（植物学专业论文）盐地碱蓬积累甜菜红素的抗氧化功能探讨.pdf

山东师范大学硕士学位论文 盐地碱蓬积累甜菜红素的抗氧化功能探讨 中文摘要 甜菜红素在繁殖器官如花瓣、雄蕊、种子和果实特定的发育阶段合成；也存 在于营养器官中，但受环境因子的高度调控。有关甜菜红素的早期研究，主要集 中在影响其合成的相关因子方面，主要包括生长调节物质、光照、光质( 远红光、 红光、蓝光) 、温度及营养元素( k + 、n o 。+ 、p q 3 、蔗糖及c u 2 + ) 等。 盐地碱蓬( 沏e 幽船j 船l ) 是典型的稀盐盐生植物，生长在黄河三角洲 滨海潮间带和洼地生长的盐地碱蓬由于受低氧、高盐与低温等综合逆境胁迫，在 整个生长季节地上部分皆为紫红色，而在地势较高或距海边较远的重盐碱地生长 季地上部分皆为绿色。王长泉等已鉴定潮间带生长的盐地碱蓬积累的色素为甜菜 红素。我们把两种表型盐地碱蓬种子都种在温室河砂中，其表型均为绿色，说明 甜菜红素的积累主要是受环境因子诱导。作为一种真盐生植物，盐地碱蓬的耐盐 机理已得到了比较广泛的研究，但有关盐地碱蓬积累甜菜红素的生物学意义尚未 见报道。本论文目的是研究甜菜红素在抗氧化方面的功能，为盐地碱蓬的抗盐机 理提供新的依据。 对盐地碱蓬进行低氧、不同盐及低温处理，以研究不同环境因子对盐地碱蓬 甜菜红素含量的影响。结果表明：低氧处理2h d ，处理6 0d 时，盐地碱蓬茎 与叶甜菜红素含量最高；一定浓度的盐处理对盐地碱蓬甜菜红含量有促进作用， 其中1 5 姗o l lm g s 仉、2 0 咖0 1 lk c l 和c a c l ：及1 5 0 姗0 1 几m g c l ：和l ( n 0 。作用 显著。但有趣的是n a c l 处理对盐地碱蓬甜菜红素的积累有抑制作用；低温( 4 2 ) 处理4h d ，处理6 0d 时，甜菜红素含量最高；相同处理对盐地碱蓬体内甜 菜红素合成的影响具有器官差异性，茎内甜菜红素含量高于叶片。这些结果表明： 盐地碱蓬甜菜红素的合成受低氧、盐及低温等因子的综合影响，其中低氧和低温 是主要因子。 在综合处理( 1 5m m o 儿m g s 0 4 、1 5 0m m o l lm g c l 2 、2 0m m o 儿k c l 、1 5 0 衄n o l lk n 0 3 、2 0i i l r n o 儿c a c l 2 、缺氧处理2h d 和低温处理41 1 d ) 条件下，茎 内h ：o 。含量显著高于叶，说明过氧化氢可能是作为一个信号分子起作用的。茎与 叶的d a b 染色表明，h ：0 ：对甜菜红素的诱导不仅与h ：o ：的含量有关，可能还与h ：0 2 的维管运输或分布有关。在茎的形态学上部，甜菜红素含量低，而h ：0 ：的含量却 高，说明甜菜红素的合成过程或分子结构本身可能对h ：0 ：存在清除作用。 无论是添加酪氨酸酶抑制剂处理，还是综合处理条件下茎与叶的比较，甜菜 红素的含量皆有显著性差异，但甜菜红素的存在对抗氧化酶活性的影响却不尽相 同。其中，a p x 酶活性增加，但s o d 的酶活性升高或降低，而c a t 酶活性则不变， 说明甜菜红素可能对超氧阴离子亦存在清除作用。 山东师范大学硕士学位论文 以自然条件潮间带生境下的紫红色表型和绿色表型的盐地碱蓬为实验材料， 对二者在抗氧化酶、过氧化氢含量等方面进行了比较研究，并对紫红色表型盐地 碱蓬进行外源过氧化氢处理，分析了外源h ：o ：浓度与叶片甜菜红素含量的相关 性。结果表明：绿色叶表型的盐地碱蓬叶内过氧化氢含量极显著高于紫红色叶表 型盐地碱蓬，而二者的抗氧化酶( s o d 、c a t 和a p x ) 的酶活性无显著性差异。外 源过氧化氢的浓度与叶片内甜菜红素含量存在显著负相关。 以上结果表明，甜菜红素可能作为一种非酶促抗氧化剂参与过氧化氢水平的 调节，从而减少胁迫引起的氧化伤害。 关键词：甜菜红素；盐地碱蓬；低氧；低温；盐；抗氧化作用；过氧化氢 分类号： q 9 4 5 7 8 山东师范大学硕士学位论文 s t u d y so nt h ea n t i o x i d a n tf u n c t i o n0 fb e t a c y a n i na c c u m u l a t i n g nt i n 跖口e 口口s 口坫口l a b s t r a c t b e t a c y a l i l i ni ss ) ，i l m e s i z e di nv e g e t a t i v e 孤1 dr 印r o d l l c t i