（植物学专业论文）拟南芥光合作用ctpa突变体的功能研究.pdf

原创性声明 y7 3 2 0 5 4 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立 进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、 数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包 含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究 成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：! 叁兰i 盐日期：至! 乏：2 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归 属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定， 同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版， 允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和 汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相 关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：缢导师签名：莓泣日 期：些i i 兰州大学硕士学位论文 致谢 在此硕士论文完成之际，谨向我的导师毕玉蓉教授和张立新教授表示诚挚的 谢意。两位恩师渊博的学识，严谨的思维，认真的态度，敏锐的学术洞察力和孜 孜不倦的工作精神深深地影响着学生。他们每周为学生组织研究讨论会，不断完 善每位学生的学术思想，多次到实验室里，亲身指导学生做实验，尽快提高学生 的实验技能。毕老师常常询问我的论文进展情况，并提出宝贵意见，张老师从实 验技术的掌握，论文的选题到写作，都给予我精心的指导，使我能够在三年罩顺 利完成学业。两位恩师对我的悉心关怀和谆谆教诲，使我受益匪浅，将鼓励和鞭 策我不断进步。 感谢郭进魁博士，陈华博士、张峰博士、杨颖丽博士，高茜博士、马今方博 士、彭连伟博士、赵敏桂博士、李贝贝博士、吴吴硕士、高大海硕士、张珠珠硕 士、乔泮硕士、陈翠云硕士、王晓敏硕士、李世峰硕士、孙峰硕士等在我实验和 学习中的帮助。同时我还要感谢我的室友及好友陈卓、费贯清、王筠、曾昭霞等 在生活中的支持和帮助。感谢生科院党政领导、实验室、资料室各位老师给予我 提供诸多的方便。 最后，深深的感谢我的父母和家人对我的全力支持和鼓励。 金美芳 2 0 0 5 年5 月 兰州大学硕士学位论文 p si p s i i n a d p h a t p p q l c h l i l c hi d f p c y t b 5 5 9 c t p a l ( d a h c f n a s c c 0 1 0 c t a b p c r d e p c d n a e t r r n a d t t t r i t o nx 一1 0 0 s d s e d t a 缩写词表 a b b r e v i a t i o n s p h o t o s y s t e mi p h o t o s y s t e m i i n i c o t i n a m i d ea d e n i n e d i n u c l e o t i d e p h o s p h a t e a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e p l a s t o q u i n o n e l i g h t h a r v e s t i n gc o m p l e x i i l i g h t h a r v e s t i n gc o m p l e xi d i i s o p r o p y lf l u o r o p h o s p h a t e c y t o c h r o m eb 5 5 9 c - t e r m i n a lp r o c e s s i n gp r o t e a s e k i l o d a l t o n h i g hc h l o r o p l a s tf l u o r e s c e n c e n o t t i n g h a ma r a b i d o p s i ss t o c kc e n t r e c o l u m b i a 0 c e t y l t r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d e l e c t r o nt r a n s p o r tm t e r i b o n u c l e i ca c i d d i t h i o t h r e r o l t - o c t y l p h e n o x y p o l y - e t h x o ye t h a n o l s o d i u md o d e c y ls