（植物学专业论文）玉米亲本自交系及其杂交种的dna甲基化水平和模式的遗传和变异研究.pdf

摘要 d n a 甲基化作为一种重要的表观遗传修饰形式，存在于许多高等动、植物中，并在 调控基因表达、维持基因组的稳定性等方面发挥重要生物学作用。同时，许多研究发现 同有d n a 甲基化水平和模式的变化会导致生物的表型异常甚至致死。但一定范围内的甲 基化变异也为物种进化提供了机遇。这一点在植物上可能更是如此，因为植物上的甲基 化变异常常可以通过减数分裂传递给后代。 玉米是利用杂种优势的主要作物之一，但f l 代杂交种所表现的超亲优势的机理目 前尚不完全清楚。因此本实验选择了3 个优良玉米自交系并配制了3 个相互杂交组合， 利用m s a p 和s o u t h e r n 杂交等分子生物学方法研究了亲本和杂交种的多个器官，包括幼 苗、胚和胚乳的d n a 甲基化水平以及甲基化模式的遗传和变异，以探索甲基化在玉米基 因组d n a 中的分布及其规律性，以及杂种优势和d n a 甲基化之间的可能关系，进而希望 从一个新颖的角度为培育强优势的玉米杂交种提供理论依据。本文研究主要得到以下结 果： 1 利用m s a p 技术对玉米杂交种和其亲本自交系的幼苗、胚和胚乳的d n a 甲基化水 平进行了分析，结果表明：两个杂交组合( m 丹、丹m 、8 丹、丹8 ) 的正反交的杂交种 幼苗c c g g 位点胞嘧啶甲基化水平均略高于其亲本自交系，另一个杂交组合( 8 m 和m 8 ) 的d n a 甲基化水平低于其亲本自交系，但同一组合正反交间的c c g g 位点胞嘧啶的甲基 化水平无明显差异。玉米幼苗基因组的d n a 甲基化模式主要以内侧胞嘧啶的甲基化为主。 幼胚中两个杂交组合( m 丹、丹m 、8 丹、丹8 ) 的d n a 甲基化总体水平同其亲本相比都略 有增加。对于胚乳，不同杂交组合的d n a 甲基化水平同亲本相比表现不同的趋势，一个 杂交组合甲基化的总体水平增加，另外一个组合水平与亲本相同，但正反交间无明显差 别。 2 同幼苗相比，胚和胚乳的d n a 甲基化水平均表现出较大程度的降低，幼胚的d m 甲基化水平显著地低于幼苗，而胚乳的d n a 甲基化水平又显著地低于幼胚。 3 玉米自交系问杂交可导致杂种一代幼苗和胚乳发生不同程度的d n a 甲基化变异。 尽管亲本向杂交种的d n a 甲基化模式的遗传传递主要遵循孟德尔式的遗传方式，幼苗的 变异百分率为6 5 9 1 1 9 2 。另外，同样对于c g 和c n g 位点的变异，来自于父本变异 方式多于相应的母本类型。玉米种胚亲本向子代的d n a 甲基化遗传传递百分比较高，变 异发生频率较小，各个组合的正反交之间遗传传递的模式间差别较小。同亲本相比，杂 交种的胚乳发生了较大程度的d n a 甲基化变异，为1 5 9 3 1 9 6 4 ，变异模式的共同特 点是变异都来自于父本，正反交的变异频率无显著差异。 4 通过m s a p 分析我们观察到同一杂交种不同单株间d n a 甲基化变异发生的位点有 的表现为随机发生，有的则是非随机发生。 5 所有亲本自交系的不同单株间甲基化的遗传模式表现完全一致。 t 6 杂交种中的甲基化变异d n a 片段经测序和同源性分析，表明玉米幼苗和胚乳的 1 ) n a 甲基化变异发生在d n a 上已知功能基因、编码序列和一些未知功能序列中。 上述研究结果显示，玉米杂交种与其亲本自交系比较，d n a 甲基化水平和模式在基 本符合孟德尔遗传规律的同时，会发生一定频率的变异，而且不同器官之间存在较大差 异；这些变异和差异有可能在一定程度上与杂种和亲本之间的基因差异表达有关，进而 有可能与杂种优势有关。 关键词：胞嘧啶甲基化；表观遗传和变异；杂交种；玉米；幼苗；胚；胚乳 u a b s t r a c t d n am e t h y l a t i o na sa ni m p o r t a n te p i g e n e t i cm o d i f i c a t i o np l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei n c o n t m l l i n gg e n ee x p r e s s i o n 肌dm a i n t a i l l i n gg e n o m i cs t a b i l 畸i nh i g l l e ra n i i n a l s 趾dp l a m s i nm a n ys i u d i e si ti sf b u l l dt b a td i s t u r b a l l c eo fi n t r i n s i cd n a m e t h y l a t i o np a n e m sm a y l e a dt o f l j i l c t i o n a la 1 1 dp h c n o t y l ，i ca b n o r n l a l i 吼o re v o l u t i o n a r yo p p o m l n i 够o nm eo t h e rh a n dm e i n h e r i t a l l c eo fs p