（植物学专业论文）梁山慈竹离体培养体系及慈竹4cl基因遗传转化研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南科技大学或其它教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名： - 司煮糸 日期：7 - of 汐：莎、乡 关于论文使用和授权的说明 本人完全了解西南科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留学位论文的复印件，允许该论文被查阅和借阅；学校可以公布该论文的 全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此规定) 签名：。司杰援导师签名：惴日期加护分弓 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 摘要 梁山慈竹是生产竹浆的优良纤维原料，但在竹浆生产过程中为了脱去竹 木质素需加入大量的强酸强碱等化工原料，造成成本增加和环境污染。通过 生物技术手段培育木质素含量低的竹种，具有巨大的经济效益和环境效益。 竹类遗传转化的关键在于再生体系建立，而梁山慈竹等大型丛生竹的组织培 养和植株再生一直是一大难点。本研究以梁山慈竹种胚和无菌苗不同部位为 外植体，对梁山慈竹组织培养和再生体系进行了研究，并对愈伤组织类型及 器官发生方式进行了分析；同时构建了慈竹木质素合成关键酶基因4 c l 的 r n a 干涉载体，并通过农杆菌介导法转化模式植物烟草和梁山慈竹愈伤组 织。 组织培养结果表明，m s 诱导效果优于w p m ，m s 2 培养基更有利于愈 伤组织的发生。种胚接种3 天后开始膨大，进入愈伤组织诱导启动期；l 5 天左右进入分裂期；3 0 天后进入分化期，形成疏松易碎、增殖能力强的颗 粒状愈伤组织，发生率高达9 6 。梁山慈竹愈伤组织有多种器官发生形式， 不同发生形式的再生小植株的分株性能存在较大差异。在m s 2 上，以梁山 慈竹无菌苗不同部位为外植体也能诱导出愈伤组织，并形成再生植株，嫩芽 和幼嫩带节茎段诱导效果较好。 对获得的p c r 阳性转基因烟草再生植株进行了烟草内源4 c l l 基因的半 定量r t - p c r 、组织化学染色、木质素含量和4 c l 酶活性分析。结果表明， 多数转基因植株的内源4 c l l 基因表达量降低，转基因烟草植株的w i e s n e r 染色比对照植株浅，木质素含量和4 c l 酶活性均有不同程度降低。茎部和叶 部木质素含量的降低范围分别为7 6 2 8 3 、2 9 2 0 1 ：4 c l 酶活性 的降低范围分别为9 3 8 5 、1 3 3 9 9 。 采用农杆菌介导法侵染梁山慈竹愈伤组织，筛选一个月后，获得了抗性 愈伤组织。p c r 检测初步证明r n a i 载体已导入梁山慈竹抗性愈伤组织基因 组中，为获得木质素含量降低的梁山慈竹转基因植株，纸浆用竹改良和竹功 能基因组学研究奠定基础。 关键词：慈竹梁山慈竹再生体系4 c l r n a i遗传转化 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 i 页 a bs trac t d e n d r o c a l a m u sf a r i n o s u sh a sd r a w nm u c ha t t e n t i o ni nl a s tf e wy e a r sa sa r e n e w a b l er e s o u r c ea n daf i n er a wm a t e r i a lf o rc h e m i c a lp u l p i n gi np a p e r m a k i n g i n d u s t r y h o w e v e r ，l i g n i nr e m o v e df r o mt h er a wm a t e r i a l sb ya l k a l ie x t r a c t i o n d u r i n g c h e m i c a l p u l p i n g c a u s e g r e a t f i n a n c i a ll o s s e sa n d e n v i r o n m e n t a l p o l l u t i o n c u l t i v a t i o no fb a m b o ow i t hl o w e rl i g n i nl e v e lb yg e n e t i ce n g i n e e r i n g w o u l dc r e a t es i g n i f ic a n te c o n o m i ca n de n v i r o n m e n t a lb e n e