（微生物学专业论文）采用噬菌体展示技术淘选桔青霉素模拟表位的研究.pdf

摘要 毒素标品建立了c i t p h a g e - e l i s a ，间接竞争 e l i s a标准曲 线的检测范围为 1 5 3 2 5 n g / m l ， 检测下限为1 0 n g / m l ，饲料样品加标回收率为8 0 . 6 - - - 1 0 2 . 1 % , 变异系数为 1 . 0 -7 . 4 % ;玉米样品加标回收率为 8 6 . 4 - 9 3 . 4 % ，变异系数为 1 . 5 - 7 . 8 % ; 大米样品加标回收率为8 4 . 8 - 9 4 . 8 % ， 变异系数为2 . 2 - 6 . 7 % 。 应用于 4 8份样品中c i t含量的检测，检测结果与传统e l i s a检测方法经统计学分析 无显著性差异。以 含有c i t十二肤模拟表位的噬菌体替代c i t 毒素标品建立了 c i t p h a g e - e l i s a ，间 接竞争e l i s a标准曲 线的 检 测范围 为1 5 - 4 3 9 n g / m l ， 检 测下限为1 0 n g / m l ，饲料样品加标回收率为6 4 . 2 - 1 0 8 . 4 % ，变异系数为1 . 1 - 5 . 6 % ; 玉米样品加标回收率为8 1 . 4 - 1 0 0 . 0 4 % ， 变异系数为1 . 1 - 4 . 0 % ; 大米样品 中c i t 加标回收率为8 4 . 1 - 9 4 . 4 % ，变异系数为2 . 4 - 5 . 8 % 。应用于4 8 份样品中 c i t含量的检测， 检测结果与传统e l i s a检测方法经统计学分析无显著性差异。 关键词:桔青霉素、单克隆抗体、噬菌体展示肤库、模拟表位、酶联免疫吸附 法 ab s tra c t abs tract c i t r i n i n ( c i t ) i s a t o x i c m e t a b o l i t e p r o d u c e d b y s e v e r a l fi l a m e n t o u s fu n g i o f t h e g e n e r a p e n i c i l l i u m a s p e r g i l l u s a n d mo n a s c u s , w h i c h h a s b e e n e n c o u n t e r e d a s a n a t u r a l c o n t a m i n a n t i n g r a i n s , f o o d s a n d f e e d s t u ff s . t h i s m y c o t o x i n i s h e p a t o - n e p h r o t o x i c a n d i m p l i c a t e d i n d i s e a s e o u t b r e a k s i n a n i m a l s a n d h u m a n s . t h e c u r r e n t l y u s e d m e t h o d s t o d e t e c t c i t a r e h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y , e n z y m e - l i n k e d im m u n o s o r b e n t a s s a y ( e l i s a ) ， a n d t h e e l i s a i s w i d e l y u s e d . b u t e l i s a n e e d s t o u s e c i t s t a n d a r d w h i c h i s e x p e n s i v e a n d h a r m f u l t o t h e p e r s o n n e l . p h a g e d i s p l a y l i b r a r i e s a l l o w s e l e c t i n g p e p t i d e m o l e c u l e s c a p a b l e o f m i m i c k i n g t h e s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l f e a t u r e s o f n a t i v e p r o t e i n s o r l o w m o l e c u l e w e i g h t c h e m i c a l s , w h i c h c a n s e r v e a s s u r r o g a t e s o f o r i g in a l o b j e c t s . s o t h i s t e c h n i q u e c a n b e a p p l i e d t o o v e r c o m i n g s u c h p r o b l e m s . we u s e d mc a b a s t a r g e t t