u l f a t e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 光系统i 光系统l i 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷 酸，辅酶l i 三磷酸腺苷 质体醌 捕光复合物i i 捕光复合物i 二异丙基氟磷酸 细胞色素b 5 5 9 c 术端加工酶 千道尔顿 高的叶绿素荧光 诺丁汉拟南芥储存中心 哥伦比亚0 型 溴化十六烷三甲基铵 聚合酶链式反应 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸 电子传递速率 核糖核酸 = 二硫苏糖醇 聚乙二醇辛基苯基醚( 曲 拉通x 1 0 0 ) 十二烷基硫酸 乙二胺四乙酸 兰州大学硕士学1 ：；) ：论文 p a g e b ng e l d m t w e e n 2 0 h e p e s n b t b c i p p b s m r n a d c m u d c p i c p d l o e c m o p s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s b l u en a t i v eg e l n d o d e c y l1 3 d - m a l t o s i d e p o l yo x y e t h y l e n es o r b i t a nm o n ol a u r a t n - 2 h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - n - 2 - - e t h a n es u l f o n i ca c i d n i t r o b l u et e t r a z o l i u mc h l o r i d e 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - - 3 - i n d o l y l p h o s p h a t e p h o s p h a t eb u f f e r e ds o l u t i o n m e s s a g er i b o n u c l e i ca c i d 3 ( 3 ，4 一d i c h l o r o p h y l ) 1 ，1 一d i m e t h y lu r e a 2 , 6 - d i c h l o r o p h e n o li n d o p h e n o l p r e c u r s o rd 1p r o t e i n o x y g e ne v o l v i n gc o m p l e x 3 - m o r p h o l i n o p r o p a n e s u l f o n i c a c i d 聚丙烯酰胺凝胶电泳 蓝绿温和胶 十二烷基麦芽糖苷 聚氧乙烯山黎聚糖单月桂 酸( 吐温2 ) n 2 羟乙基哌嗪一n 一2 乙磺酸 氮兰四哗 5 溴4 氯3 吲哚基磷酸 酯 磷酸缓冲液 信使核糖核苷酸 敌草隆 2 ，6 。二氯酚吲哚酚 d 1 蛋白前体 放氧复合体 3 吗啉丽磺酸 兰州大学硕士学位论文 摘要 p s i i 中d l 蛋白通常以前体形式( p d l ) 合成，有一个8 1 6 个氨基酸的c 一末端 延伸，c t p a 蛋白作为一种c 一末端加工酶，负责d 1 蛋白的c 术端剪切，加工后 的d l 蛋白与其它蛋白和离子结合功能完整的p si i 。本文以通过t - d n a 插入使 得a t 3 9 5 7 6 8 0 基因缺失的c t p a 突变体为材料，从c t p a 突变体的生理和分子特 征来研究拟南芥a t 3 9 5 7 6 8 0 基因功能和其编码c t p a 蛋白的作用。研究结果如下： 1 c t p a 突变体植株在整个生长过程中都略小于野生型植株，但能够健康生长。 2 c t p a 突变体的e h l a ，e h l b ，c h l a j b ，c h l a + b 的值：p si 的电子传递活性，p s i i 的电子传递活性和以及总链的电子传递活性，7 7 k 低温荧光波谱分析，以 及叶绿体显微结构分析都与野生型植株一致。 3 c t p a 突变体中国i i 、q p 和q n 的值在室温下比野生型稍有降低，经强光处 理后突变体和野生型植株p si i 受损伤程度一致，在弱光下经过较长时间的 修复，突变体与野生型都能恢复到原初水平。 4 通过n o r t h e m 分析发现c t p a 突变体中p s b a ，p s b b , p s b c , p s b o , p s a a 基因 m r n a 的转录本水平没有变化；采用蔗糖密度梯度离心研究与核糖体结合的 筇鲥m r n a 动态分布，发突变体中d l 蛋白在翻译阶段没有受影响；蛋白免 疫印迹分析发现突变体中d l 蛋白的相对含量没有变化，表明d 1 蛋白在翻 译后修饰阶段没有受到影响 5 通过蓝绿温和胶电泳和s d s 一脲一聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现，c t p a 突 变体中光合作用的各个蛋白复合体以及复合体的多蛋白组分与野生型相比 没有变化。 