（微生物学专业论文）引入二硫键提高黑曲霉xynⅢ热稳定性的研究.pdf

微生物学硕士论文 引入二硫键提高黑曲霉x y n i i l 热稳定性的研究 摘要 木聚糖酶在造纸、饲料、食品以及能源等领域的应用价值已经得到了肯定，但由于纸浆 处理通常是在高温条件下进行，在饲料制粒加工中也需要短暂的高温处理，很多天然的木聚 糖酶热稳定性较差，成为它们在饲料、造纸行业中应用的瓶颈。因此，对木聚糖酶热稳定性 的改良十分必要。 本实验室筛选的黑曲霉a 一2 5 是一株木聚糖酶高产菌株，由它分泌的b - 1 ，4 。内切木聚糖酶属 于g il 家族，最适反应温度为4 8 ，不适于在高温的生物工程环境下使用。本研究将黑曲霉 a 2 5 所分泌的x y n m 基因序列( 登录号为e u 3 7 5 7 2 8 ) 与另外两种已经引入二硫键的的木聚糖 酶序列( 登录号分别为p 5 5 3 2 9 和p 3 6 2 1 7 ) 进行序列比对，并设计7 对突变引物，分别将原蛋 白序列的第3 0 位、4 7 位、1 2 8 位、1 3 0 位、1 7 4 位、1 7 7 位、1 7 8 位的氨基酸替换为半胱氨酸， 即( g 3 0 c ；d 4 7 c ；v 1 2 8 c ；s 1 3 0 c ；n 1 7 4 c ：n 1 7 7 c ；f 1 7 8 c ) 。 通过组合，用重叠延 申p c r 和常规p c r 对野生酶基因进行定点双突变，获得四对突变基因 即四对二硫键( g 3 0 c ：d 4 7 c ，s 1 3 0 c ：n 1 7 4 c ，s 1 3 0 c ：n 1 7 7 c ，v 1 2 8 c ：f 1 7 8 c ) 。突变基因经过酶切、 酶连、转化和电泳鉴定，突变基因确实克隆到表达载体p e t 2 0 b 上。将含有突变基因的重组质 粒转化入大肠杆菌中诱导表达，获得具有木聚糖酶活性的蛋白。 通过对重组酶的酶学性质进行研究发现：野生酶在5 0 c 保温3 0 r a i n 后残余酶活为1 8 左 右，突变体酶$ 1 3 0 c n 1 7 4 c 和v 1 2 8 c f 1 7 8 c 分别为7 0 和8 0 ，其热稳定性较野生酶的提高了 四倍左右；而$ 1 3 0 c n 1 7 7 c 和g 3 0 c d 4 7 c 的热稳定性与野生酶相比有所降低，4 8 保温3 0 m i n 后g 3 0 c d 4 7 c 的残余酶活仅为2 0 ，5 0 保温3 0 m i n 后几乎为零；s 1 3 0 c n 1 7 7 c 在4 8 保温 3 0 m i n 后酶就完全失活；$ 1 3 0 c n 1 7 4 c 和v 1 2 8 c f 1 7 8 c 在5 0 条件下的半失活时间有原来的 1 2 m i n 分别提高到3 1 m i n 和2 5 m i n 。总体说来本研究成功地对黑曲霉木聚糖酶进行了改造，热 稳定性有了一定程度的提高，木聚糖酶的酶学性质得到了改良。 关键词：木聚糖酶；二硫键；热稳定性；重叠延伸p c r ；定点突变 微生物学硕士论文 引入二硫键提高黑曲霉x y n l i i 热稳定性的研究 i n t r o d u c t i o no fd i s u l f i d eb r i d g ee n h a n c e st h et h e r m o s t a b i l i t yo f t h e x y l a n a s ex y n l l lf r o ma s p e r g i l l u sn i g e r s u p e r v i s o r ：p r o f l i ul i a n g w e i m a s t e r ( p h d ) c a n d i d a t e ：l u x u e l i a b s t r a c t ：a l t h o u g hx y l a n a s e sh a v ew i d e l yu s e di nt h ep a p e ri n d u s t r y , t h ef e e di n d u s t r y , t h e e n e r g yi n d u s t r ya sw e l la si nt h ef o o d s t u f fi n d u s t r y t h e i ra p p l i c a t i o ni nt h ep a p e r , p u l pa n df e e d i n d u s t r i e si sl i m i t e ds o m e w a t eb yc e r t a i ne n z y m a y i cc h a r a c t e r i s t i c ss u c ha sp o o rr e s i s t a i n c et o h i 曲t e m p e r a t u r e t h e r e f o r e ，i ti se s s e n t i a lt oi m p r o v et h ep r o p e a i e so fx y l a n a s e sf o rb r o a d e r a p p l