e c 诵cm e t l l y l a t i o np a t t e mi na n j m a l sa 1 1 dp l a i l t s ，a n dv 耐a t i o no f m e m y l a t i o n i n d u c e db yb i o t i co ra b i o t i cf a c t o r sm a y p r o v i d en o v e li n s 噜h ti n t ot h eb i 0 1 0 9 i c a ls i g n m c a n c e o f t l l i se p i g e n e t i cm a r k e r m a i z e ( 岔口埘州) i s 锄o n gm em a i nc r o p sw l l e r et h ep h e n o m e n o no f h e t e r o s i s o rh y b r i d v i g o ri su s e di ng r a i np r o d u c t i o n n o n e m e l e s s ，t h em e c h a n j s mo f h e t e r o s i si nh y b r i d sr e m a i n s 1 a r g e l ym y s t e r i o u s i nt h i ss t u d y ，t h r e ee l i t em a i z ei n b r e dl i l l e s w e r es e l e c t e da 1 1 dw e r e c m s s e dw i t he a c ho m e rt op m d u c e ( h r e es e t so fr e c i p r o c a lh y b r i d s i n h e r i t a n c ea 1 1 dv a r i a t i o n o fm e t h y l a d o nl e v e la n dp a t t e mi nt 1 1 e s eh y 蜥d sr e l a t i v et ot h e i rc o 玎e s p o n d i n gi n b r e d p a r e n t a ll i n e sw e r ei n v e s t i g a t e db yt h em e 协y l a t i o n - s e n s i t i v ea m p l i n e dp o l y m o r p h i s mo r ( m s a p ) ，f o l l o w db ym e l y l a 廿o n - s e n s “i v es o u m e mb l o ta 1 1 a l y s i s t h em a i nr e s 山t sw e r e s 啪m e i z e da sf o l l o w i n g 1 w eu s e d m s a p m e t h o d t oa i l a l y z e t h e l e v e l s o f d n a i i ”毗l y l a t i o n i n i e a v e s ，c l b r y o s a i l de n d o s p e 珊o f m a i z ei n b r c dl i n c sa i l dh y b r i d s i nl e a v e st h et w os e t so f r e c i p r o c a lh y b r i d s ( m d 、d m 、8 d 、d 8 ) s h o 、e dh i 曲e rv a l u e so f r e l a t i v el e v e lo f c y t o s i n em e t h y l a t i o na tc c g g s i t e st h a nt h o s eo ft h e i rc o r r e s p o n d i n gm i d _ p a r e n tw h i l et h eo 也e rs c to fr e c i p r o c a lh y b r i d s ( 8 ma n dm 8 )s h o w e dv a l u e ss l i g h t l y1 0 、e rt 1 1 a 1 1m em i d - p a r e n tv a l u e ，a n dn od i h b r e n c e w a so b s e n 屯db e t 、e e nt h ec r o s sd i r _ e c t i o n s 埘m i l lag i v e nh y b r i dc o m b i l l a t i o n i ne m b r y o sm e s 锄et w or c c i p m c a lh y b r i d ss h o w e dm 曲e r1 e v e lo fm e t l l y l a t i o nt h a i lm a to ft l l e i rp