（微生物学专业论文）野油菜黄单胞菌emp途径相关基因的突变分析.pdf

i i it ii ii iii ii ii iiiiil y 18 17 4 0 2 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的 成果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位 发表或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发 表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研 究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：胡江如 学位论文使用授权说明 2 0 0 7 年6 月2 3 日 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布田解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 汇文吁名饬：纠 ；砂机芬眵名 声咖7 事一，；日 野油菜黄单胞菌e m p 途径相关基因的突变分析 摘要 野油菜黄单胞菌c8 0 0 4 ) 能在全球范围内侵染所有十字花科植 物，引起黑腐病。黄原胶，也称胞外多糖( e p s ) 是野油菜黄单胞菌的 一个重要的代谢产物，是一个重要的致病因子，在工业中具有广泛的 用途。研究与e p s 合成相关的基因对研究x c c8 0 0 4 致病机理和提高 e p s 产量具有重要的意义。e p s 的生物合成过程需要多种酶参与并消 耗大量的能量( a t p ) 。通过对野油菜黄单胞菌x c c8 0 0 4 菌株全基因组 序列搜索发现，该菌株拥有完整的e d 、e m p 、h m p 等糖的代谢途径 的相关基因。 为评估这些基因的功能，本研究中运用自杀质粒p k l 8 m o b 对编 码催化e m p 各反应步骤酶的基因x c 0 8 7 2 ，x c 0 9 7 2 ，x c 0 9 7 6 ， x c 0 9 7 8 ，x c 0 9 7 9 ，x c l 4 0 4 ，x c l 5 8 7 ，x c 2 5 3 1 进行诱变，获得了 这些基因相应的非极性整合突变体即n k 0 8 7 2 ，n k 0 9 7 2 ，n k 0 9 7 6 ， n k 0 9 7 8 ，n k 0 9 7 9 ，n k l 4 0 4 ，n k l 5 8 7 。x c 2 5 31 不能突变。 对突变体进行表型分析发现n k 0 9 7 2 ，n k 0 9 7 6 ，n k 0 9 7 9 的e p s 产量明显减少。致病性实验显示，与野生型x c c8 0 0 4 菌株相比 n k 0 9 7 2 、n k 0 9 7 6 的致病力分别下降5 1 0 1 、5 4 6 1 。采用p c r 的 方法分别扩增已含完整的x c 0 9 7 2 ，x c 0 9 7 6 ，x c 0 9 7 9 的d n a 片段 并克隆到p l a f r 3 或p l a f r 6 上，获得重组质粒分别导入相应的突变 体进行功能互补。除n k 0 9 7 9 外，n k 0 9 7 2 ，n k 0 9 7 6 的突变体的e p s i 到基本互补。 关键词：野油菜黄单胞菌胞外多糖e m p 途径致病性 a b s t r a c t x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i sp v c a m p e s t r i si st h ec a u s a la g e n to fb l a c k r o td i s e a s e i nc r u c i f e r o u s p l a n t s x a n t h a ng u m a l s oc a l l e d e x o p o l y s a c c h a r i d e s ( e p s ) e p si sa ni m p o r t a n tm e t a b o l i t ep r o d u c to f x c c 8 0 0 4 i ti sa ni m p o r t a n tp a t h o g e n i cf a c t o ra n dh a sar a n g eo fi n d u s t r i a l u s e s i ti ss i g n i f i c a n tt h a tt os t u d yx c c8 0 0 4p a t h o g e n e s i sm e c h a n i s ma n d e n h a n c et