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鸡蛋白溶菌酶结晶学研究 专业： 硕士研究生 有机化学 张承 指导老师：蔡继文教授 摘要 蛋白质是生命的基础物质用x 射线衍射法确定蛋白质的三维结构对生物体进程的理 解和指导新型药物的设计等有十分重要的意义然而，得到高质量的单晶是当前蛋白质结构 确定的瓶颈鸡蛋白溶菌酶( 简称翔狲r l ) 由于其稳定性，溶解性和易结晶性。被结晶学 家当作研究结晶理论的模板为了进一步理解蛋白质结晶的理论，我们以h e w l 为对象， 研究不同的环境对其结晶行为的影响。通过x - 射线衍射在低温下收集了5 种h e w l 晶体的 数据，并对其结构进行了解析 通过对h e w l 的四方晶体结晶条件的优化，我们研究了各种因素对四方h e w l 结晶的 影响，并确定了p h 值和s m c l 3 是影响结晶的两个重要因素 此外，我们发现了两个文献没有报道过的h e w l 结晶条件在3 7 0 ，高浓度的州l 功姻 盐，昧唑钠缓冲溶液p h6 1 ，加入d m s o 和m g a 2 混合添加剂，得到了高质量的晶体添 加剂d m s o 能够优化晶体生长的形态。单晶衍射结果表明这可能是鸡蛋白溶菌酶的一个新 的晶型它的结构解析还没有完成 在3 7 0 下，1 0m 酒石酸钠，h e p e s 缓冲溶液，娜7 5 意外得到了四方的h e w l 晶体 此晶体的三维结构与h e w l - n a c i 一致，空间群都是p 4 3 2 1 2 这个结果否定了之前报道的 h e w l 在2 5 以上任何条件下都会以稳定的正交晶型结晶的结论 用大量的金属氧化物代替氯化钠的方法，我们得到了系列与金属共结晶的h e w l 晶体 从h e w l - n a c i ，h e w i c i l a 2 ，加j w i ，n i c l 2 ，h e w l - s n 妇1 3 的结构中揭示了h e w l 中 n i 2 + ，c u 2 + ，以及四个a 一的结合位点通过结构重叠比较，我们认为金属与蛋白的结合 有可能会引起界面氨基酸构象的微小改变。 关键词：x - 身t 线衍射，溶菌酶，晶体结构，结合位点 c r y s t a l l o g r a p h i cs t u d y o nh e n e g gw h i t el y s o z y m e m a j o r ：o r g a n i cc h e m i s t r y n a m e ： z h a n gc h e n g s u p e r v i s o r ：p r o f c a ij i w e n a b s t r a c t p r o t e i ni st h eb a s i so fl i f e u s i n gt h ex - r a yd i f f r a c t i o nt e c h n i q u et od e t e r m i n et h e t h r e ed i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f p r o t e i n s h a sas i g n i f i c a n t m e a n i n g t oh e l p u n d e r s t a n d i n gt h el i f ep r o c e s sa n d t h eg u i d i n go ft h en 哪d r u gd e s i g n s i n c et h el a c k o fp r i n c i p l eo fp r o t e i nc r y s t a l l i z a t i o n , t oo b t a i ng o o do r d e r e ds i n g l ec r y s t a li st h e m a j o rb a l t i c rt os t r u c t u r ed e t e r m i n a t i o n h e ne g gw h i t el y s o z y r n e ( 眦w l ) h a sb e e n e x t e n s i v e l ys t u d i e da sam o d e lo fp r o t e i n - c r y s t a lg r o w t hb f c a u s co fi t ss t a b i l i t y , s o l u b i l i t ya n de a s co fc r y s t a l l i z a t i o n i no r d e rt of i m h e ru n d e r s t a n dt h et h e o r yo f m a e r o m o l e e u l a lc r y s t a l l i z a t i o na n db u i l daf o u n d a t i o ns t o n ef o ro u rr e s e a r c ho nt h e s t r u c t