综上所述，在本文的研究中拟南芥中a t 3 9 5 7 6 8 0 基因被完全敲除的c t 口a 突 变体，对d 1 蛋白聚集没有影响，对p si i 功能没有影响。 关键词：c t p a 突变体，d 1 蛋白，光系统i ic t p a 蛋白 4 兰州大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ed 1p r o t e i no fp si i i s u s u a l l ys y n t h e s i z e da sap r e c u r s o r ( p d l ) w i t ha c a r b o x y l t e r m i n a le x t e n s i o no f8 - 1 6a m i n oa c i d s c t p ap r o t e i n ，ac a r b o x y l t e r m i n a l p r o c e s s i n gp r o e r a s e ，i sr e s p o n s i b i l i t yf o r t h ec a r b o x y l t e r m i n a lp r o c e s s i n go fd 1 t h i s p a p e ru s e dac t p am u t a n tw h i c hi se n c o d e db ya t 3 9 5 7 6 8 0g e n ek n o c k e db yt - d n a i n s e r t i o na st h em a t e r i a l w es t u d i e dt h ep h y s i o l o g i c a la n dm o l e c u l a rc h a r a c t e r i z a t i o n o ft h ec t r i am u t a n tt or e v e a lt h ef u n c t i o no fa t 3 9 5 7 6 8 0g e n e t h er e s u l t sw e r e s u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 t h eg r o w t hr a t eo fc t p am u t a n tw a sl e s st h a nt h a ti nt h ew i l dt y p ed u r i n gt h e w h o l eg r o w t hp r o c e s s s 2 t h ev a l u e so fc h l a ，c h l b ，c h l a ba n dc h l a + b ，a n dt h ea c t i v i t i e so fp si ，p si ia n d t h ew h o l ec h a i ne l e c t r o nt r a n s p o r ta c t i v i t yw e r ea l m o s tt h es a m ei nc t p am u t a n t a n dt h ew i l dt y p e p l a n t 7 7 kf l u o r e s c e n c es p e c t r u ma n dm i c r o s t r u c t u r e o f c h l o r o p l a s tw e r ea l s ov e r ys i m i l a r 3 a tt h er o o mt e m p e r a t u r e ，t h ev a l u e so f 巾1 1 ，q pa n dq ni nc t p am u t a n tp l a n t s l i g h t l yd e c r e a s e dt h a nt h o s ei nt h ew i l dt y p e ，t h em u t a n ta n d t h ew i l dt y p e sp s i ih a dt h es i m i l a re x t e n to fp h o t o d a m a g ed u r i n gt h eh i g hl i g h tt r e a t m e n t ； m e a n w h i l e ，t h e ya l lc o u l dr e c o v e rt ot h eo r i g i n a ll e v e la f t e rp h o t o i n h i b i t i o n 4 ，n o r t h e r na n a l y s i ss h o w e dt h a tt h et r a n s c r i p t i o nl e v e l so f p s b a ，p s b b , p s b c , p s b o , p s c l aw e r eu n c h a n g e di nt h ec t p am u t a n tp l a n t e x a m i n i