h e o u t p u t o fe p sb y r e s e a r c h i n gr e l a t e dg e n e so fe p s s y n t h e s i s t h es y n t h e t i c a lp r o c e s so fe p sn e e d sv a r i o u se n z y m e sa n d c o n s u m e se x t r e m e l ye n e r g y ( a t p ) t op a r t i c i p a t ei ni t s e a r c h i n gf o r g e n o m es e q u e n c eo fx c c8 0 0 4 ，w ed i s c o v e rt h a tx c c8 0 0 4p o s s e s s e s r e l a t e dg e n e so fe m p ( e m b d e n m e y e r h o fp a t h w a y ) ，h m p ( h e x o s e m o n o p h o s p h a t ep a t h w a y ) ，a n de d ( e n t n e r - d o u d o r o f fp a t h w a y ) t o e s t i m a t et h e s eg e n e sw ec o n s t r u c t e dt h en o n p o l a rm u t a n t so fx c 0 8 7 2 ， x c 0 9 7 2 ，x c 0 9 7 6 ，x c 0 9 7 8 ，x c 0 9 7 9 ，x c 14 0 4 ，x c158 7x c 2 5 31o f e m pp a t h w a yb yu s i n gt h ep k18 m o bh o m o l o g o u si n t e g r a t i o nm e t h o d 1 1 1 n a m e l yn k 0 8 7 2 ，n k 0 9 7 2 ，n k 0 9 7 6 ，n k 0 9 7 8 ，n k 0 9 7 9 ，n k l4 0 4 ， n k l5 8 7 i tw a sf a i l u r et om u t a n tx c 2 5 3 1 t e s t i n gy i e l do fe p so f n k 0 8 7 2 ，n k 0 9 7 2 ，n k 0 9 7 6 ，n k 0 9 7 8 ，n k 0 9 7 9 ，n k l 4 0 4 ，n k l 5 8 7t h e r e s u l ts h o w st h a tt h ey i e l do fe p so fn k 0 9 7 2 ，n k 0 9 7 6 ，n k 0 9 7 9a r e g r e a t l yl e s st h a nx c c8 0 0 4 t e s t i n gv i r u l e n c eo fn k 0 9 7 2 ，n k 0 9 7 6 ， n k 0 9 7 9a n d c o m p a r i n g t ot h ex c c8 0 0 4 ，t h el e s i o nl e n g t h sc a u s e db yt h e n k 0 9 7 2 ，n k 0 9 7 6d r o p51 0 1 ，5 4 6 1 r e s p e c t i v e l yb u tt h el e s i o nl e n g t h o fn k 0 9 7 9i sn e a r l yt h es a m ea st ox c c8 0 0 4 t h ed n a f r a g m e n t sw h i c hc o n t a i n i n gw i l d t y p eg e n e s ( x c 0 9 7 2 ， x c 0 9 7 6 ，x c 0 9 7 9 ) w e r ea m p l i f i e d f r o ms t r a i nx c c8 0 0 4 b yu s i n g p c r t h e yw e r ec l o n e di n t op l a l r 3o rp l a l r 6t oc o m p l e m e n t e n k 0 9 7 2 ，n k 0 9 7 6 ，n k 0 9 7 9r e s p e c t i v e l y r e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r e i n t r o d u c e di n t on k 0 9 7 