o b i o p a n n i n g c i t m i m o t o p e . a n d c i t m i m o t o p e w a s u s e d a s s u b s t i t u t e o f c i t s t a n d a r d i n e l i s a . t h e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t c i t w a s u s e d a s t a r g e t f o r b i o p a n n i n g f r o m a p h a g e r a n d o m 7 p e p t i d e l i b r a ry a n d a p h a g e r a n d o m 1 2 p e p t i d e l i b r a ry , w h i c h w e r e d i s p l a y e d a s a f u s i o n p r o t e i n w i t h t h e c o a t p r o t e i nm o f f i l a m e n t o u s p h a g e m1 3 . w e r e d u c e d t h e c o n c e n t r a t i o n o f a n t i b o d i e s s t e p w i s e , a n d d i ff e r e n t b l o c k i n g b u ff e r w a s u s e d b e t w e e n e v e ry r o u n d . a ft e r 3 r o u n d s o f b i o p a n n i n g ， 3 0 c l o n e s o f t h e p h a g e r a n d o m 7 p e p t i d e l i b r a r y a n d 3 8 c l o n e s o f t h e p h a g e r a n d o m 1 2 p e p t i d e l i b r a r y w e re d e t e c t e d b y e l i s a a n d c i t c o m p e t it i o n e x p e r i m e n t s t o i n d e n t i f y t h e p o s t i v e c l o n e s . 2 0 p o s i t i v e c l o n e s c o u l d b i n d t o t h e a n t i b o d y , a n d t h e b i n d i n g c o u l d b e b l o c k e d b y f r e e c i t r i n i n i n t h e p h a g e r a n d o m 7 p e p t i d e l i b r a r y ， 3 3 p o s i t i v e c l o n e s c o u l d b i n d t o t h e a n t i b o d y , a n d t h e b i n d i n g c o u l d b e b l o c k e d b y f r e e c i t r i n i n i v ab s t r a c t i n t h e p h a g e r a n d o m 1 2 p e p t i d e l i b r a r y . t h e n t h e i n s e r t e d a m i n o s e q u e n c e s o f t h e p o s i t i v e c l o n e s w e r e d e d u c e d b y d n a s e q u e n c i n g . t h e c o m m o n a m i n o s e q u e n c e o f t h e m i m i c k i n g e p i t o p e w a s x h k x x x x.a c o m p e t i t i v e e l i s a i m m u n o a s s a y w a s e s t a b l i s h e d w i t h c l o n e p 1 0 o f t h e p h a g e r a n d o m 7 p e p t i d e l i b r a r y , t h e l i n e a r r a n g e o f t h e i n h i b i t i o n c u r v e s w a s b e t w e e n 1 5 n g 加l a n d 3 2 5 n g / m l ; t h e d e t e c t i n g l i m i t a t i o n w a s 1 0 n g / m l . i n d e t e c t i o n o f t h e f e e d s , c o r n a n d r i c e s a m p l e s m i x e d w i t h c i t ( 5 0 - 5 0 0 n g / g ) b y c o m p e t i t i v e i n d i r e c t e l i s a , t h e r e c o v e r y r a t e o f c i t i n f e e d s , c o r n a n d r i c e s a m p l e s w e r e 8 0 .6 - 1 0 2 . 