u r eo fo t h e ri m p o r t a n tt a r g e tp r o t e i n , w cc r y s t a l l i z e dt h eh e w lu s i n gt h e h a n g i n gd r o pm e t h o d , o b s e r v e dt h ec r y s t a u i z 蕴t i o nl 两o e e s st h r o u g ht h em i c r o s c o p e ， c o l l e c t e dt h ed a t ao ff i v es i n g l ec r y s t a l so fh e w l b yt h ex - r a yd i f f r a c t i o nt e c h n i q u e ， a n dd e t e r m i n e dt h e kt h r e ed i m e u s i o h a ls t r u c t u r e s b yo p t i m i z i n gt h ec r y s t a l l i z a t i o nc o n d i t i o no ft e t r a g o n a lt m w i _ w ei d e n t i f i e d t h a tt h ep hv a l u ea n ds m c l 3a l et h et w os t r o n gf a c t o r si n f l u e n c i n gt h ec r y s t a l l i z a t i o n h e h a v i o ro f h e w l w ea l s ot r i e dt oc j r y s t a l i i z eh e w lu s i n gt w o 柳c o n d i t i o n s u n d e rt h eh i g l l c o n c e n t r a t i o no f 删h 班p 0 k0 1mi m i d a z o l eb u f f e r , p s6 1 ，d m s oa n dm g a 2a s a d d i t i v e s , a t3 7 ( 2 ，w eo b t a i n e dt h es i n g l ec r y s t a lw i t hg o o ds i z ea n dq u a l i t y t h e c r y s t a ls h a p e 啪b eo p t i m i z e db yt h ea d d i t i o no fd m s o t h er e s u l to ft h ex - r a y d i f f r a c t i o nd a t as u g g e s t e di t m i g h t b ean e wc r y s t a lf o r mo fh e w l b u tt h e d e t e r m i n a t i o no ft h es t r u c t u r eh a sn o tc o m p l e t e d y e t u n d e rt h en e wc o n d i t i o no f1 0mn at a r t r a t e , 0 1mn a h e p e s ，p h7 5 ，3 7 c ，w e o b t a i n e dt h et e t r a g o n a ls i n g l ec r y s t a lw i t ht h ec e l lp a r a m e t e re x a c t l yt h es a m ea st h e h e w l - n a c li ti s u n e x p e c t e db e c r h s ca c c o r d i n gt ot h er e f e r e n c e s ，h e w lw i l lb e o n l yo b t a i n e da st h eo r t h o r h o m b i cf o r mu n d e rt h ep h y s i o l o g i c a lt e m p e r a t u r e s e v e r a ls i n g l ec r y s t a l sw e r eo b t a i n e db yt h er e p l a c e m e n to fn a c ! w i t ho t h e r m e t a lc h l o r i d e w ec o n f i r m e dt h en i 2 + ，c u 2 + a n df o u rc h l o r i d eb i n d i n gs i t e si nh e w l c r y s t a l s t h er e s u l to fs u p e r p o s i t i o nc o m p a r i s o ni m p l i e dt h eb i n d i n go ft