f i t s r e g e n e r a t i o n s y s t e mo fb a m b o oi s c r i t i c a lt og e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n i nt h i ss t u d y ，t i s s u e c u l t u r ea n dp l a n tr e g e n e r a t i o nw e r es t u d i e du s i n gs e e d so fd e n d r o c a l a m u s f a r r i n o s u sa n dd i f f e r e n tp a r t so fr e g e n e r a t i o np l a n t l e t sa se x p l a n t s t y p e so f c a l l u sa n do r g a n o g e n e s i so fb a m b o oi nc u l t i v a t i o np r o c e s s e sw e r ea l s o a n a l y s i s m e a n w h i l en e o s i n o c a l a m u sa f f i n i s4 c l r n a iv e c t o rw a sg e n e r a t e d a n dt h e nt r a n s f o r m e di n t ot o b a c c oa n dc a l l u s o fd f a r i n o s u s b y a t u m e f a c i e n s m e d i a t e di n f e c t i o n 。 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm sc u l t u r em e d i u mi sm o r ee f f e c t i v ef o rc a l l u s i n d u c t i o nt h a nw p mm e d i u m a m o n gm sc u l t u r em e d i u m ，m s 2i sb e t t e r s u i t e dt oc a l l u so c c u r r e n c e t h ec a l l u si n d u c t i o ns t a g eo fs e e de m b r y o i n o c u l a t e di nv i t r os t a r t e da f t e rt h r e ed a y s t h ed i v i s i o na n dd i f f e r e n t i a t i o ns t a g e o fc a l l u so c c u r si n15d a y sa n d3 0d a y s ，r e s p e c t i v e l y a n dt h ec a l l u sw i t ht h e s t r o n gp r o l i f e r a t i v ec a p a c i t yw a sl o o s e a n df r a g i l e d i v e r s i t yo fc a l l u so r g a n o g e n e s i st y p e sw a sf o u n di nt h i ss t u d y t h ec a l l u s a n dr e g e n e r a t i o np l a n t l e t sa l s oc o u l db eo b t a i n e db yu s i n gd i f f e r e n tp a r t so f r e g e n e r a t i o np l a n t l e t sa se x p l a n t so nm s 2m e d i u m a m o n gt h e s ee x p l a n t s ， b u r g e o na n dy o u n gs t e mw i t hk n o ta r em o r ee f f e c t i v et oi n d u c ec a l l u s t h ee f f e c t so f4 c lr n ai n t e r f e r e n c eo nt h ep o s i t i v et r a n s g e n i ct o b a c c o s w e r ed e t e c t e dt h r o u g ha n a l y s i so fs e m i q u a n t