a r e n t s i n e n d o s p e r n l ，m et 、v oc o m b m a t i o n sw e r ed i 艉r c n ti nt h a tw h j l eo n es e to fr e c i p r o c a lh y b r i d s s h o w e dh i g h e rl e v e l so fm e t h y l a t i o nt l l a nt l l e i rp a r e n t s ，m eo t l l e rs e ts h o w e dt h eo p p o s i t e 订e n d 2 d i 岱溯1 to r g a l l ss h o w e dd i a e r e n tl e v e i so fd n am e t l l y l a t i o nmm a i z e t h er e l a t i v e 1 e v e l so f d n a m e t h y l a d o nf 吣mh i g ht ol o wa r e ：s e e d l i n g s ，e m b r y o sa n de n d o s p e m l 3 a 1 t h o u g hi nt h em a j o r i t yo fc c g gs i t e s ，d n am e m y l a t i o ns h o w e dm e n d e l i a n i n h e r i t a n c e 丘o mp a r e n t a ll 血e st oh y b r i d s ，a l t e r a t i o n si nm e t h y l a t i o np a t t e mw e r ed e t e c t e di n a l lh y b r i d ss t u d i e da tc e r t a j n 缸q u c n c i e s ，m n g 血gf b m6 5 9 t o1 1 9 2 1 1 1 e h y b r i d i z a t i o n - i n d u c e da l t e r a t i o nf r e q u e n c i e sa l s ov a r i e da i i l o n gt h eo r g a n s ，谢mc n d o s p e m s h o w e dt h eg r e a t e s ta l t e r a t i o n i na 文i i t i o n ，t h e f ew e f em o f ea l t e r a t i o n sa tl o c ii i l h e r i t e d 丘o m t h ep a t e m a l t h a l lf r o mt h em a t e r n a lo r i g i n 4 t h eh v b r i d i z a t i o n i r l d u c e dm e t h v l a t i o na h e 枷。璐s e e m e dt oi n c l u d eb o t hd i r e c t e d a n dr a n d o me v e n t s ，a sw i l i l es o i n ea l t e r a t i o n so c c u r r e di na l lf 1h y b r i d 访d i v i d u a lp l a m s t e s t e d ，o m e r so c c u r r e d0 1 1 l y 证s o r n ei 1 1 d i v i d u a l s _ 5 p r e e x i s 廿n gh e t c r o z y g o s 时w a sm l e do u ta sa l l t e s t e di n d i v i d u a lp l a i l t s 疗o mag i v e n i l i i n b r e dl i n ea l w a y ss h o w e dm es 锄em e t h y l a t i o np a t t e m 6 h y b r i d i z a t i o n i n d u c e dd n am e t h y l a t i o na l t e r a t i o no c c u r r e di nd i v e r s es e q u e i l c e s i n c l u d i n gc e l l u l a rg e n e s ，订a n s p o s o n sa n ds e q u e n c e so f u “k n o w nf h n c t i o n t h ea b o v er e s u l t ss u g g e s tm a t ，i nm a i z e ，w h e r e a sc ”o s i n em e t h y l a t j o na t 也em 毋嘶t yo f 2 e n o m i cl