（植物学专业论文）检测拟南芥cdpk基因家族表达的cdna阵列和rtpcr方法的建立.pdf

中文摘要 中文摘要 在植物细胞穰母转导过程中，缎胞质内的游离钙作为臆内纂= 信使有重要匏生理调控 功能。但钙离子通过何种机制实现其调节细胞生理活动的功能，即胞质钙离子水平变化的 下淤律瑶瓤割为嚣，基蔫迸不涛楚。纛探讨钙僖整下游砟鬻租翱豹蓄要阏踅是臻骥钙离予 作用的靶分子及其确切的生理调节功能。由于钙依赖性蛋白激酶( c a l c i u m d e p e n d e n t p r o t o i nk i n a s e s ，c d p k ) 是植物纲臆中特有的一类矗接依藏钙激滚豹蛋白激酶，所以推测 c d p k 可能作为钙信使的靶分子而参与一些植物细胞内钙信使的下游作用途径。根据对拟 南莽垒基蠢维痔舞的分析，撤离芥c d p k 超家族包括3 4 种c p k s ( c a l c i n m ，d e p e n d e n tp r o t e i n k i n a s e s ) 、8 种c r k s ( c p k - r e l a t e d p r o t e i n k i n a s a ) 以及其它一些依赖钙的相关蛋白。 势了较全面雉研究拟南芥中存在的4 2 种钙依赖性蛋白激酶( 3 4 种c p k s 和8 种c 砌矗) 所分别具有的可能功能，首先必须建立有效的检测这些蛋白激酶表达及其变化的方法。本 论文工作根攒拟南莽基因组数据库所绐出的3 4 个c p k 和8 个c r k 序列，分别尝试建立了 4 2 种钙依赖性蛋白激酶韵e d n a 阵列和r t - p c r 检测方法。对e d n a 阵列方法的杂交特异 性分析表明，当被检序列与探针序列的同源性达到8 2 时，其杂交信号强度约是撩针与其 自身杂交信号强度的3 0 。在4 2 秘被检序捌中，仪有两个序列的同澡性在8 0 以土，其 余绝太多数序耐之闯的同源性都在7 0 以下域更低。结果表明，本工作建立的e d n a 阵列 方法蠢较好的特异性，能够满足实验的要求。同时，采用r t - p c r 方法对拟南芬c d p k 基 因家族在正常或渗透胁迫条件下的袭达进行丁定性分析，初步观测到拟南芥植株中有超过 三分之二的c 糙基嚣窝c r k 基因孬在一定程度的表达。撼说弱r t o p c r 蠢法适臻于褒究 拟南芥c d p k 基因家族的低丰度表达。这些方法的摸索和尝试为j 6 一步探讨c d p k 在植物 细胞穗号转导中的捧艏机制奠定了纂础。 关键谢：钙依赖性蛋白激酶，拟南芥，e d n a 阵列，r t - p c r 茎苎塑要 a b s t r a c t f m oc y t o p l a s m i cc a 2 + ，a sak e ys e c o n dm e s s e n g e r p l a y si m p o r t a n tr o l e si n an u m b e ro f s i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y si np l a n tc e l l s h o w e v e r , t h ed e t a i l e d d o w n s t r e a mm o l e c u l a r m e c h a n i s m s b y w h i c hc a l c i u me x e r t si t se f f e c t sr o m a l n u n c l e a ran u m b e ro f c a l c i u m d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s ( c d p k s ) h a v eb e e ne x p e r i m e n t a l l yi d e n t i f i e d i nh i g h e r p l a n t sf r o mt h el a t eo f1 9 8 0 s ，a n dn o wt h e ya r ec l a s s i f i e di n t oa nu n i q u es u p e f f a m i l y i nh i g h e r p l a n t sb a s e do nt h ec o m p l e t e dw h o l e - g e n o m es e q u e n c e so f a r a b i d o p s i s ：i t h a sb o o np r o p o s e d t h a tc d p k sm a ya c ta st h ed o w n s t r e a mt a r g e t so fc a l c i u ms i g n a l st om e d i a t ec a l c i u m i n d u c e d s i g n a l i n gp r o c e s s o s c d p ks u p e r f u m i l yi n c l u d e s3 4c p k sa n d 8c r k s ( c p k - r e l a t