2 ，n k 0 9 7 6 ，n k 0 9 7 9b yt r i p a r e n t a lc o n j u g a t i o n r e s p e c t i v e l y a n dt h em e a ne p sp r o d u c t i o no fn k 0 9 7 2 ，n k 0 9 7 6 ，c a nb e c o m p l e m e n t e d ，b u tn k 0 9 7 9i sn o t t h ev i r u l e n c eo f n k 0 9 7 6c a nr e s t o r e b u tn k 0 9 7 2c a nn o t k e yw o r d s ：x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i sp v c a m p e s t r i s ；e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e ；e m pp a t h w a y ；v i r u l e n c e i v 第一章前言 目录 1 1 野油菜黄单胞菌致病变种的( x c c ) 概述1 1 1 1 野油菜黄单胞菌简介1 1 1 2x c c 基因组特征1 1 2 胞外多糖( e p s ) 的研究进展2 1 2 1 不同细菌的胞外多糖研究进展2 1 2 2 黄单胞菌胞外多糖的结构及理化特性3 1 2 3 黄单胞菌胞外多糖的应用3 1 2 4 黄单胞菌胞外多糖的合成4 1 3 微生物( 细菌) 的糖代谢途径7 1 3 1e m p 、h m p 、e d 研究进展7 1 3 2e p s 与e m p 途径相关性的研究进展9 1 4e m p 途径研究的意义1 0 第二章材料与方法1 1 2 1 材料11 2 1 1 菌株和质粒1 1 2 1 2 细菌培养基1 2 2 1 3 菌株培养条件及保存：1 3 2 1 4 抗生素及其贮存、使用浓度1 3 2 1 5 溶液与缓冲液1 4 2 2 方法1 4 2 2 1 生物信息学分析方法1 4 2 2 2 常规p c r 反应1 4 2 2 3 琼脂糖凝胶电泳1 7 2 2 4p c r 产物的回收与纯化1 7 v 2 2 5 质粒的提取1 2 2 6 总d n a 的提取1 2 2 7 限制性内切酶酶切18 2 2 8d n a 连接18 2 2 9 电脉冲感受态细胞的制备。19 2 2 1 0 转化1 9 2 2 1 1 三亲本接合1 9 2 2 1 2x c c8 0 0 4 基因组上目标基因的整合突变体的构建2 0 2 2 1 3 胞外多糖的检测2 1 2 2 1 4 植株的致病性试验2 1 2 2 15g u s h 一葡糖苷酸酶) 活性检测2 1 2 2 1 6 粗酶液的提取及蛋白含量测定2 2 2 2 。173 磷酸甘油醛脱氢酶检测2 2 2 2 1 8 磷酸甘油酸激酶检测2 3 2 2 1 91 6 二磷酸果糖醛缩酶检测2 3 第三章结果与分析 2 4 3 1e m p 途径相关基因的突变2 4 3 1 1x c 0 9 7 2 、x c 0 9 7 6 、x c 0 9 7 9 内部片段的p c r 扩增2 4 3 1 2 将同源片段克隆到载体p k l8 m o b 上2 4 3 1 3 突变体的筛选及验证2 6 3 2x c 0 9 7 2 、x c 0 9 7 6 、x c 0 9 7 9 的生物信息学分析2 7 3 2 1x c 0 9 7 2 、x c 0 9 7 6 、x c 0 9 7 9 基因的基本特征2 7 3 2 23 磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、醛缩酶的基本性质。2 8 3 - 3x c 0 9 7 2 、x c 0 9 7 6 、x c 0 9 7 9 突变体的功能互补3 0 3 3 1x c 0 9 7 2 、x c 0 9 7 6 、x c 0 9 7 9 全基因的扩增3 0 3 3 2 将x c 0 9 7 2 、x c 0 9 7 6 、x c 0 9 7 9 全基因克隆到载体p l a f r 上3 0 3 3 3 三亲本接合子的获得3 2 3 4 突变体的酶活性检测3 3 3 5 突变体的生长分析3 5 v i 3 5 1 突变体在m m x 中的生长分析3 5 3 5 2 突变体在含2 葡萄糖n y g b 中的生长分析3 5 3 6 突变体的e p s 产量分析3 6 3 6 1 不同碳源对突变体e p s 的平板分析3 6 3 6 2 不同碳源对突变体e p s 产量影响的摇瓶发酵分析3 9 3 6 3g u m g u s 活性分析4 0 3 7 突变体的致病性分析4 1 3 8e m p 途径与e d 途径代谢关系的分析。