v eo 玛a n so fs o m ep l a n t s h lv e g e t a 廿v eo r g 锄s ，i t s c u n m l 撕o ni s1 1 i 曲l ya 丘抚t e db ye n v i r o m 朗t a lc o n d i t i o 玛 b u ti i lr 印r o d 撕v e0 r g a i l ss u c h 私p e t a l s ，s t 锄e 邶，s e e d sa i l d 觚i t s ，b e t a c y a i l i ni s m a i n l yc o n t r o n e db yd e v e l o p m e n t a ls t a g e s p r e v i o l l ss m d i e sw e r em 2 l i n l yf o c l l s e do n t l l ef 犯t o r s ，w 1 1 i c hi l l n u e n c e dm ea c c u i i 】【u l a ：t i o no fb e t a c w m i l l ，e 召p l a n t 罂d w t h r c g i l l a t o r s ，l i 出q u “t y ( e g r c d1 i 出，缸r e d1 i 蛳觚db l u el i 出) ，l i 蛳q u 锄t i 劬 t e m p e 阳臼l r ea l l d 肌t r i t i o ne l e m e m s ( e g k + 、n 0 3 + 、p 0 4 3 。、跚c m s ea i l dc u 2 + ) t h ec h e n o p o d i a c e 勋口g 如阳加l ，ac 3p l a n t ，i sas u c c u l e me u h a l o p h y t e s h o o t so f & s 口b 口a r ev i o l e t - r e dt l l r o u 曲o u tn l ew h 0 1 eg r o 、 ，t hp e r i o du i l d e rh y p o x i 码 l l i 班s a l t 锄dl o wt e m p e r a t u r ec o n 出t i o n si n 也ei 1 1 t e n i d a lz o n e ，b u tg r e e no ns a l i n e i n l a n df 打蛋b mt l l es e a s i d e n o w a d a y s ，m ep i 舯e n ti np l 锄t sh 弱b e e ni d e n t i 丘e d 鹬 b e t a c y a 血ni i l s 口厶口w h i c ho c c u 璐洫t l l e i i l t e n i d a _ lz o n e h lo u rp r e v i o 瑕 i 1 1 v e s t i g a t i o n s ，w h e ns e e d so f & 5 口西口丘d me i t l l e r 们o l e t - r e dp h e r l o t y p ep l 姐t sg r o w n i i lt h ei n t e r t i d a lz o n eo r 笋e e i lp h e i l o t ) ，p ep l a m sg r o w ni i ls a l i n ei n l 锄dw e r es o 、ni i l s 觚d 狮dc u l t i v a t e di nag r e e i l h o l l s e ，t l l e i rp h c i l o t y l ) ew e r eg r e 锄r e g a r d l e s so ft h e i r m o t l l e rp l a n t s t 1 1 er e s u l td e m o n s t r a t e sn l a tt l l ea c c u m u l a t i o no fb e t a c y a 血ni sm o s t l y r e g u l a t e db ye n v 的m e n t a lf a c t o 强缸ah a l o p h y t e ，p h y s i o l o 西c a l 髓dm 0 1 e c u l a r