o c ie x h j b i t e df h i m f u lt m n s m i t i o n 行o mp a r c m st oi n t r a s p e c i f i ch y b r i d s ，a l e r a t i o ni n b a 血l e v 0 1a n dp a n e mo c c u 盯e di na l ls t u d i e dc r o s s e s ，a n dt h er a l l g eo fa l t e r a t i o na p p e r e dt o v a r y 锄o n gt 1 1 es t u d i e do 唱a n s ，l e a v e s ，e m b r y o s 趾de n d o s p e m l t h c s ea l t e r a t i o n sr n i g h tp l a y ar 0 1 ei 1 1r e g u l a t i n gd i 仃e r e m i a lg e n ee x p r e s s i o ni nh y b r i d sv s i n b r e dp a r e n t a l1 i n e s ，a 1 1 db y e x t e n s i o n ，m i g h tc o 州b u t e ，i np a r t ，t oh c t e r o s i so r h y b r i dv i g o l k e yw o r d s ：c y t o s i n em e t h y l a t i o n ； e p i g e n e t i ci n h e r i t a n c e a n dv a r i a t i o n ； h y b r i d ； m a i z e s e e d j i n g ；e m b r y o ，e n d o s p e m 学位论文作者签名：庭碰丝日期：h “o f 弘 意丝秽签器搦 曰 期：j 曲： 妊 闩 期：1 笪! e ! ! 鱼咧 工作单位：吉拔绉业姥电话：出地 通讯地址：捌事宏d ；程粮邮编：赶f 厦 子和外来d n a 的转录，降低由非等位基因之间的转座和重组导致的基因组的破坏，并可 免遭病原的侵染。 转座子( t r a n s p o s o n ) 是基因组中一段可以移动的d n a 序列，可以通过切割、重新 整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。真核生物基因组可以 d n a 或r n a 为中介进行移动因子的持续、频繁活动。人类的基因组3 5 是由转座子所组 成的”，而植物甚至更多”。转座子在基因组内的活跃可能包括很多有害的结果，例如 它们插入到基因或调控因子内部，影响基因的正常表达。那么植物控制有害的转座子则 是通过甲基化的方式，阻止了转座子的表达”“1 。玉米的转座子a c 因子活跃与否的周 期同其甲基化和去甲基化紧密相关叩“。因此转座子通过自身的甲基化程度调节其活性， 这也正是基因组为了维持其稳定性所采取的措施，来避免转座带来的有害影响”“。 在哺乳动物中几个实验性和理论性的证据表明某些转座予存在甲基化”“”1 。 比如在小家鼠( 肋占删s c “，“s ) 的早期发育中转座子保持甲基化状态，而非重复的d n a 序列却无此特性。y a t e s 等也在小家鼠中证明t a n d e r nb 1 转座子可发生从无到有的d n a 甲基化1 。 在甲基化降低的拟南芥d d m1 突变体，几个沉默的重复序列重新激活转录“”7 ”。例 如t s i ，是重复转座子相似序列a t h i l a 的一部分，在野生型中是沉默的，但在d d m l 突变体 中却能转录”“。这表明因为缺失d n a 甲基化转移酶基因的突变体( 如m e t l 和c m t 3 ) 导致 了t s i 转录的重新活跃m 7 “。另外，还有两类内源的拟南芥转座子( m 【l e 和c a c t a ) 在d d m l 突变体也被证明产生了高频率的转录。这些研究结果都表明d n a 甲基化能有效地抑制转 座子的活性，当甲基化降低时，转座子可重新活跃并正常转录。玉米的转座子，例如a c 、 m u 和s p m ，具有活化型和非活化型两种存在状态，并且由活化型向非活化型的转换，或从 非活化型向活化型的转换均可发生并遗传给后代。一般情况下，这些非活化型的转座子 均被甲基化。以s p m 为例，伴随s p m 的活性化和非活性化，也同样发现了s p m 启动子的脱 f f 基化和甲基化。类似于这种伴随d n a 甲基化变化的转座子失活，不仅发生于d n a 转座子 上，在反转座予上也可以发生”2 “”。 大量的证据表明转座子和反转座子序列在高等真核生物中被高度甲基化m 7 “7 “， 并且d n a 甲基化对维持基因组的稳定性具有重要作用”“7 ”。而这种基本稳定则是基于保 护基因组免受有害转座子的影响”“7 “。一个生物组织通常以d n a 的完整性和忠实性的 保护作为它的首要目标。因此d n a 甲基化的重要作用是和寄主防御体系相联系的。广泛 的甲基化降低导致基因组的不稳定反映了突变频率的增加。