4 2 第四章结论与讨论 4 1 胞外多糖与致病性相互关系的分析4 4 4 2x c c 中e m p 途径作为一条能量代谢途径参与e p s 合成，影响e p s 合成的 产量4 5 4 3x c c 中e m p 、e d 途径可能的关系4 7 参考文献 4 8 附录5 6 附表一n y g b 中生长曲线的测定5 6 附表二突变体的e p s 产量分析5 6 附表三突变体的g u s 活性检测5 6 致谢5 7 攻读学位期间发表论文情况5 8 广西大学硕士论野油菜黄单途径相关基因突变分析 第一章前言 1 1 野油莱黄单胞菌致病变种的( x c c 概述 1 1 1 野油菜黄单胞菌简介 黄单胞菌是寄主广泛的病原菌之一，至少可以感染1 2 4 种单子叶植物和2 6 8 种双子叶植物，一些变种还可以感染腐生植物和附生植物。野油菜黄单胞菌野油 菜致病变种( x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i sp v c a m p e s 胁简称c ) ，是黄单胞菌属种 影响最为广泛的一种；它属于薄壁菌门、黄单胞菌属；是1 4 1 多个致病变种中的 一员【。x c c 菌体为短杆状，大小为0 4 - 0 5 1 m a x 0 7 3 0 岬，单端单生鞭毛、 无芽孢、绝对好氧、革兰氏染色阴性、菌落一般为黄色、光滑、粘稠，产生黄单 胞菌色素，病菌发病适温为2 8 。x c c 能在全球范围内侵染所有十字花科植物， 引起黑腐病，寄主包括重要作物甘蓝、花椰菜、白菜、芥菜、萝卜、油菜和模式 植物拟南芥( a r a b i o d o p s i st h a l i a n a ) 。它的致病因子主要有：毒素、胞外酶、多糖 物质。自然入侵是其主要的侵染途径，它主要通过水孔和伤口侵入植物，进入植 物后在质外体空间增殖，并沿维管束蔓延，导致系统侵染。黑腐病的典型症状是 在叶缘上形成v 字形病斑，随着病斑的扩大，叶脉变黑，因而被称为黑腐病【2 卅。 此外，野油菜黄单胞菌能够产生胞外多糖称黄原胶，黄原胶( x a m t h a ng - u m ) 另l j 名 汉生胶，又称黄单胞多糖，是国际上7 0 年代发展起来的新型发酵产品。它是黄 单胞细菌( x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i s ) 以碳水化合物为主要原料，经通风发酵、分离 提纯后得到的一种微生物高分子酸性胞外杂多糖。在工业、农业、医药等行业中 具有广泛的用途。 1 1 2x c c 基因组特征 x c c8 0 0 4 基因的平均分子量为2 5 x 1 0 9 道尔顿，g + c 为6 3 7 3 。x c c8 0 0 4 菌株的全基因组全长5 1 4 8 7 0 8 b p ，g c 含量6 4 9 t 5 1 。预测共有4 3 1 2 个o r f ，其 中1 4 9 3 个o r f 功能未知，o r f 平均长度为1 0 3 3 b p ，蛋白质编码区占总基因组 的8 4 7 ，t r n a 基因5 3 个，2 个r r n a 操纵子。全基因组中最大的o r f 长1 1 ，8 8 6 广西大学硕士论野油菜黄单途径相关基因突变分析 个碱基，最小的o r f 只有6 6 个碱基。基因组中存在大量的可移动单元如插入序 列和噬菌体序列等。编码插入序列转座酶的编码序列有1 2 1 个拷贝，i s 广泛分 布于基因组，约占全基因组4 5 。基因组中噬菌体相关的基因有3 8 个。 1 2 胞外多糖( e p s ) 的研究进展 1 2 1 不同细菌的胞外多糖研究进展 目前研究得较多的细菌多糖有乳酸菌胞外多糖( l a be s p ) 、固氮菌多糖、黄 单胞菌多糖。乳酸菌多糖是乳酸菌生长代谢过程中分泌到细胞外的粘液或荚膜多 糖【6 】。乳酸菌胞外多糖的成分和结构非常复杂，分子量在4 0 x 1 0 4 - 6 o x l 0 6 之间， 化学组成一直未明了，后来有研究者提出，此粘性物质为糖蛋白或碳水化合物 蛋白质7 t8 】；影响乳酸菌合成e p s 的因素是多种多样的，如：乳酸菌的品种、碳 源、温度、p h 值、添加物等。大量研究表明，碳源是影响各种菌种e p s 产量的 重要因素，不同菌种对碳源要求也不同，同一碳源对不同菌种产生e p s 的影响 也不相刚9 1 。乳酸菌胞外多糖起到保护菌体的作用，包括保护细胞免受毒害、抵 御不良环境、增强抗性、鏊合金属离子、定植和细胞识别，它主要应用于食品工 业、医药工业1 1 0 j 。 固氮菌的e p s 是根瘤菌与宿主植物之间进行细胞识别的信息分子。根瘤菌 e p s 是由一定数目的重复单位聚合而成的不均一多糖，重复单位的不同决定了 e p s 的多样性，一个重复单位通常是由几个不同的单糖残基组成的。