（微生物学专业论文）乳酸菌素产生菌的筛选及其发酵产物性质的初步研究.pdf

感型) ： 绿脓杆菌( p s e u d o m o n a s p y o c y a n e a ) ； 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o p ) ； 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ： 伤寒杆菌( s h i g e l l ad y s e n t e r i a e ) ； 痢疾杆菌( s a l m o n e l l at y p h i ) ； 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ， 黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) ： 白地霉( g e o t r i c h u mc a n d i d a e ) ； 后五者为本实验室保存其余均为成都药检所提供。 2 实验方法 2 1 乳酸菌素效价的测定。”1 由于该抗生物质尚在研究阶段，没有标准品做参照，故以硫 酸庆大霉素作为对照，制作硫酸庆大霉素的标准曲线，乳酸菌素 效价以对绿脓杆菌具有相同抑菌效果的硫酸庆大霉素标准品的效 价定义。 2 1 1 指示菌的制备 用l o m l 生理盐水将一支3 7 培养过夜的p s e u d o m o n a s p y o c y a n e a 斜面细胞洗下制成蔚悬液。 2 1 2 测定平板的制备 采用双层平板。下层：1 5 水琼脂培养基l o m l 。上层：l o o m l 测定培养基分装到2 5 0 m l 三角瓶，置4 86 c 水浴保温。向每l o o m l 测定培养基中加入指示菌悬液l m l ，摇匀，l o m l 平m l 甫e j 成测定 平板。 2 1 3 测定方法( 一剂量法) 2 1 3 1 标准曲线的绘制 1 ) 配制6 0u m l 、7 0u m l 、8 0 u m l 、9 0u m l 、1 0 0u m l 、 1 1 0u m l 、1 2 0u m l 、1 3 01 3 m l 、1 4 0u m l 、1 5 0u m l 的 硫酸庆大霉素标准溶液。 2 ) 取制备好的测定平板l o 套，每个测定平板中均匀放置6 个牛津杯( 1 0 8 6 e m ) ，每间隔的3 个牛津杯放o 3 m l 1 0 0 u m l 中间浓度硫酸庆大霉素标准品，其余3 个牛津杯 放o 3 m l 同一浓度标准硫酸庆大霉素标准溶液，每一浓度 做兰个重复。全部平板用瓦盖盖住，置于3 76 c 培养箱中培 养1 5 小时，测定抑菌圈直径。 3 ) 将上述3 0 个平板中3 0 个1 0 0 u m l 中问浓度硫酸庆大霉素 标准品的抑菌圈赢径的平均值作为标准曲线的校正点，将每 个浓度所得的平均值校正成适当的数值。 4 ) 以上述l o 个浓度的硫酸庆大霉素标准溶液校正后的抑菌圈 直径( m m ) 为纵坐标，相应的浓度对数为横坐标，在双周 半对数坐标纸上绘制标准曲线。或将上述数据以d = ai s c + p 进行回归，其中：d 为抑菌圈宣径( 瑚 ，c 为掷制夯浓度 ( u m l ) ，d 、1 3 为常数。 图1 标准曲线中牛津杯的排列位置照片 ( c o 为中心浓度，c k 为其它浓度) 2 1 4 发酵液效价的测定 将发酵液按标准曲线制备方法进行加样，每一浓度做三个重 复。置于3 7 。c 培养箱中培养1 5 小时，测定抑菌圈直径。对照标 准曲线计算发酵液效价。 3 乳酸菌素产生菌的筛选与鉴定 3 1 有抑菌活性菌株的筛选与鉴定 3 1 1 有抑菌活性菌株的初筛“训 初筛采用纸片法。将样品用无菌水适当稀释，取一定量涂布 于固体筛选培养基。3 06 c 倒置培养7 2 h ，待长出菌落后用灭菌牙签 挑取单菌落接种于加有l m l 筛选培养基的1 5 m l 离心管( e p 管， e p p e n d o r f t u b e ) 中，密封，3 0 c 静置培养7 2 h 。1 0 ，0 0 0r m i n 离心l m i n ， 取发酵上清液2 0 乩于三层直径为5 r a m 灭菌纸片，在抑菌活性检 测用培养基中顺置3 0 分钟后于3 7 培养箱中倒爱培养1 5 h ，挑取 纸片周围具有较大抑菌圈及发酵产物具有广谱抗性的菌株进行复 筛。 0 0 0 0 一灭菌 直径5 越m 豹 l 吸取上 三层纸片 清液 零等可号 在e p 管内 3 7 倒置- 培养1 5 h o 测定平板 选取纸片周围有明显 抑菌圈的菌株，记录 图2 有抑篮作用菌株韵筛选流程 静置3 0 r a i n 图3 抗生物质产生菌的初筛方法( 纸片法) 照片 3 1 2 有抑菌活性菌株的复筛 复筛采用杯碟法。将初筛菌株咀划线法进行纯化，保藏。将 纯化保藏后的初筛菌种接入装有1 5 0 m l 筛选培养基的1 5 0 m l 三角 瓶中活化7 2 h ，按1 的接种量按入装有2 5 0 m l 筛选培养基的 2 5 0 m l 三角瓶中，3 0 。