基因组的不稳定性也是肿瘤 产生的普遍特性”1 。 在真菌中胞嘧啶甲基化是为了保护寄主免受细菌侵染的部分机制。s e l k e r 等发现在 链孢菌中的一种防御机制就是d n a 甲基化”。在链孢菌中基因组的甲基化并不限制于重 复序列”“1 ，引起它们的不活跃不仅仅是一代。虽然它的机制并不完全清楚，但可观察 到两个或多个的长于几百b p 同源d n a 序列发生了甲基化。原核生物和真核生物间胞嘧啶 甲基化转移酶的一致性也为抵御外源的侵害性的d n a 序列提供了论据，特别是转座子和 同源性的反转录病毒。 3 d m 甲基化的遗传和变异的分子生物学研究进展 3 1d n a 甲基化的发生机制 在哺乳动物早期发育的胚胎中发生广泛的d n a 甲基化降低“”1 。早期胚的去甲基化 又紧跟着d en o v o 的甲基化5 “。因此哺乳动物基因组的甲基化模式是通过“消除一重建” 的方式进行，并且主要发生在配予遗传和胚胎早期发育中”。d n a 甲基转移酶在甲基化 的发生和遗传恢复中起重要作用。 l i a n g 等年报道在小鼠的胚胎干细胞中转座子的甲基化的维持需要不同类型的甲基 转移酶共同协作，这表明存在某种特定的甲基化机制和方式。在动物中，b e s t o r 等克 隆了第一个真核生物c 5 胞嘧啶特异的d n a 甲基转移酶一d n m t l 8 5 1 。实验发现在小鼠的胚胎 干细胞中缺少这种酶时，仍可甲基化反转录的前病毒( 即仍具备重新甲基化的能力这表 明d n t 1 并不是d en o v o 甲基化酶”1 。d n m t l 只是维持d n a 胞嘧啶的甲基转移酶，且在体内 和体外都有维持甲基化的活性，在复制时通常以甲基化的亲本d n a 链作为模板使子链d n a 甲基化。d n m t l 的失活会导致基因组广泛的甲基化降低和胚致死。1 9 9 8 年研究者又成功 分离了d n m t 2 ”，它与原核和真核生物的d n a 胞嘧啶甲基转移酶具高度同源性，但是d n m t 2 似乎在d en o v o 甲基化和甲基化的维持中并不起作用。d n m t 2 可能起着识别d n a 上特异序 列并与之结合的作用。后来研究发现了和d 肿t 相似的两种蛋白d n i n t 3 a 和d n m t 3 b ，通过小 鼠研究发现，其胚胎缺乏d n m t 3 a 时，就会发育不良并在出生3 4 周后死亡，缺乏d n m t 3 b 时受孕后能刚刚发育到g 5 天。如果缺少这两种基因的突变体就会受到更严重的影响。 这种现象在小鼠的胚胎干细胞的突变体中也得到证实。此种结果说明d n m t 3 a 和d n m t 3 b 具 有d en o v o 甲基化活性，即从无到有的使未经修饰的d n a 发生甲基化。“，人的d n l l l t 3 a 和 d n m t 3 b 的c d n a 与鼠基因高度同源，它们常常出现于甲基化早期，在胚胎细胞或一些新生 细胞的生长发育阶段开始起作用。 在拟南芥中至少有1 0 种基因能够编码d n a 甲基转移酶，多于任何其它测序的真核生 物基因组。第一种m e t 类，3 个m e t l 相关的基因包括她t 2 a 、m e t 2 b 、m e t 3 ，都具有一定功 能。第二种是c m t 类( 染色体甲基化酶) ，这是植物所特有的甲基转移酶类型，它主要起 维持d n a 甲基化的作用。在拟南芥中，编码c m t 的基因家族至少有3 个成员，在十字花科 植物和玉米中至少有2 个基因被发现。“。第3 类是转移酶( d r m ) 家族，它的结构与哺乳 动物d n m t 3 类似，但是d r m 的甲基转移酶基团以新的顺序进行了重组，d r m 基因家族可能包 括d r m l 、d r m 2 和z 翔e t 3 三个成员，但目前还不能确定它们是否同哺乳动物甲基转移酶 d n m t 3 一样在基因组的d en o v o 甲基化中起作用。对拟南芥去甲基化的d n a 突变体( d n a 甲 基化水平降低或d d m 突变体) 的筛查表明，d r m 的作用方式与真菌中的相似，多突变体在两 个位点是可恢复的o 。还有最后一个基因类似d n m t 2 。此外，植物中还存在第四类甲基转 移酶一玉米中的d m t l 0 4 和拟南芥中的d m t l l ，它们可能是d n m t 2 家族的同系物，虽然它们 在不少物种中是保守的，但其功能目前还不清楚1 。 因此，甲基化酶通过两种方式对d n a 进行甲基化。一种是维持甲基化。它是在已甲 基化的母链指导下使处于半甲基化的d n a 双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基 化；二是重新甲基化，即甲基化酶催化母链未甲基化的胞嘧啶位点，在子链进行甲基化， 称为重新甲基化。 3 2d n a 甲基化的遗传 在哺乳动物中，同d n a 甲基化相联系的的转录的表观遗传抑制，例如亲本印记、x 一 染色体失活都受发育所调控，而且表观遗传状态都可以在各个世代进行传递。动物是按 照消除一重建( e r a s u r ea n dr e s e t ) 的机制在各代中遗传”“。