i c a t i o n s t h i sl a b o r a t o r yx y l a n a s eg e n ee u 3 7 5 7 2 8w i t hx y l a n a s eg e n ep 5 5 3 2 9a n dp 3 6 2 1 7w h i c h a l r e a d yr e p o r t e di n t r o d u c t i o no fd i s u l f i d eb o n d s ，t h r o u g hs e q u e n c ea l i g n m e n ta n dd e s i g n e ds e v e p a i r so f m u t a n tp r i m e r s i no r i g i n a lp r o t e i ns e q u e n c e3 0 、4 7 、1 2 8 、1 3 0 、1 7 4 、1 7 7a n d1 7 8a m i n o a c i dr e p l a c ef o rc y s t e i n ( g 3 0 c ：d 4 7 c ：v 1 2 8 c ；s 1 3 0 c ；n 1 7 4 c ：n 1 7 7 c ：f 1 7 8 c ) t h r o u g ht h ec o m b i n a t i o n ，e x p a n d sw i t ho e p c ra n dp c ri n c r e a s e so b t a i n s4p a i r so f m u t a n t sg e n e ( g 3 0 c ：d 4 7 c ，s 1 3 0 c ：n 1 7 4 c ，s 1 3 0 c ：n 1 7 7 c ，v 1 2 8 c ：f 1 7 8 c ) t h em u t a n tg n e c u t s ，t h ee n z y m ec o m p a n y ，t h et r a n s f o r m a t i o na f t e rt h ee n z y m e ，s w i m st h ea p p r a i s a la f t e rt h e e l e c t r o p h o r e s i s ，t h em u t a n tg e n et r u l yc l o n e st om a t e r i a lp a r t i c l ep e t 2 0 b w i l li n c l u d et h em u t a n t g e n et h er e c o r g a n i z a t i o nm a t e r i a lp a r t i c l et ot r a n s f o r mi n t ot h ee s c h e r i c h i ac o l i , r e s r a r c ho nt h e r e o r g a n i z a t i o no f t h ee n z y m a t i cp r o p e r t i e s ，t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： t h et h e r m o s t a b i l i t yo ft h em u t a n tx y l a n z s e ( s13 0 c n17 4 ca n dv12 8 c f17 8 c ) r a s e da b o u t f o u et i m e s ；b u tt h ed i s u l f i d e b r i d g e ( s 1 3 0 c n 1 7 4 c a n d v 1 2 8 c f 1 7 8 c ) d e c r e a s e d t h e t h e r m o s t a b i l i t y ；t h ed i s u l f i d eb r i d g e ( s 1 3 0 c n 1 7 4 c ) i n c r e a s et h eh a l f - l i f eo f x y n i i if r o m1 2 m i nt o 3 l m i na t5 0 ，a n dv 1 2 8 c f 1 7 8 ci n c r e a s et h eh a l f - l i f et o2 5 m i n o v e r a l l t l i sr e s e a r c h m o d i f i e dt h ex y l a n a s ef r o ma s p e r g i l l u sn i g e rs u c c e s s f u l l ya n di m p r o v e m e n to ft h e t h e r m o s t a b i l i t y k e yw o r ：x y l a n a s e ：d i s u l f i d eb r i d g e ；t h e r m o s t a b i l i t y ；o v e r 1a pe x t e n s i o np c r ： s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s 3 7 微生物学硕士论文引入二硫键提高黑曲霉x y n l i i 热稳定性的研究 1 文献综述 木聚糖是最常见的半纤维素成分，是除纤维素之外自然界最为丰富的多糖，也是自然 界中最为丰富的可再生资源之一。