（水生生物学专业论文）三种紫球藻培养、胞外多糖提取及rapd分析.pdf

摘要 摘要 紫球藻是一种具有开发价值的经济微藻，在培养过程中能够合成多种生物活性物 质，如胞外多糖、不饱和脂肪酸、藻胆蛋白等。它已引起国内外的广泛关注，成为研 究的热点。本文主要研究三种紫球藻培养条件的优化，胞外多糖的提取工艺和不同碳 源、氮源对多糖产量的影响以及三种紫球藻r a p d 分析。 对于紫球藻资源的开发利用，首先要解决该藻大规模培养问题。根据紫球藻自身 营养特点，可以采用自养和兼养异的营养方式来培养藻。 本文以k o c h 培养基为基础，研究不同光强、光周期、盐度、碳酸氢钠浓度、培 养方式、碳源、氮源等因子对三种紫球藻生长的影响，初步确定三种紫球藻最佳培养 条件。铜绿紫球藻( p o r p h y r i d i u ma e r u g i n e u m7 5 5 ) 适宜培养条件：光照强度为2 5 0 0 l x ； 光周期为1 4 l ：i o d ：盐度为1 ；n a h c o 。浓度为4 0 0 m g l ；葡萄糖浓度为1 ；振荡培养 的优于静置培养；淡色紫球藻( p o r p h y r i d i u m p u r p u r e u m8 0 6 ) 适宜培养条件：光照强 度为2 5 0 0 l x ；光周期为1 8 l ：6 d ；盐度为3 ；n a h c o 。浓度为1 2 0 0 m g l ：振荡培养优于 静置培养；血色紫球藻( p o r p h y r i d i u mc r u e n t u m ) 适宜培养条件：光照强度为1 5 0 0 l x ： 光周期为2 4 l ：o b ：盐度为3 ；n a h c o 。浓度为1 2 0 0 m g l ；振荡培养优于静置培养。 多糖研究是生命大分子科学最后一个重大前沿领域。紫球藻多糖是一种高分子聚 合物，具有多种生物活性可广泛应用于食品、化妆及医药等行业，此外，还具有抵抗 多种病毒的作用，已成为近年来研究热点。 紫球藻在整个生长周期都不断释放胞外多糖，使培养液的相对粘度不断增加。本 文通过正交试验来优化紫球藻胞外多糖提取工艺，提高多糖的产量。此外，研究不同 碳源和氮源对三种紫球藻多糖产量的影响，确定适于多糖生产的最佳碳源和氮源。 研究结果表明，三种紫球藻的最佳提取工艺各不相同，铜绿紫球藻的最优提取工 艺为乙醇浓度5 0 ，乙醇用量为3 倍体积，醇沉时间为1 5 小时；氯仿与正丁醇的比 例4 ：1 ，样液与s e v a g 试剂的比例1 ：2 ，作用时间为1 5 m i n ；由方差分析可得五种碳 源和五种氮源对胞外多糖的影响不显著，其中添加乳糖和( n h 4 ) 。s o 。的培养基多糖产率 最高，分别为3 7 2 9 6 m g l 和1 2 9 6 1 m g l 。 淡色紫球藻的最优提取工艺为乙醇浓度7 5 ，乙醇用量为2 倍体积，醇沉时间为 1 小时；氯仿与正丁醇的比例3 ：1 ，样液与s e v a g 试剂的比例1 ：2 ，作用时间为4 5 m i n ： 由方差分析可得五种碳源和五种氮源对胞外多糖的影响不显著，添加碳酸氢钠和 摘要 n h z l 的多糖产率最高，分别为4 1 2 1 6m g l 和2 9 0 1 7m g l 。 血色紫球藻的最优提取工艺为乙醇浓度5 0 ，乙醇用量为1 倍体积，醇沉时间为 0 5 小时；氯仿与正丁醇的比例4 ：1 ，样液与s e v a g 试剂的比例2 ：1 ，作用时间为4 5 m i n ； 五种碳源的影响差异不显著，氮源的影响差异显著，其中添加无水乙酸钠和n h 。c 1 的 培养基多糖产率最高，分别为3 3 7 8 4m g l 和4 0 9 9 7 m g l 。 r a p d 技术可对没有任何分子生物学研究情况下的物种进行d n a 多态性分析，有 助于系统学研究中广泛进行物种间大量比较研究，实验表明r a p d 具有个体、群体、 亚种、种等各水平的特异性，符合孟德尔遗传定律，因而是一种优良的遗传标记。 紫球藻r a p l 3 研究是在外部形态分类鉴定及前人工作的基础上，采用r a p d 技术， 通过对三种紫球藻基因组的r a p d 图谱的比较研究，在分子水平上探讨这些藻种的分 类地位和亲缘关系，为丰富紫球藻属的分子系统学研究，进一步完善紫球藻属的分类 系统，揭示其系统发育及演化提供分子水平的依据。 本文用2 5 个随机引物对三种紫球藻的r a p d 分析可以得出以下结论： 由r a p d 结果和聚类分析显示，淡色紫球藻和血色紫球藻的亲缘关系较近，其遗 传距离为0 3 9 6 ，在形态分类上两者的亲缘关系也较近。 r a p d 技术在解决种属之间的关系问题上具有一定的优越性，本试验从5 0 种引物 中筛选出2 5 种条带清晰，多态性丰富的引物，发现只要选择适当的引物，r a p d 技术 可以用来鉴定种属的亲缘关系，即r a p d 技术用于紫球藻的分类鉴定是可行的。 