r e s p o n s e so f 跏口鲥a 舰西口t os a l i i l i t ) ，s 仃舔sh a v eb e e i le x t e i l s i v e l y s t u d i e d b u t n o t l l i n gi sk n o w na b o u tt 1 1 e a n t i o x i d a n tf i l n c t i o no fb e t a c y 狃i na c c 啪u l a t i n gi i l & s a l s a h lt h ep r e s e n t 咖d y f i r s t l y ，1 ee 舵c t so f h y p o x i a ，s a l t 锄d1 0 wt 锄p e r a t u r eo n t h eb e t y 锄i na c c u m u l a t i o no f & 阳厶口w e r ei l l v e s t i g a t e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt l l a t t l l eb e t a c y a i l i nc o n t e n t sw e r et l l eh i 曲e s ti i lb o t l ls t e m sa n d1 e a v e so f & s 口厶口p l 锄t s 仃i ；a t e dw i t l lf l o o d i n gf o r2hd a i l yf o r6 0d d i 佰o r e n t 多a l t si i lac e n a i nm g eo f c o n c e l l t r a t i o n sl e dt od i 行e r e n tb e t a c y a n i i la c c u m u l a t i o n ，e g 15 姗。儿m g s 0 4 ，2 0 删：l l o l i 。k c l ，2 0n 蚰o l lc a c l 2 ，l5 0m m o l lm g c l 2a n dl5 0 舢 1 1 0 儿k n 0 3g a v er i t 0t l l el l i g h e rb e t a c y a n i nc o n t e n t ，c o n l p a r e dw i t l lc o n t r 0 1 s u r p r i s i n g l y ，n a c lt 啪a i l i 1 1 址b i t o 巧e f f to nt l l eb e t a c y 乏m i na c c u m u l a t i o n u n d e rm e4 h do fl o wt e m p e r a 嗽 ( 4 士2 ) 廿e a t m e n tf o r6 0d ，t h eb e t a c y 撕no f & s 口厶口w a s 也el l i 曲t e s t 锄o n gm e a l l 仃e a h n e n t s n e v e n h e l e s s ，t h ee f r c c t so fv a r i o u s 缸。e 锄e n t so nt h eb e t a c y a n i nc o n t e n t w e r ed i f f e r e n ti i ld i f f 打e n to r g a i l so f & s 口西口，e g t h eb e t a c y a n i nc o m e n ti ns t 锄sw 觞 山东师范大学硕士学位论文 s i g 血f i c a n t l yl l i 曲e r 吐l 趾也a ti l l1 e a v e s m s er e s u l t s 辄g g e s t e dm a tt h ea c c l 瑚u l 撕o n o fb e t a c y 蜀血i n & 如厶口i sc o t n p r e h e 潞i v e l yi n n u e n c e db yd i f f e r e n tf k t o l l s 叭c h 弱 h y p o x i a s a l t s 越l dl o wt e l n p e r a t l l r e ，a n dh y p o x i aa n dl o wt e m p 目a t u r ei st h