作为植物细胞壁的主要成分，约占植物碳水化合物总量的 三分之一，在不同的组织中，可达细胞干重的7 - 3 5 不等【卜2 】。植物中的木聚糖位于木质 素和纤维素之间，以共价键与木质素作用，以非共价键与纤维素作用，在维持原位纤维素的 完整性和防止纤维免受纤维素酶的降解方面起着重要作用【3 】。 木聚糖是一种多聚五碳糖，主要成分为d 2 木糖，其基本结构单元是由p 1 4 或p 1 3 糖苷键连接的多聚木糖链。在d 一木糖的第二位氧上连接有d 葡萄糖醛酸或4 o 甲基葡萄糖 醛酸或在第三位氧上连接有l 阿拉伯呋喃糖。有些木聚糖还在第二或第三位氧上发生乙酰 化。侧链上这些不同大小的取代基与植物细胞中其它几种结构性多糖( 如木质素、纤维素、 果胶、葡萄糖等) 以共价或非共价键连接，正是这些连接致使木聚糖很难被分解。虽然木聚 糖是一类广泛存在于植物体内的半纤维素，但是，由于木聚糖在动物消化道内不能被消化吸 收，并且阻碍其它营养成分的消化利用，具有很强的抗营养特性，因而限制了许多禾谷类饲 料在饲料工业和畜牧业生产中的应用卜5 1 。所以要想完全降解这种复杂的结构需要几种酶的 作用，其中在解聚作用过程中至关重要的是内切b 1 ，4 木聚糖酶1 6 】，内切b l ，4 木聚糖 酶( 简称木聚糖酶 e c 3 2 1 8 是真菌和细菌产生水解木聚糖的糖苷酶1 7 】。 1 1 木聚糖酶的应用 木聚糖酶具有重要的潜在应用价值，自2 0 世纪8 0 年代以来，木聚糖酶的应用领域不 断扩大。目前，木聚糖酶已成功应用于动物饲料、纸浆造纸、食品等工业中。 1 。1 1 木聚糖酶在饲料工业中的应用 我国是养殖业大国，饲料产量位居世界第二。然而由于饲料原料( 小麦、黑麦、稻谷、 麸皮、米糠和统糠等) 中含有较多的非淀粉多糖( n o n s t a r c hp o l y s a c c h a r i d e s ，n s p s ) ，主要 包括阿拉伯木聚糖，1 3 葡聚糖、q 半乳糖苷、果胶、纤维素等。其中前两者占n s p s 的3 0 ， 因单胃动物不能分解n s p s ，因此，直接采用会对动物消化吸收产生一定的抗营养作用 8 1 。 已有实验证明：n s p s 能结合大量的水，使采食动物消化道中的食糜体积增大，粘度增加， 并形成凝胶。这会干扰消化酶的功能和吸收作用，影响食糜在小肠中滞留，而引起微生物异 常繁殖，造成动物生长受阻、饲料转化率降低。 因此，在饲料中添加木聚糖酶、半乳糖酶、1 3 葡聚糖酶和果胶酶等复合酶制剂，不仅 可以将n s p s 转化为营养性物质，还消除了其抗营养作用，具有十分重要的意义。另外，饲 料中添加木聚糖酶还可以减少动物结肠炎的发生，同时低聚木糖对人体的保健作用对动物同 2 微生物学硕士论文引入二硫键提高黑曲霉x y n l l i 热稳定性的研究 样适用，用木聚糖酶分解饲料中的木聚糖产生低聚木糖用于调节动物肠道的微生态环境，可 以减少抗生素等兽用药的使用量，减少残留，增强我国畜产品在国际市场的实力，扩大出口。 1 1 2 木聚糖酶在造纸工业中的应用 造纸业是我国最大的工业之一，纸浆生产在带来巨大经济效益的同时，也带来了严重的 环境污染问题。木材或其他粗原料中残留的木质素( 3 1 2 ) 会造成纸浆呈褐色，并降低 纸浆的强度，所以在制浆过程中，必须除去木质素。在通常的漂白中，采用大量氧化性含氯 化学试剂如氯气、二氧化氯等进行漂白，这些物质会反应生成大量的有机复合物，多是致癌 物质，对环境和人的健康危害很大。自1 9 8 6 年芬兰科学家i k a r i 等首先使用木聚糖酶预漂 白硫酸盐浆以来，随着对木聚糖酶研究的深入，木聚糖酶在造纸工业中发挥着越来越重要的 作用。木聚糖酶水解聚集在纸浆纤维表面的木聚糖，消除木质素提取的障碍，利于化学药品 渗透，因而提高了木质素的提取率，促进漂白。对木聚糖酶处理过的纸浆进行电子显微镜扫 描分析显示：木聚糖酶是通过增强纸浆纤维的多孔性来帮助纸浆接受化学漂白物质的【l 0 1 。 研究结果表明，利用木聚糖酶辅助漂白，可以提高纸浆的白度，还可节省后续化学漂白 剂的用量，从而降低漂白废水中氯代有机污染物的产生，为制浆造纸的清洁生产创造了条件。 1 1 3 木聚糖酶在食品、酿酒工业中的应用 木聚糖酶在食品工业中的应用，主要体现在它能从棉籽壳、甘蔗、和玉米皮芯等天然食 物半纤维素中分解得到木糖和低聚木糖等。低聚木糖具有独特的酸稳定性和难发酵性，十分 适用于在酸性饮料及发酵食品中应用。此外低聚木糖具有特殊的生理功能，它在人体内难以 消化，肠道内残存率高，可增值人和动物肠道内的双歧杆菌，因此，可以作为双歧杆菌因子 配制口服液，增强机体免疫能力【1 1 】，同时还能促进机体钙质的吸收1 2 】。用低聚木糖可制成 不同甜度的食品，可代替葡萄糖，作为糖尿病人的疗效食品。 