i t a t i v er t - p c rf o re n d o g e n e s i s 4 c l l ，w i e s n e rs t a i n i n g ，l i g n i nl e v e la n d4 c l le n z y m ea c t i v i t y t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o n1 e v e lo fe n d o g e n e s i s4 c l li nt h em o s to ft r a n s g e n i c t o b a c c o e sd e c r e a s e dc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r 0 1 p a l e - s t a i n i n gb yw i e s n e r s t a i n i n gi nx y l e mo ft r a n s g e n i ct o b a c c o sw a s o b s e r v e da n dt h el e v e lo fl i g n i n c o n t e n t si nt h es t e ma n dl e a v e so ft r a n s g e n i ct o b a c c o sr e d u c et o7 6 2 8 3 ， 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 i i 页 2 9 2 0 1 o fc o n t r o lt o b a c c o ，r e s p e c t i v e l y a n dt h a t4 c la c t i v i t i e si nt h e s t e ma n dl e a v e so f t r a n s g e n i ct o b a c c o e sr e d u c e dt o9 - - 3 8 5 ，1 3 3 9 9 o fc o n t r o lt o b a c c o ，r e s p e c t i v e l y t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tn e o s i n o c a l a m u s a f f i n i s4 c lg e n ei sap o t e n t i a la l t e r n a t i v eg e n eu s e dt om o d i f yt h ec o n t e n to r a n d c o m p o n e n to fl i g n i n g e n e t i et r a n s f o r m a t i o no fc a l l u sf r o md e n d r o c a l a m u sf a r i n o s u sv i a a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o na p p r o a c hw a sa l s op e r f o r m e di nt h i s r e s e a r c h k a n a - r e s i s t a n tc a l l u so b t a i n e da f t e ro n em o n t hs e l e c t i n g - c u l t u r e w e r ea n a l y z e db yp c r i ti se s t i m a t e dt h a ts h r n af r a g m e n tw a si n t e g r a t e d i n t ok a n a r e s i s t a n t c a l l u s ，w h i c hl a yt h ef o u n d a t i o nf o r p r o d u c i n go f t r a n s g e n t i cd e n d r o c a l a m u sf a r i n o s u sw i t hl o w e rl i g n i nc o n t e n tf o ri m p r o v i n g b a m b o op a p e r - m a k i n ge f f i c i e n c ya sw e l la st h er e s e a r c ho ff u n c t i o n a lg e n o m i c s o f b a m b o o k e yw o r d s ：n e o s i n o c a l a m u sa f f i