关键词：紫球藻培养多糖提取正交实验r a p d i i 摘要 c u l t u r e ，p o i y s a c c h a r i d e e x t r a c t i o na n dr a p d a n a l y s i s o ft h r e e s p e c i e so f p o r p h y r i d i u m a b s t r a c t t h eu n i c e l l u l a rr e da l g ap o r p h y r i d i u mi sa b u n d a n to fu s e f u lb i o a c t i v em a t e r i a l ss u c h a s p o l y s a c e h a r i d e ，p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ( a aa n de p a ) a n dp h y c o b i l i p r o t e i n s t h e r e f o r e ，p o r p h y r i d i u mh a sb r o a du t i l i z a t i o np r o s p e c t sf o rp h a r m a c e u t i c a la n dc h e m i c a l i n d u s t r y ，t h eo v e r s e a ss t u d i e so n i th a v eb e e n r e p o r t e ds i n c e1 9 6 0 ，b u tf e w r e s e a r c h e sh a v e b e e nc a r r i e do u ti nc h i n a i nt h i sp a p e r ，t h ec u l t u r ec o n d i t i o n ，p o l y s a c c h a r i d ee x t r a c t i o na n d r a p d a n a l y s i so f t h r e es p e c i e so f p o r p h y r i d i u mw e r es t u d i e d p o r p h y r i d i u mi s o n eo ft h em o s ti m p o r t a n tp r i m a l p r o d u c t i v i t y i nt h e s e a ，a n d l a r g e s c a l ec u l t i v a t i o ni st h em o s ti m p o r t a n tp r o b l e mi nt h ee x p l o i t a t i o no fm i c r o a l g a e i n o r d e rt o o p t i m i z et h ec u l t u r e c o n d i t i o n so fp o r p h y r i d i u m , t h ei n f l u e n c e so fd i f f e r e n t c o n d i t i o n so nc e l l sd e n s i t y , s u c ha sd i f f e r e n ti n t e n s i t y , d i f f e r e n tp h o t o p e r i o d ，d i f f e r e n t c u l t u r em e t h o d sa n dd i f f e r e n tc o m p o n e n t so fc u l t u r a lm e d i u mw e r ei n v e s t i g a t e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h es u i t a b l ec o n d i t i o n so f p o r p h y r i d i u ma e r u g i n e u m7 5 5a r el i g h t i n t e n s i t y2 5 0 0 l x ，p h o t o p e r i o d1 4 l ：1 0 d ，s a l i n i t y1 ，n a h c 0 34 0 0 m g l ，g l u c o s e1 ， s h a k e nb e t t e rt h a ns t a t i cc u l t u r e t h es u i t a b l ec o n d i t i o no f p o r p h y r i d i u mp u r p u r e u m8 0 6 a r el i g h ti n t e n s i t y2 5 0 0 l x ，p h o t o p e r i o d18 l ：6 d ，s a l i n i t y3 ，n a h c 0 312 0 0 m g l ，s h a k e n b e t t e rt h a ns m i l ec u l t u r e t h es u i t a b l ec o n d i t i o no fp o