在面包食品中，木聚糖酶水解谷物面包粉中的木聚糖，产生木寡糖，使水在戊聚糖相 和谷蛋白相中重新分布，从而改善面包的质地、结构、松软度和保质期；在果汁和啤酒中， 木聚糖酶能够降解果汁、啤酒中的一些多糖类物质，因而有利于果汁、啤酒的澄清；在酿酒 工业中，木聚糖酶对谷物细胞壁中木聚糖的作用有助于加快淀粉酶的作用，从而有利于提高 发酵效率，增加乙醇产量【1 3 】，也能够降低发酵液的粘度，避免过滤时滤膜堵塞，改良啤酒 e l 感【1 4 1 ；另外木聚糖酶还可用于生产咖啡过程中咖啡胶的液化，以及提取风味物质和色素物 质、植物油和淀粉。 -。 1 1 4 木聚糖酶在能源方面及其他方面的应用 科学研究的一个重要目的是转化生产力，具有优越的应用前景的研究往往会成为科学研 究的热点，木聚糖酶也不例外。木聚糖酶在当前最被看好的应用前景是在生物法生产可再生 燃料方面。在1 9 9 1 年美国运用基因重组技术成功的培养出可同时发酵戊碳糖和六碳糖的微 生物菌株后，使植物纤维水解生产酒精的技术得到了很大的发展。用纤维素酶和木聚糖酶协 3 微生物学硕士论文引入二硫键提高黑曲霉x y n l i i 热稳定性的研究 同作用可以将植物纤维彻底水解为单糖，再运用基因工程和发酵工程生产酒精，是现在研究 开发的热点和最为推崇的一种生产工艺。此外，造纸工业废料及农业废弃物中的木聚糖可被 木聚糖酶转化为d 一木糖单体。它又可被细菌、酵母及真菌转化成有价值的燃料【”】。 近年来，亦有研究表明木聚糖酶在果实的成熟、种子的萌发、真菌的寄生及植物防御机 制等诸多生理过程中也起着重要的作用。此外，还可以用于加工植物纤维材料，木聚糖酶与 果胶酶联合作用于韧皮纤维，如亚麻、黄麻和苎麻，除去果胶和半纤维素，用于脱胶使单纤 维分散，防止麻制品受潮沤烂f 1 6 j 。 总之，木聚糖酶在饲料、造纸、食品、生物能源等领域有广阔的应用前景。但当前有 许多因素制约着其应用和发展，木聚糖酶的产酶效率不高，酶活性不高，酶学性质达不到工 业应用的要求，这些都成为木聚糖酶的应用瓶颈。如何通过基因工程等技术获得产酶高，酶 学性质优良，适合工业用的木聚糖酶是当前亟待解决的问题。 1 2 木聚糖酶的分类和蛋白质结构 1 2 1 木聚糖酶的分类 根据对糖苷水解酶催化区的保守氨基酸和疏水簇的分析，将糖苷键水解酶分为5 8 个家 族，可以将所有水解酶氨基酸序列包括在内【1 7 】，木聚糖酶被划入2 个族，即f 1 0 和g 1 l 族。 不同木聚糖酶分子的氨基酸组成相差很大，但它们的催化区域的大小比较一致，同一族具有 较高的同源性，并可根据已知酶推测出未知酶的催化特性。一般而言，f 1 0 家族的木聚糖酶 分子量高( 一般大于3 0 k d a ) ，p l 值较低，结构较复杂，可以作用于对硝基苯和对硝基苯纤维 二塘，需较少数量底物结合位点，底物降解后的主要产物为低聚木糖( 聚合度1 5 d p ) ；而 低分子量且有较高p i 值的木聚糖酶( 一些真菌来源的木聚糖酶显示酸性p i 值的除外) 多属于 g 11 家族，该家族的木聚糖酶对木聚糖有很高的特异性，水解速度较慢，水解后的的产物多 为聚合度5 1 0d p 的木糖【1 引。这两个家族之间蛋白质序列没有显著相似性，即使在活性中心 区域也没有显著相似之处，因为他们的结构不一样。 f 1 0 木聚糖酶的整体结构像碗状，主要有q 一螺旋和1 3 片层重复出现而构成上面略大下 面较小的形状；而g 1 1 家族的空间结构类似于右手半握形状：有两个1 3 一折叠片层和一个a 螺旋组成i l9 1 ，折叠片层大部分是由反平行b 折叠股所组成的，两个b 折叠片层扭曲成将 近9 0 。角，从而构成一个深而且狭长的沟缝状结构，两个b 折叠片层的疏水面堆积在一起 形成三明治形状，有时也被描述为“手指形状。” 1 2 2 木聚糖酶的蛋白质结构 木聚糖酶在分子水平上有功能结构域、非功能结构域和连接区组成。不同微生物产生的 木聚糖酶在结构和性质上有很大的区别，有的只含有单一区域即催化结构域，也有的同时具 4 微生物学硕士论文引入二硫键提高黑曲霉x y n i h 热稳定性的研究 备催化区和多种非催化区【2 们。多区域木聚糖酶分子结构中含有催化结构域( c a t a l y t i cd o m a i n ， c d ) 、纤维素结合结构域( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 、木聚糖结合结构域( x y l a nb i n d i n g d o m a i n ，x b d ) 、连接序列( l i n k e r - s e q u e n c e ) 、热稳定区( t h e r m o s t a b i l i s i n gd o m a i n ，t s d ) 及其他未知功能的非催化区等1 2 1 1 ，这些区域担负着不同的生理功能。 1 2 2 1 催化结构域 木聚糖酶的催化结构域( c a t a l y t i cd o m a i n ，c d ) 决定着酶的水解特性，也是该酶的分 类依据之一。同一族的木聚糖酶的催化结构域具有同源性，g 1l 家族的木聚糖酶分子有 4 0 9 0 的同源序列。目前为止，已有六种f 1 0 家族木聚糖酶的催化区取得了高清晰度 的x r a y 结构 2 2 - 2 3 】。