n gt h ep s b am r n a d y n a m i cd i s t r i b u t i n gb yt h es u c r o s ed e n s i t yg r a d i e n t sc e n t r i f u g a l ，w ef o u n dt h e c t p am u t a n th a sn oe f f e c to nt h et r a n s l a t i o np h a s e i m m u n o b l o ta n a l y s i sr e v e a l e d t h a tt h er e l a t i v e l ec o n t e n t so ft h edip r o t e i ni nt h em u t a n tw e r et h es a m ea st h a t i nt h ew i l dt y p e 5 b l u en a t i v eg e la n ds d s u r e a - p a g eg e la n a l y s i sr e v e a l e dt h ep r o t e i nc o m p l e x e s o f p h o t o s y n t h e s i sw e r eu n c h a n g e di nt h ec t p am u t a n t t h u st h ec t p am u t a n tl a c k i n ga t 3 9 5 7 6 8 0g e n eh a sn oe f f e c to nt h ea c c u m u l a t i o n o f t h ed 1p r o t e i na n dt h ef u n c t i o no f p si i k e y w o r d s ： c t p am u t a n t ，d ip r o t e i n ，p h o t o s y n t h e s i s1 1 ，c t p ap r o t e i n 5 兰州大学硕士学位论文 第一部分前言 植物、藻类和原核生物直接利用光能同化二氧化碳和水制造有机物的过程称 为光合作用( p h o t o s y n t h e s i s ) 。在漫长的生物进化过程中，生物具有光合作用的 功能才使得地球上大量的积累有机物和氧气，使生物在直接或| 1 | j 接的消耗光合产 物的基础上生长、繁衍、演化和进化。在高等植物中叶片是进行光合作用的主要 器官，而其中的叶绿体是进行光合作用的重要的细胞器，光合作用的能量转换和 碳同化的基本过程都是在叶绿体内进行的。光合作用是地球上最重要的反应之 一，所以光合作用的研究一直是人们关注的热点。 一、叶绿体的结构与功能 高等植物的叶绿体大多呈椭圆形，直径一般约为3 - 6 m ，厚约为2 - 3 1 a m 。研 究表明，叶绿体具有双层膜结构外被膜( o u t e re n v e l o p e ) 和内被膜( i n n e r e n v e l o p e ) 。外被膜的化学组成为脂蛋白，膜中埋有特殊的运输蛋白，作为某些 物质输入的载体。外被膜对c 0 2 气体通透性高，容许离子、溶质分子如无机盐、 有机酸、氨基酸等自由通过。内被膜为一种选择性半透膜，起着防l 七叶绿体中的 酶和底物被稀释的作用。被膜内充满了流动的基质( s t r o m a ) ，基质中有许多片 层结构，每个片层由周围闭合的双层膜组成，呈扁平盘状，成为类囊体( t h y l a k o i d ) 。 类囊体堆积形成基粒( g r a n a ) ，这部分类囊体成为基粒类囊体( g r a n a lt h y l a k o i d ) 。 另类类囊体贯穿两个以上的基粒之阳j ，形成基质片层，这部分类囊体称基质类 囊体( s t r o m a lt h y l a k o i d ) 。高等植物的类囊体膜具有独特的不同于其它生物膜的 垛叠膜结构形式，形成了类囊体膜垛叠的基粒膜区和非垛叠的间质膜区。 叶绿体的主要功能是进行光合作用，光合作用又可以分为光反应和暗反应。 光反应在叶绿体类囊体中进行，包括原初反应、光能的吸收和传递、光合磷酸化。 暗反应在叶绿体基质中进行。叶绿体中的蛋白质有序的，相互关联的组合起来形 成具有相对独立功能的蛋白复合体，这些蛋白复合体共同作用完成光合作用。参 与光反应的蛋白复合体包括光系统i ( p h o t o s y s t e m ip si ) 、光系统i i ( p h o t o s y s t e m i ip s i i ) 、细胞色素b 6 f 复合物、a t p 合酶复合物。这些复合物相互 配合，捕获光能并将其转变成电荷分离，引起水的氧化裂解和放出氧气推动电 兰州大学硕士学位论文 子沿特异的电子传递链传递并进行能量的运输，从褥导致还原力n a d p h 的产 生，形成跨类囊体膜的质子梯度驱动a t p 的合成 图1 1 ) 。虽然这些复合物相 互配合，完成光能的捕获、电子的传递、水的裂解，氧气的释放、n a d p h 及a t p 的合成等一系列复杂的过程，但是他们在类囊体膜上的分布并不是均一的，一般 来说p si i 主要位于基粒部位；而p si 及a t p 合酶复合物主要位于基质类囊体上和 基粒的边缘地区；细胞色素b 6 f 复合物则是平均分都在类囊体膜上( a n d e r s o n 等， 】9 9 3 ) 。 