c 静置培养4 8 h 。将发酵液以3 0 0 0r m i n 离心 1 0 m i n ，以杯碟法测定各菌株发酵上清液抑菌活性。 3 1 ，3 酸及酸性末端产物作用的检测与排除溆，3 2 1 发酵液对指示菌的抑制作用可能是乳酸菌素也可能是酸。为 了排除酸及其它酸性末端产物的干扰，用1 n 的n a o h 和1 n 的 h c i 将h f 0 8 离心发酵上清液中和至p h 3 5 、4 0 、45 、5 0 、5 5 并设p h 5 0 的乳酸作对照，而后做对指示菌的抑菌实验。 3 1 4 过氧化氢作用的检测。“ 发酵液对指示菌的抑制作用也有可能是发酵过程中产生了过 氧化氢。为了排除过氧化氢的干扰，采用过氧化物酶法对i - i f 0 8 菌 株进行发酵过程中过氧化氢产生的检测。 3 1 5 菌种的初步鉴定 采用形态观察和生理生化实验相结合的方法，根据文献 2 0 和 2 1 进行特性鉴定，并以伯杰细菌鉴定手册( 第八版) 2 1 作为 分类参考。 3 1 6 扫描电镜的制片方法”“”1 1 ) 菌液用0 i m 磷酸盐缓冲液( p b s ) ( p h 72 ) 洗三次。 2 ) 后一次悬于适量p b s 中，浓度以滴在3 4 毫米2 小玻片 上密度均匀菌落不互相重叠为宜( 稍多为宣，因为在固定 相脱水过程中要掉许多) 。 3 ) 在3 4 毫米2 小块盖片上，铺放f o r m v r a 膜( 方法同超薄 切片) ，3 7 干燥。 4 ) 将菌悬液，稀释到适当浓度后，滴在铺有f o r m v r a 膜的小 玻片上，室温静置十分钟，将多余细胞悬液吸去。 5 ) 面朝上，把小玻片放入小称量瓶底部，用吸管沿瓶壁缓慢 加入i 冷却的戊二醛溶液，加的量只要淹过样本即可，4 固定2 小时以上，可过夜或更长时间。 6 ) p b s 洗三次。 7 ) 随即加1 四氧化锇，固定3 0 分钟( 亦可2 3 小时) 。 8 ) 用p b s 洗三次。 9 ) 逐级脱水：5 0 7 0 ，9 0 丙酮各一次，1 0 0 两次，每次5 1 0 分钟。 1 0 ) 用醋酸异戊酯取代丙酮，程序为：5 0 ，7 0 ，9 0 醋酸异 戊酯丙酮溶液各一次，1 0 0 两次，时间与丙酮相同( 各 级醋酸异戊酯用1 0 0 丙酮配制而成) 。 4 11 ) 放入临界点干燥仪进行干燥。 1 2 ) 以碳、金分别喷镀。 取出洋本，扫描电镜观察( 如不能立即观察，则应继续保存在真 空条件下或干燥器内) 。 3 1 7 抗茵谱分析 采用液体扩散法( 管碟法) ，将 球0 8 菌株的发酵液离心，取 0 3 m l 上清液置于不同供试菌平板上的牛津小杯中，于供试菌的生 长温度下培养 8 2 4 h ，或者更长时间，观察有无抑菌圈出现以及 抑菌圈大小。 4 发酵条件的研究 4 1 发酵时间与抗菌活- 眭的关系 为了测定i - i f 0 8 菌株发酵液抑菌活性最高的时段，以绿脓杆菌 ( p s e u d o m o n a sp y o c y c t n e a ) 为指示茁( 以下同) ，将i - i f 0 8 菌株接种 子m r s 培养基中，1 0 0 m l 三角瓶装l o o m l 培养基，3 0 静置培 养7 2 h ，以l 的接种量转种进行二级扩大发酵，2 5 0 m l 三角瓶装 2 5 0 m l 培养基，3 0 静置培养，从2 4 h 起，每隔1 2 h 取样离心取 上清液以管碟法做抑菌试验，以二级发酵时间( h ) 为横坐标，相 对效价( ) 为纵坐标，制作h f 0 8 菌株的抑菌活性时程曲线。 4 2 单因素实验 测定不同的碳源、氮源、起始p h 、摇瓶装量、培养温度、培养 时间、培养方式和接种量对抑菌活性的影响。 43 正交实验”蚓 为了了解培养基主要成分对菌株代谢产生揶菌活性物质的影 响，选取了培养基中的三个主要成分：碳源和两种氮源物质迸行 三因子三水平的正交实验，选取l 9 ( 3 4 ) 正交表。 对一剂量法标准曲线进行线性回归分析，回归方程为 d = 2 68 0 9 1 9 c 一3 l9 3 3 ，其中1 0 0 u m l 的硫酸庆大霉素为中心浓度， d 为抑菌圈直径( m m ) ，c 表示硫酸庆大霉素浓度( u m l ) ，线性 范围为6 0 一1 5 0 u m l ，线性相关系数r = 09 9 7 ，表明一剂量法标准 曲线有很好的线性关系。 2 乳酸菌素产生菌的筛选与鉴定 2 1 菌种的分离与筛选 样品经选择性培养基培养后生长大量菌落，在长出5 0 l o o 个单菌落的平板上共挑取了4 5 6 株典型菌株接入e p 管中进行抗生 物质产生菌的筛选，供试菌为金黄色葡萄球菌a 3 0 l f s t a p h y l o c o c c u s a u r e l t sa 3 0 1 ) 、金黄色葡萄球菌a 3 0 9 f s t a p 觚l o c o c c u s a u r e u sa 3 0 9 ，青霉素敏感型) 、绿脓杆菌 ( p s e “d o m o n a s p y o c y a n e a ) 、大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 和枯草芽孢 杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 。