1 % , 8 6 .4 - 9 3 .4 % a n d 8 4 . 8 - 9 4 . 8 % r e s p e c t i v e l y , t h e c o e f f i c i e n t s o f v a r i a t i o n w e r e 1 .0 - 7 .4 %, 1 . 5 - 7 . 8 % a n d 2 .2 - 6 .7 % re s p e c t i v e l y . a c o m p e t i t i v e e l i s a i m m u n o a s s a y w a s e s t a b l i s h e d w i t h c l o n e p l o f t h e p h a g e r a n d o m 1 2 p e p t i d e l i b r a r y , t h e l i n e a r r a n g e o f t h e i n h i b i t i o n c u r v e s w a s b e t w e e n 1 5 n g / m l a n d 4 3 9 n g / m l ; t h e d e t e c t i n g l i m i t a t i o n w a s 1 0 n g / m l . i n d e t e c t i o n o f t h e f e e d s , c o m a n d r i c e s a m p l e s m ix e d w i t h c i t ( 5 0 -5 0 0 n g / g ) b y c o m p e t i t i v e i n d i r e c t e l i s a ,t h e r e c o v e ry r a t e o f c i t i n f e e d s , c o m a n d r i c e s a m p l e s w e r e 6 4 .2 - 1 0 8 .4 %, 8 1 .4 - 1 0 0 . 0 4 % a n d 8 4 . 1 - 9 4 .4 % re s p e c t i v e l y ,t h e c o e f fi c i e n t s o f v a r i a t i o n w e r e 1 . 1 - 5 .6 % , 1 . 1 - 4 . 0 % a n d 2 .4 - 5 . 8 % r e s p e c t i v e l y . t h e p h a g e e l i s a w a s c o m p a r e d w i t h c o n v e n t i o n a l e l i s a , t h e d a t a s u g g e s t e d t h e n e w m e t h o d i s a p p l i c a b l e . t h e re s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e a c q u i r e d m i m o t o p e p e p t i d e s c o u l d b e u s e d a s t h e s u r r o g a t e o f c i t t o e s t a b l i s h e l i s a f o r d e t e c t i n g c i t r i n i n w it h o u t t h e m y c o t o x i n , t h e m e c h a n i s m o f t h e in t e r a c t i o n b e t w e e n m i m o t o p e p e p t i d e a n d a n t i b o d y m i g h t b e mi mi c k i n g h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n o f o r i g i n a l c i t a n d a n t i b o d y . k e y w o r d s : c i t r i n i n m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s p h a g e d i s p l a y p e p t i d e l i b r a ry m i m o t o p e e l i s a v 缩略语 缩 略 语 a b b r e v i a t i o n s b s a : b o v i n e s e r u m a l b u m i n牛血清白蛋白 o v a : o v u m a l b u m i n.