不同种属的 根瘤菌的重复单位是不同的，因而产生的e p s 也不同。这种差异表现在四个方 面：糖残基组成、糖苷键类型、重复单位的大小和非糖取代基的不刚1 1 】。它的主 要功能是作为信息分子，它们分别以不同的途径在侵染形成根瘤时发挥信号分子 的功能，多糖分子的大小是决定其活性的因素。低分子量e p s 对于控制根瘤菌 的侵染和植物防御之间的动态平衡起决定性的作用。 而在x c c0 0 4 中胞外多糖及胞外酶是致病生化因子【1 2 1 。e p s 在致病过程中的 ，主要作用：( 1 ) 在木质部维管束中吸持水分，阻塞导管，并引起薄壁组织质壁分 离，并使致病菌周围的细胞开始降解从而导致寄主局部组织坏死；( 2 ) 有助于菌 体抵抗寄主细胞产生的抗菌物质或氧化剂的攻击；( 3 ) 干扰寄主的免疫识别 1 3 , 1 4 , 1 5 。y t me ta l 研究发现胞外多糖抑制宿主的防御系统是通过阻止宿主细胞的 2 广西大学硕士论野油菜黄单途径相关基因突变分析 胼胝体沉积，而且胞外多糖的致病功能由胞外多糖的化学组分决定【1 6 l y u ne ta l 研究还发现在拟南介中胞外多糖作为一个很敏感的致病诱导因子，5 0 p 咖l 的低 浓度的胞外多糖就可以恢复不产胞外多糖菌株的致病性【3 4 】。有报道在假单胞菌、 欧文氏菌、野油菜黄单胞菌中产胞外多糖的能力与宿主致病程度相关【1 7 。2 3 1 。 1 2 2 黄单胞菌胞外多糖的结构及理化特性 黄原胶是以5 分子糖为一单元，由与此相同的单元聚合而成的高分子多糖物 质。黄原胶是由d 葡萄糖、d 甘露糖、d 葡萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸组成的“五 糖重复单元”结构聚合体，它的相对分子质量在2 x 1 0 6 - 2 x 1 0 7 u ( 道尔顿) 左右，分 子比为2 8 ：3 ：2 ：1 7 ：0 5 1 0 6 3 2 4 1 。黄原胶分子的一级结构是由p 1 ，4 糖苷键 连接的d 葡萄糖基主链与三糖单位的侧链组成，其侧链由d 甘露糖和d 葡萄糖 醛酸交替连接而成，分子比为2 ：1 ，连接主链的甘露糖被乙酰化，在末端的甘 露糖残基上以醛缩形式带有丙酮酬2 5 。2 9 1 。黄原胶除了拥有规则的一级结构外，还 拥有二级结构，经x 一射线衍射和电子显微镜测定，黄原胶分子间靠氢键作用形 成规则的螺旋结构。双螺旋结构之间靠微弱的作用力形成网状立体结构，这是黄 原胶的三级结构，它在水溶液中以晶体形式存在【3 0 】。黄原胶的基本结构图( 1 1 ) 。 黄原胶主要的理化特性有：与其它多糖类溶液相比，黄原胶安全无毒、无味，表 现出较强的亲水性、增粘性、假塑性、稳定性 3 1 , 3 2 1 。其中稳定性集中表现在：黄 原胶在较宽的温度范围内保持良好的稳定性；在p h 5 1 0 内能保持很好的适应能 力，粘度基本不变；黄原胶与盐具有良好的配伍性和稳定性；黄原胶和大多数酶 作用表现良好的稳定性；具有优良的乳化性和悬浮性；与其它增稠剂有良好的协 同增效作用。即使是低浓度溶液也显示出较高粘度【3 3 1 。 1 2 - 3 黄单胞菌胞外多糖的应用 由于黄原胶具有如此优良的特性，因此在工业上的用途越来越受人们的亲 睐。1 9 8 3 年世界卫生组织( w h o ) 和联合国粮农组织( f a o ) 提出将黄原胶作为食品 添加剂在世界范围内使用【3 4 1 ，至此黄原胶在食品行业得到了广泛的应用。黄原 胶在食品工业中主要作为稳定剂、乳化剂、悬浮剂、增稠剂、泡沫增强剂和加工 辅助剂，用于饮料、冰淇淋类面食制品、调味品、肉制品、乳制品等产品中【3 5 1 。 3 广西大学硕士论野油菜黄单途径相关基因突变分析 1 9 8 6 年在罗马召开的第3 0 次f a w h o 专家联合委员会会议公布了黄原胶作为 食品添加剂的质量标型3 6 】，我国1 9 8 7 年也批准使用。 黄原胶在其它行业中也有广大的市场。在日用化工业中，由于黄原胶分子中 含有大量的亲水基团，是一种良好的表面活性物质，并具有抗氧化、防止皮肤衰 老等功效，因此主要的高档化妆品中都以黄原胶作为主要的功能成分；此外，黄 原胶还用于配制牙膏、洗发香波、发型定型剂和染发剂等。在医药业中，黄原胶 是目前炙手可热的微胶囊药物襄材的功能组分，在控制药物缓释方面发挥重要作 用；在石油工业中，由于其假塑性，低浓度的黄原胶( o 5 ) 水溶液就可以保持钻 井液的粘度并控制其流变性，并且由于其优良的抗盐性和耐热性，因而广泛应用 于海洋、高盐层区等特殊环境下的钻井，并作采油驱油剂，减少死油区，提高采 油率。在纺织印染工业中，做增粘剂、上胶剂、稳定剂、上光剂和分散剂；在消 防中，作凝型抗溶泡沫灭火剂；在陶瓷工业中，作为釉浆悬浮剂和粘结剂，被称 为陶瓷工业的重大技术革新，并解决了烧制各种异型陶瓷的技术难题。