吸收， 几内贬猪的致死剂量也是0 1m g k g 1 体重，人和猪不管是口服还是 静脉注射或腹腔注射其效果一样，但对于一些动物如小鼠和大鼠尽管 经静脉注射或腹腔注射其半致死董l d 5 0 为0 3 o 。6n a g k g 1 体重，但 口服不中毒【4 】，在其它动物中，f i u m e 纠档1 发现猫和狗能用消化道 吸收。我们最近几年在调查中发现食用了中毒病人呕吐物的鸡也能中 毒死亡。鬼笔毒肽( p h a l l o t o x i n s ) 和毒伞素( v i r o t o x i n s ) 是快作用毒 素，静脉或腹腔注射实验动物，一般2 5h 内就死亡，口服不中毒， 其致死剂量比a m a t o x i n s 要高，对于小白鼠的半致死量l d s o 为1 5 2 0m g k 9 1 体重。由于在误食鹅膏菌后2 5 h 内并没表现出症状，以 及鬼笔毒肽不被肠道所吸收，因此在鹅膏菌中毒事件中，主要起作用 的是鹅膏毒肽( a m a t o x i n s ) 。鹅膏菌毒素毒理作用机制，现在已经 有了比较定性的结论，鹅膏毒肽主要抑制真核生物的r n a 聚合酶活 性，鬼笔毒肽和毒伞素则主要作用于真核细胞的肌动蛋白。 f i u m e 和s t i r p e 等( 1 9 6 6 ，1 9 6 7 ) 1 4 9 1 1 5 0 1 发现旺a m a n i t i n 中毒小白 鼠开始2 4 h 内肝细胞核r n a 含量持续下降的现象，并且发现通过体内 体外由a - a m a n i t i n 处理的属肝细胞核的r n a 合成被严重阻断，因此认 为睢a m a n i t i n 抑制r n a 聚合酶。l i n d e l l 等【5 l 】用来自于海胆和鼠肝的 r n a 聚合酶i 、i i 、i 进行实验，发现只有r n a 聚合酶i i 被抑制， 被抑制的浓度低至5 l on g m l 一，而对r n a 聚合酶i 不起作用。 s e i f a r t 等 5 2 1 进一步发现r n a 聚合酶i 也受a - a m a n i t i n 的抑制，其 a a m a n i t i n 抑制浓度为r n a 聚合酶i i 的1 0 3 1 0 4 倍。不同来源的真 核细胞的r n a 聚合酶i i 对a a m a n i t i n 的敏感性是不一样的，哺乳动 物以及鱼和昆虫的r n a 聚合酶i i 对a a m a n i t i n 高度敏感，一些植物 的r n a 聚合酶i i 的敏感性较哺乳动物细胞低5 倍左右，而一些真菌 的敏感性就小于5 0 倍以上，对于含有鹅膏毒肽的鹅膏菌，其r n a 聚 合酶i i 对c 【- a m a n i t i n 就产生几乎完全的抗性了 4 1 。b r o n d n e r 和 w i e l a n d ( 1 9 7 6 ) ”m 在牛的淋巴细胞的核内发现了一种鹅膏毒肽( a m a t o x i n s ) 的结合蛋白，同是在麦芽中也发现了这种蛋白。 由丝状肌动蛋白( f - a c t i n ) 构成的微丝是细胞骨架的主要成分， 丝状肌动蛋白( f a c t i n ) 是由球状肌动蛋白( g a c t i n ) 聚合组装而 成，在正常生理状态下，f a c t i n 与g a c t i n 之间的聚合与解聚是一个 动态的平衡过程，这一动态过程关系到r p 水解释放能量与细胞质运 动、细胞内运输和肌肉运动等生理过程，鬼笔毒肽( p h a u o t o x i n s ) 能 专一性地与f a c t i n 结合，从而打破f a c t i n 与g a c t i n 之间的平衡，大 量形成f a c t i n 毒肽复合体5 4 1 。