n i s ；d e n d r o c a l a m u sf a r i n o s u s ； c a l l u si n d u c t i o n ；o r g a nr e g e n e r a t i o n ；4 c l ；r n a i ； g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n 西南科技大学硕士研究生学位论文第页 目录 1 绪论l 1 1研究目的与意义1 1 2国内外研究现状2 1 2 1木质素生物合成的研究进展2 1 2 2木质素生物合成相关酶基因的研究现状4 1 2 34 一香豆酸辅酶a 连接酶( 4 c l ) 的研究进展7 1 2 44 c l 基因的遗传转化和转基因技术9 1 2 5竹类木质素和纤维素研究进展：1 1 1 2 6竹的组织培养和遗传转化体系1 2 1 3本研究的主要研究内容和技术路线1 4 1 3 1本研究的主要研究内容1 4 1 3 2本研究的技术路线1 6 2梁山慈竹愈伤组织诱导和再生体系建立17 2 1试验材料与仪器l7 2 1 1试验材料与试剂1 7 2 1 2 试验仪器1 7 2 2 试验方法1 7 2 2 1培养基的配制及灭菌1 7 2 2 2外植体消毒与接种17 2 2 3愈伤组织诱导1 7 2 2 4植株再生与移栽1 8 2 3结果与分析1 9 2 3 1梁山慈竹种子愈伤组织的诱导1 9 2 3 2梁山慈竹植株再生2 l 2 3 3梁山慈竹无菌苗愈伤组织的诱导及植株再生2 3 2 3 4炼苗与移栽2 5 2 4 讨论2 6 2 4 1梁山慈竹愈伤组织的类型2 6 西南科技大学硕士研究生学位论文第v 页 2 4 2影响梁山慈竹愈伤组织再分化的因素2 6 2 4 3梁山慈竹愈伤组织生根特性2 7 2 4 4愈伤组织的褐化2 8 2 4 5白化苗的发生2 8 3慈竹4 0 lr n ai 表达载体的构建2 9 3 1试验材料及试剂2 9 3 2 试验仪器3 0 3 3 试验方法3 0 3 3 1慈竹总r n a 的提取3 0 3 3 2慈竹c d n a 的合成3 1 3 3 3慈竹4 c lr n a i 目标片段的扩增3 1 3 3 4慈竹4 c l r n a i 目标片段的克隆与测序3 2 3 3 5中间表达载体p s k - 4 c l - r n a i 的构建3 5 3 3 6植物表达载体p b i - 4 c l - r n a i 的构建3 7 3 4 结果分析3 7 3 4 1慈竹r n a 的提取和4 c lr n a i 目标片段的扩增3 7 3 4 2 慈竹4 c lr n a i 目标片段的克隆3 7 3 4 3慈竹4 c lr n a i 目标片段的序列分析3 8 3 4 4中间表达载体p s k - 4 c l - r n a i 的构建与鉴定4 0 3 4 5植物表达载体p b i - 4 c l - r n a i 的构建与鉴定4 0 3 5 讨论4 1 4慈竹p b | - 彳碰一r n ai 转化烟草的研究4 2 4 1试验材料及试剂4 2 4 2 试验仪器4 3 4 3 试验方法4 3 4 3 1 p b l - 4 c l - r n a i 质粒转化农杆菌e h a l0 5 4 3 4 3 2叶盘法转化烟草4 4 4 3 3抗性再生植株的分化与生根筛选4 4 4 3 4转基因烟草植株的验证4 4 4 3 5转基因烟草植株半定量r t p c r 4 5 4 3 6组织化学染色4 6 4 3 7转基因烟草植株木质素含量的测定4 6 4 3 8转基因烟草植株4 c z 酶活性的测定4 6 西南科技大学硕士研究生学位论文第v i 页 4 4 结果分析4 7 4 4 1 p b i - 4 c l - r n a i 质粒转化农杆菌4 7 4 4 2转基因烟草n p t i 基因的p c r 检测4 7 4 4 3转基因烟草的半定量r t - p c r 4 8 4 4 4组织化学染色5 0 4 4 5木质素含量的测定5 0 4 4 6转基因烟草4 c l 酶活测定5 1 4 5 讨论5 3 5 慈竹p b i - 4 c l - r n a i 质粒转化梁山慈竹愈伤组织的研究5 5 5 1试验材料与仪器5 5 5 2 试验方法5 5 5 2 1农杆菌介导转化梁山慈竹愈伤组织5 5 5 2 2抗性愈伤组织n p t i i 基因的p c r 检测5 5 5 3 结果分析5 6 5 3 1梁山慈竹抗性愈伤组织的筛选5 6 5 3 2抗性愈伤组织n p t i 基因的p c r 检测5 6 5 4 讨论5 7 结论5 8 致谢6 0 参考文献6 1 攻读硕士学位期间发表的学术论文及研究成果6 6 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 1绪论 1 1研究目的与意义 造纸业是一个与国民经济发展和社会文明建设息息相关的重要产业，也 是最古老的行业。