e dp r o t e i n k i n a s 0 1 w e l la so t h e rc a l o i t t m - d e p a n d e n to n z y m e s i n a r a b i d o p s i s t h e l o n g - t e r mg o a lo f t h i ss t u d yi st oi n v e s t i g a t ep o s s i b l ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n so f o n oo r m o r ec d p k ( s ) i na ni n t e r e s t e dp h y s i o l o g i c a lo rd o v e l o p m e n t a lp r o c e s si nw h i c hc a z + - s i g n a l i n g i si n v o l v e dt h ef o c u so ft h i st h e s i sw o r kw a s 协e s t a b l i s hc o n v e n i e n ta n dr e l i a b l om e t h o d st o d e t e c t t h ee x p r e s s i o np r o f d e so f c d p k s t o t a l l y4 2c d p km e m b e r s ( i n c l u d i n g3 4c p k sa n d8 c r k s ) w o r ec h o s e nf o rt h ee x a m i n a t i o no f e d n aa r r a ya n d l l = r p c rm e t h o d sf o re d n a a r r a y m e t h o d ，t h em o s ts p e c i f i ce d n as e q u e n c ef o r e a c hc p k ( c 鼬，) w a so b t a i n e df o rm a k i n ge d n a h y b r i d i z a t i o na r r a y t hop r e l i m i n a r yr e s u l t ss h o w e dt h a tt h es p e c i f i c i t yo fe d n aa r r a yw a s h i g he n o u g ht od i s c r i m i n a t ee a c hc p k f r o mo t h e r sa l t h o u g hi tw a sn o ts u c c e s s f u lt od i r e c t l y d o t e c t t r a n s c r i p ts i g n a l sf r o ms e v e r a lm r n ae x l r a c t s a l t e r n a t i v e l y , r t 二p c rm e t h o dw a s a p p f i e dt oa n a l y z ep o s s i b l ed i f f e m a t i a le x p r e s s i o no fe a c hc p k ( c r k ) a m o n g 4 2a r a b i d o p s i s c d p k st h e t r a n s c r i p t so f t w o t h i r d so f 4 2 c d p k m e m b e r s w e r ed e t e c t e d b y k r _ p c r m e t h o d s i ti sc o n c l u d e dt h a tr r p c rm e t h o dm a yb em o r es e n s i t i v ef o rd e t e c t i n gc d p k e x p r e s s i o na t t r a n s c r i p t i o n a ll e v e la n dt h ee d n aa r r a ym e t h o dc a na l s ob eu s e di ft h ep r o c e d u r e sc o u l db e i m p r o v e d k e yw o r d s ：c d p k , a r a b i d o p s 曲t h a l i a n a ，e d n aa r r a y , r t - p c r , g o n ee x p r e s s i o n 2 第一章文献综述 第一章文献综述 植物细胞胞质游离钙离子是植物细胞信号转导过程中的重要第二信使。植物体在感受 外界环境刺激时，植物细胞多通过其胞质钙离子浓度的变化面引发细胞多种生理生化效应 ( b u s h ，1 9 9 5 ；m c a i n s i i 等，1 9 9 7 ) 。