（植物学专业论文）拟南芥甘油二酯激酶（atdgk7）基因抗逆生理功能研究.pdf

凼东农业大学硕士学位论文 英文缩写符号及中英文对照表 英文缩写英文名称中文名称 t i t u m o u r i n d u c i n g冠瘿瘤 t d n a t r a n s f o r m i n gd n a 转移d n a c a m v 3 53 5 sp r o m o t e ro fc a l i f l o w e r花椰菜花椰病毒3 5 s 启动 sm o s o i cv i r u s子 l b l e f tt - d n ab o r d e r 左边界 r b r i 曲tt - d n ab o r d e r右边界 v i r v i r u l e n c er e g i o n 毒性区段 a b a a b s c i s i ca c i d脱落酸 n p t i in e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e新霉素磷酸转移酶i i i i c t a b c e t y l t r i m e t h y l a m m o l l o n i u m十六烷基三乙基溴化铵 b r o m i d e c e fc e f t r i a x o n es o d i u m头孢曲松钠 b p b a s ep a i r碱基对 a m pa m p i c i l l i n氨苄青霉素 r i f r i f a m p i c i n利福平 k m k a n a m y c i n卡那霉素 a t p a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e 腺苷三磷酸 d d h 2 0 d i s t i l l e d a n td e i o n i z e dw a t e r 重蒸水 b s a b o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清蛋白 d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸 r n ar i b o n u c l e i ca c i d核糖核酸 m r n am e s s a g er n a信使r n a e be t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 e c o l i e s c h e r i c h i ac o l i 大肠杆菌 d m s o d i m e t h e ys u l f o x i d e二甲基亚砜 拟南芥甘油二酯激酶( a t d g k 7 ) 基因抗逆生理功能研究 d n t p d e o c y r i b o n u c l e o s i d e脱氧核糖核苷三磷酸 t r i p h o s p h a t e i u p c rr e v e r s e t r a n s c r i p t a t i v ep c r 反转录p c r r p m r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 转分钟 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 m s m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i am s 培养基 e d t a e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i c乙二胺四乙酸 a c i d t et r i s h c i ，e d t ab u f f e rt r i s h c l ，e d t a 缓冲液 k d a k i l o d a l t o n 千道尔顿 s o d s u p e ro x i d a s ed i m u t a s e超氧化物歧化酶 m d a m a l o n a l d e h y d e 丙二醛 p r o p r o l i n e 脯氨酸 m a p k m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i n丝裂原活化蛋白激酶 k i n a s e p p 2 c p r o t e i np h o s p h a t a s e 蛋白磷酸酶2 c s t e t s o d i u m n a c l ， ir i s h c i ，e d t 缓冲 c h l o r i d e ，t r i s h c l ，e d t ab u f f e r液 s a s a l i c y l i ca c i d 水杨酸 y e p y e a s te x t r a c ta n d p e p t o n ey e p 培养基 m e d i u m x g a l 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l p5 一溴- 4 一氯- 3 吲哚p d 半 d g