r p h y r i d i u mc r u e n l u ma r e l i g h t i n t e n s i t y1 5 0 0 l x ，p h o t o p e r i o d2 4 l ：0 d ，s a l i n i t y3 ，n a h c 0 31 2 0 0 m g l ，s h a k e nb e t t e r t h a ns t a t i cc u l t u r e t h er e dm i c r o a l g ap o r p h y r i d i u mw a sas o u r c eo fm a n yn a t u r a lp r o d u c t s ，e x p e c i a l l y s u l p h u r i z e dp o l y s a c c h a r i d e w h i c hc a u s e st h ec u l t u r et ob e c o m ev i s c o u s t h e e x p o l y s a c c h a r i d s ( e p s ) w a sh i g h - m o l e c u l a rw e i g h tp o l y m e r sw i t hc o m p l e xc h e m i c a l s t r u c t u r e ，w h i c hu s e dc o m m e r c i a la p p l i c a t i o ni nav a r i e t yo f f i e l d si n c l u d i n gt h ep a p e rm a d t e x t i l e ，f o o d ，c o s m e t i c s ，a n dc h e m i c a la n dp h a r m a c e u t i c a l i n d u s t r i e s b u tt h em o s t i m p r e s s i v ew a si t sa n t i v i r a la c t i v i t ya g a i n s tm a n y v i r u s t l i s p a p e rr e p o r t s t h a tt h eo p t i m u me x t r a c t i o no fe x o p o l y s a e e h a r i d e s p r o c e s sb y o r t h o g o n a ld e s i g na n dt h ee f f e c to fd i f f e r e n tc a r b o n i c ( c ) a n dn i t r o g e n ( n ) s o u r c e so l lc e l l 1 1 1 摘要 g r o w t h r a t ea n de x o p o l y s a c c h a r i d e sp r o d u c t i o no ft h r e ep o r p h y r i d i u m s t h eo p t i m u m e x t r a c t i o np r o c e s sw a ss e l e c t e dw i t ht h el 9 ( 3 4 ) o r t h o g o n a ld e s i g n t h es i g n i f i c a n te f f e c t s o fa l c o h o l c o n c e n t r a t i o n ，a l c o h o l v o l u m ea n dp e r c o l a t i o nt i m eo nt h ee x t r a c t i o no f e x p o l y s a c c h a r i d s ，w e r ed i s c o v e r e d c e r t a i na m o u n to f p r o t e i n sw e r e c o n t a i n e di nt h ec r u d e p o l y s a c c h a r i d ee x t r a c t i n gf r o mp o r p h y r i d i u m d e p r o t e i n i z e df r o mc r u d ep o l y s a c c h a r i d e b ya d o p t i n gs e v a g m e t h o d t h r o u g ho r t h o g o n a lt e s t ，w e f o u n dt h a tt h eb e s tc o n s t i t u t i o nf o r e x t r a c t i n g p o l y s a c c h a r i d ef r o mp o r p h y r i d i u ma e r u g i n e u m7 5 5w e r ea sf o l