此外，在花粉管和根毛极性生长过程中其顶端存在钙 离子浓度梯度，且钙离子浓度梯度为花粉管和根毛极性生长所必须( p i e r s o n 等，1 9 9 6 ： w y i n c r 等，1 9 9 7 ：b i b i k o v a 等，1 9 9 7 ：$ e h i e f e l b e i n 等，1 9 9 2 ) 。但c a 2 + 通过何种机制实现 其调节细胞生理活动的功能，郎c a 2 + 作用的下游机制为何却尚未被阐明( r o b e r t 和 h a r m o n ，1 9 9 2 ；m c a k t s h 等，1 9 9 7 ) 。而探讨钙信使下游作用机制的首要问题是明确钙离 子作用的靶分子及其确切的生理调节功能( p e i 等，1 9 9 6 ) 。由于活细胞内的一些功能蛋白 的活性受钙离子及其浓度变化所调节，所以广义的“钙调蛋白”最有可能是钙信号的下游 作用靶分子。 1 1 钙依赖性蛋白激酶( c a l c i u m d e p e n d e n tp r o t e i n k i n a s e ， c d p k ) 钙依赖性蛋白激酶( c a l c i u m d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s eo rc a l m o d u l i n 1 i k ed o m a i np r o t e i n k i n a s e ) 超家族( s u p e f f a m i t y ) 由四类蛋白激酶组成，根据其调节因素的不同分别被分为受 c i “调节的c d p k s 、受c a 2 十或c a m 调节的c a l v l k s ( c a l m o d u l i n d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e s ) 、 受c a 2 + 和c a m 二者同时调节的c c a m k s ( c a l c i u ma n dc a l m o d u l i n d e p e n d e n tp r o t e i n k i n a s e s ) 、以及不受c a 2 + 和c a m 调节的c r k s ( c d p k - r e l a t e dp r o t e i nk i n a s e a ) ( h a r m o n 等， 2 0 0 0 ) 。 自从第一个c d p k 被发现以来( h a r m o n 等，1 9 8 7 ) ，人们已经从轮藻( c h a r a c o r r a l i n a ) ( m c c u r d y 和h a r m o n ，1 9 9 2 ) 、杜氏藻( d u n a l i e l l as a b n a ) ( g u o 等，1 9 9 0 ) 等低等植物 以及小麦( p o l y a 等，1 9 9 0 ) 、玉米( e s t r u c h 等，1 9 9 4 ) 、水稻( b r e d a r i o 等，1 9 9 5 ) 、花生 ( c h a u d h u r i 等，1 9 9 9 ) 、豌豆( l i 等，1 9 9 1 ) 、甜菜( p o b a 等，1 9 8 7 ) 、燕麦( s c h a f t e r 等， 1 9 9 2 ) 、蚕豆( l i 等，1 9 9 8 ) 、菠菜( d o u g l a s 等，1 9 9 8 ) 、拟南芥( h r a b a k 等，1 9 9 6 ；h o n g 等，1 9 9 6 ) 等高等植物中发现有各种c d p k 存在，广泛分布在各种植物的各个组织中。 3 中国农业大学硕士学位论文 另外，在某些原生生物如草履虫( p a r a m e c i u mt e t r a u r e a h a ) 和恶性疟虫( p l a s m o d i u m f a l c i p a r u m ) 中也发现存在c d p k ( r o b e r t 和h a r m o n ，1 9 9 2 ：h a r d i e ，1 9 9 9 ) 。 1 ，1 1 c d p k 的结构和生化特性 1 ，1 1 1 结构 c d p k 由三个功能区域组成( h u a n g ，1 9 9 6 ；y o o ，1 9 9 6 ：h m a n o n ，1 9 9 4 ：h a r p e r ，1 9 9 4 ) ， 分别是催化结构域、自身抑制结构域和钙结合结构域。催化结构域( 激酶区) 为典型的丝 氨酸，苏氨酸蛋白激酶区域，此区域在不同异型阃的保守性较强，例如：拟南芥c p k 3 c p k l 2 十种c d p k 异型的激酶区域与c p k l 激酶区域的保守性均在8 0 以上( h r a b a k 等，1 9 9 6 ) 。 钙结合结构域( 调节区) 与c a m 的同源性为3 9 ，通常由4 个e f 手形结构组成，是c d p k 与c a 2 + 结合的部位( b r c v i w i o 等，1 9 9 5 ；i - i r a b a k 等，1 9 9 6 ；h a r m o n 等，2 0 0 0 ) 。