a l a c t o s i d e乳糖苷 t r i s t t r i s h y d r y x y m e t h y三羟甲基氨基甲烷 l a m i n o m e t h a n e 2 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学 研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出 重要贡献得个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责 任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸 质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大 学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论 文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：童也 导师签名，圭芝互一乏 日 山东农业大学硕士学位论文 拟南芥甘油二酯激酶( a t d g k 7 ) 基因抗逆 生理功能研究 摘要 甘油二酯激酶( d i a c y l g l y c e r o lk i n a s e ，d g k ) 是生物体内磷脂酸 ( p h o s p h a t i d i ca c i d ，p a ) 合成途经中的关键酶。p a 是生物膜上分子量最小 的磷脂，也是合成膜脂和脂库的一个媒介，在膜的代谢和生物合成过程中 起重要作用。同时，p a 作为动植物体内的一个脂质调节因子，参与调控 多种细胞生物学过程。关于p a 的调控作用，动物中研究比较深入，植物 中报道较少。但近几年研究发现p a 同样调控植物的生长、分化、繁殖、 激素响应，以及多种生物和非生物胁迫的信号转导过程。病原体、干旱、 高盐、冷害等多种胁迫均可诱导植物体内p a 水平的升高。生物体内源p a 主要通过2 条途径合成，目前对p l d 途径报道较多，而对p l c d g k 途径的 研究较少，植物中关于d g k 的研究相对欠缺。本实验室通过构建f 义表 达载体，转化拟南芥获得过表幽国歙7 转基因植株，分别从基因组水平 和转录水平鉴定转基因后代，对t 3 代阳性转基因植株进行抗性试验、胁迫 相关基因的半定量r t - p c r 分析，以及逆境相关生理指标的测定。主要研 究结果如下： 1 构建了p b l l 2 1 a t d g k 7 正义表达载体，利用农杆菌介导法转化拟 南芥。分别从基因组和转录水平鉴定转基因植株，基因组p c r 结果显示， 9 个拟南芥转基因植株为阳性，挑选其中5 个阳性植株进行r t - p c r 分析， 发现a t d g k 7 基因在t g l 、t g 2 、t g 4 株系中表达相对较高，t g 3 、t g 5 表达相对较低。故选取t g 2 、t g 4 、t g 5 后代进行后续生理分析。 2 不同处理下萌发率及萌发后生长状况比较发现，过表达a t d g k 7 转基因拟南芥对a b a 不敏感，1 1 t m o l l 外源a b a 处理条件下，转基因 拟南芥萌发率明显较野生型高。2 0 0 m m o l ln a c i 处理条件下，转基因拟 南芥长势明显优于野生型拟南芥，过表达a t d g k 7 转基因拟南芥抗盐能力 显著提高。 拟南芥甘油二酯激酶( a t d g k 7 ) 基因抗逆生理功能御f 究 3 植物遭受盐胁迫和水分胁迫时，胁迫相关基因p 5 c s l 、p 5 c s 2 被诱 导表达，该类基因在转基因植株中表达量明显较野生型拟南芥高。而 r d 2 9 a 的表达量在野生型拟南芥和转基因拟南芥差异不显著。推测在植物 对逆境胁迫信号的传导中，转基因植株主要是通过p 5 c s l ，p 5 c s 2 等基因 介导的通路提高植物的抗逆性。而r d 2 9 a 可能不参与该信号通路。此外， 彳肋和删b j 在转基因植株中表达量较野生型植株略低。推测，a t d g k 7 的转入可能在某种程度上削弱了a b l 2 和h a b l 的表达，进而抑制a b i l 的蛋 白磷酸酶活性。 4 在4 低温处理条件下，转基因拟南芥脯氨酸含量明显高于野生型 拟南芥。叶片s o d 活性均有增高，但三个转基因拟南芥株系s o d 活性高于 野生型植株，且差异显著。m d a 含量在低温处理后呈上升趋势，但转基 因拟南芥m d a 含量较野生型拟南芥低，说明转基因拟南芥膜脂过氧化程 度低于野生型拟南芥，膜伤害程度较轻。 5 多次试验发现，在温度、光强、光周期及水分状况相同的条件下， 过表枷缈g k 7 转基因拟南芥开花时间明显早于野生型拟南芥。 