经培养，在大薰纸片周围出现不同童径的 抑菌圈，其结果见表3 ，表4 ，表5 。 表3 有抑菌作用的菌株筛选结果 项目 发酵产物对五种致病菌都有抑制作用的菌株数( 株) 发酵产物对四种致病苗有抑制作用的菌株数( 株) 发酵产物对三种致病菌有抑制作用的菌株数( 株) 发酵产物对二种致病菌有抑制作用的菌株数( 株) 发酵产物对一种致病菌有抑制作用的菌株数( 株) 阳性菌株数( 株) 从平板中挑出进行检测的菌株数( 株) 从出发菌中筛出有抑菌作用菌株的比率 目一8 7 6 3 强 艳 誓煳鹞盯叭伯溺螂 表4 发酵产物对指示菌有抑制作用的菌株数目统计及分析 项目 数目( 株)检出率 对金黄色葡萄球菌a 3 0 1 有抑制作用的 1 4 03 0 7 菌株 对金黄色葡萄球菌a 3 0 9 育抑制作用的菌 1 6 l3 5 3 9 6 株 对绿脓抨菌育抑制作用的菌株 2 6 05 7 对大肠杆菌有抑制作用的菌株 1 8 34 0 1 对枯草芽孢杆菌有抑制作用的菌株 1 3 32 9 2 从平板中挑出进行检测的菌株4 , 5 6 一 表5 对每种指示菌有抑制作用的菌株数目统计及分析 抑菌圈直径( m a ) 抗生菌 金黄色葡金黄色葡绿脓杆菌大肠杆菌枯草芽孢 菌号 萄球菌萄球菌杆菌 a 3 0 la 3 0 9 h f 0 81 67 01 7 7 82 0 9 41 5 ，9 21 8 3 8 h f 2 11 5 3 41 4 ，4 01 4 3 61 5 9 41 4 0 4 h f 3 71 5 4 21 5 6 41 5 2 01 48 41 6 2 8 h f 5 2 1 5 0 01 3 ，6 61 4 4 01 3 9 21 3 7 6 h f 6 8 1 4 6 61 5 6 2t 2 4 81 5 0 41 6 3 6 h f 7 9 1 6 6 81 4 9 01 5 3 81 5 8 81 4 8 0 h f 9 4 1 65 21 6 2 01 4 0 6 1 42 2 1 6 0 6 h f l o l1 5 2 01 5 9 81 5 0 31 4 0 0t 5 6 0 h f 2 1 7 1 5 7 81 7 2 81 5 9 21 3 3 01 4 6 8 22 复筛结果 经复筛，发现9 株对五种指示菌均有抑制作用且抑菌活性较 强的菌株。将这9 株菌在相同条件下经多次重复试验，确定h f 0 8 菌株抑菌活力最强且稳定，特别是对绿脓杆菌具有较强抑菌活性 ( 图5 ) 。因此选择h f 0 8 菌株作为进一步实验的出发菌株。 图5 发酵液对绿脓杆菌的抑制作用 23 酸及酸性末端产物作用的检测与排除 经过1 5 h 培养，乳酸对照纸片周围没有出现抑菌圈，说明5 种 指示菌均可耐p h 5 0 的乳酸。相反h f 0 8 虽然对各指示菌抑菌程度 存差异，但都表现出一定程度抑制作用，说明排除酸作用后仍有 抑菌活性物质存在( 表6 ) 。 2 4 过氧化氢作用的检测 i - i f 0 8 菌株在发酵2 0 、2 5 、3 0 、3 5 、4 0 、4 8 h 分别进行过氧化 氢的检测，均无红色醌式染料形成，说明发酵过程中都没有过氧 化氢产生，它的抑菌作用不是过氧化氢的作用。 表6 不同p h 下h f 0 8 菌株发酵液与乳酸 对绿脓杆菌的平均抑菌圈直径 p h 值h f 0 8 菌株发酵液乳酸 3 51 7 6 4 01 5 2 4 51 2 1 5 09 4 5 59 1 2 5 菌种初步鉴定结果 2 5 1 形态特征 菌体为短杆状( 图6 ) ，长1 2 2u m ，宽o 7 5 1u m 。不产芽孢 ( 表7 ) 。 2 5 2 培养特征 菌落较光滑，乳白色，边缘整齐，无缺刻。 2 5 3 主要生化特征 革兰氏反应阳性，细胞色素氧化酶阴性，过氧化氢酶阴性，mr 试验阳性，v p 试验阴性，不能水解明胶及酪素，硝酸盐还原试验 阴性，靛基质试验阴性，不产h 2 s ( 表8 ) 。 根据各项指标的测试结果，筛选得到的h f 0 8 菌株初步鉴定为 瑞士乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s ) 。 26 菌株传代稳定性 将菌株在m r s 斜面培养基上传代1 0 次，每代均接种发酵测定 抑菌活力，结果表明该菌株具有较好的传代稳定性。 5 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 。0 0 0 1 2 。0 0 0 图6h f 0 8 菌株的扫描电镜照片 表7l i f 0 8 菌株形态特征观察结果 太 菌落特征 表面形态 表面形状颜色透明度革兰氏 反应 h f 0 8 菌株光滑圆形乳白色不透明 + 项目 菌体特征 菌瓤 菌体形状长( u 柚)宽( u ) 鞭毛 h f 0 8 菌株短杆状1 2 2 u =0 7 5 1 “m 表8f i f 0 8 菌株的生理生化特征 项目 半乳糖 鼠李糖 棉于糖 山梨醇 木糖 松三糖 d 一果糖 菌株项目菌株 + 蔗糖 一 乳糖 一 麦芽糖 一 甘露醇 一 葡萄糖( 酸) 一 葡萄糖( 气) 2 7 抗萄谱分析 乳酸菌素产生菌h f 0 8 可以抑制多种革兰氏l i 醴性菌和革兰氏阴 性菌的生长，但来发现其对真菌和霉菌的抑制作用( 表9 ) 。 