em a i l i f a c t o r u n d e rc o m p r e h 哪i v ec o n s i t i o 璐( 15m m o 儿m g s 0 4 ，l5 0m m o l lm g c l 2 ，2 0 础【l l o 儿k c l ，15 01 1 1 1 1 1 0 儿k n 0 3 ，2 0m m o l lc a c l 2 ，h y p o x i a 眈a n n 饥tf o r2h da i l d l o wt e m p e r a t u r e 缸e a t m e n t 向r4l l d ) ，t h eh 2 0 2c o n t e n to fs t e mw 硒s i g n i f i c 孤t l y h i g h e rt h a nm a to f l e a t h ed a bs t a i l l i n go fs t 锄a n dl e a fs h o w e dt h a tt l l eh 2 0 2 i n d u c t i o nf 1 0 rb e t a c y 痂w a sn o to n l yr e l a t e dt ot l l ec o n t e n to fh 2 0 2 ，b u ta l s or e l a t e d t 0t h eh 2 0 2 仃a 1 1 s p o r tt h r o u 曲v 蕊c u l a r0 ri t sd i s t r i b u t i o n t h er e s u l ti n d i c a t e dt 1 1 a t h 2 0 2m a yb ea c t e d 弱as i 弘a lm o l e c u l e a tm em o 印h o l o 萄c a lt o po fs t e m ，t h e b e t a c 弦m i nc o n t e n tw a sl o w e lb u tt l l eh 2 0 2c o n t e mw 勰k g h e r t h eb i o s y n t l l e s i so f b c t a c y a i l i no ri t sm o l e c u l a rs t n 尬t u r em a y h a v ea | la c t i 妙o fe l i m i n a t i n gh 2 0 2 b o t l l 吼d e rt l l e 仃e a t m e n to ft h et y r o s i n a s ei n l l i b i t o r 抽u t i l l ，a n dt h ec o m p a r i s i o n o fs t e ma i l dl e a f 眈a t e d 、) l r i mc o m l 7 r e h e l l s i v ec o n d i t i o n ，m eb 晚i c y 砌nc o n t e i l t sw e r e s i 鲥f i c a n t l yd i f f e r e n t 丘o mt h ec on _ 呐1 b u tm ee x i s t e i l c eo f b e t a c y a i l i nh a dd i 胁e n t e f f e c t so n 吐l e 锄t i o x i d a i l te i l z y m e sa c n i t i e s t h ea p xa 而v i t yw 弱m r e a s e d ，t h e s o da c t i v 时w 笛i n c r e a s e do rd e c r e 雒e d 锄dt h ec a ta c t i v 时w a sn o ta f f e c t e d t h e s er 豁u n ss u g g e s t e dt h a tt l l eb e t a c y a m nm a yh a y c 锄a c t i v i t yo f e l i m i n 撕n g0 2 h lm e p r e s e n ts t u d y ，t l l el e a v e so fr e d - 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h y d m x y a n t l l r a n i l i c m d