关键词：甘油二酯激酶基因；表达特性；抗逆生理功能：逆境胁迫 4 山东农业大学硕士学位论文 s t u d i e so nt h es t r e s sp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o no f d i a c y l g l y c e r o lk i n a s eg e n e ( a t d g k 7 ) i na r a b i d o p s i s a b s 仃a c t d i a c y l g l y c e r o lk i n a s e ( d g k ) ，a st h ek e ye n z y m e ，p l a y si m p o r t a n tr o l e si n t h eg e n e r a t i o no fp h o s p h a t i d i ca c i d ( p a ) a sa s m a l lm o l e c u l a rp h o s p h a t i d eo n t h em e m b r a n e ，p ah a se m e r g e da san e wc l a s so fl i p i dm e d i a t o r si n v o l v e di n d i v e r s ec e l l u l a rf u n c t i o n si np l a n t s ，a n i m a l s ，a n dm i c r o o r g a n i s m s i th a sb e e n w i d e l ys t u d i e di na n i m a l s ，w h i l et h er e s e a r c h e si np l a n t sa r el i m i t e d i nr e c e n t y e a r s ，i ti sa l s or e p o r t e dt h a tp ar e g u l a t e sm a n yi m p o r t a n ta s p e c t so fp l a n t g r o w t h ，d e v e l o p m e n t ，h o r m o n a lr e s p o n s e sa n ds i g n a lt r a n s d u c t i o ni nr e s p o n s e t ot h ee n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s m a n yb i o t i ca n da b i o t i cs t r e s s e ss u c ha s p a t h o g e ni n f e c t i o n ，d r o u g h t ，s a l i n i t y , w o u n d i n g ，c o l da n ds oo nt r i g g e r st h e a c c u m u l a t i o no fp ai np l a n ti naf a s tm i n u t e 。c o m p a r e dw i t ht h er e s e a r c h e so n t h ep l dp a t h w a y , t h ep l c - d g kp a t h w a yw a sr e p o r t e di nal e s sp r o p o r t i o n ， e s p e c i a l l y i np l a n t i no u rs t u d y , w eh a v eo v e r - e x p r e s s e da t d g k 7i n a r a b i d o p s i s g e n o m ep c r a n ds e m i q u a n t i t a t i v er t - p c ra n a l y s i sw e r eu s e d t oi d e n t i f yt h ep o s i t i v et r a n s g e n i cp l a n t s t h et 3t r a n s g e n i ca r a b i d o p s i sw e r e u s e dt ob ec o n d u c t e dw i t hs t r e s sr e s i s t a n c ea s s a ya n dr e l a t i v ep h y s i o l o g i c a l a n a l y s i s t h ee x p r e s s i o np a t t e r n so fg e n e sr e l a t i n gt o s t r e s s e sw e r ea l s o d e t e c t e d a l lo ft h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ta t d g k 7 ，a sap l a n ts u b g r o u pi id g k m e m b e r , w a sr e s p o n s e t os e v e r a le n v i r o n m e n t a ls t r e s s e ss t i m u l ia n d p h y t o h o r m o n e o v e r - e x p r e s s i o no f t h ea t d g k 7i na r a b i d o p s