指示苗名称 金黄色葡萄球菌a 3 0 1 ( 置a “，p a 3 0 1 ) 金黄色葡萄球菌a 3 0 9 ( 工a u ，e u sa 3 0 9 ) 枯草芽孢杆菌 ( 应s u b t i h s ) 绿脓杆菌 ( 尸p f o c y a b o 日) 大肠杆菌 ( ec o l i ) 伤寒杆菌 t s d r s e n t e r i a e 、 ，痢疾杆菌 ( t y p h i ) 酿酒酵母 ( sc e f e v l s l a e ) 白地霉 ( 奠c a d i 幽e ) 黑曲霉 表9h f 0 8 菌株的抗茁谱分析 分类砘位抗菌活性 g + 细菌 + g + 细菌 + + g + 细菌 g 细菌 g 细蕴 g 一细菌 + g 细菌 真菌 真菌 霉菌 ! 是r 照盟 “+ 一”表示抗菌活性很强“+ + ”表示较强，“一表示一般“一”表示无抗 菌活性。 3 3 正交实验 3 3 1 确定因素和水平 从单因素实验中发现，不同碳源和氮源对h f 0 8 发酵产物抑菌活 力影响比较大，因此选用正交表l 9 ( 3 1 ，设计一个三因素三水平 实验确定最佳的碳源和氮源含量。 3 3 2 实验结果 正交实验结果如表1 2 所示。通过比较极差可以看出各因素的 主次：培养基中蛋白胨含量对h f 0 8 发酵产物抑菌活性的影响较 大，葡萄糖与酵母膏含量其次，但同样有较大影响。 通过直接分析，可以确定发酵培养基中碳源与氮源的优化配 方：a 2 8 2 c 2 , 优化方案于单因素实验结果一致。因此，优化后的发 酵培养基组成为：大豆蛋白胨1 00 ，牛肉膏1 0 0 ，酵母提取物5 0 ， 葡萄糖2 00 ，k 2 i i p 0 4 2 0 ，柠檬酸三铵2 0 ，乙酸钠5 0 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 8 ，m n s 0 4 4 h 2 002 5 ，吐温8 0l m l ，发酵产物的抑菌 活性可达1 4 1 u m l 。 4 h f 0 8 产乳酸菌素的特性 41 对蛋白酶k 的敏感性 将发酵上清液1 m l 用l n 的n a o h 和1 n 的h c i 调节p h 为蛋 白酶k 的最适作用p h 7 6 ，按o 5 m g m l 加入蛋白酶k ，在3 7 * 0 下 温育1 h 。将p h 值调回到乳酸菌素的最适p h 55 ，以未经处理的原 液为对照，进行抑菌试验，结果如图1 2 。由图1 2 可知，h f 0 8 所 产乳酸菌素经蛋白酶k 处理后，几乎完全丧失抑菌活性。因为该 菌株所产的抑菌物质可抑制革兰氏阳性菌，也可以抑制革兰氏阴 性菌，而且这种抑菌结果经试验排除了酸及过氧化氢的作用，再 加上对蛋白酶k 敏感，因此可以初步认为该菌产生一类具有广谱 抑菌活性的类细菌素物质。 4 2 热稳定陛 取等量的粗提液分别于5 0 ，7 0 ，9 0 和1 2 1 保温2 0 m i n ， 以来经处理的粗提液为对照，做抑菌试验。随着温度的升高，h f 0 8 粗提液的抑菌活性有一定下降，但粗提液在1 2 1 处理2 0 r a i n 后仍 能保持7 0 以上的活性，这证明该乳酸菌素具有相当好的热稳定 性。 表1 2 正交实验结果 实验号 葡萄糖含 蛋白胨含 酵母膏含 抑菌圈直抑菌活力 量量量 径( u m l ) ab( m m ) n o 1il12 37 51 1 9 4 ：5 n o 2l222 5 2 71 3 6 l l n o 3 i 3 32 08 59 3l l n o4 2122 ：51 31 3 44 3 n o 5 2232 4 0 71 2 27 2 n o 6 2 3 l2 40 31 2 22 6 n o 7 3i32 49 61 3 25 0 n o 832 l2 4 8 71 3 1 4 6 n o933 2 2 26 2 1 0 83 9 k i3 4 86 73 8 63 83 7 3 1 7 k 23 7 94 l 3 9 0 2 93 7 89 3 硒3 7 2 - 3 53 2 3 7 63 4 83 3 k l 1 1 62 21 2 87 9 1 2 4 3 9 k 21 2 6 4 71 3 0 1 01 2 63 l k 31 2 4 1 21 0 7 9 21 1 6 l l 极差1 0 2 5 2 2 1 8 1 0 2 0 优化方 a ， b 2c 2- 案 k i 为各因素第i 水平所在实验中对应的实验指标之和 k i 为k i 的平均值 极差为k i 最大值与最小值的差 图1 2 蛋白酶k 处理后抑菌实验结果 1 未经处理的发酵液 2 经蛋白酶k 作用的发酵液 4 3 不同p h 值对粗提液抑菌活性的影响 发酵液的抑菌活性随着p h 值的升高而下降，当p h 为6 0 时， 抑菌活性完全丧失。