l o w ：a l c o h o lc o n c e n t r a t i o n w a s5 0 ，a l c o h o lv o l u m ew a s3 - f o l dt i m e ，p e r c o l a t i o nt i m ew a s 1 5 h ，t h ev o l u m er a t i oo f g l y c o p r o t e i ns o l u t i o nt os c r a gr e a g e n tw a s1 ：2 ，t i m ew a s1 5 m i na n ds e v a gr e a g e n tw a s4 ：1 b e t w e e nc h l o r o f o r ma n db u t a n 0 1 t h er e s u l ta l s oi n d i c a t et h a tl a c t o s ea n d ( n h 4 ) 2 8 0 4 w e r e t h eb e s tc a r b o n i ca n d n i t r o g e ns o u r c e sf o rp o l y s a c c h a r i d er e s p e c t i v e l y t h ep o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n w e r e3 7 2 9 6 m g la n dt 2 9 6 1 m g l t h eb e s tc o n d i t i o n sf o re x t r a c t i n gp o l y s a c c h a r i d ef r o m p o r p h y r i d i u mp u r p u r e u mw e r e a sf o l l o w ：a l c o h o lc o n c e n t r a t i o nw a s7 5 ，a l c o h o lv o l u m ew a s2 - f o l dt i m e ，p e r c o l a t i o n t i m ew a sl h ，t h ev o l u m er a t i oo f g l y c o p r o t e i ns o l u t i o nt os e v a gr e a g e n tw a s1 ：2 ，t i m ew a s 4 5 m i na n d s e v a gr e a g e n tw a s3 ：1b e t w e e nc h l o r o f o r ma n db u t a n 0 1 t h er e s u l ta l s oi n d i c a t e t h a tn a h c 0 3a n dn h 4 c 1w e r et h eb e s tc a r b o n i ca n d n i t r o g e ns o u r c e sf o rp o l y s a c c h a r i d e r e s p e c t i v e l y t h ep o l y s a c c h a r i d ep r o d u c t i o n w e r e4 1 2 1 6m e g la n d2 9 0 1 7m g l t h eb e s tc o n d i t i o nf o re x t r a c t i n g p o l y s a c c h a r i d ef r o mp o r p h y r i d i u mc r u e n t u mw e r ea s f o l l o w ：a l c o h o lc o n c e n t r a t i o nw a s5 0 ，a l c o h o lv o l u m ew a s1 - f o l dt i m e ，p e r c o l a t i o nt i m e w a so 5 h ，t h ev o l u m er a t i oo fg l y c o p r o t e i ns o l u t i o nt os e v a gr e a g e n tw a s2 ：1 ，t i m ew a s 4 5 m i na n d s e v a gr e a g e n t w a s4 ：1b e t w e e nc h l o r o f o r ma n db u t a n 0 1 t h er e s u l ta l s oi n d i c a t e t h a ts o d i u ma c e t a t ea n h y d r o u sa n dn h 4 c 1w e r et h eb e s tc a r b o n i ca n dn i t r o g e ns o u r c ef o r p o l y s a c c h a r i d er e s p e c t i v e l y t h ep o l y s a c c h a r