i sc o n f e r r e dt h e t r a n s g e n i cp l a n t sm o r et o l e r a n c et os t r e s s e s t h em a i n r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h ea t d g k 7g e n ew a sc o l o n e di n t op b t l21v e c t o ri nas e n s eo r i e n t a t i o n a n dt h eo v e r - e x p r e s s i o nt r a n s g e n i ca r a b i d o p s i sw e r eg e n e r a t e dw i t h a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o nm e t h o d t h eg e n o m ep c rh a s i d e n t i f i e d9p o s i t i v et r a n s g e n i cl i n e s ，f i v eo fw h i c hw e r ec o n d u c t e dw i t h 拟南芥甘油二酯激酶( a t d g k 7 ) 基因抗逆生理功能研究 s e m i q u a n t i t i v er t - p c ra n a l y s i s t h ea t d g k 7g e n ew a se x p r e s s e d h i g h e ri nt h et r a n s g e n i cl i n e st g l ，t g 2a n dt g 4 w h i l el o w e ri nt g 3a n d t g 5 c o n s e q u e n t l y ，t h el i n e st g 2 ，t g 4a n dt g 5w e r es e l e c t e dt ob e c o n d u c t e dw i t hp h y s i o l o g i c a la n a l y s i s 2 t h eg e r m i n a t i o nd e t e c t i o ni n d i c a t e dt h a tt h eo v e r - e x p r e s s i o na t d g k 7i n t r a n s g e n i ca r a b i d o p s i sw a sn o ts e n s i t i v et oa b a i n c u b a t e di nt h e1 2m s m e d i u ms u p p l e m e n t e d 州m1p , m o l la b a ，am a j o r i t yo ft h et r a n s g e n i c a r a b i s o p s i sl i n e sg e r m i n a t e da n dg r e wn o r m a l l y , w h i l et h eg e r m i n a t i o n a n dg r o w t ho ft h ew i l d - t y p ea r a b i d o p s i sw e r es e v e r e l yi n h i b i t e d u n d e r t h e2 0 0 m m o l ln a c lc o n d i t i o n s ，t h et r a n s g e n i cp l a n t sg r e ws t r o n g e rt h a n t h ew i l d - t y p ep l a n t s ，w h i c hi n d i c a t e do v e r - e x p r e s s i o na t d g k 7 p l a n t sm a y h a v ec o n f e r r e ds a l tt o l e r a n c e 3 w h e np l a n t ss u f f e r e df r o ms a l to rd r o u g h ts t r e s s e s ，s o m em a r k e rg e n e s s u c ha sr d 2 9 a ，p 5 c s l ，p 5 c s 2w e r ei n d u c e d i nt h et r a n s g e n i ca r a b i d o s i s l i n e s ，t h ee x p r e s s i o n so fp 5 c s la n dp 5 c s 2w e r eh i g h e rt h a nt h a ti n w i l d t y p ep l a n t s b u tt h ee x p r e s s i o no fr d 2 9 aw a sn o td i s t i n c t i tw a s s p e c u l a t e dt h a tt h et