（有机化学专业论文）新型荧光探针的合成研究.pdf

两北大学硕士学位论文 摘要 荧光探针是一种极好的生物分子传感器，具备灵敏度高反应时间迅速等特 点。近年来，随着生命科学的不断发展，荧光探针已经在蛋白质、核酸、细胞检 测及免疫分析等方面发挥了重要作用。随着合成及应用技术的不断改进，人们对 有机荧光化合物的认识和研究将不断深入，其应用范围也将不断扩大，有机荧光 探针的发展前景将越来越广阔。 本文以对羟基苯甲酸为起始原料，经由硝化、酯化、硝基还原、成环等9 步 反应合成了新型钙敏荧光探针的重要中间体。以偏苯三酸酐和取代间苯二酚为原 料，以甲基磺酸为催化剂缩合制备了三种5 ( 6 ) 一羧基荧光素，并对其进行了异构 体分离研究。基于荧光试剂在有机合成、材料科学、医学等领域越来越广泛的研 究和应用以及二茂铁独特的夹心结构所表现出的一系列特殊性质，探索了以二茂 铁为起始原料具有二茂铁基的荧光试剂的合成。 关键词：钙敏荧光探针；羧基荧光素：荧光试剂；合成 西北大学硕士学位论文 t h es y n t h e s i so fn o v e lf l u o r e s c e n ep r o b e a b s t r a c t f 1 u o r e s c e n tp r o b ei sa ne x c e l l e n tb i o l o g i c a lm o l e c u l a rs e n s o rw i t hh i 曲s e n s i t i v e a i l dr a p i df e s p o n s et i m e h lr e c e n ty e a r s ，w i t ht h ec o n t i n u o u sd e v e l o p m e n to ft h el i f e s c i e n c e s ，n u o r e s c e n tp r o b eh a sp l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei np r o t e i nr e s e a r c h ，n u d e i c a c i d sr e s e a r c h ，c e l ld e t e c t i o n ，a i l a l y t i c a l i n o c u l a t i o n se t c w i t ht h ei m p r 0 v e m e n to ft h e s y n t h e s i sa n dt e c l l i l o l o g y ，p e o p l e sa w a r e n e s so fo 玛a n i cf l u o r e s c e n c ec o m p o u n d sw i l l b e c o m ef u n h e lt h es c o p eo fi t s 印p l i c a t i o nw i l le x p a n da n dt h ed e v e l o p m e n to f n u o r e s c e n tp r o b e sw i l lb em o r ee x t e n s i v e i nt h i sp a p e r ，ak e yi n t e n n e d i a t eo fn o v e lf l u o r e s c e n ec a 2 + p r o b ew a sp r e p a r e d 丘o mp - h y d r o x y b e n z o i ca c i db yn i t r a t i o n ，i l i t r 0 - r e d u c t i o n 锄dc y c l i z a t i o ne t c 9s t e p s t h r e e5 ( 6 ) - c a r b o x y ln u o r e s c e i n e sw e r eo b t a i n e d 劬mt r i m e u i t i ca n h y d r i d ea n d r e s o r c i n o ld e r i v a t i v e su s i n gm e t h y l s u l p h o n i ca c i da s c a t a l y s t a n d i t si s o m e r s e p a r a t i o nw a s s t u d i e d b a s e do nt h en u o r e s c e n tr e a g e n t sr e s e a c ha i l da p p l i c a t i o n si n 0 r g a n i cs y n t h e s i s ， m a t e r i a l ss d e n c e ，m e d i c i n ea n do t h e rf i e l d s ， a n dt h es p e c i a l c h a r a c t e r i s t i co f o 昭a n i c s a n d w i c hs t m c t u r eo f f e n d c e n e ， t h e s y n t h e s i s o f f e 盯o c e n e n u o r e s c e n tr e a g e n t sw a se x p l o r e d k e y w o r d ： n u o r e s c e n tc a 2 + p r o b e ；c a r b o x y ln u o r e s c e ； f l u o r e s c e r e a g e m ； s y n t h e s i s 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。， 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它 相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名： 每硎乙争一指导教师签名：蝤 。训哆年多月，j 护日乞哪年多月y 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：硒抬巧 洲年 。月歹日 西北大学硕士学位论文 1 1 引言 第一章荧光探针研究进展 1 1 1 荧光探针的定义 当用紫外光或可见光照射某些物质时，这些物质吸收了某种波长的光后会 发射出波长和强度各不相同的光线，当停止照射后，这种光也随之消失，这种 光被称为荧光【1 ，2 1 。 荧光探针定义为能和个别组织特异结合而又不干扰其他组织成分自身荧光 的那些荧光化合物，为了和细胞中天然的自发荧光物质相区别，人们也曾称荧 光染料为次级荧光体，相应地把这种染色过程称为次级染色，把像卟啉这样的 自荧光物质称为初级荧光体。而现在把所有的荧光探针，不管其染色性能和对 天然荧光的影响如何，都统称作荧光探针【3 1 。 荧光探针大多是含有共轭双键体系的有机化合物，共轭双键使其容易吸收 激发光，其激发波长大多处于近紫外区或可见光区，发射波长多处于可见光区。 作为荧光探针应该具有以下特点1 3 】：第一，荧光探针的荧光必须与生物样品 的背景荧光易于区别。第二，荧光探针必须不干扰研究的主体。第三，荧光探 针主要用于生物活体或在天然生物条件下的体外样品的研究，所以荧光探针的 毒性、使用的p h 范围、生物相容性等方面都有严格的要求。 目前常使用的荧光探针主要有荧光素类、罗丹明类、香豆素类等化合物， 它们被称为“在化学反应中与无荧光的化合物之间形成化学键的物质【引。 1 1 2 荧光探针与分子结构的关系 荧光探针分子的荧光特性首先取决于其自身的分子结构，其次是环境因素 的影响。大量研究结果表明，荧光探针的性能与探针的共轭体系大小、共轭竹 键体系的共平面性和刚性程度、分子母体上取代基的种类及取代基位置和几何 西北大学硕士学位论文 构型等因素相关【5 1 。 共轭体系越大，离域电子越易激发，越易产生荧光，荧光强度往往越强。 但是芳香环或共轭体系增加到一定程度时，只是荧光发射波长向长波方向红移， 这与共轭丌键体系的共平面性和刚性有关。同一体系的芳香族化合物，线性结 构的荧光波长比非线性的长【6 1 。 强的荧光试剂除了具备大的共轭键体系还必须具备平面性和一定程度的 刚性。含有给电子取代基的荧光化合物，其荧光强度一般都会增强。这类基团 如：一n h 2 ，一n h r ，一n r 2 ，一o h ，一0 r 和一c n 。含有吸电子取代基的荧光化合物，其荧光 强度一般都会减弱。属于这类取代基的有一c = 0 ，一c 0 0 h ，一c h 0 ，一n 0 2 和一n = n 一基。荧 光体取代上重原子后，荧光减弱，而磷光往往相应增强。重原子的取代，一般 指的是卤素( c l ，b r 和i ) 的取代。芳烃取代重原子后，荧光强度一般随卤素原 子量的增加而减弱，这一效应称为“重原子效应”阴。 此外，溶液中的温度、溶剂、p h 等环境因素对分子荧光也可能会产生一定 程度的影响。 1 2 荧光探针的发展 1 2 1 罗丹明类荧光探针 罗丹明系列染料是荧烷类探针的一种，是目前应用比较多的荧光探针之一 【8 - 1 1 1 。该类探针有很强荧光，是有高荧光输出效率的荧光染料【1 2 - 1 3 1 ，常见的还有 罗丹明b 【1 舢1 8 1 、罗丹明1 1 0 1 1 9 - 2 0 1 、罗丹明1 2 3 【2 1 纠、罗丹明1 0 1 【2 5 2 7 1 等。罗丹明 b ( a ) c i 碱性紫1 0 和罗丹明6 g 【2 8 3 2 】( b ) c i 碱性红l 是非常重要的荧光染 料，不但可以作为荧光颜料和激光染料，而且常常作为其它荧光染料性能及量子 产率比较的标准。 