g a b b i a n i 等( 1 9 7 5 ) 1 5 5 1 当用日剂量低 于半致死剂量的曲a l l o i d i n 注射小白鼠后，发现小白鼠肝内的f a e t i n 的 数量增加，这主要是由于当鬼笔毒肽( p h a l l o t o x i n s ) 毒素通过转运系 统透过肝细胞膜时，立即与双层膜下的f a c t i n 结合所引起的。毒伞素 ( v i r o t o x i n s ) 也具有相同的作用机制。 1 5 鹅膏肽类毒素中毒治疗 1 5 1 症状前的早期治疗 对于那些误食了含有鹅膏毒肽蘑菇但在6h 以内被送到了急救中 心的病人，或者还未出现或刚表现出恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状 的病人，采用胃肠道清除是有效的。胃肠道清除有以下处理方法： 洗胃，用宽内径的导管和生理盐水洗胃；活性炭吸附，洗胃以后 先用1 0 0g 的活性炭留在胃中，如果仍未腹泻，对于成人可以混以7 0 的山梨糖醇，对于小孩可以混以3 5 的山梨糖醇；导泻，如果 没用山梨糖醇的话，可用柠檬酸镁作泻药，但柠檬酸镁与极个别致死 有关，一些机构不再建议使用。然而大多数病人都是误食后数h 开始 呕吐、腹泻以后才进医院。对于这些病人，洗胃和催吐药不能起到十 分明显的作用。 1 5 2 毒素排除 误食毒菌后的前3 d ，毒素被肝反复吸收，毒素从胃肠道中剩余的 蘑菇残渣和被毒素污染的胆汁中进入血流中，以下方法可减少胃肠道 中的毒素。通过单腔或双腔管连续的十二指肠抽吸，管子通过幽门 进入十二指肠的第二或第三部位；活性炭吸附，通过吸管或口服每 2 4 h 增加l o g 活性炭至十二指肠，活性炭的起始剂量可与山梨糖醇 混合使用( 对于成年人，剂量为每公斤体重lg 活性炭加4 3 m l7 0 的山梨糖醇，对于小孩，则使用3 5 的山梨糖醇) 5 6 1 ；胆汁引流， 该方法在4 8 h 以内可作为一种治疗方法【5 饥。 1 5 3 促进肾排泄 尿排泄是去除毒素的主要途径，因此，过去一些人建议最大限度 地排尿，强制性利尿的方法包括渗透性利尿和药物利尿如呋哺苯胺 酸，然而i | 蠡床研究缺乏确切的证据来支持这一方法。但维持适宜的尿 液排出量是必需的，过度排尿会给本已受损的肾带来危险。呕吐和腹 泻会导致体液迅速损失，因此必须维持病人的体液平衡，尤其在采取 强制性利尿的情况下更应注意，当体液不足时，强制性利尿必须禁忌， 直到体液补充治疗稳定了病人的血液动力学，利用中心静脉线可方便 监测1 3 1 。 1 5 4 医疗护理 精心医护已成为提高生存率的重要因素，对于每个病人来说，并 不是以下所有方法都要采用，但在适当情况下这些方法都应考虑和采 用【1 5 1 。摄取和排泄的监护；输液治疗；中心静脉导管的安 置，便于血液动力学不稳的病人的体液监测；静脉注射葡萄糖， 维持血液中正常葡萄糖的水平可防止对低血糖的不利影响；血清 因子的监测，凝血酶原、转氨酶、肌酸酶、电解质、钙、磷酸盐、纤 维蛋白原和氨的水平应定时( 每1 2 2 4h ) 进行监测；血浆的补 充，对于那些胃肠出血的病人需要补充血浆以维持血液体积和凝血因 子的适当水平：输血治疗，当胃肠损害很严重时，需进行输血补 充。 1 5 5 药物治疗 在过去，尽管试验了许多药物试图减少毒素对肝的进一步损害， 但由于每个病人所得到的复杂治疗难以判断这些药物的真正效果，然 而，下列药物仍可建议使用【1 4 ，巧】。青霉素g ，使用剂量为4 0 百万 单位d q 或每公斤体重0 5 1 万单位d 一，注射3d ，小孩剂量为每 公斤体重l 万单位，这种抗生素通常在连续静脉注射时加入，大剂量 的青霉索可能引起抽搐，因此在注射时要注意监护好病人；蓟素 和水飞蓟素，这种治疗方法行之有效，在欧洲几乎每个鹅膏毒素中毒 的病人都要部分用到。蓟素和水飞蓟素是从野生植物蓟( s i l y b u m m a r i a n u m ) 中提取而来，由于它的“护肝”作用而在欧洲得到广泛使 用。