r a n s g e n i cp l a n t sm a y c o n d u c t e dt h es i g n a lt r a n s d u c t i o n v i ap 5 c s la n dp 5 c s 2m e d i a t i o n ，a n dr d 2 9 am a yn o ti n v o l v e di n t h i s p a t h w a y b e s i d e s ，t h ee x p r e s s i o n so fa b l 2a n dh a b li nt r a n s g e n i cl i n e s w e r el o w e rt h a nt h a ti nw i l d - t y p ep l a n t s a c c o r d i n g l y , t h eo v e r - e x p r e s s i o n a t d g k 7g e n em a yh a v ec u tu pt h et r a n s c r i p t so fp 5 c s ia n dp 5 c s 2 , a n d t h ea c t i v i t i e so fp r o t e i n p h o s p h a t a s et h e y e n c o d e dw o u l da l s ob e i n f l u e n c e d 4 u n d e rt h el o wt e m p e r a t u r et r e a t m e n t ，t h et r a n s g e n i cp l a n t sg r e wm u c h s t r o n g e rt h a nw i l d t y p ep l a n t s ，a n de x h i b i t e dh i g h e rp r o l i n ec o n t e n t ，t o t a l s o da c t i v i t i e sa n dl o w e rm d ac o n t e n t s ，w h i c hs u g g e s t e dt h a tt h e t r a n s g e n i cp l a n t ss u f f e r e dl e s si n j u r eu n d e rl o wt e m p e r a t u r e 5 a n o t h e ri m p o r t a n td i s c o v e r yi nt h i sr e s e a r c hi st h a tt h ef l o w e r i n gs c h e d u l e o ft r a n s g e n i cp l a n t sw a sa h e a do fw i l d - t y p ep l a n t si nt h es a m ei n c u b a t i o n 6 c o n d i t i o n s 山东农业大学硕士学位论文 k e yw o r d s ：d i a c y l g l y c e r o lk i n a s eg e n e ；e x p r e s s i o nc h a r a c t e r i s t i c s ；s t r e s s p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n ；e n v i r o n m e n t a l s t r e s s 7 拟南芥甘油二酯激酶( a t d g k 7 ) 基冈抗逆生理功能研究 1 引言 甘油二酯激酶( d i a c y l g l y c e r o lk i n a s e ，d g k ) 是生物体内磷脂酸 ( p h o s p h a t i d i ca c i d ，p a ) 合成途经中的关键酶。p a 是生物膜上分子量最小 的磷脂，也是合成膜脂和脂库的一个媒介，在膜的代谢和生物合成过程中 起重要作用。同时，p a 作为动植物体内的一个脂质调节因子，参与调控 多种细胞生物学过程。关于p a 的调控作用，动物中研究比较深入，植物 中报道较少。但近些年研究发现p a 同样调控植物的生长、分化、繁殖、 激素响应以及多种生物和非生物胁迫的信号转导过程。病原体、干旱、盐 胁迫、冷害等多种生物和非生物胁迫，均可诱导植物体内p a 水平的升高。 生物体内源p a 主要通过2 条途径合成：一是在磷脂酶d ( p h o s p h o l i p a s ed p l d ) 的作用下，磷脂酰胆碱( p h o s p h a t i d y lc h o l i n e ，p c ) 水解产生p a 和 胆碱( c h o l i n e ) ；另一个是磷脂酶c ( p h o s p h o l i p a s ec ，p l c ) 催化水解磷脂 酰肌醇( p h o s p h a t i d y li n o s i t o l ，p i ) 产生三磷酸肌醇( t r i s p h o s p h a t ei n o s i t o l ， i p 3 ) 和二酯酰甘油( d i a c y l g l y c e r o l ，d a g ) ，在甘油二酯激酶( d i a e y l g l y c e r o l k i n a s e ，d g k ) 的催化作用- f d a g 磷酸化生成p a 。