卵清白蛋白 c i t :c i t r in i n桔青霉素 e l i s a :e n z y m e - l in k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y酶 联免 疫吸附 法 t l c :t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y薄层 层析法 h p l c :h ig h - p e r f o r m a n c e l iq u id c h r o m a t o g r a p h y高 效 液 相 色谱 i c 5 0 : 5 0 % i n h i b i t i o n b i n d i n g 5 0 % 抑制率 i p t g : i s o p r o p h l t h i o - b e t a - g a l a c t o s i d e异丙基 硫代一 1 3 - d 一 半乳 昔 k l h :k e y h o l e l i m p e t h e m o c y a n i n匙眼贝血蓝蛋白 x - g a l : 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y - b e t a - d - g a l a c t o s i d e 5 - 澳一氯- 3 - 0 ; 1 ir- d 一 半乳 糖昔 l b : l u r i a b e r t a n i m e d i u m l b培养基 m c a b : m o n o c l o n a l a n t i b o d y单克隆 抗体 o d :o p t i c a l d e n s i ty光密度 p b s :p h o s p h a t e b u ff e r e d s a l i n e磷酸缓冲液 p b s t : 0 .0 5 % t w e e n - 2 0 in p b s磷酸缓冲液+ 0 . 0 5 %吐温一 2 0 h r p :h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e辣根过氧化物酶 o t a : o c h r a t o x i n a褚曲霉毒素a z e a: z e a r a l e n o n e玉米赤霉烯酮 l d w : 5 0 % l e t h a l d o s e半数致死 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其 他 人己 经 发 表 或 撰写 过的 研 究 成果 ， 也 不 包 含为 获 得 南 昌大学 或 其 他 教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学 位 论 文 作 者 签 名 : 该 浮 教 签 字 日 期 : 坷年 八 13 h 学位论文版权使用授权书 本学 位 论 文 作 者完 全了 解 重遏人堂有 关 保留 、 使 用学 位 论文 的 规 定， 有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅 。 本人 授 权 南 昌大学可 以 将 学 位 论文 的 全 部或 部 分内 容 编 入 有关 数 据 库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 稀/，一 ( 保密的学位论文在解密后使用本授权书) 学 位 论 文 作 者 签 名 : 黄 啄撅 签 字 fl m : 坷年 月 1s 日 6月 / 8 日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 通讯地址: 电话: 邮编: 前言 一一瑞一 誉一一一 一 前 桔青霉素( c i t r i n i n , c i t ) 是青霉属和曲霉属的某些菌株产生的有毒次级代谢 产物， 主要作用的 靶器官是肾 脏， 也称为肾毒素 ( n e p h r o t o x i n ) ， 可引 起实验动 物的肾脏肿大，尿量增多，肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状。此外，c i t 还具有致癌、致畸和致突变性。 c i t 的产毒菌株广泛存在于自 然界中， 其中产桔 青霉素的 特征菌是桔青霉( p e c i l l i u m c i t r i n i u m ) ， 在小麦、玉米、大米、大麦、土 豆等各种农作物中都能检测到c i t 。对c i t 污染进行及时检测是预防和控制其危 害的 有效手段. 高 效液相色谱法、 薄 层层析法及酶 联免疫吸附 检测方法( e n z y m e l i n k e d h n m u n o s o r b e n t a s s a y , e l i s a ) 等都可用于 c i t 的 检测。 