（有机化学专业论文）高效液相法测定β内酰胺类抗生素中高聚物杂质.pdf

g - 6 5 7 4 2 8 中文摘要 临床上应用的p - 内酰胺类抗生素分子量都小于1 0 0 0 ，他们本身既不 具有免疫原性也不能引发过敏反应，但当他们与蛋白、多肽、多糖等大 分子载体共价结合后或当他们自身聚合后在速发型过敏反应中，他们除 了和机体产生特异性抗体有关外，主要的生物学特性是引发过敏反应。 本文论述了b 一内酰胺类抗生素中高分子杂质的来源，以及杂质的形 成机制和结构特征；详细描述了在产品质量控制中如何用高效液楣方法 ( h p l c ) ，替代中国药典2 0 0 0 版中柱色谱法来控制高分子杂质的总量， 以及影珥句分离效果的因素。 高效液相方法与柱色谱法比较有很多优势，从经济角度出发，能大 大节省费用；从效率角度出发，能极大节省时间；从准确度出发，该方 法重现性好，精确度高：并且该方法操作简单，对人员要求不高。以上 几点都更适合大型企业的大生产的要求。 关键词：b 一内酰胺类抗生素高分子杂质高效液相方法( h p l c ) 黑龙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ea n t i b i o t i c sm o l e c u l a rw e i g h to f l 3 - l a c t a ms p e c i e sa r ea l l l e s st h a n 10 0 0i n c l i n i c t h e y n e i t h e r p o s s e s si m m u n o g e n i c i t y n o t a r o u s i n g a n a p h y l a c t i cr e a c t i o n b u tw h e nt h e yc o m b i n ew i 也m a c r o m o l e c u l ec a r r i e r i n c l u d i n g p r o t e i n ，p o l y p e p t i d e a n d p o l y s a c c h a r i d e ，e t c ，o r t h e y a u t o 。p o l y m e r i z e ，t h ep r i m a r yb i o l o g yp r o p e r t y i s t h e y c a na r o u s et h e a n a p h y l a c t i cr e a c t i o nb e s i d e sp r o d u c i n gs p e c i f i ca n t i b o d yw i t ho r g a n i s mi n i m m e d i a t er e a c t i o n t h i s p a p e r d i s c u s s e st h e o r i g i n o fm a c r o m o l e c u l e i m p u r i t i e s o f 一l a c t a ma n t i b i o t i c s ，t h ef o r m i n gm e c h a n i s ma n dt h es t r u c t u r ec h a r a c t e r so f i m p u r i t i e s t h ep a p e r d e s c r i b e sh o wt oc o n t r o lt h e t o t a l q u a n t i t y o f m a c r o m o l e c u l e u s i n gh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) i n s t e a do fc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ( a sc h i n e s ep h a r m a c o p o e i a ) i nd e t a i l s ， a n dd i s c u s s e st h ef a c t o r so f i n f l u e n c i n g s e p a r a t i o ne f f i c i e n c y h p l cm e t h o dh a sm o r e a d v a n t a g e t h a nc o l u m n c h r o m a t o g r a p h y t h i sm e t h o dc a nc o s ts a v i n ga n dt i