目前对p l d 途径报道较 多，而对p l c d g k 途径的研究较少，植物中关于d g k 的研究相对欠缺 ( k e n j io k u m u r a e ta l ，2 0 0 4 ) 。 1 1d g k 的信号转导作用 d g k 催化d a g 磷酸化生成p a 。在植物生长发育过程中，p a 参与根分 化( 起始) 和生长有关的丝裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i n k i n a s e ，m a p k ) 的活化以及肌动蛋白的聚合等( m u n n i ke ta l ，1 9 9 6 ；j e n k i n s g me ta l ，2 0 0 5 ；m c d e r m o t tm e ta l2 0 0 4 ；t e s t e r i n kce ta l ，2 0 0 5 ) 。此外，p a 也参与介导植物的防卫反应( w a n gx e ta l ，2 0 0 4 ；w a n gxe ta l ，2 0 0 5 ；z h a n g we ta l ，2 0 0 5 ) 。催化生成p a 的酶主要有以下几种：( 1 ) p l d ，水解膜上的磷 脂：( 2 ) d g k ，磷酸化d a g ：( 3 ) 酰基转移酶，在可溶性p a 上添加脂肪酸； ( 4 ) 来自于三磷酸甘油醛( g l y c e r a l d e h y d e3 - p h o s p h a t e ，g 3 p ) 和磷酸二羟丙酮 ( d i h y d r o x y a c e t o n ep h o s p h a t e ，d h a p ) 途径的酶。但在形成p a 的4 条途径中， p l c d g k - 与p l d 是产生信号分子p a 的2 条最主要的途径( 图 山东农业大学硕士学位论文 1 1 ) ( e d u a r d og e ta l ，2 0 0 5 ) 。 p c d g k 图1 - 1p a 生成途径 f i g 1 1p a w a sg e n e r a t e db yd i f f e r e n tp a t h w a y s p a 磷脂酸；p c 磷脂酰胆碱：p e 磷脂酰乙醇胺；p g 磷脂酰甘油；p s 磷月匕酰丝氨 酸；p l d 磷脂酶d ；p k a 蛋白激酶a ；d a g - p p i 二脂酰甘油焦磷酸；l p p 磷脂磷 酸水解酶；d g k 甘油二酯激酶：p l c 磷脂酶c ；d a g 二酯酰甘油 p a ：p h o s p h a t i d i ca c i d ；p c ：p h o s p h a t i d y lc h o l i n e ；p e ：p h o s p h a t i d ) 7 l e t h a n o l a m i n e ；p g ： p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ；p s ：p h o s p h a t i d y l s e r i n e ；p l d ：p h o s p h o l i l ：i a s ed ：p a k ：p h o s p h a t i d i c a c i dk i n a s e ；d a g - p p i ：d i a c y l g l y c e r o lp y r o p h o s p h o r i ca c i d ；l p p ：l i p i dp h o s p h a t e p h o s p h a t a s e s ；d g k ：d i a c y l g l y c e r o lk i n a s e ；p l c ：p h o s p h o l i p a s ec ：d a g ：d i a c y l g l y c e r o l 1 1 1d g k 家族 p a 对冷害、盐害、高渗和微生物病原激发等均有响应，据此推测d g k 的活化与这些环境胁迫有关( r u e l l a n d e ta l ，2 0 0 2 ；g o m e z m e r i n oe ta l ， 2 0 0 4 ) 。动物和植物中都发现了编码d g k 的基因，哺乳动物中已报道9 个 d g k 同源基因，拟南芥基因组中发现7 个，酵母中尚未发现d g k 的编码基 因( d a v i d e ta l ，2 0 0 5 ；m a y u m ie ta l ，2 0 0 5 ) 。进化树分析图1 2 显示，拟南芥 i 拘d g k 家族可分为3 类( s n e d d e na n db l u m w a l d2 0 0 0 ；g o m e z m e r i n oe ta l ， 2 0 0 4 ；g o m e z m e r i n oe ta l ，2 0 0 5 ) 。