i d ep r o d u c t i o nw e r e3 3 7 8 4m g la n d4 0 9 9 7 m g l p o r p h y r i d i u mi sas o r to f a l g a et h a ta r ef a m o u sf o rt h e i rb i o m a s s i nt a x o n o m yr e s p e c t ， t h e yb e l o n g t or h o d o p h y t a ，b a n g i o i d e a e ，b a n g i a l e s ，p o r p h y r i d i a e e a e m u c hr e s e a r c hw o r k h a sb e e nd o n ei n i t s s y s t e m a t i c s ，b u t t h er e s e a r c ho fm o l e c u l a r s y s t e m a t i c s i n p o p h y r i d i u mi sj u s ta tt h eb e g i n n i n g i nt h i sp a p e r , t h ea p p r o a c ho f r a p d ，a su s e dt o i v 摘要 s t u d yt h r e es p e c i e so fp o r p h y r i d i u m ，i no r d e rt od i s c u s st h e i rt a x o n o m ys t a t u sa n dg e n t i c r e l a t i o n s h i p s i nm o l e c u l a rl e v e l ，a n de n r i c ht h er e s e a r c ho fm o l e c u l a rs y s t e m a t i c si n p o r p h y r i d i u m g e n o m i cd n aw e r ee x t r a c t e df r o mt h r e es p e c i e so fp o r o h y r i d i u m ，w i t hm o d i f i e d c t a bm e t h o d ，2 5w e r eu s e df o rd n a a m p l i f i c a t i o na n dat o t a l o f2 3 3a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t sr a n g ef r o m4 0 0 b p t o8 0 0 0 b pw e r e g e n e r a t e d as i m i l a r i t ym a t r i xf o ra l lp a i r w i s e c o m p a r i s o n sw a sc a l c u l a t e du s i n gn e ia n dl i sf o r m u l aa n dt h e nt r a n s f o r m e dt od i s t a n c e m a t r i x d e n d r o g r a m sw e r ec u n s t r u c t e db ya p p l y i n gu n w e i g h t e dp a i r - g r o u pa r i t h m e t i ca y e r a g e ( u p g m a ) a n a l y s e su s i n gt h ep h y l i p s o f t w a r e t h er e s u l t ss h o w e d ：d n a s a m p l e s e x t r a c t e dw i t ht h em o d i f i e dc t a bm e t h o dc o u l db es u c c e s s f u l l ya m p l i f i e db yr a p d ； p o r p h y r i d i u mp u r p u r e u ma n dp o r p h y r i d i u mc r u e n t u mh a v es i m i l a rg e n e t i cb a c k g r o u n d s ， t h e i rg e n e t i cd i s t a n c e sw a so 3 9 6a n d r e l a t i v e l yc l o s ee a c h o t h e r k e yw o r d s ：p o r p h y r i d i u m ；c u l t u r e ；p o l y s a c c h a r i d ee x t r a c t i o n ；o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ； r a p d v 硕士学位论文三种紫球藻培养、r ) b 多糖提取及r a p d 分析 第一章文献综述 1 1 微藻培养及微藻生物技术 1 1 1 微藻的培养历史与发展现状 藻类是一群晟简单最古老的低等植物，是地球上最早的绿色植物。