h em e t a l p e r h a p ss u b t l yc h a n g e dt h ec o n f o r m a t i o no ft h ea m i n oa c i dl o c a t e di nt h ei n t e r f a c e k e yw o r d ：x r a yd i f f r a c t i o n , l y s o z y m e ，h e w l , c r y s t a ls t r u c t u r e ，b i n d i n gs i t e l 、， 鸡蛋自溶苗酶结晶学研究 第1 章绪论 1 1 蛋白质结晶学概述 1 1 1 蛋白质结晶学的发展以及用x 谢线衍射研究蛋白质的意义 从1 9 世纪后期开始，蛋白质结晶学得到发展。它主要用做蛋白质的纯化手 段和纯化鉴定的标志1 1 1 ，因为当时没有其他方法来纯化蛋白质。1 9 0 0 年到1 9 4 0 年，酶成为当时研究的热点s u m m e r , n o r t h u i p ，k u n i t z ，h e r r i o t t l 2 - 5 和他们的同事 们的研究说明了结晶是研究酶这种大分子性质的重要手段。而在3 0 年代末期， b e m a l 和c r o w f o o t l 6 1 以及p e r u t z 7 1 利用x - 射线衍射技术使得蛋白质结晶出现了新 的应用。到今天，尽管蛋白质结晶仍被酶学家和蛋白质化学家看成是一种有用的 实验方法，但是x 射线结晶学，大分子及其复合物的结构确定。已经成为结晶 应用的核心领域。 在2 0 世纪年代，随着d n a 重组技术的发展，人们能够获取足够数量的 珍贵蛋白质，蛋白质结晶学的研究和应用有了很大的改变。现在，x 射线衍射方 法用到的蛋白质大多数都是从重组原料中获得，并且纯度越来越高，结晶的重现 性比以前得到了很大的提高毫无疑问，这两方面使x 射线结晶学得到了很快 的发展，进一步吸引了生物化学家，分子生物学家的注意陋一。 为了理解细胞内的动力学机理和细胞对外界信号的响应，我们首先要描绘出 分子是如何对化学和物理作用力响应，响应如何调节，以及响应是怎样通过聚集 的层级和更高级的结构来进行传递。这就要求我们确定生物体内大分子的结构以 及它们聚集和作用的原理结构生物学家希望在分子甚至原子水平上描述所有的 生物系统，而这只能通过x 射线晶体学来解决近二十年来，分子生物学的发 展以及它各个领域的应用很大程度与从原子水平对大分子结构的认识有关。这主 要包括蛋白质，另外，还有核酸，病毒，以及其他大分子复合物和聚合体。目前， 基因工程的成果已经确定了大部分蛋白质一级结构序列，接下来就是这些蛋白质 中山大学硕士学位论文张承 三维结构的确定。这个过程还只是处于初级阶段。 由于x 射线衍射分析技术在生物大分子领域的应用，以及核磁共振、蛋白 质结构预测等技术在蛋白质结构分析中的应用，2 0 世纪末又诞生了一门新兴学 科结构生物学。该学科是以生命物质的空间结构的运动性为基础来阐明生命 活动本质的- - n 学科。在人体基因组定位之后，它又发展成为结构基因组学或结 构蛋白质学，其目的就是获得全部蛋白质的三维结构与功能的关系。 蛋白质三维结构的确定不仅促进了生物化学的基础研究，它也在生物技术上 有重要的价值。它是合理的发现和创造新型药物的基础【s 9 j ，而这种发展新药的 方法目前正广泛的应用于各个主要的制药企业和生物技术公司。假如在新陈代谢 和调节过程中重要的酶的活性位点的结构可以得到确定，那么抑制或影响这些酶 的行为的化合物如药物，就可以合理的被设计出来。生物技术上又一个重要的方 法一蛋白质遗传工程也需要蛋白质的三维结构作为基础。尽管d n a 的重组技 术可以改变和修饰蛋白质，但通过x 射线晶体学确定的蛋白质三维结构则为合 理的和有目的的修饰蛋白质提供了结构向导，从而取代了随意改变氨基酸的方 法。 目前出现的低温结晶技术【1 0 l ，有着高光子计数效率的c c d 面探测器【1 1 1 ，高 强度的同步加速器x 射线源1 1 0 1 2 1 以及新的相角解决方法大大扩展了x 射线衍射 在蛋白质晶体结构确定方面的应用。 1 1 2 蛋白质晶体的性质 传统的小分子晶体有比较强的晶格力，高度有序，大多数硬而脆，容易处理， 可以暴露于空气中，对x 射线衍射强。与小分子晶体相比，蛋白质晶体则体积 较小，非常柔软，易碎，脱水则容易碎裂，对x 射线衍射能力相对较弱。它们 对温度非常敏感，长时问暴露于辐射下晶体会损坏。蛋白质晶体中平均包含5 0 的溶剂，蛋白质或者核酸占据了剩下的位置。所以，整个大分子晶体是一个被 许多空间渗透的有序的凝胶体，其中溶剂和其他小分子可以在这些空间自由的扩 散。 溶剂渗透在晶体中是造成蛋白质晶体衍射能力差的重要原因。但正是由于在 2 鸡蛋白溶菌酶绪晶学研究 蛋白质晶体中蛋白质周围被溶剂( 主要是水) 包围这种模式下，在结晶的过程中， 溶液中的离子，配体，底物，共酶，抑制剂，药物或其他分子可以通过自由扩散 进入或离开晶体。这就使得蛋白质在晶体中的结构和生物化学性质和其在溶液中 保持一致。也就是说，用x 射线衍射确定的蛋白质的原子三维结构，可以代表 蛋白质在生物体内的溶液中的状态，这无疑具有重大的意义。 