高效液相色谱法等 理化分析检测方法可精确地进行定性和定量分析，但是由于其设备昂贵、操作 复杂和对样品的纯度有较高的要求，导致检侧成本高、检测周期长，无法满足 大批量样本快速筛查的需要， 因而使用受到限制。 e l i s a 检测方法具有较高的灵 敏度和特异性，对样品的纯度要求不高且操作简单，特别适合于大批量样本的 筛选，被广泛应用于c i t 的快速检测。但传统的e l i s a 检测方法是建立在以标记 毒素或偶联毒素为竞争抗原基础上的有毒检测体系，存在标准品毒素昂贵、进 口受限、偶联反应重复性差、如操作不当，则会对生产及操作人员的健康产生 一定的危害等缺陷， 因而制约了 其应用和推广。 若能用c i t 的 替代品作为竞争抗 原，建立无毒素的免疫学检测方法，将克服上述缺陷，使之更好地推广使用。 利用噬菌体随机肤库确定蛋白 质抗原的表位、筛选蛋白 质抗原模拟表位的 技术现在已经相当成熟。其在筛选非蛋白质抗原模拟表位的应用中己初现端倪。 本研究以 抗c i t 单克隆抗体为配体， 用噬菌体展示肤库淘选c i t 的模拟表位。 c i t 的模拟表位可以特异性的与抗c i t 单克隆抗体结合，从而可用具有c i t 模拟表位 的噬菌体粒子代替c i t 毒素标准品，以 建立p h a g e - e l i s a 检测c i t 体系。 第一章 综述 第一章 综述 1 . 1桔青霉素的研究进展 桔青霉素( c i fn i n ,c i t )的 化学名称为( 3 r , 4 s ) - 4 , 6 一 二氢- 8 - 11基一 3 , 4 , 5 一 三甲 基一 6 一 氧一 3 h - 2 一 苯毗- 7 酸， 其化学分子式为c 1 3 h i 4 0 5 ， 分子量2 5 0 ， 在常 温下是一种黄色结晶物质， 熔点为1 7 0 - 1 7 3 ， 在长波紫外灯的激发下能发出黄 色荧光，其最大紫外吸收在3 1 9 n m , 2 5 3 n m 和2 2 2 m m 。纯品桔青霉素很难溶于 水， 但能溶于氯仿、丙酮、 苯、甲 醇等有机溶剂中u 1 . 1 . 1桔青霉素的生物学特性 1 . 1 . 1 . 1桔青霉素的抑菌性 桔青霉素首先是作为抗菌素从青霉属中分离并加以研究的，它具有良好的 抑菌性，能抑制芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌、蜡状芽抱杆菌、结核分枝杆菌和金 黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌，还能抗某些真菌和原生动物，对革兰氏阴性菌 抑制弱，只是因为其较强的毒性而无法应用幻 。 1 . 1 . 1 . 2桔青霉素的毒性及其作用机理 桔青霉素主要是一种肾毒性毒素，它能引起狗、猪、鼠、鸡、鸭和鸟类等 多 种动 物肾 脏病变。 大鼠 的l d b o 是6 7 m g / k g ， 小鼠 的 l d 。 是3 5 m g / k g , 豚鼠 的l d w 是 3 7 m g / k g 。 它引 起的肾 脏损害主要表现为 管状上皮细胞的 退化和坏死、 肾 肿大、 尿量增加、 血氮和尿氮升高等等， 并可引 起一系列的生理失常习 。 毒理学研究证 明，桔青霉素能抑制肝细胞线粒体氧化磷酸化效率，它通过抑制n a d h 氧化酶、 n a d h 还原酶、 细胞色素c 还原酶、 苹果酸、 谷氨酸及a - 酮戊二酸脱氢酶的活性， 引起跨膜电压的降低，从而导致氧化磷酸化效率的降低。进一步研究发现，桔 青霉素能显著抑制肾皮质细胞和肝细胞线粒体的a - 酮戊二酸和丙酮酸脱氢酶的 活性， 并能降低c a ” 吸收速率及c a t 总量 。 另外， 桔青霉素还能与其它真菌毒素 ( 如储曲霉素、 展青霉素等) 起协同作用， 增加对机体的损害5 。 桔青霉素的致突 第一章 综述 变问题在学术界一直存在争论。尽管它在体外能抑制细胞的r n a 合成及导致d n a 单链断裂，并干扰d n a 前体的合成和释放， 然而，y a n g 等在用大鼠全胚胎培养测 定桔青霉素的致突变性时却发现，在培养4 5 小时后，一定浓度的桔青霉素能引 起卵黄泡直径、头尾长度、体节数量及蛋白质、d n a 合成的减少，但未能观察到 畸形的发生， 低浓度桔青霉素处理的大鼠与对照组在外观上和组织上无差别8 而桔青霉素也不大可能在生物体内积累到如此高的作用浓度，由此可见，桔青 霉素致突变的过程是漫长而复杂的，受多种因素的综合影响，并存在种群和个 体的 差异。也许s a b a t e r - v i l a r 的研究能更好地阐明 这个问 题， 他在用沙门氏菌微 粒体试验和沙门氏菌肝细胞试验来检测桔青霉素的致突变性的实验中发现，前 者未能检测到桔青霉素有诱变作用，而后者则检测到桔青霉素对t 9 8 菌株有诱变 作用，表明桔青霉素需要通过复杂的生物转化才能发挥其致突变作用7 ， 。 1 . 1 . 2桔青霉素的产生菌株及其分布 有多种青霉属真菌和曲霉属真菌能在自然或人工条件下产生桔青霉素。如 青霉中 的纠缠青霉( p e n i c i l l i u m i m p l i c a t u m ) , 瘦青霉( p e n i c il l i u m f e l l u t a n u m ) 、 黄 绿青霉( c i t r e o v i r i d i n ) 、扩展青霉( p e n i c i l l i u m e x p a n s u m ) 等，曲霉中的土曲霉 ( a s p e r g i l l u s t e r r e u s ) 、 白 曲 霉( a s p e r g i l l u s a l b i c a n s ) 等。 