我国自建国6 0 年以来，造纸业发展迅猛，2 0 0 8 年超越美 国成为全球第一造纸生产国和第二消费国。而我国森林资源十分匮乏，森 林覆盖率只有l8 ，2 1 【2 1 ，大型造纸木材无法满足造纸业的要求，长期陷入“以 草代木 的误区，当今造纸木浆主要依靠进口，严重制约着我国造纸行业的 发展。2 0 0 8 年全国纸浆消耗总量7 3 6 0 万吨中，进口木浆占9 5 2 万吨，且呈 现继续增长的态势。我国具有丰富的竹林资源，竹浆造纸质量明显优于草浆， 竹在造纸工业中逐渐得到重视和广泛利用。2 0 0 9 年，贵州赤天化纸业股份 有限公司竹浆深度脱木素蒸煮和清洁漂白技术开发项目和四川永丰纸业股 份有限公司竹材制浆深度脱木素蒸煮和清洁漂白技术项目被列入国家重大 产业技术开发专项【3 ，4 】，其主要原因在于纸浆生产过程中为了脱去竹木质素 而加入了大量的强酸强碱等化工原料，耗费了大量的能源和原料，同时产生 的造纸黑液造成严重的环境污染，严重制约着造纸业的发展。 通过分子生物学技术和基因调控手段培育低木质素含量的竹种，具有巨 大的经济效益和环境效益。随着木质素合成途径的揭示和完善及相关基因的 克隆，通过生物技术调控木质素合成，用于改进纸浆生产已经成为可能p j 。 四川省竹类植物不仅种类较多，而且资源异常丰富，尤其以造纸竹材如慈竹， 梁山慈竹资源丰富。胡尚连等利用r a c e 技术首次克隆到慈竹的4 c l 全长 c d n a 基因( g e n b a n k 注册号为e u 3 2 7 3 4 1 ) 1 6 j ，而该基因的功能和调控研究 尚未见报道。而竹的遗传转化研究的关键在于竹的再生体系建立，而慈竹、 梁山慈竹等大型丛生竹的组织培养和植株再生一直是一大难点。梁山慈竹是 四川乡土竹种，是竹浆造纸的主要原料。本研究以泸州的梁山慈竹种子为材 料，建立梁山慈竹愈伤组织培养与植株再生体系，为竹的遗传转化研究奠定 基础。在此基础上，本研究以木质素合成酶基因4 c l 为研究对象，构建慈竹 4 c lr n a i 植物表达载体，并对烟草和梁山慈竹愈伤组织进行遗传转化，研 究该基因功能的同时，为竹类改良和竹功能基因组学研究奠定基础，为创造 适合我国国情的环保型低木质素的纸浆用竹奠定基础。 西南科技大学硕士研究生学位论丈第2 页 1 2国内外研究现状 1 2 1 木质素生物合成的研究进展 1 2 2 1木质素概述 木质素是地球上含量仅次于纤维素的一类有机物质，具有丰富的生物学 功能，在抵御植物病害袭击、抗击外来侵袭和维持植物正常生长等方面发挥 着巨大的作用【7 1 。木质素主要沉积在植物的输导组织、机械组织和保护组织 的细胞次生壁中，是一种复杂的苯丙烷单体聚合物。现代化学分析表明，木 质素主要由3 种单体聚合而成：香豆醇( p c o u m a r y la l c o h 0 1 ) 、松柏醇 ( t o n i f e r y la l c o h 0 1 ) 和芥子醇( s i n a p y la l c o h 0 1 ) 。依据单体的不同可将木质 素分为3 种类型：由对羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对羟基苯基木质素 ( p - h y d r o x y - p h e n y ll i g n i n ，h 木质素) ；由愈创木基丙烷结构单体聚合而成 的愈创木基木质素( g u a i a c y ll i g n i n ，g 木质素) 和由紫丁香基丙烷结构单体 聚合而成的紫丁香基木质素( s y r i n g y ll i g n i n ，s 木质素) 【引。三种木质素单 体结构如图1 1 。 确= r 2 = h ：p - o o u m a r y la l c o h o l ( p - h y d r o x yp h e n l y i ；h 帅m 民= h 。r 2 = o c h 3 ：c o n f r e r ea l c o h o l ( g u a i a c y l ；gu n i t ) = r 2 = o c h 3 ：s i n a p y la l c o h o l ( s y r i n g y l ；su n i t ) 图卜1木质素单体结构图【9 】 f i g 卜1 s t r u c t u r eo fm o n o ii g n o is 【9 l 植物体木质素含量在1 5 3 6 之间。裸子植物主要为愈创木基木质素 ( g ) ，包括少量的对羟基苯基木质素( h ) ；双子叶植物主要含愈创木基紫 丁香基木质素( g s ) ；单子叶植物则为愈创木基紫丁香基对羟基苯基木质素 ( g s h ) 【1 0 , 1 i ，坦】。木质素单体间连接的化学键约2 0 多种。 木质素的结构方式和含量依不同的种类、个体、组织、细胞类型、细胞 层以及环境条件而有所变化。