蛋白质晶体的性质决定了其对x 射线衍射的低强度，得到高质量的蛋白质 晶体成为了蛋白质结构确定的瓶颈问题。目前生物大分子单晶的培养还没有上升 到理论高度，主要依赖于经验。然而结晶毕竟是分子的有序化排列过程，在结晶 原理上与小分子结晶是基本一致的。 1 1 3 影响蛋白质结晶的因素 蛋白质结晶的条件很多时候是复杂的，影响蛋白质结晶的条件有很多，我们 通常能够改变的有：蛋白质的纯度；溶液的p h 值；缓冲溶液；蛋白质初始浓度； 有机溶剂；盐或离子；去垢剂；温度其他的因素比如重力，压力，环境的振荡 等也会对结晶造成影响，但我们通常是无法控制的。有时候蛋白质和一个配体或 底物结合会很容易结晶 1 1 4 蛋白质结晶的方法和策略 蛋白质结晶就是一个使溶液过饱和，成核，生长的过程根据使溶液成为过 饱和状态的方式不同，在实际中用到的结晶方法可以分为【1 1 ：微池法 ( m i c r o b a t c h ) ，蒸汽扩散法( v a p o rd i f f u s i o n ) ，液液扩散法( b e ei n t e r f a c ed i f f u s i o n ) ， 透析结晶法( c o n c e n t r a t i o nd i a l y s i s ) 其中蒸汽扩散法( 如图1 1 ) 可以分为坐滴 法( s i t t i n gd r o p ) 和悬滴法( h a n g i n gd r o p ) 以上各种方法各有利弊，方法的选择 主要由所涉及到的蛋白质和实验者的偏好而定蒸汽扩散由于操作相对简便，便 于实施而得到广泛应用。目前，蒸汽扩散法已经可以进行大规模的自动化操作， 这无疑缩短了得到蛋白质晶体的时问 3 中山大学硕士学位论文张承 图1 - 1 蒸汽扩散法( a ) 悬滴法( b ) 坐滴法 得到某种蛋白质结晶的条件有时是一个相当漫长的过程，它可能持续数个月 甚至数年。在实际应用中，为了得到一个可以上机测试的高质量晶体，结晶的策 略通常需要两个步骤【1 3 】。 ( a ) 筛选。通过筛选确定结晶的化学和物理条件。蛋白质结晶是摸索的过程， 因为结晶的条件是很难预测的，并且不是每一种蛋白质都可以找到结晶的方法。 到目前为止，蛋白质结晶仍然是一个经验性很强的过程。这个步骤通常是利用多 个条件组成的矩阵来进行筛选。现在市场上有专门的蛋白质结晶条件组出售，它 们是通过大量的经验总结出来的适合于一般蛋白质结晶的条件。例如h a m p t o n 公司推出的“c r y s t a ls c r e e n 就是一个4 8 条件的筛选。 优化。第一个步骤筛选出来的结晶条件往往还需要进一步优化才能得到可 测试的晶体。在某种条件下一旦得到了蛋白质的晶体，甚至是微晶，这个步骤就 开始了。得到晶体的条件中的每一个组分都要被考虑在优化的范围之内。例如， 缓冲溶液，盐，p h ，温度，蛋白质的浓度，添加剂等。这些都会对晶体的质量 有影响。通过交叉矩阵改变这些参数的量，来得到最好晶体的条件。这是一个耗 时和枯燥的过程。 在经过优化的条件下，我们将得到体积较大，各个面平滑，棱角分明，具有 一定的衍射能力的单晶，如图1 2 。 4 鸡蛋白溶菌酶结晶学研究 图1 - 2 蛋白质的单晶 1 2 x 射线衍射确定单晶结构的基本原理和步骤 x 射线结构分析是一门以物理学为理论基础，以计算数学为手段来研究晶体 结构与分子几何的交叉学科，包括单晶和粉末两大分支。从研究对象上可分为小 分子与生物大分子两部分0 5 1 。x - 射线衍射技术经过几十年的发展，成为当前确 定固体物质微观结构最强有力的手段。 分子中原子间的问隔距离一般在1 0 0 - - 3 0 0p m 之间，而可见光的范围为3 0 0 - - 7 0 0 h m 因此光学显微镜无法显示分子结构图像。晶体具有三维点阵结构，能 散射波长与原子间距相近的x - 射线。入射x 光由于晶体三维点阵引起的干涉效 应，形成数目甚多、波长不变、在空间具有特定方向的衍射。测出这些衍射的方 向和强度，并根据晶体学原理就可以推导出晶体中原子的排列情况 x - 射线晶体结构分析所依赖的物理原理是x - 射线衍射现象，衍射现象的产 生是x 一射线与组成晶体的原子核外电子相互作用的结果x - 射线衍射是劳厄 ( l 硼c ) 等人在1 9 1 2 年发现的。用二维模型作为起点研究x - 射线与晶体相互作用 的关系( 如图1 - 3 ) ，就是著名的布拉格方程，即公式( 1 1 ) 2 d h k l s i no = n 公式( 1 - 1 ) 式中d 为晶面( h k l ) 间距，0 为衍射角，n 为衍射级数， 为x 射线波长 布拉格方程可以简化成以下形式 s i n0 - - k 2 。1 d h l d 公式( 1 - 2 ) 5 中山大学硕士学位论文张承 图1 3 布拉格方程二维模型 - - - - - - _ 这样在一张x 射线衍射图中，同一晶面族的每个衍射点之间的距离正比于 s i n0 和1 d h k l 。晶格与其衍射图有数学上的倒数关系。 通常，x 衍射的分辨率与衍射线的波长和最大衍射角有关，一台仪器的最大 分辨率是一定的，即x 2 ，角度测量的越高，分辨率越大。 