根据古生物化 石的资料，在古代寒武纪前( 至少在2 0 0 ，0 0 0 ，0 0 0 年前) 就有藻的存在。从古生代、 中生代至新生代都有藻类化石。一般来讲藻类化石是比较少的，因为藻类没有维管系 统组织，藻体不保留在早期地层中。但是，随着近年来古代化石研究技术的进步，藻 类化石研究有许多新发现( 海藻学，1 9 6 1 ) 。 微藻不是分类学上的名称，是指在显微镜下才能辨别其形态的微小藻类类群。微 藻种类繁多，全世界藻种数量估计在1 0 0 万1 0 0 0 万之间，其中大多数是微藻。迄 今已知藻类约3 万余种，微藻约占7 0 ( 陈峰，1 9 9 9 ) 。 微藻分布十分广泛，从潮湿地带到水域都可找到它们的踪迹，主要分布于江河、 湖海和池塘，在土壤、岩石和沙漠上也有些种类，有些特殊的种类还可以在冰雪、 温泉和岩石等极端环境下生存。 单细胞藻类的培养历史，是从十九世纪末，欧洲科学家开始。自1 8 9 0 年荷兰细 菌学家b e i j e r i n c k 用培养细菌的方法将小球藻( c h l o r e l l a ) 与其它单细胞绿藻分离培 养以来，微藻培养历史已有1 0 0 多年。微藻的真正培养开始于二十世纪四十年代。1 9 4 0 年，第一次以实际应用为目的的实验室培养开始于英国，用藻来饲养幼蚝 ( b r u c e ，1 9 4 0 ) 。1 9 4 2 年，h a r d e r 和 c o nw i t s c h 在德国首次大规模培养硅藻，以获取 b 一胡萝h 素和油脂( h a r d e r , 1 9 4 2 ) 。 微藻的培养方式主要有三种：光自养( p h o t o t r o p h i c ) 、混合营养( m i x o t r o p h i c ) 和异 养( h e t e r o t r o p h i c ) 。自养是指藻细胞通过光合作用，利用无机碳( c 0 2 或h c 0 3 ) 作为 碳源的营养方式，这也是大多数藻具备的营养能力。混合培养是在培养基中添加有机 化合物，并给予充足光照，藻类既可进行光合自养，同时也利用有机物进行异养的培 养方式。异养是以糖类、蛋自质水解物、有机酸和其它形式的有机化合物来获得能量 和碳源的需要。它不考虑光照的影响，其产量稳定，培养物的生化组成稳定。异养培 养对光没有需求，利用传统微生物发酵系统就可进行异养培养。异养培养与混合营养 为微藻的大规模生产带来美好前景。 第一章文献综述 当然并不是所有的藻都具备异养的条件，一般藻类的异养有三个必需条件：( 1 ) 必需具有相关的酶。有些藻类缺乏利用有机物的酶，不能分解有机物合成自身的物质， 所以限制了异养生长的能力：( 2 ) 细胞膜具有通透性。有机物质只有通过细胞膜进入 细胞内部，才能被藻类吸收利用：( 3 ) 具有强的呼吸能力，藻类通过呼吸作用分解自 身物质，获取能量维持生长。如果呼吸作用的能量不足以维持细胞生长及运输有机物 质，则限制了异养的能力。 目前商业上使用的微藻培养系统主要是室外开放式，如园池、方池、环道等方式。， 开放系统有投资少、成本低、技术要求简单等优点。但其致命的弱点在于产量低，生 产不稳定，容易污染等。为了进行“纯种”培养，必须使用封闭系统。 自五十年代以来，许多研究者就致力于微藻光生物反应器的研究开发。在诸多的 封闭系统中，管状光生物反应器似乎更有开发利用价值，其可靠性、有效性和低成本 日益引起人们的重视。在1 9 8 3 年p i t ts j 等完成了光生物反应器的设计和操作理论及 计算机控制装置。以后在以色列、意大利、西班牙、日本、美国、法国、新加坡、加 拿大等国都进行过光反应器的研究工作。 通常情况下，光生物反应器的单位体积生物量产量远低于发酵罐，因为光反应器 中微藻的生长所需能量主要来源于光照，而光照效率紧紧依赖于表面积与体积( s v 1 的值。为了更好地解决这一问题，许多研究者制作了平板式光生物反应器，使微藻的 浓度和生物量产量分别有所提高。 作为微藻光生物反应器它具有以下主要优点：( 1 ) 具有较高的表面积与体积( s v ) 比，可以充分利用光能，提高单位体积产量。在运行良好的光反应器中，微藻的光能 利用率最高可达1 8 ，而开放式方式尚不足1 ；( 2 ) 有效地避免细菌、真菌、原生动 物及其它杂藻的污染；( 3 ) 生长条件可以有效的得到控制；( 4 ) 可以实现生产管理的自 动化；( 5 ) 可极大地降低收获成本。 目前，正在研究开发的光反应器主要有以下类型：气升式管状光生物反应器、平 板光生物反应器、光导纤维柱状光生物反应器、发光二极管光生物反应器等。 1 1 2 微藻生物技术 微藻生物技术是指以藻类学研究为基础，应用于藻类的生物技术，即利用藻类及 定向改造藻类生物体系的技术和工程原理，提供商品和社会服务的综合性科学技术。 藻类是生物技术的新领域，生物技术也是推动藻类资源开发的强动力。 