a t 尸 s y m h 特 图1 i 光反应中的电子传递( s i n g h a l ， 1 9 9 9 ) f i 9 1 1e l e c t r o nt r a n s p o r to fl i g h tr e a c t i o n 1 p s i i 的组成与功能 p s i i 是类囊体膜上存在的多亚基的蛋白复合物，是进行原初光化学反应的 功能蛋白复合体。它能够利用光能推动一系列的电子传递反应，导致水裂解为氧 和质子，释放出氧气，并将电子传到质醌( p q ) 。这个系统除了进行原初电荷分 离的分子传递组分外，还含有2 0 多种蛋白：c p 4 7 、c p 4 3 、d 2 、d 1 、c y t b 5 5 9 的4 和9 k d a 亚基、3 3 k d a 水溶性蛋白和p s b l 等基因编码的小分子量蛋白( i k e u c h i 等1 9 8 5 ；g h a n o t a k i s 等1 9 8 7 ；n a n b a 等1 9 8 7 ；p a k a r a s i1 9 9 5 ；s e i d l e r1 9 9 6 ；张 立新，梁厚果1 9 9 8 ；b u c h a n a n 2 0 0 0 ；于勇等，2 0 0 1 ) ( 图1 2 ) 。同其它光合膜复 合物一样，p si i 是核基因和叶绿体基因菸同编码的产物组成的。 兰州大学硕士学位论文 p s l 图1 2 光系统i i 反应中一i i , 结构模式图( 引自d e b u s r 1 9 9 2 ) f i 9 1 2a s t r u c t u r es c h e m a t i cv i e wo f p h o t o s y s t e mi ir e a c t i o nc e n t e r 1 1d 1 蛋白和d 2 蛋白构成p s 的反应中心的基本框架 光化学反应中心至少由2 5 亚单位构成，d l 蛋白和d 2 蛋白是两种重要组份， 它们构成p si i 的反应中心的基本框架，原初电子供体p 6 8 0 ，去镁叶绿素p h e o 、 q a 和q b 等主要的电子传递组分都结合在d l 和d 2 蛋白上( b a r b e r 等1 9 9 7 ) 。 所以位于p s i i 反应中心的d l 蛋白不仅能够为各种辅助因子提供结合位点，维持 p s l i 反应中心构象的稳定，而且还与原初电荷分离和传递有关。这就意味着d 1 蛋白的破坏不仅会导致p s i i 反应中心结构的变化，而且很可能还会引起电子传 递的受阻。再加上d 1 蛋白的半衰期仅2 0 3 0 m i n ( g r e e n b e r g 等1 9 8 9 ) ，比类囊 体膜上的其它蛋白有更快的周转速率( m a t t o o 等1 9 8 9 ) ，所有这些特征都决定了 d l 蛋白可能在p s i i 反应中心中起着非常熏要的作用。有人发现d l 蛋白的降解 不仅发生在强光下，弱光下也存在d 1 蛋白的降解，在f 常的情况下，d 1 蛋白 的降解速度小与合成速度，一旦暴露与强光下或与环境胁迫相偶联时，d 1 蛋白 的降解速度会大于合成速度，导致p si i 的反应中心的破坏( a n d e r s o n 等1 9 9 7 ) 。 1 2 核心天线c p 4 7 和c p 4 3 蛋白 在高等植物中，核心天线c p 4 7 和c p 4 3 是分别出叶绿体”6 b 平1 p s b c 基因 编码的4 7k d a ；9 1 4 3k d a 蛋白结合叶绿素a 构成的蛋白复合物( b r i c k e r ，1 9 9 0 1 ， f1 兰州大学硕士学位论文 二者均为p s i i 中结合紧密、含有叶绿素的反复折叠跨膜六次的跨膜蛋白质，均 含有5 个亲水环区。分析不同生物c p 4 3 和c p 4 7 基因结构和氨基酸序列后发现， 这两种蛋白具有高度保守性，其氨基酸序列保守程度分别为6 7 矛t 1 7 0 。c p 4 7 和c p 4 3 是p si i 的两个最大的亚基，c p 4 7 含有5 0 8 个氨基酸，c p 4 3 含有4 7 3 个氨基 酸( b r i c k e r1 9 9 0 ，w 6 l f e ，1 9 9 1 ) 。c p 4 7 和c p 4 3 与反应中心d 1 和d 2 蛋白紧密 相连，除了将外周天线叶绿素a b 蛋白复合体( l h c i i ) 捕获的激发能汇集给反 应中心外，还具有维持p s i i 放氧核心复合物的结构，参与水裂解放氧功能 ( b r i c k e r 等1 9 9 0 ，b a s s i 等，1 9 8 7 ) 。除此以外，v i r g i n 等( 1 9 9 0 ) 指出，光抑制 时受损的d 1 蛋白的降解与p s i i 中存在的蛋白酶有关，s a l t e r 和a n d e r s o n ( 1 9 9 2 ) 进一步研究证明，外加丝氨酸类蛋白酶抑制剂二异丙基氟磷酸( d f p ) 可抑制d 1 蛋白的降解，而同位素标记的d f p 可结合至u p s i i 的c p 4 3 ，这暗示c p 4 3 还可能 具有蛋白酶的作用。 