大量的实验和i | 缸床研究证明了它的有效性，静脉注射的剂量为每 公斤体重2 0 3 0m g d - i ；维生素k ，4 0m g d 一，静脉注射；皮 质类固醇如地塞米松，2 0 4 0m g d 1 ，静脉注射。二巯基丙磺酸 钠，5 5 m g ，肌肉注射，近年来在我国广泛采用。 1 5 6 中药治疗 使用中草药治疗蘑菇中毒在我国有很多方法介绍【诣】，何晓玲等【5 9 1 ( 1 9 9 9 ) 报道了应用紫灵芝对鹅膏菌中毒的治疗效果，取无虫蛀紫灵 芝干品5 0g 磨粉，加水煎2 次，然后将2 次煎液混合浓缩至约1 5 0 m l ，口服，每天3 次，每次5 0m l 。结果表明在救治的2 8 例病人中， 治愈2 7 例，因此认为紫灵芝是治疗各种毒蘑菇的理想药物。近年来 在湖南的很多蘑菇中毒病例中，湘雅医院采用我们建议的该方法也取 得了很好的效果。 1 5 7 肝移植 肝是鹅膏毒素易于损害的器官，如果肝损害很严重，需考虑肝移 植，美国自1 9 8 8 年起就把肝移植作为一种确定的方法来使用l 删，从 适宜的观点来说，很多鹅膏毒索中毒的病人都是理想的，通常他们年 轻，很少有其它不利于肝移植的健康问题，但有两个问题要注意，第 一，病人是否适宜做肝移植，第二，最佳手术时候。目前鹅膏中毒病 人死亡率一般在1 0 - - 3 0 ，而肝移植危险性很大，必须采取非常严 格的标准以防止不适宜地进行肝移植，肝移植不是一般的手术，除高 昂的费用外，并且随之产生的长期病态也仍然高。在肝损害急剧恶化 的情况下，可接受肝移植的指征包括凝血酶原低于2 0 并伴随着肌酸 肝上升( 大于2 m g d l 1 ) 和高的胆红素值( 大于2 0 m g d l 。1 ) ( l 。 1 5 8 血液透析 鹅膏毒素与活性炭有很高的亲和性，然而，狗的毒物动力学实验 数据表明任何形式的血液透析似乎不太有效，除非在误食的前几个小 时或任何症状不明显之前。尿液中的鹅膏毒素排泄量比血液透析所达 到的最大排出量要高好多倍。尽管这样，但仍有很多机构认为该方法 有一定作用，在一些国家，不管何种中毒，血液透析是一种通用的方 法，而不考虑它的科学理由。 1 5 9 血浆置换 该方法在很多鹅膏中毒的治疗病例中得到了应用【6 ，从理论来 讲，它不会对毒素浓度产生明显影响，除非在中毒的早期进行。鹅膏 毒素只在食后的开始l 2d 以比较低的浓度在血流中存在。然而， 在中毒后期，血浆置换对保持代谢正常和改善凝血机制是有好处的 【1 3 】。 1 6 该论文研究的目的和意义 发生蘑菇中毒后，要求确定误食毒蘑菇的种类，但很多情况下， 由于蘑菇发生季节很短，2 3 天后就采集不到标本了，或病人不能确定 所食用的蘑菇种类，这给鉴定带来很大困难，而目前要从中毒病人的 呕吐物、血液、尿液中进行毒素分析还很困难，主要原因是缺少毒素 标样和技术方法。目前在国际上只有美国s i g m a 公司有3 种鹅膏菌 肽类毒素标样( q a m a n i t i n ， 3 - a m a n i t i n ，p h a l l o i d i n ) 可出售，价值昂 贵，每克在1 0 万美元以上，它们主要是作为一类重要生化试剂应用 于分子生物学、发育生物学、遗传学、生物化学、医学、生物防治等 领域。因此本项目拟在本研究室研究基础上采用高效液相色谱系统等 分离纯化的方法对灰花纹鹅膏菌的毒素成分进行进一步的分离纯化， 并进行质谱分析以确定其毒素成分；通过制备型的高效液相色谱系统 制备鹅膏毒素成分的单体标样，并应用于误食毒菌子实体或中毒病人 血液、尿液中毒素成分的快速鉴定，建立一套切实可行的用于蘑菇中 毒事件处理的毒索单体标样和毒素成分快速鉴定方法。因此该项目的 研究对于预防中毒和中毒治疗具有特别重要的意义。 