其中 桔青 霉是自 然界中 最 重要的桔青霉素产生菌。桔青霉在自 然界中分布广泛，在温暖的气候条件下生 长繁殖迅速。它经常与纤维的降解，玉米、大米、面包等农产品或食品的霉变 有关。在大米中及其产地该菌是普遍存在的。近年来的调查研究发现，在许多 农产品如玉米、大米、奶酪、苹果、梨和果汁等食品和农产品中都有可能检测 到桔青霉素以及分离到产桔青霉素的菌株，不同的菌株之间产毒能力和产毒条 件差异很大，为预防和控制带来了困难d - m 。因此，桔青霉素引 起的污染问题越 来越受到人们的关注。当前， 德国及欧美各国正拟制订红曲及其相关产品的标准， 将严格控制红曲类产品中桔青霉素的含量。日 本称其红曲 产品在日 本卫生部门 受到严格的检验， 认定为不含桔青霉素才允许生产和出口。我国作为红曲的故乡， 红曲行业应当重视这一问题，因为这不仅关系到食品安全， 也涉及到产品出口。 第一章 综述 目 前我国尚 无红曲 米产品中桔青霉素的限量标准 12 1 1 . 1 . 3 桔青霉素的检测分析方法 自 1 9 3 1 年桔青霉素被首次纯化以来， 人们相继采用了薄层层析法( t l c ) , 高 压液相色谱法( h p l c ) 以 及气相色谱一 质谱联合法用于桔青霉素的分析检测。目 前， t l c 和h p l c 法是最常用的检测方法。 t l c 方法因其操作简便曾被广泛采用， 但其灵敏度和特异性都较差。 h p l c 法具有更高的灵敏度，可以 精确地对样品中 的桔青霉素进行定性和定量分析， 但是由 于其设备昂贵、操作复杂和对样品的 纯度有较高的要求， 不适合对大批量的 样本进行检测。免疫化学方法是近十多 年来发展起来的新方法，由于具有较高的灵敏度和特异性，对样品的纯度要求 不高，特别适合于大批量样本的筛查，近年来被广泛应用于各种真菌毒素的检 测。 1 . 1 . 3 . 1薄层层析法( t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ) t l c 是一种简便的真菌毒素分离技术， 但是由于灵敏度较低以及变异系数较 差， t l c 检测 方法仅适于定性检测c1 3 - 18 7 t l c 检测方法的主要缺点在于桔青霉素的弱荧光性，在正相硅胶板上的拖尾 以 及不稳定性。为了克服这些缺点，可先加热薄层层析板再喷上氯化铝，使其 黄色荧光变成蓝色，这样能增强桔青霉素的荧光，更易于检测。此外，为了减 少拖尾现象，可在硅胶板内加入草酸，但实验发现乙醇酸效果更好，因为乙醇 酸可减少桔青霉素点样的扩散， 提高其灵敏度.陈蕴等 17 用自 制薄板层析可进 行桔青霉素的定性检测，虽方便简单，但影响因素很多。红曲 样品中色素的多 少是最主要的影响因素，点样量的多少往往由桔青霉素含量的高低而定。如果 将样品集中点在一个点上，若点样量太少，则无法观察到桔青霉素的存在，而 点样量太多又不易分离，所以将样品点在一直线上，在2 0 c m x 2 0 c i n 的板上( 硅 胶浆6 0 m l ) ， 点样量为1 m l ， 点样长度为5 c m 左右， 用标准桔青霉素溶液作最低 检测浓度的 实验时， 发现当 其质量浓度为 0 .2 m g / l 时， 展开 后， 在紫外灯下仍能 看到桔青霉素的条纹。 第一章 综述 1 . 1 . 3 . 2 高 效液相色 谱法( h i g h - p e r f o r m a n c e li q u i d c h r o m a t o g r a p h y ) h p l c 技术己被成功运用到谷物、真菌培养物、奶酪、饲料及可食用添加剂 红曲 米(18 - 19 1 中桔青霉素的检测中。 h p l c 方法在正相或反相色谱柱的 选择、 流动 相及其梯度、检测方法、样品处理及纯化方法的选择上均有较大差异。 陈蕴等2 0 1 建立了 h p l c 测定红曲 产品中 桔青霉素的方法。 但该方法存在一个 突出的问题是未采用最适流动相，造成桔青霉素与有关杂质无法分离。他们对 高效液相色谱测定红曲桔青霉素的方法进行优化，比较不同色谱柱及流动相组 成对分离效果的影响， 确定了 采用色谱柱z o r b a x e c l i p s e x d b - c 1 8 ( 5 l u n , 2 5 0 m m x 4 .6 m m ) ， 流动相组成为v( 乙 睛) :v( 水) ( p h 2 . 5 ) =3 5 :6 5 . 在优化条件 下分离到的桔青霉素色谱图经质谱鉴定为单一组分。在优化的色谱条件下绘制 了 标准曲 线， 低浓度标准样品的质量浓度与峰面积的线性关系良 好， r= 0 .9 9 9 7 , 标准桔霉素h p l c 的最低检测质量浓度为0 .0 5 m g / l . 目 前， 大部分色谱法均采用酸性流动相的反相形式， 并结合荧光检测 ( f d ) 或紫外 ( u v )检测，也可采用离子配对技术结合u v 或f d的检测方法。