大分子结构确定的基本流程如下： 1 蛋白质单晶的培养目的是得到有足够分辨率衍射能力的单晶，衍射能力 与晶体的大小，形状等有关。好的晶体要有足够的大小，最好是块状，能够在三 个方向衍射。 2 数据的收集数据包括衍射指标，衍射角度，衍射点强度及其背景的强度 等等。大分子晶体的数据收集一般使用的都是面探测器。 数据收集时，要对数据收集的一些参数进行设置。主要有： 晶体与探测器的距离：距离太小，衍射点会重叠；距离太大，衍射强度会降 低。大分子由于晶胞很大，距离设置的一般比小分子要大，在7 0m m 以上。 曝光时间：曝光时间越长，衍射数据强度越高，但背景噪声也会增加。它应 该根据晶体衍射能力大小进行调整。 单幅图像的扫描角度：对于大分子来说，扫描角度一般可设置为1 。 分辨率：蛋白质晶体的衍射较弱，分辨率不高。一般来说，4 a 可以确定二 级结构和一些a 碳原子；3 - 2 5a 可以确定大部分的残基的q 碳原予和侧链，以 6 鸡蛋白溶菌酶结晶学研究 及一些羰基氧；2 5 砣a 可以确定大部分的羰基氧原子的位置，也就是可以确定 主链的构象以及一些残基的侧链；2a 或以上的分辨率则可以确定大部分的残基 侧链构象和结合水的位置 3 数据的还原与校正数据收集完成后，x - 射线衍射强度等原始数据必须经 过处理和校正产生相应的可以用于结构解析的值。而x - 射线通过晶体时，强度 会因弹性散射，非弹性散射，离子化等削弱，产生所谓的吸收效应，它与x 射 线通过的路径长度有关。如果晶体不是球形，透过率便不同，所以必须进行吸收 校正 4 晶体结构的解析它的核心问题就是相角的解决，大分子相角问题的解决 方法主要有p a t t e r s o n 法，多重同形取代法( m l r ) ，多波长非寻常散射法( m a d ) ， 分子置换法( m r ) ，直接法等 事实上，大多数的结构都可以采用分子置换法解决，这是因为m a d 法和 m i r 法都需要制备蛋白质晶体的重原子衍生物，而这不是一项容易的工作。如 果已知了一种生物体来源的某种蛋白质的结构，要解决从其他物种提取的这种蛋 白的结构，或者已知某种蛋白质的一种晶型的三维结构，要解决它的另外一种晶 型的结构，就可以用分子置换法。它是利用已知的结构作为初始的模型来找到新 的晶体的取向，从而解决晶体的结构。条件是模型与待测蛋白之问要有3 0 以 上的序列一致性。 结构解析后，分子中的任意原子i 都可以用坐标g i ( i y b 劢来表示 5 结构精修这个步骤用来获得更精确的结构数据，降低观察强度值与计算 强度值之间的偏差晶体学上引入了r 因子来评估这个偏差。 精修之后，要对结构进行检查，一切如果合理，大分子的结构就基本确定了 1 3 鸡蛋白溶菌酶研究进展 1 3 1 溶菌酶简介 溶菌酶( i y s o z y m e ) 是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁 溶解酶1 9 2 2 年弗来明( f l e m i n g ) 发现在人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细 7 中山大学硕士学位论文 张承 胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。此后人们在人和动物的多种组 织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。溶菌酶广泛存在于家 禽和鸟类的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、白细胞及其他体 液( 如淋液) 和组织( 如肝、肾) 细胞内。从大麦、芜青、无花果、木瓜和卷心 菜、萝h 等植物中也能分离出溶菌酶，其中以蛋清中含量为最高( 约含0 1 3 ) 。 溶菌酶有很多的应用价值【1 6 】。在食品工业上，溶菌酶由于其无毒、无害，且 具有一定的保健作用和一定的溶菌作用，因此可用作食品防腐剂。在医学上，溶 菌酶作为酶类抗菌药，能参与多糖代谢，具有多种药理作用。它具有抗菌、抗病 毒、抗肿瘤的功效。在酶工程上，利用溶菌酶专一性水解细胞壁的特点，可以了 解细胞壁的构造。在蛋白质结晶学上，它作为模型来研究蛋白质晶体学的原理。 近年来，溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少的工具酶，用以制造和提取 菌体内的活性物质如核酸、酶及活性多肽等。 1 3 2 鸡蛋清溶菌酶的性质和结构及其作用机理 鸡蛋清中溶菌酶( h e n e g gw h i t el y s o z y m e 以下简称i - i e w l ) 是动物溶菌酶 的典型代表，是溶菌酶群中重要的研究对象，也是目前了解最清楚的溶菌酶之 一。它的等电点为1 1 1 ，最适溶菌温度为5 0 ，最适p h 值为7 。其化学性质非 常稳定，在p h4 7 的范围内，1 0 0 处理1m i n 仍保持原酶活性，但在碱性环 境中该酶对热稳定性较差【切。在干燥条件下溶菌酶可以长期在室温下存放，其纯 品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定形粉末、无臭、味甜，易溶于水，遇碱易 被破坏，不溶于丙酮和乙醚等。 