自身抑 制结构域( 连接区) 具有对自身激酶活性的抑制作用( h a r p e r 等，1 9 9 1 ) 。不同的c d p k 在n 端区域的长度和序列上有很大变化( h a r m o n 等，2 0 0 0 ) 。一些c d p k 的n 一末端有一 段保守性极低的n _ 肉豆蔻酰化序列。n 肉豆蔻酰化序列是种翻译后的修饰方式，许多跨 膜信号途径的重要因子都有此结构，推测其与蛋白在膜上的定位有关( h r a b a k 等，1 9 9 6 ) 。 1 1 1 2 钙激活模式 纯化的c d p k 一般为单体酶，分子量在4 0 9 0i e d ) 。钙激活c d p k 的一个最简单的 方式是，当c a 2 + 与c d p k 的钙结合结构域( 钙调素样结构域) 结合后，c d p k 发生分子内 相互作用，使自身抑制结构域对自身激酶活性的抑制被解除，从而导致激酶活性被释放出 来( 被激活) ( h a r m o n 等，2 0 0 0 ) 。有研究表明，当c d p k 的钙结合结构域被去除时，外 加钙调素或钙调素样结构域可部分恢复其激酶括性( h u a n g 等，1 9 9 6 ；y o o 和h a r m o n ，1 9 9 6 ) 。 该研究结果是对上述假说的有力支持 1 1 1 3 钙敏感性 体外实验证明，即使在同一植物中，不同的c d p k 对钙的敏感性往往也不相同。例如， 大豆中的、p 、t 三种c d p k 在达到最大酶活性一半时所需要的钙浓度，即i ( 05 分别为0 ，0 6 ， 0 , 4 和1 0p m o l l ( l e e 等，1 9 9 8 ) 。这暗示着，当植物受到外界刺激所引起的胞内钙离子的 振荡频率、幅度和持久性不同时，可能会激活不同种类的c d p k ( m e a i n s h 和h e t h e r i n g t o n ， 1 9 9 8 ；s a n d e r s 等，1 9 9 9 ) 。 此外，在另一些体外实验中，同一c d p k 在底物不同时被c a 寸激活的闽值也不同。 当底物为s y n t i d e - 2 或h i s t o n e l l l - s 时，c d p k 的k os ( c a ”) 分别为o 4 或4 0p m o i l ( l e e 4 第一章文献综述 等，1 9 9 8 ) 。 1 1 1 4 调节因子 有证据表明，些c d p k 的活性除了由钙激活外还可由其它因子激活或抑制。 i 磷脂的激活作用。拟南芥a t c p k l ( b i n d e r 等，1 9 9 4 ) 和胡萝h ( d a u c u s c a r o t a ) d c c p k l ( f a r m e r ，1 9 9 9 ) 的活性由磷脂如磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇协同激活。但这些脂 类不是信号分子，所以它们是作为调节物还是作为与膜相连的c d p k 的组分起作用，目前 还存在争论。一种可能的情况是，一些c d p k 在胞质中活性低，当被运到膜上后被激活 ( h a r m o n 等，2 0 0 0 ) 。 自我磷酸化的影响。无论是天然的还是人工重组的c d p k 都表现出自我磷酸化的 能力，但自我磷酸化的作用位点还未被确认，对其作用也没有一致的看法( h a r m o n 等， 2 0 0 0 ) 。许多c d p k 的自身抑制区包含一个潜在的自身磷酸化位点( l y s g l n - p h e s e r ) 。一 些实验证据表明，c d p k 的自我磷酸化不影响其对钙的敏感性。例如，大豆c d p k 的自我 磷酸化不影响落花生( a r a c h i s h y p o g a e a ) 中c d p k 的钙敏感性( c h a u d h u r i 等，1 9 9 9 ) 。而 另一些报道却表明，自我磷酸化影响c d p k 对钙的敏感性。落花生c d p k 的自我磷酸化为 其活性所必须，但这只发生在低浓度钙条件下，且在体内可能没有调节作用( c h a u d h u r i 等，1 9 9 9 ) 。相反，从翅豆( p s o p h o c a r p u st e t r a g o n o l o b u s ) 中纯化的c d p k 的自我磷酸化 抑制其活性( s a h a 和s i n g h ，1 9 9 5 ) 。 抑制剂的作用。c d p k 的抑制剂分为以下4 类：富含碱性氨基酸的蛋白，如多 聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚鸟氨酸及豆精蛋白，它们以底物竞争方式进行抑制；p k c 的抑制剂包括鞘氨醇、k 2 5 2 ( 多粘菌素b 硫酸盐p o l y m y x i n bs u l f a t e ) 、丫啶橙、丫啶黄g 等；c a m 拮抗剂，如酚噻嗪( p h a x o t h i a z i n e s ) 、三氟拉嗪( u 证 l u o p e m z i n e ) 、w - 7 、蜂毒 肽等，但其抑制常数要高于c a m 依赖性的酶：c a2 + c a m 依赖的蛋白激酶的抑制剂， 如k n 6 2 、k n 9 3 等。