2 西北大学硕士学位论文 r 1 只2 r 1 r 2 r 3 r 4 a c 2 h 5c 2 h 5 hh b h c 2 h 5 c h 3c 2 h 5 罗丹明b ( a ) c i 碱性紫1 0 和罗丹明6 g ( b ) c i 碱性红1 结构 目前在罗丹明类染料的研究领域有两大发展趋势【3 3 】：其一是在氨基氮原子 上接一些“天线分子，其二是在苯基羧酸基上接“天线分子 。其目的是形成 三发色团或双发色团荧光染料，通过“天线分子 对紫光能量的充分吸收，将能 量通过分子内有效的传递到罗丹明母体。 s u i 等【3 卅合成了n o c t y l o x y c a r b o n y lr 1 1 0 ( a ) 和n - a c d e v d n o c t y l o x y c a r b o n y lr 1 1 0 ( b ) ，其能有效地穿透细胞，分离和检测人类重组细胞 c a s p a s e 3 和h l 6 0 。 h 2 n h 2 n d v e d h n 、c h 2 c o o h ( c h 2 ) 7 c h 3 h n 、c h 2 c o o h ( c h 2 ) 7 c h 3 n 一0 c t y l o x y c a r b o n y lr 1 1 0 ( a ) 和n a c d e v d n 一o c t y l o x y c a r b o n y lr 1 1 0 ) r i b o u 等【3 5 】合成了( 1 一芘丁基) 一2 一罗丹明酯，它的荧光保留时间非常 长，可以对细胞中的氧气浓度进行长时间的监测。 3 西北大学硕士学位论文 h 2 n ( 17 一芘丁基) 一2 一罗丹明酯 1 2 2 香豆素类荧光探针 香豆素又名邻羟基肉桂酸内酯、1 ，2 一苯并吡哺酮或氧杂萘邻酮【3 6 1 。自从1 9 2 9 年k r a i s 首次发现了天然香豆素化合物e s c u l i n 能用来提高一些纺织品的白度 以来【3 8 1 ，一直为人们广泛研究，许多天然和合成香豆素衍生物被用于荧光增白 剂、激光染料和荧光染料等方面【3 9 4 3 1 。 由于香豆素荧光染料的结构特点，决定了该类化合物作为有机荧光试剂极 高的荧光效率和大的s t o k e s 位移等优异的特点1 4 4 1 。所以，近几年香豆素衍生物 是有机荧光试剂研究的重点之一【4 5 4 9 1 。 香豆素的衍生物己被众多的荧光化学研究者所熟悉，在它们的分子结构中 不但含有六元杂环，而且含有羰基，二者都有产生荧光的潜能，大多数的香豆素 荧光染料为黄色，带有绿色荧光【5 2 1 ，但香豆素( a ) 是无色的，且在常温下没有荧 光，但取代后的香豆素衍生物，特别是给电子基团的取代，将增加其荧光量子产 率，常见的7 。位取代基是羟基、烷基、烷氧基及烷氨基。实验证明，在3 位和4 位上引入吸电子基团，将导致吸收和发射光谱向长波方向移动。如( b ) 是无色的， 而( c ) 就是黄色【5 3 1 。 4 西北大学硕士学位论文 r 1 r 2 r 1r 2 r 3 香豆素母体( a ) 和含取代基的香豆素 罗先金等【5 4 】对新型香豆素类荧光染料进行了研究，发现在香豆素的3 位杂 环上引入磺酰胺基后，增加了杂环的吸电性，使最大吸收波长发生红移，增加 了染料的摩尔吸光系数，提高了染料的日晒牢度和耐升华牢度等性能。同时， 可通过磺酰胺基引入不同碳链的烷基，提高染料的溶解度，此类化合物有更广 泛的应用前景。 邓继勇等【5 5 】以b 一萘酚为基本原料，经r e i m e r - 砸e m a n n 反应，合成了2 一 羟基1 萘甲醛，在催化剂存在下进一步与苯乙酸进行缩合反应合成香豆素类 荧光增白剂3 苯基。5 ，6 苯并a 吡喃酮，该合成工艺反应条件温和，产品总收 率达6 5 ，纯度 9 9 。合成路线如下： h c h o 3 一苯基一5 ，6 一苯并a 一吡喃酮合成路线 智双等【5 6 】以4 。二乙氨基水杨醛为基础，用苯并氮杂环法合成了六种香豆素 类荧光试剂，该法操作简便，产品收率高，质量好。合成路线如下： r n h ， n 2 弋耐h 2 c 5 c h o o h h h 刚 h h 叫 玛 电 h 呱 呱 西北大学硕士学位论文 r ( x = o ，s ，n h ，c o n h ；y = c n ，c o o r l ，c o n r 2 r 3 ；r 1 = 取代的烷基，芳基等 ：r 2 ，r 3 = h ，c h 3 ，c h 2 c h 3 等) 苯并氮杂环法六种香豆素类荧光试剂合成路线 1 2 3 荧光素类荧光探针 荧光素及其衍生物是重要的荧光探针材料【5 7 5 引。荧光素是最早应用的荧光 探针之一。由于它在水溶液中具有较大的消光系数和较高的荧光量子效率，激发 波长处于可见光区域，不能对细胞造成严重损坏，而被广泛地应用于标记和感应 生物分子的实验【5 9 。6 1 1 。 荧光素的结构图 h 氨基荧光素是荧光素类染料中重要的荧光探针之一，其活性氨基基团能与 生物分子中羧基相结合，结合后荧光强度大大增强，因而广泛地应用于蛋白质 分析和免疫学研究。