堡兰兰垡堡茎三种紫球藻培养、胞外多糖提取硬r a p q 坌堑! 微藻生物技术主要包括：微藻的基础理论研究，即微藻的生理生化特性、培养条 件的优化、有效成分及活性物质的分析等；微藻的大规模培养技术，如高效光生物反 应器的研制和微藻高密度培养技术：微藻生物量和活性物质( 代谢产物) 的采收及分 离纯化工艺等；藻类基因工程的研究以及微藻有关产品的开发应用研究等。 藻类含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物、人体所必需的脂肪酸和维生素等营 养成分、可燃性油料以及其它多种生物活性物质，是人类索取食品、保健品、药物、 燃料、化工纺织产品、生物试剂等材料的重要来源。 藻类不仅用于保健品和食品添加剂，也用于饲料添加剂和水产饵料等。固氮蓝藻 是一种非常重要的天然肥料，日本、印度等国早已对此进行了培养试验。藻类的代谢 产物可谓多种多样，如抗生素、微囊藻毒索、高不饱和脂肪酸、藻胆蛋白、多糖、s o d 、 微藻燃料等。由此可见，藻类生物技术的应用有着巨大的潜力。 藻类生物技术的发展方向主要为：( 1 ) 微藻的工业化生产；( 2 ) 藻类活性物质的 开发：( 3 ) 藻类光生物反应器的研究开发；( 4 ) 藻类基因工程的研究；( 5 ) 开发新的藻 类资源。 微藻生物技术前景取决于三个因素：( 1 ) 降低成本以使藻的生物量从局限于保健 市场发展成大商品；( 2 ) 开发合适的反应器，如具有抗污染，易于保持纯藻种培养， 水蒸发损失少，易于保持培养基盐浓度，细胞密度高，控温好等特点，从而保证高产 出的密闭系统。但这些系统还需经大规模生产运转，以评估出较高的投资是否能从较 高的藻生物量产出得到补偿。( 3 ) 要使微藻生物技术在经济上有活力，还需要使用更 多种类的藻，要进行藻株改良，利用分子生物学与基因工程的手段进行藻种的筛选与 改良，以适应露天的各种环境。 1 1 3 藻类的应用 1 t 3 1 人类食物中的应用 推动微藻大量培养技术发展的最早因素，是世界人口的增加和全球性蛋白的缺乏 以及航天的需要，但在这方面的研究为数并不多，并且大多是在1 9 7 0 年以前进行的。 而关于微藻对人类的营养价值研究则仁智互见，莫衷是。不过最后的结论是：用微 藻作为食物是可行的。由于微藻细胞壁难以消化，食用后易产生不良副反应，因此食 用前必须进行充分的加工处理。 1 1 3 2 动物饲料的应用 第一章文献综述 微藻营养丰富，大小适合可直接作为水产经济动物以及成体的饵料，如大多数贝 类的幼虫、虾类的蚤状幼体和糠虾幼体、海参类幼体等，同时也可用于培养动物性生 物饵料，如轮虫、枝角类、桡足类等，再以动物性生物饵料投喂作为水产经济动物幼 体饵料( p a t t n a i k ，1 9 9 9 ) 。微藻起了“间接饵料”的作用。微藻作为饲料添加剂是因其营 养价值丰富如小球藻是一种潜在蛋白替代品，可用于各种动物( r e n a u d ，1 9 9 9 ) ；此外 微藻含有较高浓度及高价值的色素如杜氏藻生产b 胡萝b 素，红球藻生产虾青素，小 球藻生产时黄索是观赏鱼类、虾、蟹、三文鱼和家禽的皮色、蛋黄着色的主要色素 ( b r o w n ，1 9 9 9 ；u c h i d o ，1 9 9 9 ) 。 1 1 3 3 利用藻类处理污水 从经济角度看，大量培养藻类最有发展前途的用途是用于废水处理系统中。藻类 活体光合作用可释放氧气，改善水质。比如螺旋藻具有上浮性易于收获，生产过程中 还能分泌胞外生物絮凝剂，从而强化了废水处理过程。此法与传统的三级处理相比， 具有成本低，能耗少，效益大的优点，是一项非常有开发潜力的环保工程。 1 1 3 4 医药工业中的应用 徽藻的药用价值正日益引起人们的注意。应用藻类是最有效的辐射能转化器之 一，对太阳能的转化率约为7 。藻类菌体经过生长、收集并进行发酵后，可最终生 产出甲烷气体。废渣中则含有适合作肥料或动物饲料的有用营养物。美国曾用垃圾中 生长的藻体进行发酵。应用藻类作为沼气池的补充料在中国和印度都曾试验过。沼气 池中除去废渣后的上层发酵液可重新利用，作为某种循环系统中培养藻类的营养物 ( 曹健，1 9 9 6 ) 。 随着氮肥价格不断上升，藻类作为生物肥料的应用显得越来越重要。细菌和蓝藻 是自然界生物圈中几乎一切固定氮的来源，雨蓝藻是唯一既具有通过光合作用生产氧 气，又具有固定氮气代谢能力的生物体。 1 1 4 前景展望 微藻的研究和开发虽已取得不少成绩，但就总体而言，研究才刚刚起步，有很多 研究方向微藻还未触及，因此微藻的开发利用潜力十分巨大。 目前，研究焦点多集中在它的生物活性物质，如多糖、藻蓝蛋白、维生素、d 胡萝h 素和y 亚麻酸以及一些酶等，这些活性物质对热的稳定性比较敏感，故其提耿 硕l 一学位论文 - - 种紫球藻培养、胞外多糖提取及r a p d 分析 加工工艺直接影响其功效，所以提取条件仍是研究的重点。为了不同目的，培育不同 的藻种，乃至藻种定向改良及遗传工程的研究仍是热点问题，它需要多学科间的相互 渗透和合作。 微藻种类繁多，生态习性复杂，能天然生产许多不同及稀有的脂类、糖类和藻胆 蛋白等生物活性物质。它们还包括大量未曾开发利用的一些生物，可有效提供源源不 断的产品资源。 