m es a v i n gg r e a t l y ，a n dt h i sm e t h o dh a s h i g h e rp r e c i s i o n ，h i g h e r a c c u r a t ea n dh i g h l y r e a p p e a r a n c e ，b e s i d e s t h i s m e t h o di se a s et o o p e r a t e ，a n d l o w e rr e q u e s tt o p e r s o r m e l t h ea b o v e s u p e r i o r i t i e s a r em o r es u i t a b l ef o rt h e p r o d u c t i o nr e q u i r e m e n t s o ft h e l a r g e s c a l ee n t e r p r i s e k e y w o r d s ：t h eb l a c t a ma n t i b i o t i c s m a c r o m o l e c u l ei m p u r i t i e s h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) 一一 第1 章引言 mi 第1 章引言 1 9 7 5 年，周恩来总理就曾批示，要找出青霉素过敏的原因所在，杜 绝医青霉素过敏而导致病人死亡的悲剧。所以在“六五”和“七五”期 间，我国都将其列入攻关项目。艰辛付出2 0 年，这个难关最终被攻克。 完成周总理遗愿的科学家名叫金少鸿。金少鸿是中国药品生物制品检定 所的副所长，世界卫生组织国际药典及药品专家委员会委员。由金少鸿 教授主持的这项研究，获得2 0 0 1 年国家科技进步二等奖，完成了周总理 的遗愿。 中国科学家经过2 0 多年的试验研究，在多次试验中发现青霉素本身 并不是过敏源，引起患者过敏的原因是合成、生产过程中弓l 入的杂质造 成的，而控制杂质含量就可以控制过敏反应发生率。中国科学家还在国 内外首次建立了凝胶色谱自身对照外标法定量测定b 内酰胺类抗生素中 高聚物，此方法成为我国对进口药品技术把关的重要指标。通过质量分 析和临床实验，青霉素高聚物含量标准初步确定为，原料中含量须在0 1 以下制剂产品在0 2 以下，超过此标准的产品容易引起过敏反应。 据路透社报道：金少鸿教授所研究的高聚物杂质控制工艺技术业已 为香港澳美、柏林化学( b e r l i n c h e m i e ) 、奥地利b i o c h e m i e 公司和韩 国希杰等国际药品中间物和制剂生产企业引进，大大提高了高分子聚合 物检测及生产技术控制水平。以香港澳美为侈i j ，其采用高聚物杂质控制 工艺技术生产的阿莫灵，选用世界上纯度最高的奥地利原料，运用金少 鸿教授的高科技，将杂质含量做到了1 以下。进入中国市场后，在北 京友谊医院、协和医院、上海华山医院等进行了万例临床安全性试验， 结论为安全可靠，没有发现一例过敏休克反应。在此基础上，卫生部批 1 黑龙江大学硕士学位论文 准阿莫灵“使用前免皮试”。由于其拿到了“安全性高”通行证，自进军 大陆市场以来，每年都以较高的速度递增。2 0 0 3 年有望突破1 4 亿粒， 大陆平均每人一粒，占有着巨大的市场份额。但是，非常令人奇怪的是， 采用该技术的国内生产企业却寥寥无几，这种技术的推广出现“墙内开 花墙外香”的尴尬局面。 第2 章b 一内酰胺类抗生素高分子杂质的分类及控制的意义 第2 章1 3 一内酰胺类抗生素高分子杂质的分类 及控制的意义 1 3 一内酰胺类抗生素( 1 3 一l a c t a m s ) 系指化学结构中具有p 一内酰胺 环的一大类抗生素，包括临床最常用的青霉素与头孢菌素，以及新发展 的头霉素类、硫霉素类、单环b 一内酰胺类等其他非典型0 一内酰胺类抗 生索。此类抗生素具有杀菌活性强、毒性低、适应症广及临床疗效好的 优点。 抗生素中高分子杂质系指分子量大于药物本身的的杂质总称，其分 子量一般在1 0 0 0 5 0 0 0 ，个别可至i 0 0 0 0 左右。其来源通常分为外源性 杂质与内源性杂质两类。 2 1 外源性杂质与内源性杂质 外源性杂质包括蛋白质、多肽、多糖或由抗生素与蛋白质、多肽、 多糖等的结合物。由于b 一内酰胺类抗生素生产工艺中都经过微生物发酵 过程，半合成产品还需要用大肠杆菌酰化酶裂解发酵产物后再通过化学 合成而得。因此在最终产品中有可能残留微量的蛋白、多肽类杂质a b a t c k e l o r 和s t e w a r t 曾分别从青霉素g 、头孢菌素c 、和7 - a c a 中分离 到具有免疫原性和引起过敏反应的蛋自类杂质。