潘会英等【6 1 1 以4 一硝基邻苯二甲酸、间苯二酚、氯化锌为原 料合成了硝基荧光素，经还原得到5 ( 6 ) 一氨基荧光素。 h h 2 n 5 ( 6 ) 一氨基荧光素 6 西北大学硕士学位论文 a i t a 等【6 2 】报道合成了取代的氨基荧光素探针，可以在近红外区发光，荧光 寿命为2 3 s 。 1 3 前景与展望 h o h _ 一乏弋 h n n ， l n 八一i ! i h 取代的氨基荧光素探针 有机荧光探针作为重要精细化学品之一，以其独特的性能在冶金、农业、考 古学、矿物学、环境化学、药理学、生理学、分子生物学、细胞生物学、分子 遗传学、单个分子检测、信息科学、荧光标记、激光染料等越来越多的领域【6 3 粕】。 近年来，随着生命科学的不断发展，荧光探针已在蛋白质、核酸、细胞检测及 免疫分析等方面起着举足轻重的作用，并具有广阔的应用市场前景【6 9 1 。随着 合成及应用技术的不断改进，人们对有机荧光化合物的认识和研究将不断深入， 其应用范围也将不断扩大，有机荧光探针的发展前景将越来越广阔。 7 西北大学硕士学位论文 参考文献 【9 】 【1 0 】 【1 1 】 【1 2 】 【1 3 】 【1 4 】 【1 5 】 【1 6 】 【1 7 】 【1 8 】 【1 9 】 【2 0 】 黄晓峰，张远强，张英起，芡觉攘舒发，衣人民军医出版社，2 0 0 4 许屏，芡党韧免疫龙老染色技术反应属人民卫生出版社，1 9 8 3 李楠等，党老蔟胃应臌衣军事医学科学出版社，1 9 9 8 李晓花，马会民，董素英，房鲁学狻化学学疑2 0 0 3 ，2 4 ( 1 1 ) ，1 9 8 4 - 1 9 8 6 张华山，王红，赵媛媛，分子旋纤与捡劾铡科学出版社，2 0 0 2 贾建洪，盛卫坚，高建荣，纪乙对烈2 0 0 4 ，1 8 ( 1 ) ，1 8 - 2 2 赵德丰，张立军，杨凌宵，荣判乙纥1 9 9 7 ，3 4 ( 1 3 ) ，1 6 s o hj h ，s w 锄yk m k ，飚ms k ，e t a 1 ，死抛办e 出伽e 抛胚，2 0 0 7 ， 4 8 ( 3 4 ) ，5 9 6 6 5 9 6 9 g a oy ，l ij l ，s 1 l iz ，劬觑船e 国绷f c 口儿e 地坶，2 0 0 7 ，1 8 ( 6 ) ，6 6 7 - 6 6 9 k os k ，y a n gy k ，t a ej ，s h i ni ，z 彳聊( 劢e ，见5 d c ，2 0 0 6 ，1 2 8 ( 4 3 ) ， 1 4 1 5 0 1 4 1 5 5 r e d d i n 舀o nm ，l y t t l em ，u s 2 0 0 5 1 7 0 3 6 3 顾学军，方黎，郑海洋等，鸯子曹孑学掘2 0 0 4 ，2 1 ( 6 ) ，8 5 5 - 8 5 8 b a es ，t a ej ，死加 谢r d 咒三p 地昭，2 0 0 7 ，4 8 ( 3 1 ) ，5 3 8 9 - 5 3 9 2 郭卓，张维维，王立锋等，叨衍石丘工2 0 0 6 ，2 6 ( s 2 ) ，9 5 - 9 8 v a s ua ，e d w i n ，仇，e 珊肋，配幽v f r d n ，l e ，l f ，2 0 0 7 ，2 ( 2 ) ，1 2 7 1 3 4 m e il ，x i a n gy ，l in ，e t a 1 ，而肠咒纽，2 0 0 7 ，7 2 ( 5 ) ，1 7 1 7 1 72 2 b a s a v a 讪k ，k u m a ru r ，a n i l ，e 舶“m 以z 巧函e m 西砂，2 0 0 6 ，3 ( 1 2 ) ， 1 7 3 1 8 1 m c c a b ea f ，g r a h a md ，m c k e o w nd ，s m i t hw e ，zj 配，z 口，l 印e c 护c ，2 0 0 5 ，3 6 ( 1 ) ，4 5 4 9 高勇，田敏，张斌等，存扔纪钱2 0 0 7 ，2 7 ( 2 ) ，2 6 9 2 7 1 w a i l gz q ，l i a oj f ，d iw ，z h e nj ，曰面d ，g 口，l 把m a 出c 伽口zc 垤e 所括缈 8 1 j 1 j 1 j 1 j 1 j 1 j 1 j 1 j n 口p p 陋p 降 西北大学硕士学位论文 上e 抛糟，2 0 0 5 ，1 5 ( 9 ) ，2 3 3 5 - 2 3 3 8 【2 1 】 t 0 s ig ，c o s t a n t i n ol ，r i v a s if ，e t a 1 ，乃h m 口zd ，c 锄力切z z 础尺e 如口s e ， 2 0 0 7 ，1 2 2 ( 1 ) ，1 - 9 【2 2 】 i s t i n as b ，a n d r e at ，k es d ，w a s a i lk m 乃“聊口zd 厂肋口朋口哕& p 庇口，7 竹口c e “c 口z 鲇f e n c ：s ，2 0 0 7 ，1 0 ( 