这说明h f 0 8 所产乳酸菌素在酸性条件下稳 定，显示抑菌活性的p h 值范围是3 5 5 5 ( 表1 3 ) 。 表1 3 不同d h 值对发酵液抑菌活性的影响 p h 值抑菌圈平均直径m m 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 未经处理的原液 2 0 0 4 1 6 0 0 1 2 6 2 9 6 4 9 0 0 2 0 0 0 4 4 金属离子对发酵液抑菌活性的影响 发现微量( 0 0 0 2 m o v l ) k 和m n 2 + 对乳酸菌素的抑菌活性有 增强作用，f e ”、c u ”、c a 2 + 有抑制作用，而n a + 和m 9 2 + 对其影 响不大( 图1 3 ) 。 匡 霎。褊j冀蜃i 鎏， 羹 霎震羹i k + h a 舯秽f e 簖潆对照 图1 3 金属离子对发酵液抻菌活性的影响 5 h f 0 8 菌株的质粒提取及琼脂糖凝胶电泳 采用碱裂解法对h f 0 8 菌株细胞进行质粒提取，经过琼脂糖凝 胶电泳，得到了一条比较明显的质粒带，质粒大小约为2 7 k b 左 右。如图1 4 所示。 。 6 h f 0 8 菌株的质粒消除结果 采用变温一s d s 法交替传代对菌体细胞进行质粒消除，将交替 传代后的培养液适当稀释后涂步于筛选培养基平板上，待长出菌 落后对其进行质粒提取和检测，确定质粒消除突变子，命名为 h f 0 8 4 。经琼脂糖凝胶电泳发现，已经检测不到先前那样的质粒带， 证明该菌质粒已经被消除，结果如图1 5 所示。 7 h f 0 8 菌株抑菌活性基因位置的初步确定 将h f 0 8 4 以复筛方法检测抑菌活性，实验结果显示h f 0 8 4 丧失 o $麓磊霉 4 4 金属离子对发酵液抑菌活性的影响 发现微量( 0 0 0 2 m o v l ) k 和m n 2 + 对乳酸菌素的抑菌活性有 增强作用，f e ”、c u ”、c a 2 + 有抑制作用，而n a + 和m 9 2 + 对其影 响不大( 图1 3 ) 。 匡 霎。褊j冀蜃i 鎏， 羹 霎震羹i k + h a 舯秽f e 簖潆对照 图1 3 金属离子对发酵液抻菌活性的影响 5 h f 0 8 菌株的质粒提取及琼脂糖凝胶电泳 采用碱裂解法对h f 0 8 菌株细胞进行质粒提取，经过琼脂糖凝 胶电泳，得到了一条比较明显的质粒带，质粒大小约为2 7 k b 左 右。如图1 4 所示。 。 6 h f 0 8 菌株的质粒消除结果 采用变温一s d s 法交替传代对菌体细胞进行质粒消除，将交替 传代后的培养液适当稀释后涂步于筛选培养基平板上，待长出菌 落后对其进行质粒提取和检测，确定质粒消除突变子，命名为 h f 0 8 4 。经琼脂糖凝胶电泳发现，已经检测不到先前那样的质粒带， 证明该菌质粒已经被消除，结果如图1 5 所示。 7 h f 0 8 菌株抑菌活性基因位置的初步确定 将h f 0 8 4 以复筛方法检测抑菌活性，实验结果显示h f 0 8 4 丧失 o $麓磊霉 抑菌活力。由此我们可以初步判定h f 0 8 菌株对各种指示菌有抑菌 活性的乳酸菌素基因可能由质粒编码。 图1 4h f 0 8 菌株质粒d n a 的琼脂糖凝胶电泳 1 ：m a r k e rd l2 0 0 0 ：2 ：h f 0 8 菌株质粒d n a 图1 5h f 0 8 蔼株的琼脂糖凝胶电泳图 1 ：n i a r k e rd l2 0 0 0 ；2 ：质粒消除实验后的h f 0 8 “菌株 l a c t i c i nb 、a c i d o p h i l u c i na 和c a s e i c i n8 0 等。 ( 3 ) 羊毛硫细菌素 羊毛硫细菌素是一类有特殊生物活性的多肽，它岔有脱水氨 基酸和羊毛硫氨酸残基，形成分子内硫醚键。这样单硫桥决定了 羊毛硫细菌素具有多环结构。根据羊毛硫细菌素的环间的位景， 可以将它们分为两种类型，线型( g r o u p a ) 和环形( g r o u p b ) 。 乳链菌肽是目前研究最清楚的羊毛硫细菌素。 2 2 3 乳酸菌素的分子结构 1 9 7 1 年g r o s e 和m o r e l l 首次对n i s i n 的分子结构进行了报道。 n i s i n 是由3 4 个氨基酸残基组成，分子末端有氨基和羧基。对于 n i s i n 单体，分子中含有5 种稀有氨基酸，分别为氨基丙酸( a b a ) ， q 、b 一不饱和二脱氢丙氨酸( d h a ) ，b 甲基二脱氢丙氨酸( d 皿) ， 羊毛硫氨酸( a l a s a l a ) 和t 3 甲基羊毛硫氨酸( a l a s a b b a ) ， 通过硫醚键形成5 个环。分子量为3 5 1 0 ，另外，其二聚体和四聚 体也有报道，分子量分别为7 0 0 0 和1 4 0 0 0 。 3 、乳链菌肽( n is i n ) 乳链菌肽亦称乳酸链球菌素，属于n 血清型的某些乳酸链球 菌( 现称为乳酸乳球菌) 产生的一种多肽物质。乳酸乳球菌是乳 酸乳球菌属最典型的一种，该菌是兼性厌氧的革兰氏阳性球菌， 细胞对生，卵圆型，它长期以来被广泛应用予各种发酵奶制品。 