桔青霉 素在长波紫外光下具有荧光特性， 使其检测可达到n g / g o 荧光检测与紫外吸收 检测相比， 具有更高的灵敏度， 被广泛应用于桔青霉素检测。陈蕴等川 根据红 曲样品预处理方法及h p l c 检测器的不同， 比 较了高效液相色谱结合紫外及高效 液相色谱结合荧光定量检测桔青霉素这两种方法，实验结果显示采用高效液相 色谱结合荧光对桔青霉素进行定量检测，其结果准确可靠，重现性好.最低检 测限 为。 . 6 0 n g , h p l c 方法的最低检测限 为0 . 1 m g / l ， 在0 . 1 1 0 m g / l 的 质量 浓度范围内，标准桔青霉素溶液的质量浓度与峰面积的线性关系良好， r 2 = 0 . 9 9 8 0 1 . 1 . 3 . 3酶联免疫吸附法( e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y , e l i s a ) e l i s a方法由于操作简单、灵敏度高、准确性好、一次可检测多个样品而 第一章 综述 被普遍采用。其测定毒素的基本原理是:在合适的载体上，酶标记的毒素 ( 抗 原) 或酶标记的抗体与相应的抗体或毒素 ( 抗原)生成酶标记的抗原抗体复合 物，然后加入酶的作用底物，在酶的作用下，底物生成另一种有色物质，在一 定的条件下，酶复合物的含量与光密度成正比，通过测定 o d值，可计算出抗 原 ( 毒素)的含量。 根据抗体抗原反应动力学又可将 e l i s a分为竞争 e l i s a 和非竞争e l i s a ， 根据反应体系与检测体系之间的关系又分为直接e l i s a和间 接e l i s a 。直接竞争e l i s a检测真菌毒素与间接竞争e l i s a的原理相同，但 其操作步骤不尽相同。直接竞争e l i s a的操作步骤少，耗时少，变异系数小， 重复性好，但在酶标毒素的构建过程中，对毒素的结构可能造成破坏，以致破 坏毒素的抗原性，影响实验的可靠性和准确性，且可能降低酶的效价，导致灵 敏度也降低，灵敏度的不足可能导致在检测样品时，需对样品进行多次纯化浓 缩处理以提取纯化毒素，这将消耗较多的试剂和需较长的样品处理时间;间接 竞争e l i s a则克服了以上缺点， 其灵敏度高， 样品处理时间短， 但变异系数大 2 1 ， 其变异系数可以 通过实验条件的优化得到控制。 已有e l i s a方法用于桔青霉素检测的报道。 1 9 9 5 年a b r a m s o n 采用了桔青 霉素与匙孔贝血蓝蛋白( k l h ) 偶联制成的人工抗原免疫得到的兔抗血清，用桔 青霉素与葡萄糖氧化酶的偶联物作为包被抗原，制成间接竞争酶联免疫试剂测 定桔青霉素， 其检测下限为i - 1 3 n g / m l ， 在样品中加入标准桔青霉素的含量为 2 0 0 - 2 0 0 0 n g / g 时，回收率为8 9 % - 1 0 4 %，变异系数为6 . 9 % - 1 3 % o 1 9 9 6 年 他再次采用多克隆抗体制成的直接竞争酶联免疫试剂和间接竞争酶联免疫试剂 测定了大麦中 桔青霉素的含量， 采用1 0 %的甲 醇一 p b s 溶液对样品 进行抽提， 直 接竞争法采用桔青霉素与辣根过氧化酶偶联作为标记抗原，检测下限为 2 - 4 n g / m l ， 在大麦中 加 入标准桔青霉素的 含量为5 0 0 - 2 0 0 0 n g / g 时，回收率为1 0 8 % - 1 1 1 %， 变异系数为8 . 4 % - 2 6 . 9 % ， 间 接竞争法的 检测下限 为0 .4 - 0 . 8 n 留 m l , 大麦样品中 加入标准 桔青霉素的 含量为1 0 0 - 2 0 0 0 n g / g 时，回收率为1 0 5 % - 1 1 2 %， 变异系数为4 . 5 0/ 6 - 1 2 % o 1 9 9 9 年， 他采用了碳酸钠溶液抽提样品的简易 第一章 综述 方法， 用间接竞争酶联免疫法对加入到玉米中的2 0 0 - 2 0 0 0 n g / g 桔青霉素进行测 定， 回收率为5 3 . 2 % - 6 7 . 2 %， 变异系数为1 8 . 4 % - 5 1 . 5 % m . 2 0 0 0 年v r a b c h e v a 等建 立的 免 疫 学 方 法的 检 测下限 是5 n g /g (m ) ， 而h e b e r 在2 0 0 1 年建 立的间 接 竞争 酶 联 免 疫 试 剂的 检测 下限 却只有1 5 “ 眺n 。 陈 福生 等27 制 备了 牛血 清白 蛋白一 桔青霉素包被抗原和卵蛋白一 桔青霉素免疫抗原， 用卵蛋白一 桔青霉素连接 物免疫小白鼠，间接e l i s a测小鼠抗血清效价， 待血清效价达到要求后，腹腔 注射骨髓瘤细胞，1 0 1 5 d 后抽取腹水离心得抗体， 建立了竞争e l i s a 检测红 曲样品桔青霉素含量的方法，研究了该法的特异性和桔青霉素的加标回收，结 果表明， 桔青霉素的 测定 浓度范围为5 .0 - 2 0 0 n g / m l ，回 收率为9 7 % - 1 0 4 % 0 由此可见，采用的抗体、检测方法及样品的提取方法不同，都会导致回收率、 灵敏度等存在极大的差异。 1 . 2噬菌体展示技术及其研究进展 噬菌体展示( p h a g e d i s p l a y ) 技术是2 0 世纪8 0 年代发展起来的一项技术。 