（参考课件）中药材知母中皂苷类成分的分析.ppt

中药材知母中有效成分分析概述,中药化学袁航,1,药材概述,理化性质,化学成分结构,含量测定,检识鉴别,体内代谢,2,知母概述,【植物来源】：百合科植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根茎【本草考证】：首载于诗经尔雅神农本草经将其列为中品“味苦寒，主消渴，热中，降邪气，肢体浮肿，下水，补不足，益气”【功效】：清热泻火、滋阴润燥【临床应用】：烦热消渴、热性病高烧、肺热咳嗽、结核病发热、糖尿病、大便干燥,3,皂苷,【数量】：知母中现已有文献报道的甾体皂苷成分约有40种【含量】：在根茎中含量约为6%【分类】：据皂苷元的母核不同可分为螺甾烷类皂苷和呋甾烷类皂苷两大类。螺甾烷类：以菝葜皂苷元连接不同的糖链构成的知母皂苷A，如皂苷A-,A-等；马尔可皂苷元、新吉托皂苷元、薯蓣皂苷元等及其与糖组成的皂苷呋甾烷类：知母皂苷B，如知母皂苷B-、知母皂苷B-、知母皂苷B-等，知母皂苷E1、E2、N、O，知母皂苷H1、H2、I1、I2【结构差异】：3-位羟基连接的糖链19-位的取代基（-OH或-OCH3）双键的位置（5,6,18,19）22-位取代基有无【药理作用】：防治老年痴呆症、保护脑缺血损伤、抗凝血、抗氧化、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗炎、降血压、降血糖及降血脂等药理活性。,4,5,黄酮,6,甾体皂苷：1、苷元结晶性好，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等有机溶剂2、皂苷多为无定性粉末，易溶于热水，稀醇3、均具有旋光性，多为左旋4、具有溶血性5、皂苷的乙醇溶液可与甾醇形成难溶的分子复合沉淀物6、颜色反应：L-B,R-H反应可与三萜皂苷进行区分,双苯吡酮类：水溶性较差结构修饰：将芒果苷3-位酚羟基转化成3-ONa在4-位引入磺酸钠基，制备得芒果苷磺酸钠盐,理化性质,7,薄层色谱法,8,香草醛（3-甲氧基-4-羟基苯甲醛）-浓硫酸显色剂是薄层色谱广泛使用的一种通用显色剂应用：在挥发油、萜类、甾类和皂苷等中药成分的薄层分离中，多能显示出颜色各异的斑点未改进配制：含有1%香草醛的浓硫酸溶液缺点：粘度高喷显困难，往往使显色点呈“花斑状”，模糊不清易将薄层表面喷散，对薄层扫描定量影响很大改进方法：将浓硫酸中加入一定量的水以降低其粘度结果：70%或60%的硫酸配置的显色剂，对样品显色的灵敏度、显色速度和呈色稳定性与浓硫酸配制基本相同。现配制方法：1g的香草醛加到60%的硫酸100ml中（1%）15g香草醛+250ml乙醇+2.5ml浓硫酸（5%）5g香草醛，用10%硫酸乙醇100ml（无水乙醇）（5%）,显色剂变革,9,知母皂苷入血成分研究,10,样品前处理：30ul血浆样本，文献用量提取：乙腈蛋白质沉淀法流动相选择：乙腈1mmolL-1乙酸铵溶液(30:70，V:V)色谱柱：AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6mm150mm，5m)峰型好，分离度佳分析时间长AlltimaHPC18柱(2.1mm50mm，5m)良好峰型缩短分析时间：t（知母皂苷B-）=1.78mint(重楼皂苷，内标)=1.96min分析周期3min,血液中知母皂苷B-测定,11,含量测定,指标成分：2005版之前药典：菝葜皂苷元2010版药典：芒果苷和知母皂苷B-,HPLC-ELSD,HPLC-MS,薄层色谱扫描法,酶联免疫法,显色剂-UV,12,HPLC-ELSD,皂苷类成分大多数无紫外吸收，所以对其皂苷类成分的含量测定，目前报道常用ELSD显示器和示差折光法测定。