v a r d h m a n 等指出哺乳动 物的一种典型同表观表达状态相关的等位基因爿矗门一缸目d ( 爿哥j “) 的特征表型与在 彳矗“内的反转录转座子的不同d n a 甲基化有关，矗f 扩的这种表观修饰可以通过母本和 父本在各代中遗传一。 动物和植物间有着完全不同的甲基化遗传传递模式。在植物中通过减数分裂并能稳 定地传递给下一代。3 ”1 。a m a d o 等1 9 9 7 年对小黑麦的m l 代植株的不同生长发育阶段 采用5 一a z a c 去甲基化处理并在m 2 代分析表达方式1 。以未处理作为对照，经处理的子 代可观察黑麦来源r d n a 基因的表达。这个研究结果表明由5 一氮胞苷处理导致的甲基化 变异可从m 1 代传递到m 2 代，并引起基因表达的改变。 m e s s e g u e r 等比较番茄不同品种间及后代中甲基化多态性的结果表明，亲本中观察 到的甲基化的多态性是可以高度遗传的，而且以孟德尔的方式进行”“。在拟南芥转基因 的反义植物或突变体中，通过异型杂交失去突变和转基因后，其后代还是不能恢复正常 的甲基化水平，这也说明甲基化是可以遗传的”“。 k a k u t a n j 等1 9 9 9 年将带有甲基化降低的单拷贝m 1 0 5 等位基因的植株( 品系 c o l u m b i a ) 和野生型植株( 品系l a n d s b e r g ) 进行杂交后后对其f 2 代群体进行分析。研 究发现全部的7 9 个单株中，甲基化降低的m 1 0 5 等位基因经相互杂交和自交后仍保持原来 的甲基化水平。在2 0 个纯合的l a n d s b e r gm 1 0 5 等位基因的单株中，1 个发生甲基化降低， 因此，m 1 0 5 序列的甲基化降低通过减数分裂从d d i n l 突变体中转移到分离群体中”。 玉米a c 转座子降低的甲基化状态在减数分裂时保持稳定，改变了的甲基化模式可遗 传给后代删。 r i d d l e 和r i c h a r d s2 0 0 5 年将拟南芥的1 个核仁组织区高度甲基化的品系和2 个甲 基化程度较低的品系相互杂交，研究和分析了f l 代单株的r r n a 基因在核仁组织区( n o r 2 和n o r 4 ) 的甲基化的遗传和变异请况。结果表明：一个杂交种胞嘧啶甲基化含量按照孟 德尔特性进行分离；另一个f l 的n o r 2 的胞嘧啶甲基化含量在双亲值中间，且同亲本的甲 基化模式是一致的。因此原有d n a 甲基化的水平和外界因素所导致的甲基化降低是可 通过减数分裂进行传递。 3 3d n a 甲基化的变异 真核生物的d n a 甲基化修饰可通过自己特有的方式传递到下几代，在某种情况下外 界因素的影响也会导致这种相对稳定的表观遗传状态发生变化，而改变原来的甲基化水 平和模式。 在高等植物存在多种方式或因素可导致基因组发生广泛的甲基化发生变化。例如转 基因可导致它自身和同源基因重新甲基化，从而导致基因抑制或沉默“。m i c h a e l 等将 编码胞嘧啶甲基转移酶的基因( m e t l ) 作为反义r n a 转入到拟南芥植株后发现，总体的 d n a 甲基化水平的3 4 一7 1 发生降低，高度重复序列和低拷贝序列中都可观察到去甲基 化变化”。t a n a k a 等年研究烟草的表达反义r n a 的s a h h 转基因植株的甲基化后也发现， 在重复d n a 序列出现了降低甲基化“。 植物组织培养也可引起广泛的基因组甲基化变化”1 。离体培养再生植株的甲基化变 化首先在玉米体细胞无性系再生植株中发现。来白玉米幼胚再生植株的某些无性系与供 体相比发生了超甲基化。在胡萝 、番茄、马铃薯等多种植物的培养细胞或再生植株中， 均报道发现了因d n a 甲基化改变而产生的体细胞变异“。除了d n a 甲基化程度的增加外， 离体培养中还可导致d n a 甲基化程度的降低。最典型的例子是油棕体细胞胚植株由于甲 摹化的减少而造成的雄蕊雌性化变异1 。2 0 0 1 年p e r a z a e c h e v e r r i a 利用m s a p 技术研 究经组织培养的香蕉的植株的甲基化变异情况，从雄性花序得到的再生株甲基化变异百 分率为3 ，从根新枝得到的再生株的甲基化变异百分率为1 7 “”3 。 植物的种间杂交也可导致大量的胞嘧啶甲基化变异。1 9 9 9 年x i o n g 等将两个水稻籼 稻品系珍汕9 7 和明辉6 3 杂交后得到的杂交种汕优6 3 ，通过骼a p 分析，结果表明杂交 种的旗叶和幼苗所得到1 0 7 6 和7 2 l 条带中甲基化变异( 甲基化增加和甲基化减少) 的带 数分别是1 6 条和1 3 条带，这表明水稻品系间杂交可导致基因组发生不同程度的甲基化 变异“。动物上也有相似的研究结果“0 盯。 l i u ，b 利用渐渗杂交的方法将所得到的5 个渐渗系进行r f l p 分析，将9 个菰专化序列 和3 个已知功能的基因作为探针，杂交结果表明全部的渐渗系同3 个探针杂交后均表现甲 基化变异，一个渐渗系同6 个探针杂交都出现了甲基化变异的信号。同时还发现在每个 渐渗系都存在甲基化增加和甲基化减少变异“”。另有研究发现基因组渐渗也可导致基因 和转座子区域发生广泛的甲基化变异“。 