噬 菌体展示是将外源蛋白质或多肤的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋白融合， 并在 其表面展示， 同时将其遗传密码信息整合到个体噬菌体的基因组中。 该技术的最 大优点是直接将可现的表达型与其基因型联系在一起， 再利用其配体的特异性 亲和力，将所感兴趣的蛋白质或多肤挑选出来。在探索受体与配体之间相互作 用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表 位、 新型疫苗的 研制等方面应用广泛。1 9 8 5 年 s m i t h m ， 首次通过基因手段将 外源抗原决定簇与丝状噬菌体的次要外壳蛋白融合，使其展示在噬菌体颗粒表 面。 最先构 建的 噬菌体多 肤或抗体展示文 库则始于1 9 9 0 年3 1- 3 2 1 。 由 此， 噬菌体 展示技术进入了一个飞速发展的时期。 g e y s e n 3 3 认 为， 含 有关 键残 基的 短 肤能 够模 拟蛋白 质 上的 决 定 簇: 多 数 情 况下，几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了蛋白质全部结合 的主要部分，即蛋白 质之间的相互作用或识别是通过局部肤段间的相互作用来 实现的， 上述两点为肤库的提出奠定了理论基础。 第一章 综述 噬菌体展示系统因载体和宿主细胞不同分别有丝状噬菌体展示系统、人 噬 菌体展示系统及t 4 噬菌体展示系统3 1 。 当以一组随机多肤编码序列或基因群插 入表达载体进行表面 展示时， 其总体 称为 表面展示库( s u r f a c e d i s p l a y l i b r a r y ) . 在展示库中每一个噬菌体粒子只展示一种序列的外源肤，展示技术将被展示的 多肚或蛋白 质与其基因联在一起， 构成一个实体。 因 此在得到某种多肤结构时也 就获得了它的基因，噬菌体展示技术最先是以m 1 3 噬菌体为载体，后来根据目 的不同也有选用t 4 和x 噬菌体为载体，目 前主要的库类型有:噬菌体抗体库， 随 机短肤库， 多肤构 象库， c d n a 展示库， 基因 突变体展示库等g.当 前噬菌体 展示技术在以下方面得到了广泛的运用: 1 . 2 . 1 以单克隆抗体作为靶分子，确定相关的抗原表位 噬菌体展示库能模拟各种抗原表位实现基因型与表现型之间的转换，使人 们在特异性抗原性质不明或实验中缺少可利用的高纯度抗原的情况下，能使用 单克隆抗体筛选噬菌体肤库获得有意义的特异性抗原表位3 -3 71 。目 前，应用随 机肤库技术己经成功地筛选出众多的单克隆或多克隆抗体的抗原表位序列。这 些抗原表位有些可以 模拟线性抗原表位，有些可以模拟空间立体抗原表位，这 样的 模 拟 抗 原 短 肤 作 为 半 抗 原 可 特 异 地 识 别并 结 合 相 应抗 体 . t h ir u m a l a - d e v i 3 01 等从噬菌体展示随机肤库中淘选到能与抗a f b ; 特异性结合的噬菌体克隆，并用 噬菌体 模拟肤替代a f b ， 建 立了a f b 的p h a g e - e l i s a检测方 法， 实验结果提示 利用该技术筛选的 模拟表位肤可有效替代黄曲霉毒素b , 参与免疫化学反应。刘 仁荣 1 等以 抗o t a单克隆抗体为靶物质， 对噬菌体展示七肤库进行淘选， 四轮 淘选后， 通过e l i s a方法挑取与靶分子特异性结合的1 1 个阳性克隆， 并建立了 o t a无毒免疫学检测方法，检测下限为 1 5 0 p g / m l 。由此证明了从噬菌体展示 多肤库淘选真菌毒素模拟表位抗原来替代真菌毒素的无毒免疫学检测的可行 性。 王 欣之 等40 1 为 获 得日 本 血吸 虫 保 护 性单 抗s s j 1 4 的 模 拟 抗原 表位。 用 纯化 的s s j 1 4 单 抗筛选 噬 菌 体随 机1 2肤库 ， 对 所得的3 3个克 隆 进行e l i s a验证， 获得 3 0 个阳性克隆， d n a序列分析表明这 3 0个克隆分属 1 1 个多肤序列， 分析 第一章 综述 比 较发现这些多肤具有“ h - n p q - x - s - p p f - x - x - l - a - t ” 的相似基序。 进而选取 3 个阳性单克隆及混合阳性噬菌体克隆进行 we s t e rn - b l o tt i n g实验， 证明都有良 好的 抗原性. 用它们免疫b a l b / c鼠 ， 并用免疫鼠 攻击血吸虫尾拗， 观察免疫鼠 抗血吸虫感染的保护效果， 结果表明筛选获得的噬菌体阳性克隆具有良 好的免 疫原性， 能诱导免疫鼠 产生高滴度的 抗血吸虫的 特异性抗体。 张颖等4 11 利用鼻咽 癌患者血清中纯化的e b病毒相关多抗， 从噬菌体展示肤库中筛选相关的优势抗 原表位， 并将其与 e b病毒蛋白的抗原性区域进行同源序列比对分析， 发现分别 与e b病毒的主要壳蛋白v c a抗原区域4 5 6 4 7 4和5 6 0 5 7 7 处氨基酸存在序 列相似性， 与膜蛋白m a抗原区域的 1 6 2 - 1 7 9处氨基酸及胸昔激酶t k抗原区 域2 1 3 2 3 1处氨基酸亦存在序列相似性， 这样就确定了 抗原决定