第一类包括a t d g k l 和a t d g k 2 ，该类成 员含有2 个典型的d a g 结合区域，分别与n 端的基础序列和富含半胱氨酸 9 拟南芥甘油二酯激酶( a t d g k 7 ) 基因抗逆生理功能研究 的区域( e x t e n d e dc y s t e i n e r i c hd o m a i n ，e x t c r d ) 相连，d a g 的催化区和催化 辅助亚区位于c r d 区下游( t a k a h a s h ie ta l ，2 0 0 2 ；t o s h i h i k oe ta l ，1 9 8 5 ) 。 a t d g k 2 位于拟南芥基因组第v 号染色体，多类植物组织都检测到么国饼，2 基因的表达( k a t a g i r ie ta l ，1 9 9 6 ) 。第二类包括a t d g k 3 、a t d g k 4 和 a t d g k 7 。a t d g k 7 位于第号染色体，g e n b a n k 数据库可检索到4 个 爿f d 似7 的表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，e s t ) ，分别是a v 7 9 8 9 7 6 、 a v 8 2 7 6 8 2 、c f 7 7 3 8 8 2 、z 2 6 2 2 9 和2 个c d n a 序列( a f 3 6 0 1 7 4 、a y l l 3 9 1 5 ) 。 a t d g k 7 与a t d g k 2 具有4 0 的序列同源性。g e n b a n k 未检索到其它植物物 种的d g k 编码基因全长序列，但可检索至u e s t 序列，如葡萄c b 9 8 11 3 0 、 杏树c b 8 2 1 6 9 4 、番茄a w 0 3 5 9 9 5 。第三类包括a t d g k 5 和a t d g k 6 。此类 d g k 结构比较简单，不含上游的基础序列、d a g 结合区域和c r d 区域 ( g o m e z m e r i n oe ta l ，2 0 0 4 ) 。 l o 山东农业大学硕士学位论文 o 0 5 i 一j i i i 袭 i i 类 图1 2 植物d g k 的系统进化树分析 f i g 1 - 2p h y l o g e n e f i ca n a l y s i so f p l a n td g ki s o z y m e s 以上基冈在g e n b a n k 中的注册号：a t d g k ln m1 2 0 8 7 4 ；a t d g k 2n m _ 1 2 5 7 7 2 ； a t d g k 3n m _ 1 7 9 6 4 9 ；a t d g k 4 n m _ 1 2 5 1 5 2 ；a t d g k 5n m - 1 2 7 6 6 0 ；a t d g k 6 n m 11 8 9 5 3 ；a t d g k 7n m - l1 9 1 8 0 ；l e d g k la f l 9 8 2 5 9 ；z m a y l 0 6 3 2 0a y l 0 6 3 2 0 ； t a b t 0 0 9 3 2 6b t 0 0 9 3 2 6 s e q u e n c e sw e r er e t r i e v e df r o m t h eg e n b a n kd a t a b a s e ：a t d g k ln m1 2 0 8 7 4 ；a t d g k 2 n m _ 1 2 5 7 7 2 ；a t d g k 3n m _ 17 9 6 4 9 ；a t d g k 4n 丝1 2 515 2 ；a t d g k 5n m12 7 6 6 0 ； a t d g k 6n m _ 1 1 8 9 5 3 ；a t d g k 7n m _ 1 1 9 1 8 0 ；l e d g k la f l 9 8 2 5 9 ；z m a y l 0 6 3 2 0 a y l0 6 3 2 0 ；t a b t 0 0 9 3 2 6b t 0 0 9 3 2 6 s n e d d e n 和b l u m w a l d ( 2 0 0 0 ) 在番茄中克隆到一个e d n a ，命名为 l e c b d g k ，它编码一个钙调素结合蛋白，其序列与动物中的d g k 类似。 这个钙调素结合区域在l e c b d g k 的c 端有2 5 个残基( k a m a d aa n dm u t o ， 1 9 9 1 ) 。他们还分离到另一个l e c b d g k 的编码基因，它与前一个l e c b d g k 蛋白序列同源性较高，只是缺少一个钙调素结合区域。钙存在的情况下， 拟南芥甘油二酯激酶( a t d g k 7 ) 基因抗逆生理功能研究 l e c b d g k 可以与细胞膜结合，而钙调素的拈抗物则能破坏这种结合。这 表明，l e c b d g k 从可溶物到与细胞膜组分结合的转变过程中，钙的作用 是不容忽视的( s n e d d e na n db l u m w a l d2 0 0 0 ；h o u s s a e ta l ，1 9 9 8 ) 。 