不同来源的溶菌酶的一级结构氨基酸的数量是相同的，但在多肽链上个别氨 基酸有差异，因此，它们的分子量各不相同。1 9 6 3 年，j o l l e sj 等【1 8 】对鸡蛋白溶 菌酶的化学结构做了细致的研究，测定了鸡蛋清溶菌酶的一级结构序列。其分子 是由1 2 9 个氨基酸组成的单一肽链，2 2 0 0 个原子，分子量为1 4 0 0 0 。分子中含有 八个半胱氨酸，多肽链折叠使一对半胱氨酸相互靠近，形成了四对二硫键( 残基 6 1 2 7 ，3 0 一1 1 5 ，6 4 - - 8 0 ，7 6 9 4 ) ，多肽链内的g l u 3 5 残基与a s p 5 2 残基与酶 的活性有关，多肽链的氨基末端是l y s 残基，羧基末端是l e u 残基，如图1 - 4 1 1 9 1 8 鸡蛋白沼菌酶结晶学研究 k e y ：- b a b e - ie x t e n d e ds t r a n d ，r 1 - t ：u m ，瞿电蕞睁占q t 辩殴ld i s u l f i d eb o n d 、，、，、，l a i p h ah e i i ，、，认产3 1 0h e l l x ，、，、产，p ih e f t 也 u r e v e ao u tr e s i 口u e s1 3 a v on os r r u c 乜j r a ii n t o 丌n a 口o n 图1 4h e w l 的一级结构序列 h e w l 是第一个弄清楚其三维结构的酶。1 9 6 5 年，b l a k e 2 0 l 和他的同事首次 通过x 射线衍射的方法确定了h e w l 的三维结构它是在二级结构单元基础上 再经盘绕成紧密折叠的4 5x3 0 3 0k 3 椭球形结构；其中含有三个n 螺旋，三个 3 t o 螺旋，另有一部分肽链回折成一段反平行式b 折叠结构，其余肽链为无规则 线圈( 1 0 0 p ) 在椭球形结构中，二级结构的肽链生成后，在无规则线圈处自身折 叠时几乎所有的氨基酸侧链上的极性亲水基团都朝向外，处于球形分子表面，而 所有的疏水性侧链氨基酸则避开溶剂聚集在分子的内部。在酶椭球形的表面上有 一个明显的狭长裂隙。实验证明，此部位是酶的活性中心所在地【2 溶菌酶具有分解细菌细胞壁中肽聚糖的特殊作用。细菌的细胞壁由胞壁质组 成，胞壁质是由n 乙酰氨基葡萄糖( n a c e t y l a l u c o s a m i n e ) 及n - 乙酰胞壁酸 ( n - a c e t y h n u r a m i ca c i d ) 交替组成的多聚物。胞壁酸残基上可以连接多肽，称为肽 聚糖( p c p t i d o g l y c a n ) 多糖以直链形式存在，彼此邻近的多糖链之间可以通过 肽链部分相互连接，从而形成三维结构溶茵酶的活性中心是天门冬氨酸和谷氨 酸，溶菌酶通过其肽键中第3 5 位的谷氨酸和第5 2 位的天门冬氨酸组成的活性部 位水解破坏组成微生物细胞壁肽聚糖分子的n 乙酰胞壁酸( n m ) 与n - 乙酰葡 萄糖氨( n a g ) 之间的p 1 ，4 糖苷键，使细胞因渗透压不平衡引起破裂，从而 导致菌体细胞壁溶解而起到杀死细菌( 尤其是球菌) 的目的【2 2 1 9 笔 中山大学硕士学位论文张承 1 3 3 溶菌酶晶体生长的研究 1 9 4 6 年a l d e r t o n 报道了四方晶系的溶菌酶晶体。后来，p u s e y 瞄1 用接种法 测量了溶菌酶溶解度随温度的变化。r o s c n b c r g e r f 2 4 i 用配液法测量了溶菌酶溶解 度和p h 值的关系。在此基础上，h o w a r d 2 s l 测定了不匾 n a c i 浓度下溶菌酶的溶 解度。2 0 世纪8 0 年代初，人们已经得到溶菌酶溶解度随温度、p h 值变化的三 维曲面图。1 9 9 1 年，r i c s k a u t t 和d u c r u i x l 2 6 l 测定了鸡蛋白溶菌酶在各种条件变化 下的溶解度曲线，并且说明了h e w l 在不同的盐中的溶解度大小顺序。 s c n 4p t s i n 0 3 b f c r 9 5 。提取于鸡蛋白，经过三次结晶，透析， 制成冻干粉末。在以后的结晶实验中没有进一步对蛋白质提纯。 水：三蒸蒸馏水 各种有机物无机物，国内各大化学试剂厂生产 主要仪器： 光学显微镜，型号s z 6 1 ，放大倍数：9 倍，o l y m p u s 公司。 移液枪，1 1 0l il ，g i l s o n 公司，5 5 0 t tl ，2 0 2 0 0 i il ，1 0 0 1 0 0 0 i il ， t h e r l e l e c t r o n 公司 2 4 孔结晶板，硅化的盖玻片等 2 1 2 悬滴法原理与方法 此法是摸索蛋白质结晶条件最常用的方法，因为它不但可以节省样品而且还 可以有效利用储存空间，适用于一次进行多条件的筛选。悬滴法是在封闭的环境 中，应用气相扩散原理，使任何挥发性的组分在小液滴和大样品池之间达到气液 平衡，使蛋白质液滴中沉淀剂及蛋白质的浓度逐渐增加，达到过饱和状态，最终 析出晶体。 蛋白质溶液a 的配制，用水或者缓冲溶液溶解一定质量的蛋白质固体粉末， 配制成一定浓度。