a丙二醛m a l o n d i a l d e h y d e m c t蛋氨酸 m e t h i o i l i n e n b t氯化硝基四唑兰 n i 协ob l u et e 缸a z o l i 啪c h l o r i d e p v p聚乙烯吡咯烷酮 p l o y v i n y l p y r o l l i d o n e r o s活性氧 r e a c t i v eo x y g e ns p c c i e s s d s十二烷基黄酸钠盐 d o d e c y l s u l f a t en a s a l t s o d超氧化物歧化酶 s u p e r o x i d ed i s m u t 弱e t b c硫代巴比妥酸t 址ob a rb i t u r i ca c i d t c a三氯乙酸t r i c h l o r o a u c e t i ca c i d u d p鸟苷二磷酸u r i d i n ed i p h o s p h a t e 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：7 司圈 力 导师签字：z 沙岁 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名闩留铲 导师签字： 易纱与 签字日期：2 0 0 9 年月6 日签字日期：2 0 0 伊年6 月石日 山东师范大学硕士学位论文 1 文献综述 盐地碱蓬( 鼬粥砌舳妇l ) 是一种典哩的稀盐璎盐生植物，生长在黄河三 角洲滨海潮问带地区和洼地的盐地碱蓬由于受高盐、低温与低氧等综合逆境的胁 迫，在整个生长季节地j ：部分皆为紫红色，而在地势较高或距海边较远的重盐碱 地生长季地卜部分皆为绿色门1 ( 见图1 1 ) 。王长泉等( 2 0 0 6 ) 已鉴定紫红色叶表 型盐地碱蓬积累的色素为甜菜红素盈：。 一i i ：i 。0 - 。，j 。? - 0 ，。“ i j l 。，、二j 。；：二o + 。 圈1 1 自然生境下生长的紫红色表塑( 左) 和绿色表型盐地- 蠢篷( 右) f g 1 1t h e 删v i o 埘p h 蛐o t y 雕( 1 e 矗) a n dg 啪np h e 肿铆p e ( r j g h t ) & 册蛔l 1 1 甜菜红素的基本性质 甜菜红素为甜菜素的一类，甜菜素分为甜菜红素( b e t a c y a n i n ) 彳甜菜黄素 ( b e t ，a x a n t h i n ) ，其分子结构见图1 2 。令人感兴趣的是甜菜素和花色素相互排 斥从没有发现在种植物中同时存在这两种色素，所以甜菜素被用来作为一种 重要的化学分类指标【2 7 。5 5 聪9 引。甜菜素普遍存在石竹日的藜亚目( c 镌阴删妇g ) 中，包括以下十个科：番杏科似觑昭伽p ) 、落葵科批c 幽p ) 、苋科 ( 彳朋鲫彻舭c e 础) 、仙人掌科( c i 口c f 口c g 础) 、藜科( ( 劲e 丹印删凯e 口g ) 、紫菜莉科 ( 批f 口g 拥删) 、商陆科( 坳，口c 翻韶韶) 、马齿苋科( j d ，f 材妇勰鹏) 、 d 柚e ，口c p 卯、而k 确砌，f 口c 阳；而石竹亚只( ( 勿，) 唧7 z 川7 f 加p ) ( 石竹科与粟米草科) 的植物不合成甜菜素，而是合成花青剥z 7 1 。至今存原核生物和动物细胞中仍未发 现甜菜素。但有趣的是，一些扣 子茼纲如伞形毒菌( 彳脓狮妇) 、肋御加口却合 成一种与甜菜素相类似的色素m 啦c a n a v i n l 5 5 硎。甜菜红素在繁殖器宵如花瓣、 雄蕊、种子和果实特定的发育阶段合成；也存在于营养器官中，但受环境冈子的 高度调控瑚9 3 二。甜菜红素秘累在液泡内，是一种水溶性含氮色素，4 i 溶于无水的 有机溶剂，可见光最人吸收波长因溶剂不同在弓3 5 5 3 8 n m 之间波动。 山东师范大学硕士学位论文 8 吣、_ 一。