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 供试材料 灰花纹鹅膏菌( a m a n i t a f u l i g i n e ah o n g o ) 于2 0 0 2 年、2 0 0 3 年6 7 月在长沙灰埠、福临铺等地采集，采集后即进行清洁、冷冻干燥， 贮存在冰箱中备用。小白鼠购自于中南大学湘雅医学院。绿豆种子购 自市场。鹅膏中毒患者血样和尿样由中南大学湘雅医学院附属第三医 院提供。 2 1 2 毒素标样 阶a m a n i t i n ， 3 - a m a n i t i n ，p h a l l o i d i n ( p h d ) 购自美国s i g m a 公司， p h a l l a c i d i n ( p c d ) ，p h a l l i s i n ( p h s ) 由德国m a x - p l a n ki n s t i t u t f u e r m e d i z i n i s c h e f o r s e h u n g 的h f a u l s t i c h 教授惠赠。 2 1 3 试剂 醋酸铵( 美国s i g m a 公司) 、乙腈和甲醇为色谱纯( 湖南省化工 研究院) 、冰醋酸为分析纯、航空汽油、双蒸水( 自制) 。丙氨酸氨 基转移酶( a l t ) 赖氏法检验试剂盒，谷草转移酶( a s t ) 赖氏法检 验试荆盒。 2 1 4 主要仪器 高效液相色谱仪为w a t e r sd e l t a6 0 0 e ，填料为y e g c l 8 ，1 0 1 m a 的 反相柱，半制备柱为1 0 x 2 5 0 m m ，分析柱为4 0 x 3 0 0 0 r a m 。w a t e r s 2 4 8 7 紫外检测器，杭州英谱公司色谱工作站。 7 2 5 p s p e c t r u m ( 上海光谱仪器有限公司) 。 u v - 2 4 0 l p c 紫外分光光度计。 质谱仪为q t o f 型。 2 2 方法 2 2 1 鹅膏菌粗毒的提取 把鹅膏菌干子实体在烤箱中于6 0 7 06 c 烤于到恒重后粉碎。按 1 ：1 5 ( 克干子实体：毫升) 甲醇置于摇床上在室温下1 2 0 r m i n 1 抽提 1 2 小时，悬浊液4 0 0 0r m i n 。离心1 0 m i n ，取上清液保存于冰箱中， 沉淀同样再抽提一次，两次上清液合并，用航空汽油去脂二次，然后 进行冷冻干燥，冻干的样品用适量超纯水溶解，再用o 2 2 9 m 的微孔 滤膜过滤，得不同鹅膏菌的粗毒抽提液。保存于冰箱中备用。 2 2 2 鹅膏毒素的分离纯化 洗脱液由a 、b 两液混合，a 液为l o 乙腈+ 9 0 0 0 2 m 0 1 l 1 醋 酸铵；b 液为2 4 乙腈+ 7 6 0 0 2m 0 1 l o 醋酸铵。用冰醋酸调节p h 至5 0 。分离梯度模式1 4 7 1 ：o 一1 5 m i n ，b 液0 5 ，1 5 - - - , 3 5 m i n ，b 液5 - - - , 8 0 ，并保持5 m i n ；4 0 - - * 4 5 m i n ，b 液8 0 一1 0 0 ，并保 持5 m i n ；5 0 - - * 5 5 m i n ，b 液1 0 0 - - * 0 ，保持1 0 m i n 。纯化梯度模 式：0 - + 1 0 m i n ，b0 _ 5 ；1 0 - - * 2 5 m i n ，b5 _ 8 0 ，并保持5 m i r a 3 0 - - * 3 5 m i n ，b8 0 _ 1 0 0 ，并保持5 m i n ；4 0 - - + 4 5 m i n ，b1 0 0 _ o ， 并保持到结束。检测波长：2 9 5 n m ；柱温：4 0 v ；流速；分析柱： l m l m i n 1 ：半制备柱：2m l m i n 。进样量：分析柱：1 0 9 l ，半 制备柱：l m l t 4 7 1 。 