研究表明，f 1 0 、g ll 两家族之间木聚糖酶催化结构域的氨基酸序列 和催化基团的周围序列不存在有意义的同源性，表明它们在进化上来源于不同的祖先基因， 并有不同的折叠方式【2 4 1 。此外还揭示木聚糖酶活性催化区与纤维素酶的催化区基本没有同 源性，表明这两种酶在进化上也是来源于不同的祖先基因。尽管木聚糖酶的氨基酸组成在数 量上变化很大，但其催化区在大小上都趋向一致。 1 2 2 2 纤维素结合结构域 在自然界中，纤维素通常是与木聚糖等半纤维素共存于植物多糖结构中，且多以纤维 素为骨架，因此有些木聚糖酶也含有c b d ，使之既能水解纤维素，也能水解木聚糖，成为 双功能蒯2 5 l 。木聚糖酶分子中c b d 在功能和氨基酸组成上与纤维素酶分子中的c b d 相似， 甘氨酸、天冬氨酸及4 个色氨酸高度保守，缺乏带电氨基酸，在靠近n 端和c 一端分别有一 个半胱氨酸与改结构域紧邻。一些木聚糖酶能结合纤维素，虽然c b d 对催化功能不是必需 的，但它们能调节酶对可溶性和不可溶性纤维素底物的特殊活力。例如粪碱纤维单胞菌( c f i m i ) 中木聚糖酶d ，它的全长和截短形式对水解纸浆木聚糖是等效的，但含有c b d 的酶 衍生物能更有效的降低k a p p a 值【2 6 1 。 1 2 2 3 木聚糖结合结构域 与纤维素结合结构域一样，木聚糖结合结构域也是酶分子中独立的无催化功能区域，能 和木聚糖结合。它的存在并不影响酶的催化活性，但对不溶性底物有着特殊作用。如 s t r e p t o m y c e so l i v a c e o v i v i d i se 一8 6 中的f x y n 酶，它包含有催化区域及x b d ，在天然状态下 它既能降解可溶性木聚糖，也能降解不溶性木聚糖；当人工除去木聚糖结合结构域时，它不 能降解不溶性木聚糖，但并不影响其对可溶性木聚糖的降解效率。所以木聚糖结合结构域对 降解不溶性底物是必不可少的【27 1 。研究表明，木聚糖酶在p h p i 时，基本不结合2 引。 1 2 2 4 热稳定结构域 在某些微生物中有某些区段可增加相应酶的最适作用温度，称为热稳定区 ( t h e r m o s t a b i l i s i n gd o m a i n ，t s d ) 。有人认为g 11 族木聚糖酶本质上更耐热，不像f 1 0 族木聚糖酶需要通过折叠方式而使它们相对容易进化为嗜热酶f 2 9 1 。大多数木聚糖酶的最适 5 微生物学硕士论文引入二硫键提高黑曲霉x y n l i i 热稳定性的研究 温度在5 0 - 6 0 c 之间，研究发现，嗜热真菌比嗜热细菌产的木聚糖酶耐热性差1 3 0 1 。在提高酶 的热稳定性方面有人尝试在分子内和分子间引入二硫桥，热稳定性虽然提高了，但是酶的活 性并不都一定随着升高1 3 1 1 。在耐热机制方面有人证明木聚糖酶的热稳定性与带电侧链和螺 旋偶极子的疏水堆积及有利的相互作用有关，还与在螺旋n 端引入p r o 残基有关【3 2 1 。 有研究表明，t s d 对木聚糖酶的热稳定性是非必需的。首先，对一些极端嗜热木聚糖酶 的研究表明，它们只有单一的催化结构域而不存在t s d ，例如，来源于t h e r m o t o g am a r i t i m e 的两个木聚糖酶x y n a 和x y n b , 前者有t s d 而后者只有催化结构域，但x y r d 3 的作用最适 温度高达1 0 2 ，热稳定性也远高于x y n a ；其次，t s d 也存在于中温木聚糖酶中，推测t s d 的作用可能是保护木聚糖酶免受蛋白酶或极端酸碱环境的破坏；再次，在除木聚糖酶外的其 它蛋白中没有找到与t s d 相似的结构，将来源于c a l d i b a c i l l u sc e l l u l o r o r a n s 的木聚糖酶x y n a 的t s d 删除，除热稳定性下降外，酶的底物特异性和催化效率也受到一定的影响，因此， t s d 可能也是一种专一的木聚糖结合区。 1 2 2 5 连接序列 连接序列位于催化结构域和c b d 之间，并赋予了蛋白质结构的柔韧性。该序列中含有 较多s e r 或p r o 和t h r 残基，通常都是被高度o 一糖基化，序列的长度变化很大，一般为6 5 9 个氨基酸【3 3 】。但在r f l a v e f a c i e u s 木聚糖酶中有一富含a s p 和g l u 的由3 7 4 个残基组成的连 接区。对于不同来源的木聚糖酶来说，他们的连接序列之间同源性一般不高，这些连接序列 将不同的功能区域连接起来，形成柔韧可伸展的铰链区。来源于热介纤维素梭菌( c l o s t r i d i o m t h e r m o c e l l u m ) 的木聚糖酶c 中，催化结构域和连接序列末端之间的短连接区有一个锚定结 构域，它负责多纤维素体的装配【3 4 l 。 1 3 木聚糖酶的分子改造 不同领域中应用的木聚糖酶需要具有不同的综合性质，而天然酶往往难以满足，因此， 有必要利用现代基因工程技术及蛋白质工程，有目的的选育、改良木聚糖酶，以满足实际生 产的需要。