浓度采用质量体积比。为方便计算，忽略溶解过程体积的改 鸡蛋白溶菌酶结晶学研究 变。配置好的蛋白质溶液一般在2 0 c 冰箱中冷冻保存 结晶溶液b 的配制，一般是各种沉淀剂( 可能有多种) ，一定p h 值的缓冲 溶液的混合溶液，有时候还要加入添加剂。混合前先配好要用到的溶液的高浓度 的贮备液接着按照结晶溶液各个组分的浓度计算用到的各种组分贮备液的体 积，并依次加入结晶板的孔中，混合均匀我们一般配成每个孔结晶溶液的的总 体积是6 0 0 ”l 溶液 操作步骤，如图2 - 1 ： a ：在结晶板的孔边缘涂上适量的凡士林，其作用是粘贴盖玻片。 b ：在孔中依次加入计算好的一定体积的各种溶液，总体积6 0 0pl ，混合 均匀，此为结晶溶液b c ：撕开盖玻片两边的保护薄膜，使用吸耳球吹气除去盖玻片上可能带有的 灰尘。 d ：用移液枪在盖玻片上滴2 ul ( 最大不超过1 0 i il ) 的蛋白质溶液a ，接 着从孔中吸取等量的结晶溶液b 与蛋白质液滴混合。 c ：翻转盖玻片，使其小心的平铺于孔上，并使其与孔边缘紧密结合，务必 使其密封 f 在一定温度的培养箱保存结晶板，定期观察并记录晶体的生长情况。 匕严j 硅化董玻片 篓晏溶衲 ) 液漓 一 a bc 图二1 悬漓法流程 丸硅化的盖玻片；融蛋白质溶液a 与结晶溶液b 在盖玻片上混合：c ：翻转盖玻片， 并使孔密封 2 1 3 晶体的观察 1 7 中山大学硕士学位论文张承 所有的晶体观察是通过光学显微镜进行的，观察的结果根据晶体生长情况于 专用的蛋白质结晶记录纸上记录“澄清”，“沉淀”，“分层”，“微晶”，“片状晶体”， “针状晶体”，“大晶体”等现象。 晶体的照片由c a n o na 6 2 0 数码相机拍摄，晶体的测量和照片上的标准尺 寸由s p o t a d w 澍c e d 软件处理。 一个星期内每天观察，以后每一个星期观察一次。 2 2 四方h e w l 结晶条件的优化 一般来说，液滴中蛋白质的总量是一定的。晶体的晶核过多，生长速度过快， 会产生大量的小晶体，而不是形成少数的体积较大的晶体。而晶体的大小是制约 蛋白质晶体衍射能力的重要因素。因此，控制晶核的数量对于得到高质量的晶体 来说非常重要。 h e w l 四方晶型的结晶情况已经被大量的蛋白质晶体学文献报道。其结晶 条件一般是：缓冲溶液醋酸钠，酸性p h 值，n a c l 做沉淀剂。此外，也有报道 h e w l 在m p d t 5 6 1 和硫酸氨【5 7 1 作为沉淀剂时长出了四方晶体。除了研究各个组分 对结晶的影响，还有人讨论了环境的因素的影响，例如大气压f 5 8 】和磁场【5 们。 我们以一般的条件为基础，对其各个组分条件进行了优化，并讨论了各自对 结晶的影响。 2 2 1 条件的初筛选 蛋白质溶液：4 0 ，3 0 ，1 5m g m l h e w l ，0 0 2 ( w v ) n a n 3 ( 防止蛋白质长 菌) 结晶溶液：n a c l 溶液1 ，3 ，5 ，7 ( w w ) ，n a a c o - a c o h ，0 1m ，p h 4 2 ， 4 7 ，5 2 ，5 7 。 温度；4 1 2 ，2 0 1 2 ，3 7 晶体在第二天就出现，四天内长到最大。结果发现，在h e w l1 5m g m l ， 1 8 鸡蛋自溶苗酶结晶学研究 n a c i5 ，p h5 2 ，2 0 条件下，晶体的晶核较少，晶体能够达到一定的大小 2 2 , 2 上述条件周围小范围的条件优化 蛋白质溶液：1 5m g m l h e w l ，0 0 2 ( w v ) n a n 3 结晶溶液：n a c i4 5 - - 6 5 ，n a a c o - a c o h ，0 1m ，p s4 9 - 5 3 温度；2 0 1 2 2 2 3 使用s m c h 添加剂 我们用s m c l 3 作为添加剂结晶四方晶型，希望改善晶体的质量。 在条件n a c i 浓度4 ，5 ，6 ，n a a c oo 2 m ，p 8 5 2 下分别用浓度为5 m m ， 1 0 m m 的s m c l 3 作为添加剂对h e w l 结晶。 2 3 用各种金属氯化物代替氯化钠结晶 为了研究金属离子与h e w l 的结合情况，我们选择了用多种二价，三价的 金属氯化物代替n a a 的方法结晶 使用到的金属有，二价金属盐c a c l 2 ，m g c h ，s r c h ，b a c h ，m n c h ，s n c i z ， c o c h ，n i c l z ，c u c l 2 ，z n c l 2 ，c d c h ：三价金属盐c r c h ，f c c b ，s m c l 3 ，l a c h 我们根据n a c i 体系结晶的条件进行条件的初筛选 结晶筛选条件：蛋白质溶液浓度1 5 ，3 0m g m l 二价金属离子盐浓度范围0 3 ，0 5 ，o 7m 三价金属离子盐浓度范围0 3 ，0 5m 缓冲溶液0 2m n s 3 c o - h c i ，p a4 7 ，5 2 温度2 0 在能够得到晶体的条件下，最快第二天就可以观测到晶体的出现，晶体在十 天内长到最大 中山大学硕士学位论文 张承 2 4 影响四方晶体生长的因素讨论 2 4 1 溶液p h 值 和文献报道的结剁3 1 - - 致，p h 值是影响h e w l 结晶最敏感的因素。