1 3 捕光色素蛋白复合体 p si i 紧密结合着六个核基因编码的叶绿索结合蛋白( l h c b l 6 ) ，它们组成 了捕光复合体i i ( 1 i g h th a r v e s t i n gc o m p l e xi i ，l h ci i ) 。在植物类囊体中，l h c b 占总蛋白和叶绿素含量的一半，是高等植物和绿藻进行光合作用时主要的能量捕 获者( b a s s i ，1 9 9 0 ) 。它不仅能为p si i 捕获光能，而且能够将激发能传递n p si 。 在高等植物体内，捕光色素蛋白复合体( l h c ) 是一类捕获光能，并把能量迅速 传至反应中心引起光化学反应的色素蛋白复合体。l h ci i 的组分是一类结构相 似、进化相关、由核基因( l h c b ) 编码的蛋白与色素所形成的色素蛋白复合体家 族( l h c b ) ，目前国际上主要采用j a n s o n ( 1 9 9 2 ) 命名原则，并认为l h ci i 主要由 六种色素蛋白复合体组成，它们分别由l h c b l 、l h c b 2 、l h c b 3 、l h c b 4 、l h c b 5 和 l h c b 6 六种基因型编码的蛋白与色素形成l h c b l 、l h c b 2 、l h c b 3 、l h c b 4 、 l h c b 5 和l h c b 6 。其中l h c b l 、l h c b 2 和l h c b 3 总称主体l h ci i ( 或 l h c n b ) ，l h c b 4 ( c p 2 9 或l h ci i a ) 、l h c b 5 ( c p 2 6 或l t t ci i c ) 年n l h c b 6 ( c p 2 4 或l h ci i d ) 合称微量l h ci i 。它们在类囊体膜中除了进行光能的吸收和 传递之外，在维持类囊体膜的结构，调节激发能在两个光系统之问的分配，光保 护以及对各种环境的适应等过程中都起着重要的作用。 兰州大学硕士学位论文 1 4 细胞色素b 5 5 9 c y t b 5 5 9 作n p sl i 的一个组份，与p si i 反应中心结合非常紧密，在p si i 功能 发挥中起着重要的作用。c y t b 5 5 9 1 扫叶绿体基因组中筇be 、p s bf 基因编码的 亚基和p 亚基组成，其中亚基含8 3 个氨基酸残基，p 弧基含3 9 个氨基酸残基。在 这2 个亚基中各有一段由2 5 2 6 个氨基酸残基组成的疏水区可以形成跨膜螺 旋结构( s t e w a r t ， 1 9 9 8 ) 。c g b 5 5 9 有可变的氧化还原中点电位， 既可被光氧 化，也可被光还原， 这暗示它可能使光系统i i 某些电子传递实现环形通路。 c y t b 5 5 9 光反应的低量子产额表明它不可能成为经典非循环电子传递的递电子 体，同时也暗示它可以在强光条件下限制剧烈电子传递的发生。卢荣禾等( 1 9 9 7 ) 研究指$ c y t b 5 5 9 能够直接从p h c o 。接受电子，从而形成一条不依赖醌受体的由 p h e o 到c y t b 5 5 9 的电子传递路线，防止p s i i 反应中心遭受破坏。辛越勇等( 1 9 9 8 ) 研究表明，当发生p s i i 供体侧光抑制时，高电势态的c y t b 5 5 9 能够供电子给 p 6 8 0 + ，当发生p s i i 受体侧光抑制时，低电势态的c y t b 5 5 9 可以接受电子，所以 在光抑制时，c y t b 5 5 9 的高低电势态变化，不仅可以促进电子吸收传递，而且可 通过电离偶合促进电子经过c y t b 5 5 9 的循环，从而使反应中心供体侧和受体侧发 生短路，维持电子传递动态平衡，保护p si i 免遭进一步的光破坏。作为p si i 的 核心组分，对c y tb 5 5 9 的任何破坏性突变，都将导致p si i 组装的障碍，因此c y t b 5 5 9 在p si i 组装中发挥一定功能。c y t b 5 s 9 在p si i 组装的早期步骤中发挥重要作 用，它可能作为成核因子调节类囊体膜上p si i 的组装。 1 5 放氧复合体 p s i i 的水氧化放氧系统位于类囊体膜的表面，p 6 8 0 受光激发后在类囊体内 表面发生水的氧化反应，并向类囊体腔内释放质子和氧气，包埋c p 4 3 、c p 4 7 和 反应中心的类囊体膜与大量内在蛋白紧密相连，这些包括p s b o ( 3 3 k d ) 、( 2 3 k d ) 、 ( 1 7 k d ) 的基因产物，它们与m n 簇、c 1 。、c a 2 + 共同组成了放氧复合体。( 余叔 文等，1 9 9 7 ) ，3 3 k d 亚基起稳定m n 簇和放氧复合物的作用，2 3 k d 亚基使p s i i 在c a ”、c l 。浓度受限制的条件下放氧，1 7 k d 亚基辅助在c l 严重受限制 ( h a n k a m e r 等1 9 9 7 ) ，p s i i 的放氧复合物是一个多肽组成的离度有序的结构， 它为无机离子提供结合位点并调节它们的活性( d e m e r t r i o s 等1 9 9 0 ) 。