蒸发光散射检测器是比较好的选择，它比示差折光检测器灵敏度高，而且可以用梯度洗脱的分离条件。蒸发温度和雾化气体的流速都会影响蒸发光检测器的灵敏度而影响测定。,陈千良等利用HPLC-ELSD同时测定知母皂苷A和知母皂苷C：灵敏度最佳。整个分析时间控制在25min内,13,显色剂-UV,14,目的：通过制备菝葜皂苷元多克隆抗体，建立ELISA分析方法，对知母药材中的总皂苷进行了含量分析,酶联免疫法测定知母中菝葜皂苷元的含量,步骤：1、完全抗原的合成2、动物免疫3、SAR多克隆抗体效价的检测4、标准曲线的制备5、SAR多克隆抗体交叉反应6、待检测样品制备，ELISA法含量测定,结论：SAR多克隆抗体对甾体皂苷的螺甾烷结构识别特异性强与HPLC-ELSD方法相关性良好，但样品前处理简单测定过程中不需HPLC分析时杂质峰与待测峰的分离能够实现中药多组分中单一成分的快速检测，同时可利用多孔酶标板同时测定上百个样品，适合于大批量样品快速检测的需求,多克隆抗体：多种抗原表位刺激机体免疫系统后，机体产生的针对不同抗原表位的混合抗体。,15,菝葜皂苷元（SAR）,琥珀酸酐,酯化,菝葜皂苷元琥珀酰酯(SAR-HS),活泼酯法偶联,载体蛋白BSA，OVA,完全抗原:SAR-HS-BSA免疫SAR-HS-OVA分析检测,M小,原理：,完全抗原的合成：琥珀酸酐法,16,参考文献：1.中华人民共和国药典.中华人民共和国药典委员会.北京.2010.2.陈万生,乔传卓.知母本草学研究J.中药材.1997,20(1):53-54.3.徐爱娟,韩丽萍,蒋琳兰.知母的研究进展J.中药材.2008,31(4):624-628.4.蔡飞,王维豁,高守红,等.知母皂苷及其苷元的药理作用进展J.药学实践杂志.2011,29(5):331-3355.吉星,冯毅凡.知母中皂苷类成分研究进展J.中草药.2010,41(4):附12-附156.廖洪利,王伟新,赵福胜,等.知母化学成分研究进展J.药学实践杂志.2005,23(1):12-14.7.HikinoH,etal.知母的化学成分与药理活性J.国外医药植物药分册.1992,7(2):59-618.康利平,马百平,史天军,等.知母中的两种新呋甾皂苷J.药学学报.2006,41(6).527-532.9.孟志云,徐绥绪,李文,等,知母中新的皂苷成分J.中国药物化学杂志.1999,9(4):294-298.10.匡海学.中药化学M.北京:中国中医药出版社.2003.11.周智.芒果苷药理实验研究新进展J.内科.2011,6(5):426-464.12.邓家刚,郑作义,曾春晖.芒果苷的药效学实验研究J.中医药学.2000,20(6):802.13.陈行愉,韩丽萍,梁均乐.知母甾体总皂苷中知母皂苷B的鉴别及含量测定J.时珍国医国药.2012,23(2):401-402.14.欧阳辉,黄小方,周茂福,等.知母皂苷A-、知母皂苷C对照品的制备与鉴定J.中国药房.2011,22(15):1391-1393.15.姚乾元,贾元印.香草醛-浓硫酸薄层色谱显色剂的改良J.中药通报.1986,11(7):47.16.梁均乐,韩丽萍,蒋琳兰,等.大鼠口服知母皂苷后入血成分研究J.广州医药.2010,41(3):69-72.17.王莉,贾彦波,陈方,等.HPLC-MS-MS法测定大叔血浆中的知母皂苷B-J.中国药理学通报.2010,26(8):1064-1068.18.陈千良,孙小明,王文全,等.HPLC-ELSD法同时测定知母药材中2种皂苷含量J.中国中药杂志.2011,