1 9 4 4 年，m a t t t i k 和h i r s c h 证明由乳酸链球菌产生的乳链菌肽可抑 制许多g + 细菌并将这种生物抑制剂称为n i s i n l l l i 。由于它可用作人 类食物的天然防腐剂，从而引起世界许多国家重视。 31 乳链菌肽的应用“2 川： 对乳链菌肽的研究起先集中于是否具有抗生素效能的药物应 用领域。m a t t i c k 和h i r s c h 研究乳链菌肽作为药物应用的潜力，并 获得了许多重要的致病菌对乳链菌肽敏感的鼓舞人心的结果。可 是此后研究发现由于n i s i n 在生理p h 下的低溶解性和消化系统中 某些酶对它的破坏作用，从而使n i s i n 作为药物应用的潜力就失去 了基础。正是由于n i s i n 不能作为药物、低毒，没有生长刺激作用 以及它对奶制品中的大部分致病菌如金黄色葡萄球菌，肉毒梭菌 以及大部分罐头食品腐败微生物杀死或抑制作用，从而展示了用 作食品防腐剂的极好特性。研究表明由于n i s i n 这种天然防腐剂在 一些乳制品，罐头食品及肉食品中的使用，不但可明显延长货架 期，同时也可节省能量，改变质地和外观。目前全世晃约有5 0 个 国家和地区包括我国都已批准乳链菌肽作为食品防腐剂。 乳链菌肽不仅可作为食品防腐剂，而且还可控制酒类发酵中 的污染，它也可与其它灭菌手段结合使用增强杀菌效果，因此可 用于清洗设备和容器等。 我国人口多，食品消耗量大，研制开发无毒高效食品防腐剂 是发展我国食品工业，保障人民身体健康一个急需解决的问题。 对乳链菌肽这种天然食品防腐荆的研究和开发无疑会带来重大的 经济效益。 3 2 乳链菌肽的结构 乳链菌肽是第一个阐明结构的羊毛硫细菌素f h i 。成熟的乳链 菌肽分子含有3 4 个氨基酸残基，属于线型结构，有五个硫醚键形 成的分子虑环，一个是羊毛硫氨酸，其它四个是b 甲基羊毛硫氨 酸。乳链菌肽不含芳香族氨基酸，在2 8 0 n m 无吸收峰( 图2 ) 。 6 0 l 矗t 蓦t 舯簟 t b ) 帆 图2 乳链菌肽前体的加工及成熟孚l 链菌肽分子的结构 乳链菌肽的分子量约3 5 1 0 d a ，其分子可能会出现二聚体和四 聚体，分子量分别为7 0 0 0 d a 和1 4 0 0 0 d a 。目前已在自然界中发现 了两种乳链菌肽的天然变异型，n i s i n a 和n i s i n z 。二者的差异仅 存在于成熟分子的第2 7 位氨基酸残基上，n i s i n a 为组氨酸，n i s i n z 则为天冬酰胺。一株乳链菌肽产生菌只能产生一种乳链菌肽。在 己分离的乳链菌肽产生菌中，二者的分布是均等的。比较两者的 溶解度和抑菌谱仅有微小的差异，但通过反相高压液相层析对这 两种乳链菌肽进行研究时，结果表明n i s i nz 在洗脱时明显地延迟 于n i s i na f l 5 】a 3 3 乳链菌肽的性质 6 1 331 物理和化学| 生质 对n i s i n 氨基酸序列研究清楚后，人们发现n i s i n 具有亲水和 疏水两重性，即在n 末端存在大量的疏水残基，在c 末端存在着 亲水基团。n i s i n 具有3 个阳离子( n i s i n z 有2 个) ，表现为阳离子 多肽的特性，其等电点在碱性范围。n i s i n 的溶解性、稳定性和生 物学特性部与溶液的p h 值密切相关。n i s i n 的溶解度随p h 值的下 降而提高，p h 值2 5 时溶解度为1 2 ，p h 值为50 时下降到4 ， 在中性及碱性条件下几乎不溶解【i “。 n i s i n 稳定性与其在不同p h 值下的溶解度有关。乳链菌肽的 溶解度随着p h 值的下降而显著增高，p h 2 它的溶解度可达 5 7 m m l ，p h 6 时大约为1 5 m m l ，在中性和碱性条件下几乎不溶。 n i s i n 溶液在p h 25 或更低口h 的稀盐酸溶液中煮沸，其活性 不发生变化，即使在p h 2 0 、1 1 5 6 加热一定时间，n i s i n 还很稳 定：1 2 1 时，加热3 0 m i n 还未失去活性。当p h 值超过4 时，特 别是在加热条件下，它在水溶液中迅速失去活性。n i s i n 的抑菌效 果最佳的p h 范围时6 5 68 ，然而在这个p h 范围内，稳定性最差， 如当p h 为5 0 和68 时，活性分别丧失4 0 和9 0 。但乳链菌肽 加入食品后由于受到牛奶、肉汤中大分子的保护稳定性大大提高。 乳链菌肽可被人体中的胰凝乳蛋白酶降解，因而乳链菌肽不会在 体内残留或造成体内致病菌的抗药性。对乳链菌肽的素养性与生 物学研究表明它对人体是安全的。其半致死量与食盐相近。乳链 菌肽这一性质使它成为一种应用前景看好的天然食品防腐剂。 温度也影响n i s i n 的抑菌作用，在一定的温度范围内，随温度 的升高活性有所降低。在原料干酪( p h 56 60 含水5 4 ，5 8 ) 中 添加n i s i n ( 2 5 1 0 5 单位k g ) ，经巴氏灭菌后将其贮藏在不同的温 度下，3 0 d 后测其活性，发现n i s i n 残留量分别为：2 0 为9 0 ； 2 5 为5 5 ；3 0 为4 0 。