3 ) ， 3 1 9 3 3 1 【2 3 】宋剑萍，乒虏天学学期箧曹亏幻，2 0 0 6 ，3 1 ( 4 ) ，6 1 0 一6 1 2 【2 4 】包金风，刘国卿，徐群渊，乒留笏理学翅撼2 0 0 4 ，2 0 ( 1 1 ) ，1 2 6 5 - 1 2 6 8 【2 5 】赵智，丁泽军，王中平等，蔚压幼理学据2 0 0 6 ，2 0 ( 1 ) ，6 - 1 0 【2 6 】 融oe ，m o r id ，勋沈d 口咖砌勋彬砌g 口砌施奶，d ，2 0 0 5 ，2 ，1 5 7 - 1 6 4 【2 7 】 b e z r o d n y iv i ，i s h c h e n k oa a ，k o v t u ny p ，p r o s t o t ay a ，乃h 朋口zd ， 却p l i e ds p e c t r o s c o 眇( t r n n s l 口t i o n 研z h w n a lp r t 戤以n o is p e k t r o s 蛔砸) ， 2 0 0 4 ，7 1 ( 1 ) ，6 8 - 7 2 【2 8 】牛小玲，冯震，应用纪工2 0 0 6 ，3 5 ( 5 ) ，3 4 8 - 3 5 0 【2 9 】 c h e nz ，t a n gy j ，x i et t ，e t a 1 。，r d 蹦，l 口zd 厂，饥d ，e s c e ，z c p ，2 0 0 8 ，1 8 ( 1 ) ， 9 3 1 0 0 【3 0 】郭会琴，樊静，冯素玲等，刃历彻讫久学黼自然羁厶劳饲，2 0 0 7 ，3 5 ( 4 ) ， 9 5 - 9 8 【3 1 】 p a l o m i n o m e r i n or ，t o r r e s k r n j f h a nj ，l o z a d a i m 0 r a l e sr ，e t a 1 ， 肠c m “肌，2 0 0 7 ，8 1 ( 1 1 1 2 ) ，1 4 8 0 - 1 4 8 3 【3 2 】高甲友，黝褫2 0 0 5 ，2 5 ( 1 ) ，3 4 - 3 5 【3 3 】陈孔常，田禾，房等：7 鳞匆纪学儡纪毙中国轻工业出版社，1 9 9 9 【3 4 】 s u ix c ，z h a n gh z ，j o h ng ，e t a 1 ，b 如肠，簪朋台讲c a e 耽三e 纸，2 0 0 l ， ( 1 1 ) ，3 9 4 2 【3 5 】 a n n ec r ，v i g oj ，s l m o nj m ，p h o t o c h e mj ，砌d 幻6 面正彳? 幽绷，2 0 0 2 ， 1 5 1 ，4 9 5 5 【3 6 】b o i s d ep m ，m e u l yc k 吼硎死c 庇，l d 正肫w 场比如砌晰幼勋，l s 觑c 1 9 9 3 ，7 ，6 4 7 9 西北大学硕士学位论文 【3 7 】 m o e c k l ip ，d 少f 爆口，z d p t g m e ，l 坫，1 9 8 0 ，1 ，3 1 5 【3 8 】张传智，蒋春霞，王旭等，府分子槲群学与工程2 0 0 7 ，2 3 ( 6 ) ，8 5 8 8 【3 9 】高春香，刁杰，王蕾，棠群与染台，2 0 0 6 ，4 3 ( 6 ) ，5 1 5 2 【4 0 】 y o s h i n o b ua ，k e n j iy ，k h n i h i r 0s ，l e 纰船玩0 曙口，l f cc a 绷括f 秒，2 0 0 6 ， 3 ( 1 0 ) ，7 5 9 - 7 6 3 【4 1 】b o s ea k ，死加j l l p d 加以三e 地坶，2 0 0 6 ，4 7 ( 1 4 ) ，2 4 2 3 - 2 4 2 5 【4 2 】c h e n gj a ，c h a i l gc p ，c h e nc h ，l i nm s ，乃h 朋口zd 厂乃陟历e ， r 甜e 口，如，2 0 0 5 ，1 2 ( 1 ) ，5 3 - 5 9 【4 3 】 v i k t o ro ，c 己bc 死绷据说三口6 d 厂“咒dj 5 f f 0 纪c j l l ，l f 七，2 0 0 7 ，5 8 ( 9 ) ，3 2 8 - 3 3 7 【4 4 】胡建军，于艳，周春隆，耩纫霸萄纪工1 9 9 6 ，1 3 ( 6 ) ，6 - 1 1 【4 5 】厉建超，申书昌，马文辉等，纪工缈彤2 0 0 7 ，2 1 ( 1 0 ) ，7 9 【4 6 】秦省军，辛秀兰，徐宝财，当疗荔生互2 0 0 7 ，3 6 ( 6 ) ，6 2 3 - 6 2 6 【4 7 】 m a i k e lw ，r o s e n t h a ls j ，b i n n ez ，p o r t e rn a ，z 彳，1 ( 劢e m s b c ，2 0 0 6 ， 1 2 8 ( 3 5 ) ，1 1 7 2 0 - 1 1 7 2 6 【4 8 】n e h a da ，f 册砌砌以删口c p “比口，2 0 0 5 ，7 3 ( 4 ) ，1 9 5 2 1 6 【4 9 】祁刚，屠树滋，王秋娟等，尹宙药纺纪学象? 