近十年来对酶分子的改造工作都着眼于两个方面，一是基于序列的合理化设计方 案，如化学修饰等；二是利用基因的可操作性，模拟自然界的演化进程的非合理设计方案， 如定向进化等。对酶分子的研究可分为认识和改造两个方面，前者利用各种生物化学、晶体 学、结构和功能之间关系等方面的信息，以此为依据对酶分子进行改造，成为酶分子的合理 设计；与此相对应，不需要准确地酶分子结构信息而通过随机突变、基因重组、定向进化等 方法对其进行改造，则称为酶分子的非合理设计。 体外诱变是相对于体内诱变而言的，它是指在体外取代、插入或缺失d n a 序列中的任 何一个或多个碱基的诱变技术。该诱变技术与体内诱交最大的不同是它可将克隆的基因单独 在体外高效突变而不影响遗传背景上任何其它遗传因子，能大大提高特异性和效率，成为最 重要的生物学研究手段之一。根据其原理不同，可将其分为两大类：依赖p c r 的体外诱变 6 微生物学硕士论文引入二硫键提高黑曲霉x y n l i i 热稳定性的研究 和不依赖p c r 的体外诱变。不依赖p c r 的体外诱变包括体外缺失诱变、酶切定点诱变、定 域随机诱变、外显子改组，杂合酶技术等。依赖p c r 的体外诱变包括p c r 定点诱变、d n a s h u f f l i n g 、交错延伸、体外随机引发重组、序列饱和诱交、易错p c r 诱变和核苷三磷酸类似 物掺入法等。依赖p c r 的定点诱变技术由于突变效率高，操作简单，耗时短，成本低廉等 优点而备受瞩目。 1 3 1 重叠延伸p c r 法( o v e r - 1a oe x t e n sio np c r ，0 e p c r ) 1 9 8 8 年由r h i g u c h i 3 5 1 提出。这种方法运用非常广泛、灵活，不受突变位置及突变类型 的限制，利用0 e - p c r 不仅能实现基因点突变，还能便利地实现大片段的插入及删刚强3 7 】 其原理如图1 1 所示，在重叠延伸p c r 中，两个重叠d n a 片段是分别从两个独立的p c r 扩增反应 得到的。预设突变构建在重叠区域，存在于两个扩增片段中。设计4 种引物，用第一对引物 扩增含有突变位点及其上游序列的d n a 片段，第二对引物被用来扩增含突变位点及其下游序 列的d n a 片段，两个侧翼引物含野生型序列，两个突变引物含有希望引进的突变位点，如置 换、插入或缺失。混合两次p c r 的产物，由于两个突变引物有重叠区，重叠片段之间退火， 延伸成异源双链，加入外侧引物进行第三次p c r ，即可得到目标突变体。 通用引枥1 突变引物1 三兰兰= = 三兰兰= = =a 突变引物2通用引物2 1 l 第一次p = = = = = = = = = = = i e l l = ；= = = = = = = 5 ， j r 量弋，空性退火 1 = ! 。i 5 i 通用引物1 0 延伸 = = = 一一 一一；= i 通用弓i 物2 5 ， 1 l ，二次阳r3 ， 3 5 突变的全长基圜 ， 气f 亏磊焉5 ，n 3 s 1 中卜bs 2 。 詈= = 兰兰= 咀一t 2 j s 1 。5 2 百5 与a b 早期的循环 ：_ = - = = _ ：1 c a 百 1 l 后期的循环 - _ 亡亡= = = ：= = = = 【】_ s 1 a a s 2 图1 1 重叠延伸p c r 12 p c r 图一步重叠延伸 o e p c r 法诱变效率较高但需要两次p c r 和产物纯化，步骤较为繁琐。针对这些不足， 后来许多学者对o e p c r 进行了改进。1 9 9 7 年，u r b a n 掣3 8 1 提出一步重叠延伸p c r 法( o n e s t e p o v e r l a pe x t e n s i o np c r , o o e p c r ) ，使得三个p c r 反应得以在一个试管里进行，并且省略了 繁琐的中间产物纯化过程。其原理( 如图1 2 所示) 是首先将待突变的d n a 以相反的方向克 隆到两个载体中，这两个载体除了多克隆位点相反外其余均相同( 例如p u c l 8 ，1 9 ) 。这样便 得到两个模板。将这两个模板，两个突变引物及个与载体互补的通用引物置于一个试管中 7 微生物学硕士论文 引入二硫键提高黑曲霉x y n l l i 热稳定性的研究 进行次p c r 反应即可得到含突变的目的基因。 1 3 2d n a 改组( d n as h u f f ii n g ) 技术 s t e m m e r 等3 9 1 首先使用d n a 改组完成体外重组。该技术是基因在分子水平上进行有性重 组( s e x u a lr e c o m b i n a t i o n ) ，通过改变单个基因或基因家族( g e n ef a m il y ) 原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产 物以新功能。 d n a 改组( 如图1 3 ) 是将一群密切相关 的序列( 如多种同源而有差异的基因或一组突变 基因文库) 在d n a s ei 的作用下随机切成小片 段，这些小片段之间有部分的碱基序列重叠，它 们通过自身引导p c r ( s e l f - p r i m i n gp c r ) 延伸， 并重新组装成全长的基因，这一过程被称为再组 装p c r ( r e s s e m b l yp c r ) 。