另外，n i s i n 的稳定性还与其它因素如 溶液的化学组成、蛋白质的保护作用等有关【l ”。例如，n i s i n 可以 与某些蛋白质产生可逆的吸附作用，当n i s i n 被加热时，这种吸附 作用可能对n i s i n 起保护作用。如食品中的牛奶、肉汤等均可使其 稳定性大大增强。在冰箱中保存n i s i n 数日后未发现其化学和生物 特性发生变化。如果n i s i n 呈干燥状态，可在几年内保持活性。 3 32 乳链菌肽的生物学特性 当n 胰蛋白酶、胰酶制剂和枯草杆菌肽作用n i s i n 后，会使 其失去活性，但羧肽酶a 、胰肽酶e 、肠肽酶、胃蛋白酶和胰蛋白 酶对n i s i n 无作用。h u r s t i ”l 报道，n i s i n 对a 凝乳蛋白酶、胰酶、 消化酶、唾液酶等很敏感，但对粗制凝乳酶、脂酶、淀粉酶不敏 感，在酸性条件下，1 0 0 ，1 0 m i n 对链霉蛋白酶不敏感。 3 3 3 乳酸菌素的抑菌作用机制 防腐剂的抑菌作用机制是近年的研究热点之一，并不断取得 突破。n i s i n 被微生物吸附是其杀菌作用所必需的，如果在体系中 加入活性炭等吸附剂，会使抑菌时间显著延长。n i s i n 对敏感菌细 胞的吸附使用很强烈，并受p h 的影响很大l l ，在p h 65 时吸附率 达1 0 0 ，在p h 45 仅为4 3 。研究表明，n i s i n 可以引起敏感菌 细胞质的释放，从而造成细胞裂解。由于n i s i n 带有正电荷，经它 处理后的细菌细胞紫外吸收物质有泄漏现象。因此有人提出n i s i n 对于敏感菌细胞膜的作用类似于阳离子表面活性荆。又因为n i s i n 中的d h a 和d f i b 可以与敏感菌细胞膜中某些酶的硫基发生作用， 因此也有人认为n i s i n 作用机制与这两个脱水氨基酸有关1 2 。n i s i n 对营养细胞的作用主要在细胞膜上，它可以抑制细菌细胞壁中肽 聚糖等的生物合成，使细胞膜和磷脂化合物的合成受阻，导致细 胞内物质外泄，引起细胞裂解【2 l 】( 图3 ) 。 近年来，一些研究人员提出了一种“孔道形成( p o r e f o r m a t i o f i ) ” 理论【2 2 2 扪，指出：由于n i s i n 是一个疏水的带正电荷的小肽，在一 定的膜电位下，吸附于敏感菌的细胞膜上，并可通过其c 末端的 作用侵入膜内而形成通透孔道。因此有人认为n i s i n 也属于孔道形 6 3 成蛋白，由于其分子特殊的三级结构，可允许分子量小于0 5 k d a 的亲水分子通过，从而导致k 从胞浆中流出，细胞膜去极化及a t p 的泄漏，细胞外水分子流入，造成细胞白溶而死亡。 图3 乳链蘸肽与细胞膜作用的模型 为进一步研究n i s i n 的抑菌作用机制，有人利用脂单分子层体 系，研究发现，对于n i s i n z 来说，其n 末端( 1 - 2 2 ) 进入到脂相 中，而c 末端或许与n i s i n 的单体或寡聚体与阴离子脂类的离子相 互作用有关。 通过对n i s i n 抑菌谱的研究，发现n i s i n 主要杀灭或抑制g + 菌及其芽孢。而对g 一菌基本无影响。对比革兰氏阳性细菌的细胞 壁，可以发现革兰氏阳性细菌的肽聚糖层明显比革兰氏阴性细菌 的厚，而革兰氏阴性细菌的细胞壁组成比较复杂，主要包括磷脂、 蛋白和脂多糖等，十分致密，仅能允许分子量在6 0 0 d a 以下的分 子通过，而n i s i n 的分子量约为3 5 1 0 d a ，所以无法通过，因此， n i s i n 不能达到细胞膜而发生作用。同时还发现，经过处理而改变 革兰氏阴性细菌的外壁的透过性质后，革兰氏阴性细胞也对n i s i n 敏感，同时可以被抑制或杀死1 2 6 1 。这也证明了革兰氏阴性细菌对 n i s i n 不敏感是由于细胞壁的作用。在n i s i n 杀菌过程中。其分子 中所含的稀有氨基酸对n i s i n 的作用方式影响很大，国外对这一问 题的研究进行得相当活跃i ”，主要是通过蛋白质工程的手段，定 向改变n i s i n 分子中的一个或一段氨基酸组成，以对其功能进行研 究。 综上所述，n i s i n 对微生物的作用首先是n i s i n 对细胞膜的吸 附，在此过程中，n i s i n 能否通过细菌细胞壁是一个关键因素。同 时，其它因素如：口h 值、m 9 2 浓度、乳酸浓度、氮源种类等均可 影响n i s i n 对细胞的吸附作用。带有电荷的n i s i n 吸附在细胞膜上 后，利用离子间相互作用及其分子的c 末端、n 末端对结构产生 作用，形成穿膜“孔道”，从而引起胞内物质泄漏，细胞解体死亡 2 8 , 2 9 1 。 另外，n i s i n 对于孢子的作用是杀死孢子1 3 。1 ，而不是静止孢子 活性。它在孢子膨胀前就抑制了发芽过程。实验证明，经加热杀 伤的孢子对n i s i n 更敏感。图4 说明了嗜热脂肪芽孢杆菌孢子对 n i s i n 的敏感性随程度而变化。 3 34 乳酸菌素合成的遗传学研究 编码n i s i n 的遗传学密码的确切位置有两种理论，一种认为它 与质粒连锁，另一种则认为是在染色体上。