这些酸性双亲分子( 如脂肪酸和类脂) 、碱性双亲分子( 如鞘氨醇、 酚噻嗪、蜂毒肽) 和碱性多肽均能影响多数c d p k s 的活性，但是尚不清楚这些成分是否 作用于c d p k a 的同一位点及这些成分影响的生理功能( 陈硕和陈珈，2 0 0 1 ) 。 找到c d p k 专性抑制剂对有关c d p k 的研究有重要推动作用，但迄今为止尚未发现 c d p k 的专一性抑制剂。许多研究小组正根据c d p k 结合结构域的氨基酸序列来寻找专一 性抑制剂( r o b e , s 和h a r m o n ，1 9 9 2 ：h o n g 等，1 9 9 6 ) 。 中国农业大学硕士学位论文 1 1 2 c d p k 的生理功能 1 1 2 1 c d p k 与花粉萌发和花粉管生长 花粉萌发与花粉管的生长是有花植物双受精的前提，因此，有关其机理的研究是植物 生殖学中的重要课题之一。同时，花粉萌发和花粉管生长具有极性生长的特征，可作为植 物细胞极性生长及细胞信号转导机制研究的模型之一。许多研究表明，c 一在花粉萌发和 花粉管生长过程中起关键作用。c a 2 + 可能参与调节花粉和花粉管中细胞骨架的结构和功 能，调节高尔基囊泡的运动、相互融合及与质膜的融合( d e r k a o n 等，1 9 9 5 ) ，并可能调节 花粉管壁的机械性能( h o l d w a y - c l a r k e 等，1 9 9 7 ) 。同时，c a 2 十还在调控花粉管生长方向 中起重要作用，可能由质膜c i “通道的不对称活性b i 起的花粉管顶端c 浓度的局部变 化控制者花粉管的生长方向( p i e r s o n 等，1 9 9 6 ：m a l h o 和t r e w a v a s ，1 9 9 6 ) 。另有研究表 明，伴随花粉管的波动性生长，花粉管顶端c a 2 十浓度梯度呈现明显的振荡特性，且二者的 频率基本一致( p i e r s o n 等，1 9 9 6 ；h o l d w a y - c l a r k e 等，1 9 9 7 ) 。但花粉管生长的波动和花 粉管顶端胞质c a 2 + 的振荡之间的关系，目前尚不清楚。 既然c a 2 十在花粉萌发和花粉管生长过程中起关键作用，那么，对与钙信号直接相关的 下游信号转导过程的研究就成为花粉萌发和花粉管生长调节机制研究的重要内容。已有证 据表明，c d p k 可能作为c a 2 + 作用的靶分子参与花粉萌发和花粉管生长的信号转导途径。 1 9 8 6 年，p o l y a 等首次发现在烟草花粉的总蛋自提取物中存在具有激酶活性的蛋白，而且 该激酶活性受c a 2 + 调节。后来从玉米花粉中克隆到一种c d p k 的e d n a ，通过s o u t h e r n 分析表明其属于一个多基因家族，各成员在激酶区有很高的同源性；通过n o r t h e m 分析显 示其在花粉中特异性表达，并且随着花粉的成熟和萌发，其表达量逐渐增加：另外将其反 义寡聚核苷酸引入正在生长的花粉管中，发现花粉管生长受抑，说明该c d p k 为花粉管生 长所必需( e s t r u c h 等1 9 9 4 ) 。另有实验表明，从烟草花粉中克隆到的种c d p k 能将花 柱的s r n a s e 磷酸化( k u n z 等，1 9 9 6 ) 。 此外，将大豆中c d p k d 的单克隆抗体进行荧光标记后孵育到紫露草的花粉管中，发 现其与肌动蛋白( a e t i n ) 共分布，但在体外实验中提纯的c d p k n 既不能磷酸化f - a e t m ， 也不能与其结合( p u t n a m e v a n s 等，1 9 8 9 ) 。这研究表明，c d p k 可能通过与细胞骨架的 相互作用参与花粉管生长的信号转导过程，但其作用机制尚不清楚。m o u t i n h o 等( 1 9 9 8 ) 利用荧光标记的方法初步证明了正在生长的花粉管顶端区域表现出较高的c d p k 活性，而 在不生长的花粉管细胞中c d p k 活性为均匀的分布。这些结果都初步揭示了c d p k 作为 c d + 的下游靶分子参与花粉萌发与花粉管生长的信号转导过程的可能性。 6 第一章文献综述 1 1 2 2 ，c d p k 与生物、非生物逆境 c d p k 也参与一系列逆境信息传递的过程。u r a o 等人( 1 9 9 4 ) 利用n o r t h e r n 方法，发 现干旱和盐胁迫条件可快速诱导拟南芥的c d p k 基因c a l c d p k l 和e a t c d p k 2 的表达， 而低温和外源a b a 处理则无此效应，这说明环境渗透势的改变是诱导c 衄c d p k l 和 c a t c d p k 2 表达的一个调节因子。而在玉米叶原生质体中，拟南芥中的a t c d p k l 和 a t c d p k l a 均可激活逆境蛋白表达的启动子h v a l 的活性( s h e e n ，1 9 9 6 ) 。另外c d p k 的抑制剂可阻止寒冷驯化和寒冷诱导的k i n 基因表达，说明c d p k 还可能参与了拟南芥的 寒冷驯化过程( t l i x t i h 鲥u 等，1 9 9 7 ) 。 