根据蛋白序列同源性将已分离到的9 个哺乳动物d g k 分为5 类，9 个 d g k 成员在n 木端都含有2 或3 个c r d 区域( t o p h a ma n dp r e s c o t t ，1 9 9 9 ，) 。 第一类d g k 成员包括d g k a 、d g k b 、d g k 7 ，都含有2 个结合c a ：+ 的e f 手； 属于第二类的d g k 8 、d g k h 在n 端都有1 个p h 结构域：第三类成员只有 d g k e ，该类d g k 没有调节区域，结构最为简单；第四类d g k 的c 端有1 个锚蛋白重复序列，在催化区域的上游还有1 个与m a r c r s 蛋白的磷酸化 位点同源的区域；第五类只有1 个成员d g k 0 ，它有1 个p h 结构域，但这个 结构域不同于第二类，位于c r d 区域之后，催化区域的上游( w i s s i n ge ta l ， 1 9 8 9 ) 。 d g k 的活性不仅表现在产生p a 上，也表现在消除d a g 上。在动物体 内，d a g 是个激活蛋白激酶c ( p r o t e i n k i n a s ec ，p k c ) 和其它效应因子的 一类有效的脂信号。有报道认为，动物中的d g k 通过将d a g 转化为p a ， 从而削弱d a g 的信号作用( r e g i e re ta l ，2 0 0 5 ；c d a v i de ta l ，2 0 0 5 ) 。在植物 体内，尽管还未分离到d a g 的靶蛋白，但有证据表明在磷脂酰肌醇 ( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ，p i ) 磷脂酶c 途径中产生的d a gr 范够迅速地转化成 p a 。动物中的p i p l c 有5 类：i 郊p l c l 3 、8 、和。而拟南芥中有9 个p i p l c ， 它们的区域结构类似于最简单的动物中的p l c 薯( m u e l l e r r o e b e ra n dp i c a l 2 0 0 2 ；w a n g2 0 0 4 ) 。 1 1 2p l d 家族 p l d 是水解膜上磷脂产生p a 的一个重要的磷脂酶。在许多植物中都 克隆到p l d s 基因( e l i a se ta l ，2 0 0 2 ；w a n ge ta l ，2 0 0 2 ；m e i j e re ta l ，2 0 0 3 ) 。拟 南芥中已分离到1 2 个p l d 基因，根据序列同源性和生物化学特性，将其 分为6 类，p l d a ( 3 ) ，1 3 ( 2 ) ，丫( 3 ) ，8 ，( 2 ) ( z h a n gw e ta l ，2 0 0 5 ) 。在这1 2 个p l d 成员中，1 0 个p l d s 含有一个c 2 区，该区域是c a ：+ 和磷脂结合的结构域。 而2 个p l d s 在n 端都有一个p x 和p h 结构域，而该结构域存在于磷酸 肌醇互作结构域p h o x 同系物和p l e c k s t r i n 同系物中，c 2 p l d 是植物中特 1 2 山东农业大学硕士学位论文 有的结构域，而p x p h - p l d s 不仅存在于植物中，也存在于其它的物种中。 而拟南芥中的p l d s 在结构和序列上与哺乳动物中的p l d 相类似( p l d l p l d 2 ) ，这是拟南芥中其它p l d 所没有i 拘( e l i a se ta l ，2 0 0 2 ；q i na n dw a n g 2 0 0 2 ) 。一般来说，离体条件下，c 2 p l d 区结构域水解膜脂p c 、p e 、p g ， 而p x p h 结构域主要以p c 作为底物( w a n ge ta l ，2 0 0 2 ；q i na n dw a n g 2 0 0 2 ) 。c a 2 + 、p p 2 、不饱和脂肪酸等影响了植物中不同p l d 的活性( q i n a n dw a n g ，2 0 0 2 ；q i ne ta l ，1 9 9 7 ；w a n ga n dw a n g ，2 0 0 1 ) 。 多个调节区域和分子的相互作用表明，p l d s 的活性在细胞中受到多 方面的影响。p l d s 的差异性表现在活性，底物选择，基因表达，亚细胞 定位方面，这对于从空间和时间上调节p a 的产生起到重要作用。除此之 外，p l d 也可以通过其它机制调节细胞功能，这依赖于环境刺激和胁迫的 种类，包括( 1 ) 脂质调节子的形成，如p a ，n a e ( n 一酰基乙醇胺) ，以 及其它衍生物；( 2 ) 其它蛋白的直接相互作用，如g a ，肌动蛋白，微管 蛋白；( 3 ) 改变膜脂成分；( 4 ) 膜的降解( f i o n a e ta l ，2 0 0 5 ；f r a n ke ta l ， 2 0 0 2 ) 。 p l d a l 是拟南芥中最常见的p l d ，a b a 处理下，p l d a l 产生p a ， p a 与a b i i 共同作用调控a b a 信号转导过程( z h a n ge ta l ，2 0 0 4 ) 。p l d a l 与g p a l 相互作用，影响( p a l 的功能。冻害条件下，p l d a l 选择性的 水解p c ，改变膜脂的相对数量，降解膜脂( w