该过程所产生的相 关序列间的交换归因子模板的转换。d n a 改组 过程中也可能引入新的点突变。因此，仅d n a 改组就可以有效地从单一基因序列开始进行蛋 白质的定向进化。c r a m e f i 等【4 0 i 利用这一技术在 改进鲸鱼绿色荧光蛋白的荧光信号强度中获得 理想结果，荧光信号强度提高t 4 5 倍。此外， z h a n g 等【4 l 】通过此技术将p 半乳糖苷酶的p 硝 基苯岩藻糖苷酶的活性提高了6 0 倍。 随机片段化 单基因 兰兰三三兰兰舭机片段 o 一一 一 _ _ 。_ 一_ _ _ _ 一【：f 鼢眈 ：器滚 相关的随机 突变家族 随机片段化 _ 一a i 。一 _ o _ _ 一o 一_ _ _ _ 一1 _ _ 。一 ；, - - - 兰。，w 篁；= ；笔三兰至i 兰d 1 l l i 随机片ii 曾f = ，r b _ 日o - - 一w = 蜀= = = 嚣竺= 库 重组p n t 大的重组文 库 保留阳性突变组合觥人去凹性照组合 保留阳性突变组合 八 云睬阴性哭受组台 图1 3d n a 改绢的原坪 虽然d n a 改组技术在酶的定向进化中已广泛应用，但它也有一定的局限性，如：它需 要多次进行p c r 扩增和检测，而且在d n a 片段重新组装成全长序列之前必须去除干净 d n a s e i ，操作较为繁琐、费时。 1 3 3 交错延伸技术( s t a g g e re x t e n s io np r o c e s s s t e p ) s t e p 是z h a o 掣4 副1 9 9 8 年在d n a 改组基础上发展起来的一种体外重组方式。即用p c r 同时 扩增多个拟重组的模板序列时，在热循环中大大缩短退火与聚合酶催化延伸的时间。在每一 循环中，不断延长片段根据序列的互补性与不同模板退火，并进一步延伸，反复重复直到全 长序列形成。由于模板的转换，大多数多核苷酸含有不同亲本的序列信息。交错延伸原理的 核心是：在p c r 反应中把常规的复性和延伸合并为一步，并大大缩短其反应时间，从而只能 合成短的d n a 分子( 图1 4 ) 。s t e p 法重组采用的是变换模板机制，这正是反转录病毒所采用 的进化过程。在操作上它省略了d n a 改组中用d n a s ei 酶切成小片段这一步，因而缩短了反 应时间，更加简便易行。该技术已成功地重组了由易错p c r 产生的5 个热稳定的枯草杆菌蛋白 8 微生物学硕士论文引入二硫键提高黑曲霉x y n l i i 热稳定性的研究 酶e 的突变体，得到了热稳定性进一步提高的重组酶0 4 扪。 l 变性、退火并再、尖p c r - 1 - r 1 c - _ _ - 一 提纯并再扩增 图1 4 交错延伸原理图1 5 体外随机引发重组原理 1 3 4 体外随机引发重组( r a n d o mp rm in g n vi t r or e c o m bn a t io n ，r p r ) 体外随机引发重组是以单链d n a 为模板，配合一套随机序列引物，在k l e n o w 片段作 用下，先产生大量互补于模板不同位点的短d n a 片段( 5 0 5 0 0 b p ) ，由于剪辑的错配和错 误引发，这些短d n a 片段中会有少量的点突变。然后去除模板，进行无引物p c r ，重新组 装成全长基因，经最后的有引物p c r 后，克隆到表达载体，随后筛选。其原理如图1 5 所 示。与d n a 改组相比，r p r 技术有以下优点：( 1 ) r p r 可直接利用单链d n a 或m r n a 做 模板；( 2 ) d n a 改组利用d n a s ei 随机切割双链d n a 模板，在d n a 片段重新组装成全长序 列之前，d n a s ei 必须去除干净。一般来说，r p r 技术使基因的重新组装更容易；( 3 ) 合成 的随机引物长度一致并缺乏序列的偏向性，保证了点突变和交换在全长的后代基因中的随机 性； ( 4 ) 随机引导的d n a 合成不受d n a 模板长度的影响，这给小肽的改造提供了机会； ( 5 ) 所需亲代d n a 比d n a 改组所需的量少1 0 2 0 倍1 44 1 。s u e n a g a 等 4 i 将联苯双加氧酶大亚 基的基因b p h a l 通过2 轮的r p r 过程，得到进化的酶，该酶不仅降解多氯联苯同系物的活 力提高，还能降解原酶所不能作用的二苯并噻吩、芴等化合物，显示了多功能的加氧活性。 体外随机引发重组以其独特的优势在酶的定向进化中得到了广泛应用。但它也有一定的 局限性，如：需要去除模板、重新组装和扩增，操作较为繁琐、耗时，而且突变率不易控制。 1 3 5 体外诱变技术的应用 来源于微生物的酶已在许多工业生产过程中得到成功应用。工业应用的微生物酶制剂 主要通过对微生物的分离培养和筛选来获得。通过筛选还获得了能够在一些特殊工业过程如 高温、高盐、有毒介质、非水相等中应用的若干微生物酶。