此外，c d p k 还可能参与植物抗病的信号转导过程。当番茄被枝孢菌特异性侵染后， 番茄体内的c f - 9 基因表达，其产物与病原菌a v r 9 基因产生的无毒产物a v r 9 发生相互作用 从而使番茄产生对病原菌的抗性( v a nd e na e k e r v e k e l l 等，1 9 9 2 ：j o n e s 等，1 9 9 4 ：d ew i t ， 1 9 9 7 ；h a m m o n d - k o s a c k 等，1 9 9 8 ) 。r o m e i s 等以c f - 9 转基因烟草悬浮细胞为材料研究发现， 当加入诱发子a v r 9 后5 分钟时，细胞内一种与膜结合的c d p k 从无激酶活性的形式( 分 子量6 8 k d ) 转化为有激酶活性的形式( 分子量7 0 k d ) ( r o m e i s 等，2 0 0 0 ) 。 1 1 2 3 c d p k 与膜运输蛋白 许多体外实验表明，离子通道和离子泵分别是c d p k 的内源底物之一。从原核表达系 统中纯化得到的拟南芥c d p k ( a k l ) 在m g ”- a t p 存在下可激活液泡膜上的c l 通道( p e i 等，1 9 9 6 ) 。c d p k 的底物竞争性抑制剂还可逆转c a 2 + 对c 通道的抑制作用( w a n g 等， 1 9 9 8 ) 。从蚕豆保卫细胞中提取的c d p k 可体外磷酸化k a t l 通道( l i 等，1 9 9 8 ) 。重组的 蛋白脂质体上的a t p a s e 被c d p k 磷酸化，其水解a t p 与运输质子的能力均受到抑制， 这一抑制作用可被碱性磷酸酶所逆转( l i n o 等，1 9 9 8 ) 。 有些c d p k 对某些水通道也具有调控作用。在固氮细菌和豆科植物根瘤的共生膜上存 在的水通道n o d u l i n - 2 6 是根瘤中的一种c d p k 的内源底物( w e a v e r 和r o b e r t ，1 9 9 1 ) ，其 蛋白肽链上第2 6 2 位的s e r 可被膜结合或重组型c d p k 磷酸化( w e a v e r 和r o b e r t ，1 9 9 2 ) ， 这一磷酸化过程可将n o d u l i n - 2 6 从全开放、高通导性的状态变为电压敏感的低通导性状态 ( l e e 等，1 9 9 5 ) 。菜豆( p h a s e o l u sv u l g a r i s ) 种子储藏蛋白的液泡膜上的( x - 水通道蛋白 ( ( x - t i p ) 在非洲爪蟾( x e n o p u sl a e v i s ) 卵母细胞中异源表达时可被相同膜上的c d p k 磷 酸化，并且通道对水的通透性得到提高( j o h n s o n 和c h r i s p e e l s ，1 9 9 2 ) 。这些证据表明， c d p k 参与了多种离子以及水分的跨膜运输过程。 7 孛鞭农业大学硬士学位论文 1 1 ，2 4 c d p k 的其它生理功能 在植物叶片中，一些胞质中的酶如磷酸蔗糖合成酶、硝酸还琢酶( n r ) 和p e p 羧化 酶鲍磷酸纯及活性状态醚党含捧用懿进行磷迅速变化。当光舍捧髑活跃对，上述三秘酶被 激活，并有可能加快蔗糖合成、固氮和c 4 有机酸的台成，为植物成氨基酸提供碳源和氦 源( d o u g l a s 餐，1 9 9 8 ；z h a a g 等，1 9 9 9 ) 。簸菠菜肄中提取豹露瞵酸纯确骏还原辩s e r 5 4 3 位点可被拟南芥的c d p k 抗体识别，测序绪果也表明此酶是一种c d p k ：当菠菜叶中的硝 酸还鹱酶被邀秘c d p k 磷酸必蠹鄹失去活靛并与l 钙- 3 虽囊结合( d o u g l a s 等，1 9 9 8 ) 。大 豆根瘸中的蔗糖台成酶n o d u l i n 1 0 0 是根瘤中c d p k 的底物，虽然体外实验表明这种磷酸 位俸震势不爨著建影购荬蔗糖袭勰薅戆嚣性，一僵却簿僬了薅表藩黪蘸承撵燕，滋骥这静共 价修饰有可能参与了n o d u l i n 1 0 0 在根瘤共生膜，质膜和胞质之间的分配，间接通过酶的膜 维含懋与可漆型豹获态交纯谣节簿静活性( z h a n g 簿，1 9 9 9 ) 。勇豁，h u b e r 等式瓣实验诞 明在难米叶片中，c d p k 的磷酸化作用可将尿苷二磷酸( u d p ) 对蔗糖的k i n 值降低5 倍， 说翡磷酸纯西能激漭了蔗耱瓣分解谯落 蓬稳( h u b e r 等，1 9 9 6 ) 。瓣踅，c d p k 不役参与穰 物细胞中的物质跨膜运输，还有可能调节代谢过程中某些酶的活性，从而直接参与代谢调 控。 男有证据袭明，c d p k 述可通道磷酸化细胞骨架相关骚白来调节细胞骨架的遮动和生 理功髓。玉米中的徽丝解聚斑子z m a d f 3 的s e t 6 位点可被由钙激活的激酶磷酸化，且遮 种磷酸化为z m a d f 3 与g - a e t i n 或f - a e t i n 结合井引起微熊解聚或聚合所必须( s m e r t e n k o 等，1 9 9 8 ) 。 