木质素在植物体垂直分布、径向分布都表现出 不均匀性，如木质素在心材和边材、春材和秋材中的分布。在植物细胞内， 木质素的分布也是不均匀的，胞间层木质素的含量较高，次生壁较低；对阔 叶木材来说，木质素分布更不均匀【1 3 。 0 0 0 o h c - _ _ 叫k _ i + h t 憎日憎- 一 m 呻 西南科技大学硕士研究生学位论文第3 页 c w - - - ， h l 枷 o n c h 一- 一 o 豫 l 螺 t i r 瀚 。帕 c 啊m ，r 啼- 黼 h _ ，- l ，呦l 湖，蛳l t 啪 酬咤鬣。吲蜊 l l _ ， t o 埘一 q 蕾嘲 o h a _ 日 图1 2 木质素单体合成网状图9 】 f ig 卜2a no u t ii n eo fiig n inb i o s y n t h e s is 【9 j ，h d i i - p a l 苯丙氮酸裂解酶；c 4 h 香豆酸4 羟化酶：a h 肉桂酸3 羟化酶：o m t 甲基转移酶：h c t p 羟基肉桂酰辅酶a 乙酰基转移酶：c c o a o m t 咖啡酰辅酶a 30 甲基转移酶；f s h 阿魏酸5 - 羟化酶；4 c l 4 - 香豆酸：c o a 连接酶；c c r 肉桂酰辅酶a 还原酶：c a l d s h 松柏醛- 5 - 羟基基化酶； a i d o m t 5 - 羟基松柏醛0 甲氧基转移酶；s a d 芥子醇乙醇脱氢酶：c a d 肉桂酰乙醇脱氢酶；7 未经证实的 p a l p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a l y a s e ；c 4 h c i n n a m a t e4 - h y d r o x y l a s e ；c 3 h c i n n a m a t e3 - h y d r o x y l a s e ； o m t 0 m e t h y i t r a n s f e r a s e ；h c t q u i n a t ep - h y d r o x yc i n n a m o y lt r a n s f e r a s e ；c c o ao m t c a f f e o y l c o e n z y m ea0 - m e t h y l t r a n s f e r a s e ；f 5 h f e r u l a t e5 - h y d r o x y l a s e ；4 c l 4 - c o u m a r a t e ：c o e n z y m ea l i g a s e ； c c r c i n n a m o y lc o e n z y m ear e d u c t a s e ；c a l d s h c o n i f e r a l d e h y d e5 - h y d r o x y l a s e ；a i d o m t 5 - h y d r o x y c o n i f e r a l d e h y d e0 - m e t h y l t r a n s f e r a s e ；s a d s i n a p y ia l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ；c a d c i n n a m y la l c o h o l d c h y d r o g c n a s c ；7 y e tu n c o n f i r m e dr e a c t i o n s 鸭 棚6 伽f h 洲f斜卜 c 姒 嚣矿 妊州f 函 = 朋 州 镰zv舶爱 + j 岳删节一。，一 卜g甜耳6。耳秽 1 2 2 植 第 氨酸。 第2 阶段：苯丙氨酸途径，苯丙氨酸经由脱氨基、羟基化、甲基化和氧 化还原反应，最终生成3 种主要单体。 第3 阶段：木质素的特异合成途径，木质素单体在过氧化物酶和漆酶的 作用下进一步氧化聚合形成木质素。木质素单体主要通过酯、醚或碳碳键 相连，在细胞质中合成，然后转运到细胞壁再聚合成木质素。 与木质素相关的苯丙氨酸途径被多次修订，参与其中的大部分酶和一些 关键反应已经得到证明，参与苯丙氨酸途径的酶有：苯丙氨酸裂解酶( p a l ) 、 肉桂酸4 羟化酶( c 4 h ) 、香豆酸3 羟化酶( c 3 日) 、甲基转移酶( d m r ) 、 p 羟基肉桂酰辅酶a 乙酰基转移酶( h c t ) 、咖啡酰辅酶a 3 0 甲基转移酶 ( c c - d 彳d m r ) 、阿魏酸5 羟化酶( 彤) 、4 香豆酸：c o a 连接酶( 4 c l ) 、肉 桂酰辅酶a 还原酶( c c r ) 、松柏醛5 羟基基化酶( c a l d 5 h ) 、5 羟基松柏 醛o 甲氧基转移酶( a l d o m t ) 、芥子醇乙醇脱氢酶( 翱d ) 、肉桂酰乙醇脱 氢酶( c a d ) 。 