“ r n j 曳火； e o o h r p 一h 、 一文蝴 h o o c 1 1 n 、c a 0 h h ：y 气 图1 2 甜菜红素( 左) 和甜菜黄素( 中) 通式及其基本生色团甜菜醛氨酸( 右) 埔1 f i g 1 2b e t a c y a n i n ( 1 e f t ) b e t a x a n t h i n ( m i d d l e ) a n db e t a i a m i ca c i d ( r i g h t ) 1 8 l 1 2 甜菜红素的合成步骤 甜菜素合成主要步骤见图1 3 ，酪氨酸在酪氨酸酶的羟化作用下形成多巴 ( 3 ，4 一二羟基苯丙氨酸) ，多巴在酪氨酸酶的氧化作用下形成多巴醌，然后自发 形成环状多巴；另一合成支路是多巴在4 ，5 多巴双加氧酶的作用下形成开环多巴 ( 4 ，5 一s e c o d o p a ) ，继而自发反应生成甜菜素的基本生色团甜菜醛氨酸；甜 2 ，皿 b 旺y m i ct e 觚t i d m 一t 1 r m o i 瑚口e j l h 州b m 弼d 硝o n b o d d a d o n 一d 叩a4 ，5 一d i o 珊e ，哪e - - 5 一o - 山c o ，y l 由阻n s 血- 锄t 铀o n 劬e o i bz e a 6 0 n h 叠融，n l h i r 讳 b r i 错o 朔- 图1 3 甜菜红素的合成步骤1 8 i f i g 1 3t h eb i o s y n t h e s i sp a t h w a yo f b e t a c y a n i n l 8 d由，盎 山东师范大学硕士学位论文 菜醛氨酸和环状多巴自发缩合形成甜菜红素，甜菜红素在u d p 一葡糖基转移酶的 作用下在c 一5 或者c 一6 位连接上糖基，形成甜菜红色素苷，在液泡中积累。甜菜 醛氨酸和氨基酸或者胺自发结合则形成甜菜黄素【5 引。 1 2 1 酪氨酸酶( 研o s i n a s e ) 酪氨酸酶( e c l 1 4 1 8 1 ，t ) s i l l e ) 又称酚氧化酶、多酚氧化酶、儿茶酚氧 化酶，是结构复杂的多亚基的含铜氧化还原酶，广泛存在于哺乳动物、植物和微 生物体内【矧。酪氨酸酶作为一种重要的生物资源，有着广泛的用途，在生物体内 具有许多重要的生理功能。例如，它在植物中类黄酮、紫胶、软酸、酚类、生物 碱、木质素、l d o p a 及动物体中黑色素等的生物合成中起着重要的作用【1 2 】。 目前，关于酪氨酸酶酶学特征方面的研究较少，主要是由于植物中甜菜红素 的积累非常缓慢，酶活较低，所以，很难从植物中获得高活性的酶提液。然而在 伞形毒菌中，甜菜素的积累非常迅速，使之成为研究酪氨酸酶的理想生物f 8 。潮 间带生长的盐地碱蓬在整个生长季节地上部分皆为紫红色，积累大量的甜菜红 素，可能也可以作为研究酪氨酸酶的较好的植物材料。 酪氨酸酶是甜菜红素合成过程中的第一个关键酶，属于含铜蛋白，有两个 c u 结合位点，分子量一般在4 0 - - 7 0 k d ，它具有单酚氧化酶( e c l 1 4 1 8 1 ) 和 双酚氧化酶( e c l 1 0 3 1 ) 的双重活性，分别以酪氨酸和d o p a 为低物，二者都 是甜菜红素合成的关键性前体。在高等植物与真菌中，酪氨酸酶存在三种异形体： 未成熟型前体、成熟型前体和活化型6 6 1 ，但是，有关异形体的动力学特性及三者 之间的关系仍未确定。 目前，有关酪氨酸酶结构域的研究报道不一。从双孢蘑菇中提取的酪氨酸酶 分子量为1 2 0k d ，由两条轻链( l ) 和两条重链组成【7 9 1 ，而且存在h 。和h 。两种 重链亚基，分别构成h 2 4l 2 和h 2 9 l 2 两种酪氨酸酶【6 2 1 ，s t e i n e r 甜以( 1 9 9 9 ) 从大 花马齿苋( 凡w “肠g 阳刀幽厂口h o o k ) 纯化而得酪氨酸酶，并证明该酶以单体 形式存在，其分子量为5 3 k 7 2 】。然而，l m 潍a m u e l l e r 鲥以n 9 9 6 ) 的研究证明， 伞形毒菌中酪氨酸酶是以异二聚体形式存在的，单体分子量分别为3 0 k d 和 2 7 l ，并且通过p a g e 电泳技术表明该酶可能存在同功酶【5 4 】。通过对不同生物 来源的酪氨酸酶序列进行分析发现，所有的酪氨酸酶具有一个保守域，即c u 结 合域【8 6 矧。 一 酪氨酸羟化酶的最适p h 约为5 7 ，p h 低于3 则酶活消失，当p h = 8 时，该 酶仍具有最大酶活的7 5 。多巴氧化酶的最适p h 则为7 o ，它专一性作用于l 酪氨酸，其酶活与甜菜红素的含量成正相关，这表明它不同于参与生物体内其他 代谢的酪氨酸酶【陀j 。 1 2 1 1 酪氨酸酶抑制剂 3 山东师范大学硕士学位论文 酪氨酸酶抑制剂主要来源于以下三个渠道：( 1 ) 从天然植物组织分离提取； ( 2 ) 从商品化合物中筛选；( 3 ) 有机合成出新的化合物【i l o 自然界中存在丰富 的酪氨酸酶抑制剂，而且没有毒害作用。