表2 0 0 4 ，1 4 ( 6 ) ，3 3 1 - 3 3 4 【5 0 】 b a k e e rh m ，觑纪，l 口“d 咒口f 乃m ，z 口z 巧函绷括砂，2 0 0 7 ，1 7 ( 3 ) ，1 9 7 - 2 0 4 【51 】l u i 舀l ，$ ，l 砌p 虎c d m 肌“，l i 矗d 舢，2 0 0 6 ，3 6 ( 1 5 ) ，2 2 0 3 2 2 0 9 f 5 2 】 b a h e k a rs s ，s h i n d ed b ，z e 打讼j l e c 咖o ，l e f f e r s ，2 0 0 4 ，4 5 ( 4 3 ) ，7 9 9 9 - 8 0 0 1 【5 3 】m o e c k l ip ，砂醯口咒d p 而即明绍，1 9 8 0 ，1 ( 1 ) ，3 - 1 5 【5 4 】罗先金，宋健，程侣柏，尹厚弹毙2 0 0 1 ，3 1 ( 6 ) ，5 4 2 - 7 4 7 【5 5 】邓继勇，易兵，夏赞成，印柒劂2 0 0 2 ，1 9 ( 2 ) ，1 3 - 1 4 【5 6 】智双，赵德丰，李海玉，棠群与荣色2 0 0 4 ，4 1 ( 2 ) ，8 7 9 0 【5 7 】 j o a n n as ，s c o t ta h ，p e t e rw ，e t a 1 ，c l l e m 妇砂b f d d ：秒f ( m 6 ，碰g 弓 a 缉踟f 枷锄州，2 0 0 7 ，1 4 ( 1 1 ) 1 2 2 1 - 1 2 3 1 【5 8 】a l 【i m i t s uo ，k 舷u ot ，t e t s u of ，i s a os ，鳓绷b 幻劬绷，2 0 0 4 ，5 ( 7 ) ， 9 5 8 9 6 3 1 0 西北大学硕士学位论文 【5 9 】 b o x i no ，m a u r e e nh ，r o n a l dlp ，面“聊口，d 厂彳g r 耙“历f m ，鲫d 而d d 函绷西缈，2 0 0 l ，4 9 ( 1 0 ) ，4 6 1 9 - 4 6 2 6 【6 0 】胡波，刘子丽，分子衫学学掘2 0 0 6 ，2 2 ( 5 ) ，3 5 4 3 5 7 【6 1 】潘会英，葛风燕，陈立功，应劈纪髯2 0 0 6 ，2 3 ( 2 ) ，1 9 3 19 7 【6 2 】k a z u l 【ia ，t a k a s h it ，y u j ik ，h i d e os ，三“聊访酷c e 咒c e ，2 0 0 7 ，2 2 ( 5 ) ，4 5 5 - 4 6 1 【6 3 】 l iy ，x uy ，q i a nx ，q ub ，z 0 印口j l l e d r d 咒k 兢，2 0 0 4 ，4 5 ，1 2 4 7 - 1 2 5 1 【6 4 】 j u n gh j ，s i n g hn ，j a l l gd o ，死加j l l e d 阳珂l e 抛坶，2 0 0 8 ，4 9 ( 1 8 ) ，2 9 6 0 - 2 9 6 4 【6 5 】k o l p a s h c h i k 0 vd m ，上彳聊劬绷勋c ，2 0 0 6 ，1 2 8 ( 3 2 ) ，1 0 6 2 5 1 0 6 2 8 。 【6 6 】t r e m b l a ym s ，s a m e sd ，d ，g 口，z i c 工e 地坩，2 0 0 5 ，7 ( 1 2 ) ，2 4 1 7 2 4 2 0 【6 7 】 n o b u l 【ik ，m a s a y o s h ii ，h i r o t a k as ，e t a 1 ，死加j l e 加，l ，2 0 0 6 ，6 2 ( 3 1 ) ， 7 3 0 7 7 3 1 8 【6 8 】 k e c y ，h a r b e r sg m ，g r a i n g e rd w ，e t a 1 ，上4 朋国绷勋c ，2 0 0 7 ， 1 2 9 ( 3 0 ) ，9 4 2 9 - 9 4 3 8 【6 9 】 y a s u t e mu ，m a k ok ，k o j i r ok ，e t a 1 ，上么历伪e 垅勋c ，2 0 0 5 ，1 2 7 ( 1 3 ) ， 4 8 8 8 4 8 9 4 1 1 西北大学硕士学位论文 第二章新型c a 2 + 敏荧光探针关键中间体的合成研究 2 1 引言 钙离子是机体的重要元素，同时作为细胞内第二信使参与包括细胞代谢、 细胞周期等多种细胞功能的调节【。钙离子在细胞功能如神经质释放、激素分 泌、肌肉收缩中都具有重要的作用。细胞钙的转运和利用及其与某些疾病发生 和发展的关系是当前生理功能微观研究中的重点之一【2 ，3 1 。精确地测定细胞内自 由钙离子浓度是生命科学和基础医学研究中的前沿课题【4 1 。