支持前一种观点的主 要证据有：1 9 4 7 年，k o z a k 研究产n i s i n 的菌株的突变现象时发现， 若先以原黄素或演乙锭诱变并进行高温处理，再以n t g 进行诱变， 末检测到回复突变株。并据此推测n i s i n 基因可能位于质粒上。进 步的研究发现，n i s i n 的产生与一个1 75 m d a 的质粒有关。1 9 9 1 年，k a l e t t a 和e n t i a n ”l 从乳酸链球菌6 f 3 的质粒中成功的克隆到 了n i s i n 的结构基因。 f t 乎i t j 精i o 尊 ，o 幸o j o n o j 囊再jn 一， 谆搠中尊1 1 i 簟氆- ：一r 图4 嗜热鹰肪芽孢杆菌孢子热杀伤性预期对n i s i n 的敏感性之间的关系 近十几年来，通过对质粒消除和接合转移实验的研究也证实 n i s i n 基因位于质粒上，并认为n i s i n 产生基因( n i p + ) 、蔗糖发酵 基因( s u e + ) 和n i s i n 抗性基因( n i s + ) 是紧密连锁的。但是另一 些研究者认为p 2 】n i s i n 的基因位于梁色体上，并有实验证明一些产 n i s i n 的菌株中并不存在质粒。在结合转移实验中，虽然供体菌的 n i p + 、n i e + 、g u o + 的性状可以向受体菌转移，但在结合子中并未分 离到质粒，分离供体菌、受体菌和转移接合子染色体d n a 和质粒 d n a ，分别与和n i s i n 基因互补的1 4 寡核苷酸探针杂交，结果显 示该探针与供体菌和转移接合子染色体d n a 片段有杂交带，而与 质粒d n a 没有杂交带，从以上实验可以看出n i s i n 的产生与菌株 是否带有质粒无必然联系。 一些研究者对n i s i n 的基因定位进行了研究，他们根据对染色 体的缺失与杂交实验，提出n i s i n 结构基因与染色体上的一个可接 合转座子有关。h o m 等人则提出n i s i n 基因存在于一个7 0 k b 大小 的转座子t n 5 3 0 l 中，同时另一些研究者的工作也证实了这个转座 子的存在，且发现n i s i n 基因座不稳定。这些发现可能提示我们， n i s i n 基因位于一个可转座于质粒和染色体上的转座子中，在不同 的菌株中，n i s i n 的位黄不一定相同。 1 9 8 8 年n i s i n 基因首次被克隆出来，不同于大部分的多肽类 抗生素，n i s i n 前体蛋白是由核糖体合成，经过包括脱水、硫环形 成等一系列复杂的翻译后加工过程，最终形成有活性的成熟n i s i n 分子。对n i s i n 遗传学研究的深入，将有可能定向改变n i s i n 的溶 解度、稳定性、抑菌范围等，对于n i s i n 的应用前景有着重大而深 远的意义。 3 35 乳链菌肽生物合成基因簇及其生物合成的调控 3 3 51 乳链菌肽生物合成基因簇的结构和组成 与乳链菌肽生物合成有关的基因是以基因簇的形式存在于染 色体上约7 0 k b 的转座子上1 3 3 , 3 4 1 。该基因簇由1 1 个基因组成，约 1 3 1 4 k b ，排列j l 质序为h i s a z ，n i s b ，n i s t n i s c ，n i s i ，n i s p , n i s rn i s k ， n i s f , n i s e n i s g i ”l ( 图5 ) 。n i s a z 是乳链菌肽的结构基因n i s i 与 n i s f e g 与菌体的自身免疫有关。另几个基因与乳链菌肽翻译后修 饰有关。基因簇的转录由三个启动子控制。n i s a 上游及n i s f 上游 各有一个诱导表达启动子，n i s r 上游是一个组成型表达的启动子。 乳链菌肽的生物合成过程及调控是由多个基因参与的复杂过程。 3 3 5 2 乳链菌肽的成熟过程 在乳链菌肽的成熟过程中，它首先以前体形式在核糖体上合 成，随后经过复杂的翻译后修饰作用，转位( t r a n s l o c a t i o n ) 及前 导肽切除( p r o t e o l y s i s ) ，产生具有独特结构和生物学活性的成熟分 子( 图6 ) 。乳链菌肽前体基因编码一个5 7 个氨基酸残基的多肽。 其前导肽部分含2 3 个氨基酸残基，它的作用包括：( 1 ) 保持乳链 菌肽的非活性状态：( 2 ) 参与修饰酶的结合与识别；( 3 ) 帮助乳 6 7 链菌肽前体的分泌。 飘 脚 嘲 ，a t，麓搿帮 棘蝴觯辩棚 蝻 _ 嗍鼬_ _ _ _ 图5 乳链菌肚生物合成基因簇的组成 图6 乳链菌肽的成熟过程 成熟的乳链菌肽分子由3 4 个多残基组成，其中含有7 个脱水 残基，即脱氢内氨酸和b 甲基脱氢内氨酸，它们分别由丝氨酸和 苏氨酸衍生而来，这些脱氢氨基酸可能会和半胱氨酸的巯基发生 立体专一性的亲核加成反应，从而形成特殊的羊毛硫氨酸与b 甲 基羊毛硫氨酸，也可能在成熟的细菌素中作为脱氢氨基酸存在。 n i s b 和n i s c 是羊