染色体数目的变化包括整个基因组复制和增加减少单个染色体也可能导致d n a 甲 基化的变化“”。2 0 0 0 年l i u ，b 研究发现：将一系列多倍体小麦和其二倍体祖先物种， 同2 1 个低拷贝的d n a 序列进行s o u t h e r n 杂交后，多倍体小麦发生了广泛的胞嘧啶的甲基 化变异。同时一个人工合成的六倍体小麦也得到同样的结果，其甲基化变异发生在较早 的s 5 、s 6 、s 7 世代，而且这种变异在在3 个世代间能稳定遗传。这个结果表明，二倍体 物种之间杂交后在形成多倍体物种的过程也可产生广泛的基因组胞嘧啶甲基化变异“”3 。 不良的环境影响也会造成基因组的甲綦化变异。s t e w a r d 等发现甲基化模式的改变 依赖于环境的变化，研究发现玉米幼苗遭受低温胁迫时，根组织发生了基因组广泛的去 甲基化”1 。l o n g 等研究发现高压可导致水稻基因组中转座予相关的区域发生甲基化变 异，而且变异的甲基化状态可以遗传给后代“。 由此可见高等真核生物基因组中存在广泛的d n a 甲基化变异，它的存在为物种的多 样性和进化提供了新的契机，同时也对扩大遗传资源和培育新品种提供了良好的途径， 使人类在认识的同时更好的加以利用。 8 种一代) 的表现呈高度相关；而在那些系谱关系( 不同杂种优势群之间) 较远的组合中， 未发现显著的相关性。随着分子生物学的发展，用分子标记( 特别是r f l p ，即限制性内 切酶片段长度多态性) 对亲本遗传差异与杂种优势的表现进行了大量研究。但同其它研 究一样，优势最强组合的并非是遗传距离最大的组合。 基因否定剂量效应对于解释多倍体同二倍体的杂种优势差别提供了理论根据。很多 物种的四倍体中自交衰退的速度比二倍体预期的等位基因的纯合的速度更快“2 “”“”2 t ”。 异质杂合体 a b 的自交在任何位点产生的子代有一半是纯合的，另一半是杂合的。在 一个同源四倍体中，杂合体( a a b b ) 的自交在任何一个座位点上将产生纯合体 ( a a a a 或b b b b ) 仪有l 1 8 的子代( 依赖于同着丝粒连锁的程度) ，除了a a b b 杂合体，还有a a a b 和b b b a 杂合体。在四倍体中自交衰退经常比预期的要快，几 乎同二倍体的纯合速度相同。有些物种，四倍体自交衰退进行速度比二倍体更快。 r a n d 0 1 p h 发现玉米自交系的四倍体衍生物经常比其二倍体祖先的优势更低。因而，在这 个物种，四倍体自交衰退最终产物比二倍体小，即使基因型是一致的( 但剂量不同) ， 这表明等位基因剂量起了更大作用“。 在m r n a 水平上探讨基因表达与杂种优势同杂种f l 的基因及其互作对杂种优势表现 起决定性作用，从基因作用途径分析，必须通过d n 卜咀r n a 一蛋白质才能对最终性状起 作用。因此，除了在d n a 水平探讨位点杂合性及基因互作与杂种优势的关系，有必要从 m r n a 水平上和基因表达调控角度来分析研究杂种优势的形成。t s a f t a r i s 等对两个玉米 杂交种研究发现，3 5 种基因在杂交种中的平均转录水平高于亲本自交系，并且强优势种 的m r n a 比弱优势种要多，意味着强优势组合中超亲表达的基因数目多于弱优势杂种， 这可能是产生杂种优势的原因“。x i o n g 等对水稻8 个自交系及其组配的2 8 个杂种进 行m r n a 差异显示研究，在m r n a 差异扩增带中发现仅在一个亲本出现，在f l 和另一亲 本均不出现的差异表达带与f l 杂种优势和杂合性呈正相关 与此相反f l 出现但双亲均 不出现的差异表达带与杂种优势和杂合性呈负相关，其它差异表达带则与杂种优势和杂 合性不相关“2 。结果说明杂种优势与显性类型的基因表达无关面与基因表达在f l 中的 抑制有关，这更进一步表明了杂种优势的复杂性。目前还无法确定发生表达改变的基因 所占比例较小。3 个亲 本自交系材料的甲基化水平差异较小，而它们的实际遗传距离较远。m 丹、i 叼晤掣 咧3 霉丑烛要李删日。l l 一；i i 耋i 鲶魏g 套霸珏l 毯i 薹嘞雌雅凑 阳渡淀澎疆；i i 蚕j 器菇望霎甜翟端嫂鸶喉隧i i 。| | 纂一j i 掌；0 喧中淳i ? 米2 个亲本甲基化胞嘧啶的 比例为3 1 4 和2 8 3 ，杂交种则为2 7 4 。这表明d n a 甲基化程度降低很可能导致 了基 因表达的增强，从而可能影响杂种优势的形成“”1 。也有研究者指出，表观遗传机制 在调控杂种基因组特有的等位基因的表达起着重要的作用同时有助于杂种的表现型 x 不同的甲基化模式对形成杂种优势起着重要作用。”3 ，但相关研究总体上较少。鉴于d n a 甲基化对基因表达的潜在的调控影响，杂交种中非加性的或亲本甲基化模式的变异可能 有助于新的表达，因此可能对杂种优势起着定作用。 5 本研究目的和意义 研究表明拟南芥中由d d m l 基因突变体所导致的甲基化降低可以传递多代”“。最近揭 示了不同的拟南芥生态型，在包括两个核糖体座位的基因组区域，自然发生的不同的甲 基化状念也能够实现从亲本向品系间杂种的忠实的表观遗传9 ，然而某个杂交组合有时 也会产生很显著的变异或亲本甲基化模式的改变，这表明因生态型而异的反式作用因子 同忠实的甲基化遗传的控制有关。