近年来由于敏感的 荧光c a 2 + 指示剂的发展和计算机软、硬件技术的提高使简便、快速、多样和高 敏感性、高精确性地直接测量细胞内 c a 2 + 成为可能。 为了准确掌握c a 2 + 浓度的变化，人们发展了一系列的方法，其中应用c a 2 + 敏荧光探针测定c a 2 + 浓度是目前主要应用的方法【5 1 。 1 9 8 2 年美籍华裔科学家加利福尼亚大学的钱永健教授( r o g e ry t s i e n ) 等 合成了第一代c a 2 + 荧光探针q u i n 1 、q u i n 2 、q u i n 3 等8 种。其中仅q u i n 2 的 准确度较高，对c a 2 + 的亲和力较高，适合于静态细胞c a 2 + 的测定，但其对温度敏 感、激发波长较短、光稳定性差、离子选择性差，并且荧光强度较弱，为了除 去细胞自身荧光的影响，测定中q u i n 2 的用量要达到o 5 衄o l l 才能高出背 景荧光1 6 j 。 h 3 c h 2 c o o h ) 2 c h 3 q u i n 一2 1 9 8 5 年第二代c a 2 + 荧光探针出现，包括f u r a 1 、f u r a 2 、f u r a 3 、i n d o 1 等 6 种，其中f u r a 2 最好同。 1 2 西北大学硕士学位论文 2 c o o h ) 2 o 、 ，o c o o h i n d o l n 夕黪 v h 2 c o o h ) 2 c h 3 h 2 c o o h ) 2 c o o h f u r a 一2 1 9 8 9 年第三代c a 2 + 荧光探针出现，共计有5 种，其中f 1 u o 一3 性能最佳【8 】o h 0 2 c 、1 审叫瓤c f l u 0 3 f l u o - 4 及其衍生物【9 ，1 0 1 是2 0 0 0 年以后发展起来的c a 2 + 荧光指示剂，它是将 f l u o 3 分子中荧光发色团上2 ，7 位的c l 以f 取代后得到的f l u o 3 的同系物。其 独到之处在于考虑到f l u o 3 广泛应用于4 8 8n m 氩激光器激发的共聚焦显微镜、 流式细胞仪中，f l u o 4 在4 8 8 眦附近的吸收相对于f 1 u o 3 更大，可被4 8 8m n 的光更有效的激发，荧光强度更强。 西北大学硕士学位论文 h h 0 2 c 、 p 瓤x x = c h 3 ，f l u o - 4 ；x = f ，f l u o 一5 f ；x = c l ，f l u o - 5 c l ；x = n 0 2 ，f l u o 一5 n f l u o 一4 及其衍生物结构图 新一代的c a 2 + 荧光探针有两种形式：游离酸形式和a m 衍生物形式。游离 酸形式有较强的亲水性，不易透过细胞膜但能与c a 2 + 结合并产生荧光强度的变 化。在游离酸形式的荧光探针负性基团部位，加上亲酯的乙酰羧甲基酯后就成 为a m ( a c e t o x y m e t h y le s t e r s ，a m ) 衍生物形式。a m 衍生物形式可以透过细胞 质膜进入细胞内，随后被胞浆分解成游离酸形式与胞内游离钙结合成复合物而 使其荧光光谱发生变化，这些荧光光谱的变化通过荧光分光光度仪、荧光显微 镜等仪器测量就可以确定胞内游离钙的浓度【1 1 1 。 亲醺不黼a 2 + 邺叉h 。! 水，黼a 2 +h 3 c 7 、o c h 2 一 图2 1 荧光探针负载入细胞过程示意图 1 4 西北大学硕士学位论文 c a 2 + 荧光探针的设计合成是在对c a 2 + 高度专一的c a 2 + 螯合剂的母体上连接 适当的荧光发色团和靶向定位基团。目前广泛使用的c a 2 + 螯合剂是由e g t a ( 乙 二醇双( b 一氨基乙基) 醚四乙酸) 演变而来。b a p t a 、a p n 溘，c i s 一5 和q u i n 2 等【1 2 1 ，结构见图。 h h 0 2 c 、 尹砸x e g l 隗 h 0 2 c 、 浑弘带韵 占l 己三 h 0 2 c 、 罗瓤c h 3 c l s 。5 q u i n - 2 图2 2 常用c a 2 + 螯合剂结构示意图 螯合剂部分主要决定指示剂与c a 2 + 结合的亲和力和选择性；而荧光发色团 部分除了作为螯合剂分子上的取代基对指示剂与c a 2 + 结合的亲和力和选择性有 影响外，还主要决定试剂的光谱性能【1 2 】。 e g l a 是第一个被发现在c a 2 + 、m 矿+ 共存的体系中，对c a 2 + 具有很高选择 性的螯合剂。但e g t a 环上氮原子与h + 的结合常数p l 妇为8 9 6 和9 5 8 ，与c a 2 + 结合或离解的速度减慢，因此e g t a 作为c a 2 + 指示剂有明显的不足之处。 b a p l a 在生理条件下完全能够离子化，以b a p t a 4 形式存在，其与c a 2 + 的亲和力不受p h 值变化的影响，结合或释放c a 2 + 的速度比e g t a 高2 。