目前，关于木质素单体合成途径，人们倾向于将它想象成一个网络结构， 合成途径中的多数酶表现出多个反应底物，而非单一底物，合成途径相互交 叉成一个网络。木质素的合成对植物体极其重要，在水生植物向陆生植物进 化演变的过程中起着重要作用一j 。 1 2 2木质素生物合成相关酶基因的研究现状 近年来，苯丙氨酸途径的研究成为木质素生物合成研究的热点。经过多 年的研究，在拟南芥14 1 、烟草15 1 、杨树【16 1 、葡萄17 1 、苜蓿【18 1 、马铃薯【1 9 1 、 大豆( 2 0 】和黑麦草【2 1 】等植物已经成功克隆出不同的苯丙氨酸途径的合成酶基 因。多数研究采用共抑制、反义抑制及过表达等技术，尤以反义技术研究得 最多也最成熟，对这些基因的遗传调控取得了一定的进展。 堕塑型垫奎兰堕圭堕窒竺兰焦笙奎篁! 要 表卜1部分植物木质素生物合成关键酶基因遗传调控研究与结果9 l t a b i e l 1g e n e t i cm a n ip u i a t i o no fii g n inb yr a is in gt r a n s g e n i cp ia n t s wit hv a rio u sg e n ec o n s t r u c t so fm o n oi ig n olbio s y n t h e ticp a t h w a y l 9 】 西南科技大学硕士研究生学位论文第6 页 正义和反义抑制烟草中p a l 活性，会导致木质素含量降低，伴随s g 比 值升高，对植物的生长产生不良影响【2 2 1 。在乃h 活性缺失的拟南芥突变体 中，仅含有微量的s 木质素。将丹日在该突变体中过量表达时，转基因植 物中的木质素基本上都是由s 木质素组成【2 3 】；同样将该基因导入正常植株 表达，也会使s 木质素含量增多，且使其在植物中的组织分布特异性消失2 4 1 。 西南科技大学硕士研究生学位论文第7 页 这表明丹编码基因可以显著增加s g 比值，利于木质素的脱除。b a u c h e r 等将从毛果杨美洲黑杨中分离出来的c a d 酶的c d n a 通过农杆菌进行正 义和反义技术转化欧洲山杨银白杨，结果表明有3 个反义转化和2 个共抑 制的品系的木质部组织的c a d 酶活性下降7 0 。在c a d 活性降低少于6 0 的品系中，可检测到红色的木质部，但木质素含量与对照相似的并未下降； 经光谱分析，其木质素中香豆基和紫丁香基含量提高，纸浆检验证明c a d 活性下降的品系只有少量木质素存在于纸浆中【2 5 1 。刘惠荣等人通过农杆菌介 导法将毛白杨c c o a o m tc d n a 反向导入烟草，大部分转基因株系木质素含 量较对照均有不同程度的下降，下降最多达3 7 【26 1 。这些研究均表明，通 过基因调控技术降低植物木质素，培育低木质素的植物完全可行，是减少造 纸污染和促进造纸业发展的一条绿色途径。改良造纸原料苯丙氨酸途径中的 主要基因的遗传调控研究及结果见表1 - 1 。 1 2 34 一香豆酸辅酶a 连接酶( 彳睨) 的研究进展 4 香豆酸辅酶a 连接酶( 4 c o u m a r a t e ：c o al i g a s e ，4 c l ) 是木质素合成 后期的关键酶之一，位于木质素生物合成和其它苯丙烷类衍生物生物合成的 分叉点上，参与羟基肉桂酸及其衍生物的辅酶a 酯化合物的形成。4 c l 的主 要功能是催化羟基苯乙酸到相应硫酯的反应，维持苯丙酸类( 如木质素和黄 酮类化合物) 生物合成所需新陈代谢，利用不同的底物来调节木质素合成。 在木质素苯丙氨酸途径中，4 c l 起着重要的应激酶作用，是联系木质素前体 和各个分支反应的纽带，分别催化p 香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸生成 相应的c o a 酯，促进木质素单体的合成犯。 4 c l 催化羟基肉桂酸及其衍生物形成相应辅酶a 酯，是通过两步反应达 到的：4 c l + 香豆酸+ a t p _ 4 c z ：香豆酰p a + p p i ；4 c l ：香豆酰p a + c o a _ 香 豆酰c o a + a m p + 4 c l 。形成的这些活性形式的硫酯酰c o a 则是后续各分支 途径的直接前体分子1 2 引。 4 c l 有两个氨基酸保守区序列，s s g t t g l p k g v 被认为是4 c l 催化反 应中保守的a m p 结合功能域【2 9 1 ，同时也是包括4 c l 、荧光素酶、乙酰c o a 合成酶、长链酯酰基c o a 合成酶和多肽合成酶在内的腺苷酸形成酶超家族 的保守域。系统进化分析结果表明，与乙酰c o a 合成酶，长链脂酰基c o a 合成酶相比，4 c l 更接近与荧光素酶1 3 们。