不同抑制剂的作用机理不同，根据酪氨 酸酶抑制剂作用机理的不同，把抑制剂主要分为以下几类： 1 ) 竞争性抑制物： 如壬二酸( 它的抑制机制可能是它的一个羧酸基团可以与酪氨酸的羧酸基团 共同竞争酶的活性位点，阻断酪氨酸酶催化的多巴到多巴醌的反应) 、熊果苷 ( 舳u t i l l ) ( 通过自身与酪氨酸酶直接结合，竞争多巴的结合位点) 、苯甲醛类取 代物( 抑制酪氨酸酶催化的多巴的氧化反应) 和托酚酮饵5 1 等。最近，日本有研究 报道从药用植物一红花的培养细胞中提取了一种新的酪氨酸酶抑制剂k i n o b e o n 它具有抗氧化剂的作用，可以抑制从酪氨酸生成多巴以及后者生成多巴醌两个反 应阶段。 2 ) 非竞争性抑制物曲酸： 如曲酸( 在体外的非细胞试验中，能够有效抑制酪氨酸酶的活性，方式为非 竞争性抑制。它可以通过螯合铜离子，而使酪氨酸酶失活) 、茴香酸( 抑制了酪 氨酸酶对多巴的氧化作用) 嘞1 、3 ，禾二羟基肉桂酸( 以非竞争性抑制方式影响 多巴醌的生成) 嘲、甲硫咪唑( 作为c u 2 + 的螯合剂起作用) 等。 3 ) 混合型酪氨酸酶抑制剂： 如氢醌( 作为传统的酪氨酸酶抑制剂，氢醌通过作用于酪氨酸酶组成氨基酸， 使酪氨酸酶失活，是一种混合型抑制剂) 、曲酸1 和 2 h y d r o x y 4 一m e m o x y b e n z a l d e h y d e 【5 2 】，近来发现有一种物质扁柏素( 2 一羟 基4 一异丙基苯甲醛) ，它可以和酪氨酸酶主要氨基酸区域形成席夫碱，从而抑制 了酪氨酸酶的活性，作用机制与氢醌有相似之处。 4 ) 其他抑制剂： 酪氨酸酶能够被硫醇化合物抑制，如：二乙基二硫代氨基甲酸盐、巯基乙醇、 半胱氨酸、甲硫氨酸以及谷胱甘肽等。h l l 【勰a m u e l l e r 甜以n 9 9 6 ) 等证明1 0 i i m 的托酚酮或5 0i lm 的2 巯基苯并噻唑能在离体条件下完全抑制酪氨酸酶活性 【5 4 】 o 1 2 1 2 酪氨酸酶激活剂 酪氨酸酶活化剂的范围也非常广泛，如s d s 【4 6 1 、脂肪酸8 0 1 、酸激【4 钔、醇【1 6 1 、 蛋白水解酶【2 5 - 6 3 1 及病原体侵袭【6 9 】等。3 - h y d r o x y 龃t l l r 觚i l i c ( h a a ) 能够激活酪氨 酸酶的单酚氧化酶活性i l 引。 1 2 2 多巴双加氧酶( d o p a 4 ，5 d i o x y g e n a s e ) 多巴双加氧基因最早是从毒蝇伞( 4 m 删f 细朋淞，胁) 中克隆出来的，是甜 4 山东师范大学硕士学位论文 菜素合成途径中第一个被克隆出的功能酶的基因，该酶在翻译水平被调控，和已 发表的类似酶的基因序列相似性很低【4 3 1 。它由4 7 个分子量为2 2 k d 的亚基组成， 最适p h 为8 5 ，可能需要f e 2 + 作为辅助因子。除了作用于d 0 p a 外，该酶还以其 它二酚如多巴胺、几茶酚和邻苯二酚为底物，当以d o p a 为底物时，酶切芳香环 的4 ，5 或2 ，3c c 键，分别生成甜菜醛氨酸( 植物) 或m u s c a f i a v i i l ( 1 n u s h r o o m ) 。 目前，多巴双加氧酶已从大花马齿苋中克隆出来( c l l i s t i n e t 甜以，2 0 0 4 ) 。参与 甜菜红素合成的多巴双加氧酶可能代表一种新型的双加氧酶，有报道【4 3 1 证明，毒 蝇伞中多巴双加氧酶的d n a 及蛋白序列与已知的双加氧酶序列并无明显相似 性，但它们在进化上仍可能具有相关性，因为所有的双加氧酶( 真菌的除外) 都 具有七个氨基酸组成的保守序列，其中的五个组氨酸和一个酪氨酸可能是f e 2 + 的结合位点【3 3 1 。 至今，前人已在多巴双加氧酶的提取及酶活测定方面做过许多尝试，但可能 是由于抑制剂的存在，或者由于辅助因子的缺失，抑或是反应条件不适合，导致 多巴双加氧酶的浓度较低，或者非常不稳定，因此，但都未成功提取到有活性的 酶液。 。一 1 2 3 糖基转移酶( g 1 u c o s y l t r a n s f e r a s e ) v o 昏等于1 9 9 9 年从番杏科彩虹菊( d d 阳历印刀f j i 淞6 p 刀砌归，m 西) 中克隆出 5 o 一葡糖基转移酶基因，这是第一个从高等植物中克隆的参与甜菜素合成的关键 酶的基因，该基因与从茄科的烟草和番茄中获得的葡糖基转移酶基因序列以及其 他公开发表的葡糖基转移酶基因序列有很高的同源性【8 引。 