赵建西等用凝胶过滤法 从商品青霉素g 中分离到具有强致敏性的青霉噻唑多肽类杂质。 肉源性杂质系指药物自身聚合，聚合物即可来自生产过程中又可在 储存过程中形成。在储存过程中的聚合速度与温度和包装材料的密闭程 度有很大关系。不适当的用药过程也会加速聚合物的形成。如阿莫西林 黑龙江大学硕士学位论文 糖浆当采用开水冲服时其高分子杂质可增加1 0 0 倍。 2 2 对高分子杂质控制的意义与策略 l 临床上应用的1 3 一内酰胺类抗生素分子量都小于1 0 0 0 。他们本身既 不具有免疫原性也不能引发过敏反应，但当他们与蛋白、多肽、多糖等 大分子载体共价结合后或当他们自身聚合后在速发型过敏反应中，他们 除了和机体产生特异性抗体有关外，主要的作用是引发过敏反应。动物 实验表明，用不含有高分子杂质的抗生素攻击致敏动物时，动物表现出 过敏症状。由此可见减少抗生素中高分子杂质的含量是防止过敏反应的 重要途径。 综上所述1 3 一内酰胺类抗生素高分子杂质主要有抗生素与大分子的 载体的结合物( 外源性杂质) 和抗生素本身的聚合物两大类。随着现代 生产工艺的不断改进和技术水平的提高，目前产品中外源性杂质日趋减 少，而内源性聚合物却难以避免。因次控制产品中聚合物的量是当前控 制抗生索高分子杂质的重点。 由于高分子聚合物的聚合程度是不均一的，但结构不同的高分子杂 质，尽管由于分子量的不同，抗原的免疫性强弱有差异，却通常具有相 似的生物学特性，均为过敏性杂质。因此在产品质量控制中不必控制不 同结构的高分子杂质含量而只需控制产品中高分子杂质的总量。 2 3 本章小结 本文主要是对无法避免的由于药物自身聚合而形成的内源性聚合物 进行定量检测，望引起有关生产企业和临床使用部门的重视，以减少临 床中最常见的速发型过敏反应等不良反应，减轻医护人员的心理压力， 同时也减少对患者的危害。 4 第3 章b 一内酰胺类抗生素高分子杂质的测定 第3 章b 一内酰胺类抗生素高分子杂质的测定 本文建立了用高效液相色谱方法测定b 一内酰胺类抗生索高分子杂 质的方法，取代了传统的柱色谱法。采用日本岛津公司生产的液相色谱 仪，液相泵型号为l c i o a t 。，检测器型号s p d i o a 。，数据处理器型号为 7 - r c a ，液相柱采用的是葡聚糖凝胶( s e p h a d xg - 1 0 ) 作为填料，用仿外 标方法进行测定与计算，并且对该方法进行了方法验证。 3 1 分离原理 3 1 1 测定流程 供试样品一高效液相泵一色谱柱一u v 检测一数据处理。 3 1 2 分离原理 3 1 。2 。1 分子筛机制 让药物分子自由进入凝胶颗粒内部而让高分子杂质被派阻在颗粒外 部或只能部分进入较大的凝胶空隙内。 3 1 2 2 葡聚糖凝胶与溶质分子间存在的多次极相互作用 在凝胶颗粒内部，凝胶有较大的比表面积和较小的自由空间，故溶 质分子在颗粒内部较颗粒外部更易和凝胶介面接触，更易产生吸附作用， 上述因素使高分子杂质和药物分子在色谱柱上在流动相的带动下产生不 同的迁移速度从而得到色谱分离。此种色谱行为可以下列公式表示： 黑龙江大学硕士学位论文 耻糟 k 。，：分配系数 v 。：被分离物质通过色谱柱所需洗脱液体积，或称洗脱体积 v 。：柱内凝胶床中颗粒间的自由空间所占的体积，或称外水体积 v 。：柱内凝胶颗粒占有的体积和外水体积之和，或称柱床体积 对全排阻的组分洗脱峰，v o = v 。，k 。，= o ； 对能进入部分凝胶内孑l 隙的的组分的洗脱峰，v ， v o v 。，o k 。， n o 。c d n c0 , 3 1 5 3 ，p t 1 396 9 7 1 0 8 1 8 5 81 7 8 3 2 h 03 1 5 3 1 l y l1 n a i r e a1 7 自3 203 15 3 0 0 o o 0 乱 豇 恤 陬 缸 一 一 - 萋垂 罴 一 插图和附表清单 i i 附表7 头孢噻肟对照品测相对标准偏差谱图 c a l c u ta t i o nr e p o r tt c hp k n ot m ea r e a m g h t 、mi d n oc o n c煳 13 0 8 i 6 24 4 5 6 8 7 89 3 6 9 0s h1 0 1 0 1 3t b s w g j ，一一一一一 t o t a l4 4 5 6 8 7 8 9 3 6 9 00 1 0 1 3 c - r 7 ac h r o m a t o p a cc h = ir e p o r tn o = 5 3 d a t a = i ：s b z 4 2 2c 0 20 4 0 4 2 21 1 ：1 5 ：0 6 “c h ；嚣裂”槲e ”嗍：e g h tm ki d n oc o n c n a l3 58 1 6 8 4 4 2 1 0 9 