由于在自然界大量存在的微生物 9 微生物学硕士论文 引入二硫键提高黑曲霉x y l l i i i 热稳定性的研究 至今并未获得成功的分离培养，因此，人类所发现的微生物来源的酶的种类和数量是极其有 限的。通过分子生物学技术改造现有酶( 蛋白质工程) 或对未知微生物所产生的酶进行筛选将 成为微生物酶研制和开发的热点。体外诱变( 定向进化) 技术已经被广泛地应用于各种酶分子 的改造，如：在提高酶分子热稳定性，提高底物专一性和增加对底物催化活性方面。使其朝 向人们所期望的性质进化，获得了许多满意的结果。 随着体外诱变技术的不断发展，它己在基础研究及应用领域显示了越来越大的优势，它 不仅能使酶( 或蛋白质) 进化出非天然特性，还能定向进化某一代谢途径，不仅能进化出具有 单一优良特性的酶，还能使已分别优化的酶的两个或多个特性叠加，产生多项优化功能集于 一体的酶，大大丰富了酶类资源，使酶工程的研究进入了一个崭新的领域。体外定向进化与 合理设计互补，将会使分子生物学家更加得心应手地设计和剪裁酶分子，使蛋白质工程学更 加显示出强大的威力，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力，取得越来越大 的成果。 1 4 木聚糖酶的研究热点 为了获得更高的木聚糖酶活及提高木聚糖酶对极端环境( 高温、强碱) 的耐受能力，使木 聚糖酶具有更高的工业应用价值，不少研究者开始了利用分子生物学手段来改造木聚糖酶的 尝试。主要集中在两个热点：一个是对信号肽加以改造以提高木聚糖酶的表达量，另一个是 构建二硫桥以提高酶分子的耐受力。 1 4 1 引入突变构建二硫桥 随着基因工程和蛋白质工程技术的发展，蛋白质的稳定性的研究越来越受到人们的高度 重视二硫键作为球形蛋白中的一种重要的稳定因素1 4 6 ，对蛋白质的稳定性产生着微妙、 复杂的影响在增加蛋白质的稳定性方面，人们通常想n g l 入分子内的二硫键【4 7 】，这是因 为不管是天然的二硫键，还是化学交联确实可以提高稳定性。 在蛋白分子中，两个在空间上邻近的半胱氨酸可形成二硫键( 在肽链上至少间隔两个氨 基酸残基) ，二硫键对提高木聚糖酶的热稳定性有一定的作用。用非自身二硫桥来增加蛋白 质的稳定性的观点首先由v i l l i f r a n c ae t t t a l 于1 9 8 3 提出，后有许多蛋白质被引入二硫桥。 木聚糖酶核心区域极其稳定，在靠近可变的q 螺旋c 一端构建二硫桥，可能会提高木聚糖酶 分子的热稳定性【4 孓4 9 1 。通过在蛋白质的n 末端附近一个残基的置换和嵌合改变，引入二硫桥， 使木聚糖酶的稳定性得到很大的提高，同时也可通过突变获得扩展在碱性p h 下的活性范围 5 i n 5 1 】。 ， t u r u n e n 等【52 】将三个位点上的突变引入x y n i i ，其中包括一个位于q 螺旋中的二硫桥( 通 过c y s 取代1 1 0 位的s e r 和第1 5 4 位的h s n 而形成) 。这个二硫桥把x y n i i 在6 5 下的半衰期从小 于l m i n 增加至l j l 4 m i n 。另一个突变位于a 螺旋的c 末端( t t i s 或t y r 取代第1 6 2 位的g l n ) 把半衰期 提高到了6 3 m i n 。在很宽的p h 范围内p h 稳定性也提高了，但无论是在酸性或中碱性p h 值下酶 l o 微生物学硕士论文引入二硫键提高黑曲霉x y n i 热稳定性的研究 活都有所降低。f e n e l 等于2 0 0 4 年成功地在t r e e s e i 的内切- 1 ，4 - p 木聚糖酶的n 末端区域通 过用c y s 取代第2 位和2 8 位的t h r ，构建了一个二硫桥。这种突变增加了这种嗜温的酶热灭活 时的半衰期，在6 5 的条件下从约4 0 s 增加 ! l j 2 0 m i n ，7 0 c 时从少于1 0 s 至l j 约6 m i n 。n 末端的二 硫桥使得突变的x y n i i 的热稳定性提高了大约1 5 【5 3 1 。2 0 0 7 年有人对来源于b a c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i l u s 的木聚糖酶进行改造，引入二硫键( 通过c y s 取代1 0 0 位的s e r 和第1 5 0 位的 a s n 而形成) ，使x y n a 的热稳定性提高t s c 5 4 】。这说明一个设计合理的二硫桥，可以非常有 效地抗热灭活。 1 4 2 改造信号肽 k 6 b i r 纠5 5 】通过置换信号肽提高s t r e p t o m y c e sl i v i d a n s 的木聚糖酶产量。s t r e p t o m y c e s l i v i d a n s 的木聚糖酶a 基因的信号肽在上游序列第5 7 个核苷酸处被纤维素酶a 的信号肽序 列所置换，后者包括一个反向重复序列( 5 - ! 鱼q q a c g c 丛她) ，反向重复的3 末端包 含一个盒子( t c c c a ) ，它是和sl i v i d a n s 的1 6 sr r n a 互补的。去除反向重复和盒子，木 聚糖酶的产量减少了9 0 。还原反向重