3 3 k d 、 1 0 兰州大学硕士学位论文 2 3 k d 、1 7 k d 多肽复合物也称为水裂解放氧酶复合物，它们像一层屏障遮住放 氧复合物的m n 簇。3 3 k d 的多肽在所有放氧有机体中都普遍存在，而1 7 k d 和 2 3 k d 多肽在不同的植物中有所不同( r e n g e r 等1 9 9 7 ) 叶绿体类囊体膜上的复合物是由核基因和叶绿体基因共同编码的，成熟的叶 绿体含有2 5 0 0 - - 3 5 0 0 多种蛋白质( p e l t i e r 等，2 0 0 2 ) ，大约9 5 以上的蛋白质都 是由核基因编码，在细胞质翻译后转运进入叶绿体。因此叶绿体蛋白质的合成和 组装受到高度的调控，除环境因素外，还涉及叶绿体基因转录及转录后调节、翻 译与翻译后修饰调节。植物与我们的生活息息相关，光合作用是植物生长不可缺 少的，要掌握植物进行光合作用时，叶绿体中的各蛋白的作用以及蛋白问的相互 作用，就必须对其中的各个蛋白进行研究。除了叶绿体类囊体膜上的电子传递蛋 白复合体的研究外，人们对些起调节修饰作用的蛋白和小分子蛋白也有了研 究，j l l s e c y 与p s i i 中d l 蛋白的转运、定位有关( l i x i n 等，2 0 0 1 ) ，f t s h 对d 1 蛋白的快速周转有重要作用( s h a u n 等2 0 0 2 ) 。d e g p 在d l 蛋白降解中有重要作用 ( t h o m a s 等2 0 0 3 ) ，以及p s b s ，p s b w 的研究( e l l m o r 等，2 0 0 2 ) ，p s b j 对p s i i 中 有效地电子传递有重要作用( r a l f 等，2 0 0 1 ) 等等。 二、叶绿体蛋白酶 生物体中有很多的蛋白酶，它们在细胞的生命活动中超重要作用。蛋白酶可 以调控细胞循环、基因表达，蛋白质定位，确保重要蛋白活性，细胞程序化死亡、 维持细胞结构，细胞代谢以及外界环境对机体胁迫的响应都超重要的调节作用。 植物生长的各个过程中都会有蛋白酶的存在，如种子萌发、形态建成、衰老、程 序化死亡等( h u f f a k e r1 9 9 0 ，v i e r s t r a1 9 9 6 ，b e e r s 等，2 0 0 0 ) ，植物体中的蛋白 水解酶在许多细胞器中都有研究，如叶绿体、线粒体、微粒体，高尔基体等( p l a m a 等，2 0 0 2 ) 。 叶绿体5 0 的组分是蛋白质( p e o p l e s 年 1 d a l l i n g ，1 9 7 8 ) ，蛋白质的催化反应 在叶绿体发育的各个阶段都有发生。在叶绿体的生物发生，前质体到质体成熟过 程中不仅有新的蛋白合成，还有早先合成的蛋白质的降解，需要蛋白酶的调节； 核基因编码的蛋白质需要蛋白酶的帮助才能进入叶绿体发挥其作用；蛋白酶也调 兰州大学硕士学位论文 节基因表达。总之，叶绿体中的蛋白酶的关键作用就是调节光台作用，它可以加 工未成熟的蛋白前体，降解一些不完全的或错误折叠的蛋白，以及植物受到高温， 强光等胁迫后蛋白质的降解等，使得植物体无论在正常的生长情况下，还是当植 物处于胁迫条件下，在蛋白酶的调节作用下都能够维持细胞功能，进行光合作用 ( a d a m l 9 9 6 ，a n d e r s s o n ，等1 9 9 7 ，n a i r 等，2 0 0 4 ) 。叶绿体起源于蓝藻类的 原核生物，虽然在漫长的进化过程中由于失去或向核内转移一些基因而与蓝藻类 原核生物形成巨大差异，但叶绿体还是明显的带有蓝藻类原核生物的特征。叶绿 体中的所有蛋白酶的研究并不清楚，多年来。人们通过同源性比较，根据其特征 在叶绿体中确定了一些同源蛋白酶( l i n d a h l ，1 9 9 6 ) 。研究的比较多的，清楚 的蛋白酶( a d a m 等2 0 0 2 ) 主要有以下几种。 1 c l p 蛋白酶家族 c 岫蛋白酶在大肠杆菌中发现，是可溶性的多砭基蛋白复合物，也是熏要的 蛋白水解酶，典型的c l p 蛋白有两种类型亚基组成，个皿基具有蛋白水解酶活 性的c i p p ，另外一个亚基c i p a 或c l v x ( w i c k n e r 等，1 9 9 4 ) 作为分子伴侣，调节 肽酶复合物的蛋白水解活性( s q u i r e s1 9 9 2 ；w e a v e r 等，1 9 9 9 ) e s c h e r i c h i ac o i la n d b a c i l l u ss u b t i l i s q b c l p 蛋白在胁迫耐受中起重要作用，宜接降解错误折叠的蛋白和 受损的蛋白，在c h l a m y d o m o n a s 的叶绿体q b c l p p 参与细胞色素b 6 f 矛t l p s1 1 复合物 的分配。植物叶绿体中的c l p 蛋白1 9 9 0 年首次得到确认，它是一类由叶绿体基因 编码的丝氨酸蛋白酶家族( g r a y 等，1 9 9 0 ，m a u r i z i 等，t 9 9 0 ) ，定位在叶绿体 基质( z h e n g 等，2 0 0 2 ) 拟南芥基因组中有2 6 个c 1 口基因，包括5 个核基因和一个 叶绿体基因编码的c l p p ，4 1 c l p r ，3 个c l p x ，2 个c i p c ，1 个c i p d ，4 个c l p b ，1 个c l p f ，2 一j - c l p s ，1 ，个 c l p z 和两个c i 口相似的亚基( a d a m 等，2 0 0 t ，p e l t i e r 等， 2 0 0 1 ) 。