g e i c i r g 是4 c l 中另外一个氨基 酸绝对保守域，但它不像保守域s s g t t g l p k g v 那样直接参与反应，但其 却是非常重要，缺失g e i c i r g 保守域的4 c l 完全丧失了活性p 。 西南科技大学硕士研究生学位论文 。 第8 页 近2 0 年来，编码维管植物4 c l 的d n a 序列和c d n a 序列相继被分 离出来。从欧芹、水稻、马铃薯、毛白杨和火炬松等植物中分离了编码4 c l 的基因序列。从欧芹、马铃薯、大豆、毛白杨、火炬松、美洲山杨、烟草、 拟南芥、紫穗槐和紫草等植物中分离了编码4 c l 的c d n a 序列l z 。 在大量植物中，发现大部分4 c l 基因是以基因家族的形式存在，如烟草、 拟南芥、水稻、黑麦草、大豆等。在一些植物中( 如欧芹，马铃薯，火炬松 等) ，4 c l 基因家族的编码的蛋白完全相同或几乎相同；而在一些植物中( 如 烟草，大豆，白杨等) ，4 c l 所编码的蛋白在结构和功能上却有差异。e h l t i n g 等【3 2 】研究表明，拟南芥中的4 c l 基因家族( a t 4 c l i 、a t 4 c l 2 、a t 4 c l 3 ) 就 有不同的底物特异性和偏爱性。基于酶活特性、表达特征和进化关系，e h l t i n g 推断a t 4 c l 3 激活p 香豆酸作为查耳酮合成酶的底物，最后进入到黄酮合成 途径，而a t 4 c l l 、a t 4 c l 2 才与木质素和其他酚类化合产物的合成有关。 a t 4 c l j 、a t 4 c l 2 有底物偏好性，a t 4 c l 2 只能以4 香豆酸为底物，a t 4 c l l 除了以4 香豆酸为底物外，还可以催化阿魏酸生成阿魏酸c o a 。因为，a t 4 c l j 和a t 4 c l 2 在底物结合区域( s b di 和s b di i ) 的氨基酸编码也有所差异，两 者在s b di 有九个氨基酸差异，在s b di i 有4 个氨基酸差异p 引。 - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 一 西南科技大学硕士研究生学位论文第9 页 4 c l 基因遗传调控的研究中，在拟南芥 3 4 1 、烟草3 5 3 6 】及杨树【3 7 】中都已 得到4 c l 活性降低的转基因植株。但在不同的植物中所得到的结果相差较 大，转基因拟南芥和杨树的4 c l 活力几乎全部抑制，木质素含量也有相当部 分的减少，转基因烟草的木质素含量降低较小。除含量上的改变以外，4 c l 的基因调控对木质素的单体组分也有影响，在抑制4 c l 表达的转基因拟南芥 中，g 木质素减少而s 木质素则并无多大改变；然而转基因烟草中，s 木质 素与g 木质素的含量虽都减少，但s 下降的幅度要比g 大得多。 s m i t ar 认为p a l 、c 彳日、c 3 h 和4 c l 在木质素基因调控中不是好的靶 向基因，因为它们的调控往往会带来一些不良效应，而o m t 、c c o a o m t 和 c a d 则是改变木质素含量和组分的良好靶向基因【9 】。而许多研究证明4 c l 是改造植物木质素组成的良好靶向基因。k a j i t a 等【38 】用4 c l 活性较低的转 基因烟草进行制浆实验，发现转基因株系木质素易去除，化学药品耗用量少， 纸浆产量增加。除木质素含量的降低外，有研究表明，4 c l 基因的下调同时 伴随着纤维素的增加，赵艳玲等人将g r p l 8 融合的反义4 c l l 基因转入烟 草，转基因烟草的木质素含量较对照平均降低了l3 7 ，纤维素含量较对照 升高了l5 6 【3 9 】。由此可见，4 c l 是用于改良造纸原料植物的较为理想的目 标基因。 1 2 4 4 c 1 基因的遗传转化和转基因技术 植物遗传转化是应用重组d n a 技术、细胞组织培养技术或种质系统转 化技术，有目的地将外源基因或d n a 片段插入到受体植物基因组中，并使 其在后代植株中得以表达的过程。在短短的几十年中植物遗传转化技术发展 异常迅速，已报道的方法多达十几种，归纳起来可分为两类，即利用载体系 统转化法( 农杆菌法、脂质体法) 和直接遗传转化法( 基因枪法，花粉管通 道法，电击法，电注射法，p e g 法，显微注射法，超声波法等) 。 农杆菌介导法应用最多，已成为植物遗传转化的常规技术和首选方法之 一，因为其操作简便易行、成本低，且转基因低拷贝、能够转化大片段的 d n a ，并稳定遗传至后代。农杆菌介导法包括叶盘法、真空渗入法、原生质 体法、整株感染法、原生质球法及脂质体法。1 9 8 5 年农杆菌叶盘转化法【4 0 】 的创立大大推动了农杆菌介导法的应用，并促使植物遗传转化的研究得到了 迅速发展。近年来，人们将农杆菌介导法与其他方法结合运用以增强受体材 料被有效感染的能力，如超声波辅助农杆菌介导法、低能离子束与农杆菌介 导结合