在农业中， 黄原胶还能用作油型农药乳化剂和农药喷雾的粘着剂，在喷洒期间能很好的控制 其漂流和粘附，延长有效期，是农用化学物质的良好稳定剂。黄原胶还作为各类 作物种子包衣( 保水剂、肥料、农药、激素等) 最佳成膜剂、鱼虾高档颗粒饲料粘 结剂，另外还可用于烟草、油墨、胶体炸药，水溶性涂料、工业擦亮剂、除锈剂、 湿法冶金的增稠剂等【3 5 3 7 4 0 】。 国内每年生产的黄原胶主要应用于食品工业，其它工业领域应用仅限于石油 行业，占市场份额不大；在纺织、印染、陶瓷加工、涂料、炸药、湿法冶金、医 药、农业、化妆品等工业中的应用刚刚起步，黄原胶的应用潜力和作用远远没有 得到人们的充分认识。提高黄原胶的生产工业水平和产品质量，降低成本，开拓 黄原胶的应用领域，是黄原胶在我国研究的关键【4 1 1 。 1 2 4 黄单胞菌胞外多糖的合成 ( 1 ) e p s 的生物合成 e p s 的生物合成属于依赖于糖基载体脂的合成机制，糖基载体h 旨( c 5 5 一l i p i d - p ) 存在于细菌细胞膜内，其功能是将胞质内的糖基在其上聚合成多糖，并携带多糖 分子跨膜输出。这种合成机制包括五个阶段：由单糖转变成糖核苷衍生物前体： u d p g l c ，g d p - - m a n ，u d p - - - g l c a ；五糖亚基顺序组装到内膜多聚异二烯 广西大学硕士论野油菜黄单途径相关基因突变分析 醇脂载体上形成五糖重复单位；甘露糖残基的乙酰化和丙酮酰化；五糖重复 单位的聚合；以c 5 5 1 i p i d - p 为载体，胞外多糖的分泌 4 2 1 。x c c 合成胞外多糖 的生化途径和所需的酶系统，如图1 2 所示【4 3 1 。 e p s 生物合成历经多步，涉及多个相关基因。迄今为止，从x c c 菌株染色体 基因组中克隆到的与e p s 生物合成相关的基因x p s l i i ，x p s l v , x p s v l 区域和一个 3 5 3 k b 基因簇的编码产物与第一阶段有关，它们参与糖核苷前体的生物合成 4 4 , 4 5 1 。而即坝又称为聊) 区域编码产物与第二阶段相关m 4 8 1 。g u m 基因簇在e p s 合成中的作用已研究的较为详细，这一区域共有1 2 个基因( g u m b - 一g u m m ) 。这 1 2 个基因组成一个操纵子( o p e r o n ) 。g u m b 基因上游存在强启动子，g u m k 基因上 游有一弱启动子。g u m d 编码糖基转移酶i ，催化u d p g l c 的糖基转移；g u m h 编码糖基转移酶i i i 负责u d p m a n 的糖基转移g u m k 编码的转移酶催化u d p - - g l c a 葡萄糖醛酸转移；删硝编码第类转移酶，催化第二个g d p - - m a n 的 糖基转移至葡萄糖醛酸上。g u m 三编码酮酰转移酶，使甘露糖残基丙酮酰化；g u m f 编码乙酰基转移酶；g u mg 编码丙酮酰转移酶；而g u m g u m b 、g u mc 、g u m e 则与e p s 的聚合及运输出关 4 6 , 5 0 - 5 1 。 图1 - 1e p s 的重复单位的结构【1 8 】 f i g 1 - 1o r g a n i z a t i o no f t h er e p e a t e du n i to f x a n t h a n 广西大学硕士论野油菜黄单途径相关基因突变分析 图1 2 黄原胶的合成过程图【4 9 】。g l c ：葡萄糖；m a n ：甘露糖；g i c a ：葡萄糖醛酸；p 巧：丙 酮酰基；a c ：乙酰基 f i g 1 - 2p r o p o s e dp a t h w a yf o rt h es y n t h e s i so f t h ex a n t h a ng u m ( 2 ) e p s 合成的调控 e p s 的调控一般有四个部分：信号传导、正负向调控、输出调控、全局调控。 野油菜黄单胞菌拥有一个双组份调控系统，该系统由一个感受蛋白和一个调 控蛋白组成。在黄单胞杆菌至少存在3 个双组份调控系统，它们在e p s 的调控 中可能具有两个作用 5 2 , 5 3 】。r p f c 、r p f c g 编码一个双组份系统的信号传导系统， 存在一个r p f 基因簇中，它们正向调控e p s 的合成【5 3 】。r p f 簇中至少存在8 个基 因，这8 个基因没有一个是编码与e p s 合成相关的结构基因。巾f b 、印伍编码扩 撒因子，p i g b 也是一个扩撒因子，它与野油菜黄单胞菌的e p s 和黄色素的产生 有关【5 4 5 5 1 。r p f n 是e p s 的负调控因子，其过量表达可抑制e p s 的合成；突变f p f n e p s 过量合成【5 6 】。 