2 2 3 环肽的检测 取两块2 5 m m x 2 5 m m 的硅胶g 板，( 板l 和板2 ) ，将样品分别点 在两块板上，用氯仿一甲醇( 8 5 ：1 5 或9 ：1 ) 展开，挥发掉溶剂后， 板l 放置，板2 悬于底部加有约l m l 浓h c l 的密封磨口玻璃缸中( 耐 酸和耐高温的玻璃缸) 置于已升温至1 1 0 c 的烘箱中加热水解l 一2 小时，冷却后取出板2 ，在通风柜中挥发掉盐酸，然后将未经水解的 板1 和加盐酸水解的板2 同时喷0 2 的茚三酮丙酮试剂，再用电吹 风加热几分钟即可显色。如果板2 上有紫色或黄色斑点，而板l 相应 位置上无显色的斑点。由此可提示样品中可能含有环肽或肽酰胺【6 2 】。 2 2 4 毒素的紫外光谱扫描 毒素在0 0 2 m 0 1 l j 的n i - h a c 和h a c 的缓冲液p h 为5 的条件 下，在1 9 0 4 0 0 m 范围内进行紫外光谱扫描。紫外光谱仪为 u v - 2 4 0 1 p c 紫外分光光度计。 2 ，2 5 鹅膏毒肽的质谱分析 在q - t o f 质谱仪上分析。 2 2 6 鹅膏毒素的l d 的测定 采用纪云晶主编的实用毒理手腮1 6 3 1 上所记载的简易方法。预 备实验：设三个梯度，每个梯度三只老鼠，每只老鼠注射的剂量分别 为5 0 p g k 岔1 ，5 0 0l a g k g 1 ，5 0 0 0p g k g 。补充实验：根据第一步 结果，设合适的间距较小的四个剂量，每组一只动物根据补充实验试 验结果，取两个或三个相邻剂量的几何平均值即得l d 5 0 。 2 2 7 注射鹅膏毒素的小白鼠的脏器体重比值的测定 称重后处死小白鼠，检查各内脏器官，取出肝脏和肾脏，在电子 天平上称重，计算脏体比值。 2 2 8 鹅膏毒素对绿豆种子萌发的影响畔1 用目标毒素溶液配成1 、o 5 、o 0 1 、0 0 5 、o 0 1m g m l 1 五个浓 度梯度的溶液。按对照组( c k ) 和处理组分别选取颗粒饱满、大小 均一绿豆种2 0 粒，放入衬有双层滤纸的培养皿中，3 组重复，加不 同浓度的目标毒素溶液3 m l 后置于2 6 t c 恒温箱中进行暗萌发，4 4 小时和7 0 小时后分别测量根的长度。于7 0 小时后每皿测量1 0 棵绿 豆的湿重与干重，并进行形态学观察。 2 2 9a m a n i n 和p h d 的生物活性筛选 方法：酶联接免疫吸附剂测定法( e n z y m el i n k e d i m m u n o s o r b n e n t a s s a ye l i s a ) 2 2 1 0 血样和尿样中静a m a n i t i n 的测定 ( 1 ) h p l c 测定条件及参数：洗脱液由a 、b 两相混合，a 液为 1 0 的乙腈+ 9 0 0 0 2m 0 1 l _ 的醋酸铵；b 液为2 4 的乙腈+ 7 6 o 0 2 t 0 0 1 l 1 的醋酸铵。用冰醋酸调节p h 值至5 0 。流速为l m l r a i n 一，柱温为4 0 。洗脱梯度设置为：1 0 0 a 液1 5 分钟- - - * 9 5 a + 5 b 液2 0 分钟- - * 2 0 a + 8 0 b 液1 分钟一1 0 0 b 液5 分钟一1 0 0 a 液 1 0 分钟。 ( 2 ) 样品的处理：准确量取o 5 m l 血样和尿样分别处理。每份 样品加1 0 0 的甲醇置于摇床上在室温下摇荡培养1 2 小时，4 0 0 0 r m i n 1 离心1 0 分钟，取上清液于冰箱中保存，沉淀再重复抽提一次， 取上清与前一次的合并，挥发掉甲醇，用l m l 超纯水溶解，用航空 汽油去脂二次，在冻干机中抽干，再用0 1 m l 超纯水溶解，用o 2 2 t t l 的微孔滤膜进行过滤，每次进样2 0 p l 。尿样浓缩到0 1 m l 后用0 2 2 1 l