y a h a l o m 等( 1 9 9 8 ) 从玉米中躯轴的细胞壁组分中分离褥列了与胞闻连熊结合的 c d p k ，它存在于细胞壁内部，类似于膜内在蛋白，并可以磷酸化2 0 种玉米细胞壁蛋臼 中的8 种( y a h a l o m 等，1 9 9 8 ) ，这裘甥，c d p k 有可能参与了胞间连丝蜘门控。 1 。2 。撞魏功缝基因缝学聚究进蓑 戳越南芥精承稻掩代表的檀耪摹鞫缀研究进展邋速，副2 0 0 0 华1 2 月为止，搅南芥綦 因组( 1 0 0m b ) 的d n a 序列测定已经全部完成，并在g e n b a n k 数据库中髓记注册。水稻 基因缀的工律框架序掰圈已经在2 0 0 2 年4 月的s c i e n c e 杂志上公布，而且其第四条染色体 的精确测序工作也由中国于2 0 0 2 年9 月完成，而且水稻其它染色体的d n a 测序媳正在测 序也藏在紧张地进行牛。随漕植物基因组计划的实施和进展，g - e n b a n k 中累积了大量的束 知功熊的d n a 序列，如何浆定出这些基因的功能将成为慕因组研究的重点谋题。因此， 第一章文献综述 基因组研究应该包括结构基因组学( 以全基因组测序为目标) 和功能基因组学( 以基因功 能鉴定为目标) 两方面的内容，后者往往又被称为后基因组研究。目前拟南芥和水稻的功 能基因组研究已经全面展开，尤其是对已完成全基因组铡序的拟南芥来说，其功能基因组 研究任务更加紧迫。虽然植物的基因组研究起步较晚，但由于吸取了人类基因组研究中积 累的一些经验，所以进展相当迅速，而且对植物功能基因组学的研究也日益受到重视。 1 2 1 功能基因组学的含义 功能基因组研究的内容是利用结构基因组所提供的信息，发展和应用新的实验手段、 系统地分析基因的功能( h i c t c r 和b o g u s k i ，1 9 9 7 ) 。基因的功能主要包括：生物化学功能， 如作为蛋白质激酶对特异的蛋白质进行磷酸化修饰：细胞学功能，如参与细胞间和细胞内 的信号转导途径；发育上的功能，如参与植物形态建成。目前，获取一段d n a 序列的功 能信息的最简单的方法是将该d n a 序列与g e n b a a k 等数据库中公布的基因序列进行同源 性比较，如利用b l a s l n 和b l a s t k 两种软件分别进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较 后，根据与目的d n a 序列同源性较高的基因的功能来推测。但该方法仅仅为该d n a 片段 的功能提供了间接的证据，对基因功能的直接证据还需要实验上的数据。b o u c h e z 和h o f t c ( 1 9 9 8 ) 将所需要的实验证据归纳如下：通过研究基因的时空表达模式确定其在细胞学 或发育上的功能，如在不同细胞类型、不同发育阶段、不同环境条件下、以及病菌侵染过 程中m r n a 和( 或) 蛋白质的表达的差异等。研究基因在亚细胞内的定位和蛋白质的 翻译后调控等。利用基因敲除( k n o c k - o u t ) 技术进行功能丧失( 1 0 s s o f f u n c h o n ) 分析 或通过基因的过量表达( 转基因) 进行功能获得( g a i n o f - f u n c t i o n ) 分析，进而研究目的 基因与表型性状问的关系。通过比较研究自发或诱发突变体与其野生型植株在特定环境 条件下基因表达的差异来获取基因功能的可能信息。 1 2 2 植物的表达序列标记( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，e s t ) 与基因组大 规模测序 通过从c d n a 文库中随机挑取的克隆进行测序所获得的部分c d n a 的5 或3 端序列 称为表达序列标记( e s t ) ，一般长3 0 0 5 0 0b p 左右，利用e s t 作为标记所构建的分子遗 传图谱被称为转录图谱。目前植物e s t 计划主要集中在拟南芥( h o f t e 等，1 9 9 3 ；c o o k e 等，1 9 9 6 ) 和水稻上( y a m a m o t o 和s a s a k i ，1 9 9 7 ) ，其次是大豆和玉米的e s t ( 见n c b i 数据库中d b e s t ) ，其他植物的e s t 相对较少。这些e s t 不仅为植物基因组遗传图谱的构 建提供了大量的分子标记，而且来自不同组织和器官的e s t 也为基因的功能研究提供了有 9 中国农业大学硕士学位论文 价值的信息。此外，e s t 计划还为基因的鉴定提供了候选基因( 李子银和陈受宜，2 0 0 0 ) 。 e s t 计划的一个不足之处在于通过随机测序有时难以获得那些低丰度表达的基因和那 些在特殊环境条件( 如生物胁迫和非生物胁迫) 下诱导表达的基因，因此为了弥补e s t 计 划的不足，必须开展基因组测序计划。通过分析基因组序列能够获得基因组结构的完整信 息，如基因在染色体上的排列顺序，基因间的间隔区结构，启动子的结构以及内含予的分 布等( 李子银和陈受宜。2 0 0 0 ) 。 b e v a n 等( 1 9 9 8 ) 研究表明，拟南芥第四染色体上1 9m b 长的片断中平均每4 8k b 就有一个基因存在，而且5 4 的基因与g o n e b a n k 中已知功能的基因有同源性，5 6 的基 因可与o e n e b a n k 中的e s t 相对应。