x c c 中含有一个编码与e c o l ic a p ( 降解产物激活蛋白) 类似的基因a p ，它与 大肠杆菌中的c a p 基因存在4 5 的同源性。在大肠杆菌中c a p 是一个全局性 调控基因，它广泛存在于c a m p 分布的地方。突变c a p 后，大肠杆菌利用碳源 的能力遭到削弱。而在野油菜黄单胞菌中c 勿基因突变后利用碳源的能力不受影 响但它的胞外酶、黄色素、e p s 的合成受到影响并且致病力下降【5 7 1 。 e p s 的调控是相当复杂的，e p s 和l p s 合成的前体都有糖类和乙酰类物质， 因此对e p s 的调控还包括这些前体合成的调控 4 5 , 5 8 , 5 9 】。而合成不同的前体有不同 的合成机制和调控机制。对致病菌e p s 生产的调控还包括运输机制的调控。 6 广西大学硕士论野油菜黄单途径相关基因突变分析 1 3 微生物( 细菌) 的糖代谢途径 1 3 1e m p 、l i m p 、e d 研究进展 微生物的新陈代谢是一个非常复杂的网络，包括很多条代谢途径。其中主要 的代谢路径有：e m p 、h m p 、e d 、p k 、h k 和s t i c k l a n d 等途径【6 0 石2 1 这些途径担 负起为微生物提供能量和合成物质的中间产物的重要任务。这些途径的代谢过程 伴随着能量的释放，这些能量部分是通过底物水平磷酸化生成a t p 以高能磷酸 键的形式贮存在三磷酸腺苷( a t p ) q b ，部分被转移至递能分子中形成还原力 h 】， 这些能量主要用于维持微生物的生理活动或供合成代谢需要。 e m p 途径( e m b d e n - m e y e r h o f p a t h w a y ) 许多微生物都利用该途径对葡萄糖 进行分解代谢。该途径定位在微生物的细胞质中，有氧无氧都能进行。e m p 途 径是以葡萄糖为起始底物，丙酮酸为其终产物，整个代谢途径历经1 0 步反应， 分为两个阶段：e m p 途径的前5 步为准备阶段，是耗能阶段，葡萄糖通过两步 磷酸化、异构化裂解为2 分子3 磷酸甘油醛，消耗2 分子a t p ；e m p 途径的后 5 步为产生a t p 的贮能阶段，3 磷酸甘油醛接受无机磷酸被进一步磷酸化，以 n a d + 为受氢体发生氧化还原反应，3 磷酸甘油醛转化为l ，3 二磷酸油甘酸；同 时n a d + 接受氢( 2 e + 2 h 3 被还原生成n a d h 2 。二磷酸甘油酸中的2 个磷酸键均为 高能磷酸键，在1 ，3 二磷酸甘油酸转变成3 磷酸甘油酸及随后发生的磷酸烯醇式 丙酮酸转变成丙酮酸的2 个反应中，发生能量释放与转移，各生成1 分子a t p 。 总反应产生2 分子丙酮酸、2 分子n a d h 和2 分子a t p 。e m p 途径中的关键酶 是磷酸果糖激酶、3 一磷酸磷酸甘油酸激酶、丙酮酸激酶【6 1 1 。e m p 途径常和e d 、 h m p 途径同时存在于微生物中，它们共同承担代谢作用、相互协助或在条件发 生变化时发生替代作用。e m p 途径常起到代谢枢纽作用因为e d 、h m p 途径的 共同中间代谢产物之一：3 磷酸甘油醛都能够汇入e m p 途径继续进行代谢。如： 1 - 3 h m p 途径( h e x o s em o n o p h o s p h a t ep a t h w a y ) - 是以6 - 磷酸葡萄糖为起始底物， 反应分为两个阶段，第一阶段即氧化阶段：从6 磷酸葡萄糖开始，经过脱氢、水 解、氧化脱羧生成5 磷酸核酮糖和二氧化碳。第二阶段即非氧化阶段：为磷酸戊 糖之间的基团转移，缩合( 分子重排) 使6 磷酸己糖再生。6 个6 磷酸葡萄糖分子 7 广西大学硕士论野油菜黄单途径相关基因突变分析 经h m p 途径，再生5 个6 磷酸葡萄糖分子，产生6 分子c 0 2 和p i ，并产生1 2 个n a d p h 2 。h m p 途径的主要特点是一条葡萄糖不经e m p 途径和t c a 循环而 彻底氧化产能、产还原力【h 】和许多中间代谢产物的途径；进行一次周转需要六 分子的葡萄糖同时参与，但实际只消耗一分子的葡萄糖；能产生大量的还原力 h 】 ( 1 2 个n a d p h 2 ) ，是合成脂肪酸、固醇等物质所需；也可通过呼吸链产生大量 能量；反应中有c 3 c 7 各种糖，使微生物可利用的碳源范围广；能产生多种重 要的中间代谢产物( 如核苷酸、多种氨基酸、辅酶和乳酸等) 。它的主要作用用于 生物合成【6 1 1 。h m p 途径与e m p 途径密切相关，h m p 途径中的3 磷酸甘油醛可 以进入e m p 途径，大多数好氧和兼性厌氧微生物中都有h m p 途径，而且在同 一微生物中h m p 途径一般是与e m p 途径并存，一起构成细胞糖分解代谢与合 成代谢的调控网络。 