研究表明，甜菜红素合成过程中的糖基化可分为两个途径。一条是甜菜醛氨 酸的糖基化；另一条糖基化途径发生在c y c l o d o p a 上。糖基转移酶利用 u d p g l u c o s e 在甜菜醛氨酸的5 o 或6 o 发生糖基化，现已证明催化这两个不同 位点糖基化的酶不同，而且，与参与黄酮类化合物代谢的糖基化酶相比，具有相 似的性质和动力学特征。v o 昏( 2 0 0 2 ) 等【8 9 】的研究也表明，从彩虹菊中克隆的 6 o 葡糖基转移酶基因序列与5 o 葡糖基转移酶基因序列明显不同，而与花色素 葡糖基转移酶的基因序列有较高的同源性。虽然5 一o 葡糖基转移酶与6 o 葡糖 基转移酶有相似的底物，但其蛋白质氨基酸序列只有1 9 的同源性，这也说明这 两种酶在糖基转移过程中是相互独立其作用的。利用定点突变技术发现彩虹菊 5 o 葡糖基转移酶两个高度保守的氨基酸序列g l u 3 7 8 和h i s 2 2 被取代后酶的活 性会完全丧失，由此建立了5 o 葡糖基转移酶三维结构解释其催化模型【4 0 】。 目前已从紫茉莉( 肘讥z 6 f 凰归厶甲口) 等中检测到c y c l o d 0 p a - 5 - 0 g l y c o s y l t m s f e 勰e 活性，并且酶活与甜菜红素积累的量呈正相关性，该酶虽未能 成功的分离纯化，但已从紫茉莉和鸡冠花( c p 伽细础纽纪) 中克隆出了该酶的 5 山东师范大学硕士学位论文 候选基因( s 2 u s a k i 耐以，2 0 0 5 ) ，结果表明二者有6 2 的氨基酸序列相似。 所有的甜菜红素都需要糖基化，然后大部分甜菜红素的糖基会与酯相连而发 生酰基化。 1 3 甜菜红素合成的遗传模型 t r e z z 诚( 1 9 9 0 ) 以大花马齿苋( p d 砌肠即刀匈7 d ，口) 为模式植物对参与 大花马齿苋花蕊中甜菜红素合成的基因进行了研究，并提出了三基因模型【8 z l ： 基因c ：与甜菜醛氨酸的合成有关，可能编码多巴4 ，5 双加氧酶，基因c 只在有色的表型中能够表达。 基因r ：基因r 属于不完全显性基因，它有三个等位基因。基因r 可能编码 调节因子调节酪氨酸酶的氧化作用，调控d o p a 向c y c l 0 d o p a 的转化：另外， 基因r 可能与c y c l o d o p a 的糖基化有关。 基因i ：基因i 抑制甜菜素的合成。它抑制甜菜醛氨酸与氨基酸的缩合形成 甜菜黄素。认为发色团甜菜醛氨酸存在于细胞质中，而色素却积累液泡内，发色 团通过特定的转运蛋白进入液泡，然后利用液泡内的氨基酸发生缩合反应，从而 积累色素。基因i 可能是通过编码一种蛋白来抑制转运蛋白的作用，阻止甜菜醛 氨酸的转运。基因i 至少存在两个等位基因，并且与基因r 存在遗传连锁。 1 4 影响甜菜红素合成的因子 甜菜红素的合成受到许多化学因子和物理因素的综合作用调控，主要有以下 几方面： 生长调节物质：甜菜红素的合成受培养基中生长调节物质，特别是2 ，4 d 与6 一b a 比值的影响。有人认为甜菜红素的合成受细胞分裂素的诱导，其作用机制可能是： 细胞分裂素可能参与调控植物对酪氨酸的利用，诱导合成或激活酪氨酸酶【77 】；但 有人持反对意见，认为细胞分裂素与甜菜红素的前体水平及酶活之间不存在相关 性f 3 2 1 。 光照：光是调节甜菜红素合成的重要因子。有趣的是，甜菜( 置咄墙) p 9 】和大 花马齿苋( p 胛力幽m ) 【1 9 5 1 】在黑暗条件下培养会抑制甜菜红素的合成；在黑 暗条件下，c j l 绷印d 妣m 删6 删扰愈伤组织中甜菜红素含量高于光照条件下培养的 愈伤组织甜菜红素含量 1 7 1 。以上研究说明光照并不是甜菜红素合成的必要因子， 但对于某些植物来说，光照能够刺激植物合成甜菜红素；有资料表明，光照是甜 菜红素形成的前提条件。 可见光、红光与远红光：可见光和红光能够促进么砒d 胁和c p 缸肌口合成甜 菜红素和甜菜黄素【3 7 】，但短时的可见光( 4h ) 或红光处理( 1 5m i l l ) 对甜菜红 素合成的促进作用，却受到短时远红光( 5m i n ) 的逆转，这表明甜菜红素的合 成属于光敏色素依赖型。但有趣的是，延长光照时间，仍能够促进甜菜素和叶绿 6 山东师范大学硕士学位论文 素的合成，但不受远红光的逆转，而且，利用抑制剂抑制叶绿素合成的同时，也 抑制了甜菜素的生物合成，说明光合系统在调节甜菜红