水稻中，也有研究发现一个品系间杂种的9 6 的甲 基化位点表现为遗传，而变异的位点是4 “。玉米基因组较大，8 0 是由反转座子和它 们的衍生物所组成“。而且基因和重复序列的甲基化程度不同“1 。因此我们可以设想 玉米基因组的甲基化的水平和模式都会有别于拟南芥和水稻。 玉米( 历am 色y sl ) 起源于玉米族玉米属，在我国已有近5 0 0 多年的栽培历史。 作为世界上种植面积位于第3 位的粮食作物，它在农业生产上起着举足轻重的作用。日 前玉米在生产上的主要利用途径是杂种优势。表观遗传学作为一门新兴的分子遗传学学 科，已经在基因表达和调控所控制的各种分子机制中表现了重要作用，因而从表观遗传 学角度来探讨杂种优势为玉米杂种优势可能机理的揭示提供了一个新的途径和方式，也 为我们对此进行研究提供了广阔的空间。因此本试验从玉米基因组d n a 甲基化的水平和 的模式角度研究亲本自交系和它们的杂交组合间的甲基化的遗传传递和变异情况，来探 索d 姒甲基化在玉米中的分布和存在的规律性，以及杂釉优势和d n a 甲基化之间的可能关 系，并为培育优良的玉米品种提供理论依据。另外通过玉米在发育过程中d n a 甲基化的 变化来研究甲基化对植物生长发育的影响，进一步探索甲基化在基因表达和调控中的作 用。研究的主要内容包括以下方面： 1 对玉米亲本自交系和杂种一代基因组d n a 的甲基化水平的比较分析，从总体掌握 玉米基因组d n a 的甲基化分布状况和亲子代间甲基化存在主要差异。 2 研究玉米亲本自交系杂交过程中d n a 甲基化模式的传递和变异情况，探讨杂交过 程中甲基化模式的表观遗传机制及同杂种优势的可能联系。同时对于玉米杂种优势的利 用和培育新的优良玉米品种具有理论指导意义。 3 对玉米不同发育阶段( 幼苗、胚和胚乳) 的d 甲基化模式和水平进行比较研究， 掌握玉米在生长发育过程中的表观遗传的规律。 1 供试材料 材料与方法 常用玉米自交系m o l 7 、丹3 4 0 、7 8 5 9 9 ( 由吉林农业大学杨伟光教授提供) 均已进 行2 0 代严格套袋自交，2 0 0 4 年春播种于吉林农大试验田，常规田间管理方式，并按完 全双列杂交方法配制杂交组合，详见表l ： 表1 亲本自交系间杂交组配方式 m 0 1 7 丹3 4 0 7 8 5 9 9 m o l 7 ( m ) 丹3 4 0 xm 0 1 7 ( 丹m ) 7 8 5 9 9xm 0 1 7 ( 8 m ) ( m 丹) 丹3 4 0 ( 丹) 7 8 5 9 9x 丹3 4 0 ( 8 丹) ( m 8 ) 丹3 4 0 x7 8 5 9 9 ( 丹8 ) 7 8 5 9 9 ( 8 ) 每个杂交组合各配制三穗，在母本授粉后1 5 天，取亲本自交系m 、丹、8 及其杂交 种8 m 、m 8 、m 丹、丹m 、8 丹、丹8 的幼胚和胚乳，分别提取基因组d n a ，每个材料各取 两个果穗。剩余一个果穗待种子成熟后收获，干燥后脱粒并在室内培养，待幼苗长至5 6 周，提取幼苗基因组d n a 。所有实验材料的发育时期和生长状态均保持一致。 2 实验方法 2 1 植物基因组d n a 的提取与纯化 用改良的c t a b 法“”3 提取上述植物材料( 幼苗、幼胚和胚乳) 的基因组d n a 。首先 液氮研磨成粉，转入5 0 m l 离心管内。加入等体积d n a 提取缓冲液( a 液：o 3 5m 0 1 l s o r b i t o l ，0 1m o l lt r i s h c lp h7 5 ，0 5 l m 0 1 le d t a ，b 液：o 2m 0 1 lt r i s h c l p h 7 5 ，0 0 5 m o l le d t ap h8 0 ，2 m o l ln a c l ，2 c t a b ，c 液：5 n 1 a u r o y l s a r c o s i n e 。 a 、b 、c 液按1 ：1 ：o 4 混合，混合前加d n a 提取缓冲液总体积1 的p v p 于b 液中， 置于6 5 的恒温水浴摇床上，于4 0 5 0 r p m 振摇9 0m i n 。冷却至室温然后加入等体积 的氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ，轻轻上下颠倒1 0 1 5 分钟，之后于4 0 0 0 r p m 离心1 0 一1 5 分钟。 吸取上层水相，加入2 3 体积的预冷的异丙醇，上下颠倒1 0 分钟并置4 冰箱内l o m i n ， 一2 0 于3 0 0 0 r p m 离心1 0m i n ，倒掉液体，将d n a 于7 0 乙醇中过夜。然后弃去乙醇将 风干后的d n a 置于加1 m 1t e 使其完全溶解。 加入5 “1 不含d n a 酶的r n a 酶，3 7 温浴3 0 m i n 以除去d n a 中的r n a 。然后于 1 2 e p p e n d o r f 管中按提取程序进行纯化。最后将7 0 乙醇中过夜的d n a 溶于2 0 0 一5 0 0ult f 中。待d n a 完全溶解后进行1 琼脂糖凝胶电泳，检查d n a 的质量并据已知的d n a m a r k e r 估计其浓度。将d