这说明e s t 研究是一种发现基因的有效方法，尤其是 在还不可能对基因组较大的植物进行全序列测定的情况下，e s t 研究是功能基因组学研究 的最佳途径之一。 1 2 3 植物基因的功能分析方法 基因的时空差异表达是植物发育、分化、衰老和抗逆等生命现象的分子基础。基因在 不同组织、不同器官、以及不同环境条件下的差异表达特征，为基因的功能提供了重要的 信息。v e l e u l e s e u 等( 1 9 9 7 ) 将在特定组织或细胞内转录的所有基因及其表达丰度称为转 录组( 1 r a n s e r i p t o m e ) ，因此在转录水乎上进行的基因表达差异分析实际上就是进行转录组 研究。经典的减法杂交( s u b s l r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ) 、差示筛选( d i t f e r e n e i a ls c r e e n i n g ) 、以 及m r n a 差异显示( d i f f e r e a e i a ld i s p l a y ) 等技术已被广泛用于鉴定和克隆差异表达的基 因，但是这些技术不能胜任对大量的植物基因进行全面、系统的分析。于是，基因表达的 系统分析( s e r i a la n a l y s i so f g e n ee x p r e s s i o n ，s a g e ) 、e d n a 徽阵歹 ( e d n a m i e r o a r r a y ) 和d n a 芯片( d n a c h i p ) 等能够大规模地进行基因差异表达分析的技术应运而生( 李子 银和陈受宜，2 0 0 0 ) 。 1 2 3 1 e d n a 微阵列和d n a 芯片技术 e d n a 微阵列和d n a 芯片都是基于f e v o l - s en o r t h c m 杂交以检测基因表达差异的技术。 二者的基本思路都是首先把e d n a 或e s t 或基因特异的寡聚核苷酸固定在固相支持物上， 并与来自不同细胞、组织或整个器官的m r n a 反转录生成的第一链e d n a 探针进行杂交， 然后用特殊的检测系统对每个杂交点进行定量分析。理论上杂交点的强度基本上反映了其 所代表的基因在不同细胞、组织或器官中韵相对表达丰度。这两项技术的优点是可以同时 对大量基因，甚至整个基因组的基因的表达差异进行对比分析。e d n a 微阵列技术是s c h w a 等( 1 9 9 5 ) 发展起来的，其主要优点是：灵敏度极高，能够检测出丰度低于十万分之一的 i o 第一章文献综述 m r n a ；使用几种不同颜色的荧光染料标记探针，这样在同一张阵列膜上进行一次杂交实 验就可以同时分析不同细胞间或不同环境胁迫下基因表达的差异。e d n a 微阵列技术的主 要不足是成本较高，如需要机器人点膜和特殊的信号检测分析系统、点在玻璃片上的a r r a y 不能重复使用等。近几年，d e s p r e z 等( 1 9 9 8 ) 和胡玉欣等( 1 9 9 8 ) 分别独立发展了利用尼 龙膜作固相支持物和使用同位素标记探针进行杂交的e d n a 表达阵列技术，从而降低了成 本，但检测的灵敏度也相应降低( 万分之一) 。d n a 芯片技术是a f f y m e t r i x 公司率先研制 出来的，该技术利用结合化学手段在玻璃固相支持物上原位合成大量的基因特异的寡聚核 苷酸，并与荧光标记的探针进行杂交，再利用特殊的检测系统进行信号分析，就可以获得 基因的时空差异表达谱。r a m s a y 等( 1 9 9 8 ) 对d n a 芯片技术的原理和应用进行了较全面 的介绍，本文不再赘述。 1 2 3 2 蛋白组研究 蛋白组( p r o t e o m e ) 指的是由基因组表达出的全部蛋白质，由英文单词p r o t e i n 的前半 部加上单词g e n o m e 的后半部组合而成。蛋白组学即研究蛋白组的学科。由于基因功能的 实现最终是以蛋白质的形式体现的，因此，在揭示基因的确切功能方面，开展蛋白组研究 可以提供比在转录水平上更为直接有力的信息。蛋白质双向电泳是目前蛋白组研究的首选 技术( h u m p h o l y - s m i t h ，1 9 9 7 ) ，但是该技术在以下方面尚需改进：分辨率和可重复性、蛋 白质斑点的自动定量检测系统、以及蛋白质n 端和内部氨基酸序列测定技术等。利用蛋白 质双向电泳技术对基因敲除( k n o c k o u t ) 突变体或转基因重组体与野生型个体间双向电泳 蛋白图谱的差异进行对比分析就可以对目的基因的功能进行分析。在植物上该技术已被用 来分离新的基因。d a m c a w a l 等( 1 9 9 8 ) 分析了玉米o p a q u e 2 基因的近等基因系之间的双 向电泳蛋白图谱的差异，结果鉴定克隆了一个新的转录激活因子基因。对水稻盐胁迫处理 和a b a 处理前后的双向电泳蛋白图谱进行的对比分析同样克隆了几个与水稻耐盐性相关 的胚胎晚期丰富蛋白( 1 e a ) 基因( m o o n s 等，1 9 9 8 ：m o o n s 等，1 9 9 7