如图2 2 ， 从晶体的照片可以观察到，在其他条件相同，p h 值分别为4 2 ，4 7 ，5 2 时，晶 核数量逐渐减少。在一个液滴中晶核的数量分别是6 8 ，3 2 ，6 个。在p h5 7 时， 晶体生长的重现性比较差。 实验结论，p h5 2 是最优p h 值条件，这时晶体的晶核数最少。 这可能是由于调节溶液中n a a c o 的p h 值会改变h e w l 表面的净电荷数， 从而改变其结晶行为。 a bc 图2 - 2p h 值的变化对晶核数量的影响。 a ：p h 4 2 ，b ：p h 4 7 ，c ：p h 5 2 其他条件n a c l5 ，h e w l l 5 m 咖l 温度2 0 c 2 4 2 溶液中n a c i 浓度 n a c l 是h e w l 结晶的沉淀剂，n a c l 浓度越高，晶体越容易出现，晶核数 目越多。n a c i 浓度过高会造成晶核太多，过低则不会产生晶体。 实验结论：n a c i 浓度为5 - 6 时，生长的晶体体积最大。 这个结果与理论是符合的。h e w i 的等电点在1 1 1 ，因此它在酸性环境下表 面带正电荷，加入n a c l 结晶时c r 与h e w l 作用使得表面的净电荷数减少，溶 2 0 鸡蛋白溶菌酶结晶学研究 解度变小，从而结晶因此增大c r 的浓度，可以增加晶核数目 2 4 3 结晶的温度 在4 c 下用与2 0 c n 样的条件结晶，发现有大量的微晶出现，晶核数目过多 这可能是由于温度降低，h e w l 的溶解度下降，结晶成核过快造成的。 在3 7 1 2 下用同样体系结晶。结果在n a c i 浓度从1 到9 的条件下都没有 观测到晶体出现。这可能是由于h e w l 的溶解度随温度的升高而增加引起的。 实验结论：2 0 c 是h e w l 在此体系下本实验室结晶的最佳温度。 2 4 4s m c h 添加剂 我们用s m c l 3 添加剂希望得到结合s m 3 + 的h e w l ，但意外的发现了s m c h 作为h e w l 四方结晶体系的添加剂，能够明显的控制晶核数量，获得大晶体， 改善晶体的质量，如图2 - 3 。在未加入s m c l 3 时，晶核数量很多，有5 0 个，在 用5m m 和1 0m m 的s m c l 3 作为添加剂结晶时，晶核数量明显得到了控制，分 别有9 个和1 4 个，并且晶体的大小增加 abc 图2 - 3s m c l 3 作为添加剂对四方h e w l 结晶的影响 a ：不加s m c i ，b z 加入5 t a m s m 0 3 ，c ：加入1 0 n 谢s m c b 其他结晶条件n a c l 6 ，p a 5 2 ，温度2 0 c 经过对n a c i 体系的条件优化后，最终得到了质量较高的h e w l 晶体，如图 中山大学硕士学位论文张承 2 - 4 ，晶体大小：0 4 x 0 2 x 0 2m m ? 优化后的结晶的条件：n a c i5 ，0 2mn a a c o 溶液，p h 5 2 ，s m c l 35 m m ， 2 0 2 4 5 金属离子 图2 - 4 ：h e w l 晶体 照片的标尺由s p o t a d v a n c e d 软件处理 在p h4 7 或5 2 ，浓度0 2m 的n a a c o - h c i 缓冲溶液中，c a c h ，m g c h ， m n c h ，c o c h ，n i c h ，e a c h ，z n c h ，c d c h ，c r c h ，s m c h ，l a c l 3 等作为沉淀 剂都得到了与用n a c l 结晶形状类似的块状晶体。晶体在1 0 天内长到最大。 经过对p h 值，金属盐的浓度，蛋白质浓度等条件优化以后，用c a c h ，m g c h ， n i c h ，e a c h ，c d c h ，s m c h 共结晶的晶体，都获得了足够大的晶体进行衍射实 验。晶体照片如图2 5 。 结晶条件分别是： h e w l - c d c l 2 晶体： 3 0m g m lh e w l ，0 2mn a a c o - h c i p a5 2 ，c d c h0 6 - 4 ) 7 m h e w l - c a 0 2 晶体： 3 0m e , m lh e w l ，0 2m n a a c o - h c lp h4 7 ，e a c ho 4 - 0 5m h e w l - m g c l 2 晶体： 2 2 鸡蛋白溶菌酶结晶学研究 图2 - 5 各种金属氯化物条件下得到的h e w 晶体 a ：瑚臣w i 正攫= 1 2 ，b ：i m w l 如c bc ih e w l - l a c l 3 ，d ：h e w l - n i a 2 ，e ：h e w i ，s m c i j 中山大学硕士学位论文张承 3 0m g m lh e w l , 0 2mn a a c o h c lp h5 2 ，m g c i z0 5m h e w l - n i c h 晶体： 1