e d 途径：e d 途径于1 9 5 2 在嗜糖假单胞茵( p s e u d o m o n a ss a c c h a r o p h i l a ) 中 首次被发现的，几年后在大肠杆菌中发现【6 2 】，再后来发现它存在于整个微生物 系统中，包括古生菌【6 2 , 6 3 1 。有报道认为在分解代谢途径的演化过程中，e d 途径 先于e m p 途径形成【6 4 1 。 e d 途径特点是：在这一途径中，6 磷酸葡萄糖先脱氢产生6 磷酸葡萄糖酸， 后在脱水酶和醛缩酶的作用下，生成1 分子3 磷酸甘油醛和1 分子丙酮酸。3 磷酸甘油醛随后进人e m p 途径转变成丙酮酸。1 分子葡萄糖经e d 途径最后产 生2 分子丙酮酸，以及净得各1 分子的a t p 、n a d p h 和n a d h 。在革兰氏阴性 的假单胞菌属的一些细菌中，e d 途径分布较广，如嗜糖假单胞菌，铜绿假单细 胞，荧光假单胞菌，林氏假单胞菌等。固氮菌的某些菌株中也存在e d 途径。e d 途径可不依赖于e m p 和h m p 途径而独立存在【6 5 1 。 近年来，人们已经对各条途径的酶进行了详细的研究，目前很多的研究人员 通过各种试验手段试图细分这些途径在生物体的代谢过程中所起的作用大小，都 没有取得显著的效果。因为不同的生物它们所具有的代谢途径是不一样的，即使 是同种生物它们在不同的培养条件下也会采取不同的代谢方式。例如：在古生菌 中d e s u l f u r o c o c c u sa m y l o l y t i c u s 只通过e m p 途径降解葡萄糖；t h e r m o p r o t e u st e n a s 则是同时利用e m p 、e d 途径，其中e m p 途径所起的作用大约为8 5 ，e d 途 径所起的作用大约为1 5 ；而s u l f o l o b u sa c i d o c a l d a r i u s 仅仅利用e d 途径对葡萄 广西大学硕士论 糖进行降解 6 6 - 6 9 。目前研究代谢途径最先进的技术就是利用核磁共振技术，这中 技术能够对活细胞进行时时监测【6 3 1 。 1 3 2e p s 与e m p 途径相关性的研究进展 对于e p s 的合成过程以及每一个过程需要什么样的酶我们已经很清楚的认 识了，但是对于这些参与作用的酶作用机制，能量提供的方式，它们的调控机制， 我们并不完全了解。近年来研究e p s 合成的科学家们逐步把精力转移到酶的作 用机制上、酶的调控机制以及e p s 合成的能量研究上。而e m p 途径作为糖和能 量的主要代谢途径之一，理所当然的成为了研究主要对象。不过目前研究得最多 的是e m p 途径的代谢前半部分。研究大肠杆菌、乳酸菌、链球菌的研究者hm ， a n dn k l e c k n e r 、i n g e b o r gc b o e l s ，a n ar a m o s 、b a r td e g e e s t 等主要研究 糖的降解和糖的核苷酸化分支点。在这个分支点上他们都对葡萄糖磷酸变位酶 ( p g m ) 进行了研究，发现突变该酶基因，结果影响了大肠杆菌的形态、链球菌e p s 的组分而对乳酸菌的e p s 产量影响不大1 7 0 j 。i n g e b o r gc b o e l s 等人还对葡萄糖激 酶( p i k ) 、调控基i 天t ( c c p a ) 进行研究结果发现过量表达葡萄糖激酶( p m ) 大量的提高 葡萄糖磷酸化水平从而提高葡萄糖核苷酸化水平不能增加e p s 的产量；突变调 控基因( c c p a 这个基因在乳酸菌中调控磷酸果糖激酶p f k 和丙酮酸激酶p y k ) 葡萄 糖的核苷酸化水平没有受到影响但e p s 明显减少，估计与能量有关。芽孢杆菌 中也有报道说过量表达葡萄糖激酶( p 呔) 和葡萄糖磷酸变位酶( p g m ) 对e p s 的合成 没有影响【7 0 1 。在x c c8 0 0 4 代谢研究中，研究者们主要从下面四个方面研究1 主 要研究e d 途径与e p s 的关系2 主要研究e p m 途径中的关键酶与e p s 合成的关 系3 研究e m p 途径前半部分与e p s 合成的关系。他们的研究发现x c c8 0 0 4 主要 利用e d 途径，而基因组中同时拥有e d 、e m p 、h m p 三条代谢途径的基因。为 了了解e m p 途径与e p s 合成关系，我们设计了这个实验。 9 广西大学硕士论野油莱黄单途径相关基因突变分析 图1 - 3 ，e m p e d 、h m p 代谢途径相互关系筒易图 f i g1 - 3s i m p l i f i e dp r e s e n t a t i o no f t h r e em a j o rc a t a b o l i cp