29 1 7 7 9s h101 0 9 5t b s w g j t 0 1 h l 、4 4 2 1 0 9 29 1 7 7 9 c r 7 ac h r o m a t o p a cc h - i r e f d r tn o = 5 4 c ”hc p a k n l o c u “7 t i o i m n “”：nh e i g h t t3 981 6 7 4 3 3 8 2 3 78 9 1 0 8 t o t a l4 3 3 8 2 3 78 9 1 0 8 0 1 0 0 5 d a t a = i ：s b z 4 2 2 c 0 3 0 4 0 4 i 2 2l l ：3 4 ：1 2 m k 【d n o s hi c o n c 0 0 9 8 6t b 制8 00 9 8 6 黑龙江大学硕士学位论文 u u 一 5 0 。 1 口0 - 厂 8 1 7 4 $ c a l c u l a t i o nr e p o r t c hp k n ot i m ea r e ah e l g h tm ki d n oc o n c n a m e i4 78 1 7 44 4 1 4 6 8 98 9 1 6 7s hl 0 1 0 0 4t b s w g j t o t a l 4 4 1 4 6 8 98 9 1 6 7 f ， 、 c 啦7 ac h r o m a t o p a cc h = ir e p o r tn o = 5 6 一o 0 一 s 0 ，o o _ r 8 1 7 9 c a l c u l a t i o nr e p o r t c hp k n ot i m ea r e ah e i g h t 13 98 1 7 94 2 7 1 1 2 58 4 8 9 3 t o 可a l4 2 7 1 1 2 5f 1 4 f 1 9 4 2 - i 一 一 e 1 0 0 4 d a t a - t ：s b z 4 2 2 c 0 50 4 0 4 2 21 2 ：1 2 ：4 4 m ki d n 0c o n cn 删e s h l0 0 9 7 1t b s w g j 茚丽i 插图和附表清单 附表8 测定头孢噻肟钠样品中高聚物杂质谱图 头孢噻肟钠标准品图谱： d 0 5 r0 一l0 0 t5 0 8 ，5 3 2 c a l c u l a t l 0 nr e p o r t c a l l b r a t i o nw i t h f in a ls t a n d a r d c hp k n 0t i m ea r e ah e l g h t m ki d n oc o n c 128 5 3 22 9 0 8 4 2 47 3 8 5 6s1 嗍l 寸赢 + c a l l b r a t i o nd a t a l ：t b s w l d e n t i f i c a t i o n t a s l 5 i o n on a m et i m eb a n d 1t b s w g j w8 5 3 头孢噻肟钠样品图谱 7 3 8 5 6 c o n e 0 1 3 0 n a m e t b s w g j w f a c t o r ( ”f a c t o r ( 2 ) 4 4 6 9 7 7 e - 8 c a l c u l t i o nr e p o r t c h9 州? t i m e a r e a h e i g h t m k i d n o c o n ( ； n a m e ll 8 8 0 6 2 4 8 7 3 14 0 5 2h l 0 0 5 9 6t b s 鸭j w t o t a l 2 4 8 7 3 14 0 5 2 0 0 5 9 6 o 5 o 一 _ 黑龙江大学硕士学位论文 c a l c u l a t l 0 nr e p o r t ， p k n ot l 村ea r e ah e i g h tm kl d n oc o n cn a m e 288 0 6：2 0 8 4 9 73 3 7 8hl0 ，0 5 1 lt b s y g j w t o t a l2 0 8 4 9 73 3 7 80 0 5 1 1 l 插图和粥表清单 附表9 两种色谱法测定高聚物杂质图谱比较 柱色谱法测定头孢曲松钠标准品与样品中高聚物图谱 c ”hc m a l c u ；器，”融 m ki d n o c o n c t ；鬣；。滞； 。巢 t o t a l4 6 8 3 1 篮6 2 15 8 2 黑龙江大学硕士学位论文 柱色谱法测定头孢哌酮钠样品中高聚物图谱 c a l c u l t 1 0 nr e p o r t c h z t i w e * 蠊