3 个数 量级，而且试剂与h + 和c a 2 + 的亲和力都可通过改变苯环上的取代基而进一步调 1 5 西北大学硕十学位论文 节，并不会改变配位体的几何构型。另外，b a p t a 分子中的芳香环形成了基本 的发色团，其吸收和荧光光谱受c a 2 + 的强烈影响。但不足之处在于b a p t a 与 c a 2 + 形成络合物的吸收光谱在紫外区( 2 5 0 一3 0 0 衄) ，位于芳香氨基酸和核酸 的吸收波段下，故b a p t a 不适宜于直接作为细胞内游离【c a 2 + 】测定的指示剂。 a p t r a 试剂与m 孑+ 、c a 2 + 的解离常数分别为1 3m m 和1 8 um 。通 过对b a p t a 键合部位的剪切，使其对m f + 的亲和力提高了1 个数量级，而对 c a 2 + 的亲和力减小了2 个数量级。荧光发色团与a p t r a 连接后，显示出与 b a 盯a 非常类似的光谱响应。可以用于高含量( m m 水平) c a 2 + 的测定，但不 足的是选择性差。 q u i n 2 与b a p t a 相比对c a 2 + 的亲和力略有降低，但对m 孑+ 的亲和力却增 加约5 倍，选择性变差。这是q u i n 2 作为c a 2 + 指示剂的一个最大缺陷。 由此可见，对于高亲和力c a 2 + 指示剂，虽测定灵敏度高，能满足静息态细 胞低浓度【c a 2 + 】的测定。然而一旦细胞受到刺激使细胞内【c a 2 + 】升高至较高浓度， 或对于本身【c a 2 + 】较高的细胞器中【c a 2 + 】的测定，高亲和力试剂将趋于饱和而失 去分辨能力，此时则需要低亲和力的c a 2 + 指示剂。 改变试剂对c a 2 + 亲和力的最简单的方法就是在b a p t a 分子中引入吸电子 或推电子取代基。在b a p t a 分子中引入给电子的甲基，使试剂对c a 2 + 的亲和 力略有增加，其c a 2 + 络合物的稳定常数l o gk 稳由6 9 7 增加至7 4 ；如用吸电子 取代基溴原子则使c a 2 + 络合物的l o gk 稳由6 9 7 降至5 8 ；而以强吸电子基n 0 2 取代弱给电子基c h 3 后，亲和力降低约7 0 一4 0 0 倍，引入两个f 后，亲和力也 降低大约同等程度。 b a p t a 功能团的空间结构恰能与c a 2 + 的大小相匹配，在生理条件下可与 c a 2 + 高选择性结合，并且其可以被酯化，即将游离酸分子中羧羟基氢以乙酸甲 酯基取代，制成乙酸甲酯型( 简称a m 型) 而无损伤导入细胞。连接适当的荧 光发生团并通过改变具有配位功能的螯合剂部分或与之相连的荧光发生团结 构，即可获得具有不同性能的c a 2 + 荧光指示剂。当前国际上最广泛使用的仍然 是n u o 3 和f u r a 2 。而这些试剂均存在某些不足。合成新的整体性能优良的c a 2 + 荧光探针是十分重要和迫切的。本论文在b a p t a 母体上连接荧光团，设计合 1 6 西北大学硕士学位论文 成新型的钙荧光探针。设计的c a 2 + 荧光探针以对羟基苯甲酸为起始原料，经由 9 步反应完成。合成路线如下： o h c o o h 1 o h 5 c o o h 2 拿9 8 始m e n n 0 2 b r ，c l c o o m e c o o m e 3 c h 3 h 3 c o o c o o m e 南7 c o o m e x 7 h c h 3 旦 d m f h 3 c o o 9 6 4 嚣黜m e c h 3 c o o m e 山一c o o m e 命u 命 c h o c h 3 c h 3 图2 3c a 2 + 敏荧光探针中间体合成路线 1 7 8 2 h 西北大学硕七学位论文 2 2 实验部分 2 2 1 仪器与试剂 x 4 数字显示显微熔点测定仪( 温度计未经校正) ；美国螺l 埘 i n o v a 4 0 0 核磁共振仪；德国b r u k e r 5 5 红外光谱仪；英国m a i ，d i t o f 飞 行时间质谱；所用其它试剂均为市售分析纯，使用前未进一步提纯。 2 2 2 化合物2 的合成 在三颈瓶中加入n a h s 0 4 。h 2 01 1 0 5g ( 0 8m 0 1 ) ，n a n 0 36 7 9g ( o 8m 0 1 ) ， 水2 0 0m l ，待其溶解后再加入反应物对羟基苯甲酸1 1 0 5 0g ( 0 8m 0 1 ) ，水浴 小心加热，搅拌下反应( t l c 监测) 。待反应完全后冷却至室温，抽滤。水乙 醇重结晶，干燥后得产物9 5g ， 产率6 4 8 5 ，m p 1 7 9 1 8 1 ( 文献【1 3 ，1 4 1 值： 1 8 3 - 1 8 4 ) 。瓜( k b r ) v c m ：3 0 0 2 ，2 6 7 5 ，2 5 5 7 ，1 4 3 0 ，1 2 9 4 ，8 6 2 ；”cn m r d ： 1 7 1 5 0 ，1 5 5 0 3 ，1 3 2 4 7 ，1