对拟南芥中的c l p 基因分析，发现c l p 基因的产物在光合作用的组织和根 中都存在( z h e n g 等，2 0 0 2 ) ，当植物脱水、处于高浓度的盐环境、暗诱导的黄化、 或者低温都能诱使c l p 蛋白的表达( z h e n g 等，2 0 0 2 ，n a k a s h i m a 等，2 0 0 2 ) ，叶 绿体中的c l p 蛋白酶不管是正常生长的植株还是受到胁迫的植株中也都存在，证 g j j c l p 肽酶是叶绿体基质中的持家蛋白( s h a n k l i n 等，1 9 9 5 ) 。 2 兰州大学硕士学位论文 2 d e g 蛋白酶家族 属于丝氨酸肽酶，广泛存在于细菌和真核细胞中，即是h t r 家族，包括三个 成员h t r a ( d e g p ) ，h h o a ( d e g q ) 和h h o b ( d e g s ) 。大肠杆菌中的d e g p 蛋白 是不依赖于a t p 的丝氨酸蛋白酶，低温环境中作为分子伴侣，而在高温环境中 作为一种热激蛋白，是大肠杆菌生存所必需的蛋白( l i p i n s k a 等，1 9 9 0 ) 。拟南 芥中有1 4 个基因编码d e g 肽酶，其中两种d e g p 肽酶在高等植物中得到研究， d e g p l 位于类囊体腔侧，与类囊体膜紧密结合，当植物受到热胁迫时他的表达会 增加；d e 醇2 与类囊体的基质侧紧密相连( h a u s s u h l 等，2 0 0 1 ) ，参与p s i i d l 蛋 白的降解( k i e s e l b a c h a 等2 0 0 3 3 f t s h 蛋白酶家族 细菌中的f t s h 是整合到膜上的依赖于a t p 的膜蛋自，参与细胞内转录因子 03 2 和未组装的s e c y 的降解( t o m o y a s u 等，1 9 9 5 ，k i h a r a 等，1 9 9 5 ) ，叶绿体中 的f t s h 整合到类囊体膜上，它的a t p 和z n + 2 结合位点暴露在基质侧，降解聚集在 类囊体膜基质侧的未组装的f e s 蛋白和光系统i i 反应中心的d 1 蛋白( o s t e r s e t z e r 等，1 9 9 7 ) 在s y n e c h o c y s t i s 中有四个基因编码f t s h 肽酶成员，拟南芥中有1 6 个 同源基因编码f t s h 肽酶家族成员，而且这些f t s h 肽酶多数位于叶绿体膜上 ( s o k o l e n k o 等，2 0 0 2 ) ，参与类囊体蛋白的降解( o s t e r s e t z e r 等， 1 9 9 7 ) ，后来发 现当p s i i 反应中, b d l 蛋白降解成为2 3 k d 和1 0 k d 的两个亚基后，f t s h 依赖于a t p 使得2 3 k d 的片段进一步降解( l i n d a h l 等，2 0 0 0 ) 。 4 s p p a 肽酶家族 s p p a 家族由两个成员组成，在不同的种类中他的命名都不相同，s p p a 是丝 氨酸类型的，对a t p 没有依赖性，它与类囊体基质紧密结合。在大肠杆菌e c o l i 中有s p p a 和s o h b ，两个都是膜结合蛋白，s p p a 对信号肽的内部剪切非常重要。 细菌s p p a 的两种蛋白作为信号肽蛋白酶，它对一些小的肽段的加工和转移很 重要( n a v a k 等，1 9 8 8 ，b o l h u i s 等，1 9 9 9 ) 在s y n e c h o c y s t i s 中有s p p a l $ 1 s p p a 2 ， 在拟南芥中只有一个同源基因s p p a l ，这个基因在转录水平和翻译水平都受到光 激活，s p p a 蛋白与脂双分子表面相互作用，还可以和类囊体膜结合形成同型四 兰州大学硕士学位论文 聚体，s p p a 的表达随光强度的增加而增加，还可以调节光合作用天线蛋白， ( l e n s e h 等，2 0 0 1 ) 。在s ”e c h o c y s n s 的两个基因被敲除的突变体中得到，as p p a l 的突变体在中等光强下比野生型生长的快，而且对强光比较敏感；相反，as p p a 2 突变体比野生型生长的慢，对光也不敏感( s o k o l e n k o 等，2 0 0 2 ) 。 5 蛋白末端加工酶家族 蛋白加工酶可以分为c 一末端加工酶和n 末端加工酶。许多叶绿体蛋白都是由 核基因编码的，在细胞质中合成一个带有n 末端延伸的前体蛋白，这个特殊的序 列或转运肽可以引导蛋白质正确的转运到叶绿体中( w a n 等，1 9 9 6 ，s o i l 等，1 9 9 8 ) ， 当这些蛋白到达叶绿体基质后，这些转运肽就会被可溶性基质加工酶( s p p ) 剪 切掉，这种蛋白加工酶对叶绿体前体蛋白剪切是通用的( a n d r e a 等，2 0