第一章文献综述 1 2 紫球藻研究进展 藻类是初级生产力的重要组成部分，在生态学中有着重要的意义，此外还可以作 为人类的保健食品、动物的饵料、提取生物活性物质、改善土壤和处理污水等作用。 随着人们对藻类认识的加深，藻类作为一种新的生活资源，引起广泛的重视。紫球藻 能够合成多种生物活性物质，如硫酸多糖、不饱和脂肪酸、藻胆蛋白、超氧化物歧化 酶( s o d ) 、b 一胡萝h 素等，已成为国内外研究的热点。 紫球藻生物活性物质有着重要的商业价值( f u e n t e s ，2 0 0 0 ) ，如硫酸多糖，可作为 稳定剂、粘合剂、增稠剂等应用于造纸、纺织、食品、化妆品、化工以及制药行业 ( g e r e s h ，1 9 9 9 ) ，并能有效抑制各种病毒( f a b r e g a s ，1 9 9 9 ；m a r i n a ，2 0 0 2 ；s h i m o n a ，2 0 0 2 ； h u h e i h e l , 2 0 0 2 ) ：不饱和脂肪酸花生四烯酸a a ( 2 0 ：4 0 6 ) 和二十碳五烯酸e p a ( 2 0 ：5 0 6 ) 等，都是人体必需的不饱和脂肪酸( d i e g o ，1 9 9 8 ；r o b l e s ，1 9 9 9 ) ，具有广泛的生理活性 ( n u u t i l a ，1 9 9 7 3 ，同时也是鱼油的极好来源：藻胆蛋白，既可作为食品添加剂，又可 作为荧光标i 己( r u p e r t o ，2 0 0 1 ) ；紫球藻中分离的硫代异鼠李糖甘油二酯s q d g s 可有效 抑制人体癌细胞增生，用于药物预防和药物治疗( d u m a y , 2 0 0 2 ) ；抗氧化剂超氧化物 歧化酶s o d 可应用于化妆品、保健食品等行业，此外还含有b 胡萝h 素以及丰富的 维生素和多种矿物质。 紫球藻具有可密集培养、适于工业化生产等特点。由于其结构相对简单，非常适 于进行生理及细胞学研究。自6 0 年代以来紫球藻从分类、生态、培养等基础理论的 研究，逐渐进入医药、化工等应用领域的探索。目前国内的研究现状与国外还有定 的差距，主要是因为国内对于紫球藻的研究起步较晚，基础比较薄弱。近年来，国内 外对紫球藻进行的大量的研究取得一定的成果。随着微藻生物技术的发展，以及分子 生物学等实验技术手段的完善，紫球藻的研究范围也将更加深入、广泛。 本文总结国内外有关紫球藻的研究情况，对其的生物学特征、营养成分、生物活 性物质及应用以及培养等多方面的研究进行综述，为紫球藻的深入研究提供参考。 1 2 1 紫球藻生物学特征 1 2 1 1 分类地位 紫球藻属( p o r p h y r i d i u m , n a g e l i ，18 4 9 ) 系红藻门( r h o d o p h y t a ) ，红毛菜亚纲 ( b a n g i o i d e a e ) ，红毛莱目( b a n g i a l e s ) ，紫球藻科( p o r p h y r i d i a c e a e ) 。紫球藻分稚广泛， 在海水、淡水、咸水和潮湿的土壤等环境中均可以找到其踪影。紫球藻由于缺少红藻 硕士学位论文三种紫球藻培养、胞外多糖提取及k a p d 分析 门形态学和繁殖特征，早期被归属于绿藻门或蓝藻门，分类地位很不明确，后由m o l i s h 等根据其细胞构造和色素性质确定为单细胞红藻( 冈村金太郎，1 9 3 0 ) 。此外在 p c r u e n t u m 徊p a e r u g i n e u m 中发现有弗罗里多苷和y 一亚麻酸的存在，也证明了紫球藻 属于红藻门( m o r e t t i ，1 9 8 2 ) 。目前报道过的种类有p o r p h y r i d i u mc r u e n t u m ( a g ) n a g ， p o r p h y r i d i u mp u r p u r e u m ( b o r y ) d r e we tr o s s ，p o r p h y r i d i u ma e r u g i n e u m g e i t l e r ， p o r p h y r i d i u ms o r d i d u mg e i t l e r ，p o r p h y r i d i u mg r i s e u m ，p o r p h y r i d i u mm a r i n u m ， p o r p h y r i d i u mv i o l a c e u m 。p s o r d i d u m 最早发现在北美。自1 9 6 7 年以来没有更深入的 报道( o t t ，1 9 8 7 ) a 常见的紫球藻主要有：p c r u e n t u m 、e p u r p u r e u m 和p a e r u g i n e u m 三 种。此外在培养过程中还有一些变种，供实验研究( r i t z ，1 9 9 8 ) 。 1 2 1 2 细胞形态结构特征 紫球藻细胞圆形或卵形，细胞直径5 2 4 1 a m 。单一生活或多数个体不规则聚生而 成一层。紫球藻细胞膜外缺少纤维成分，郎无细胞壁。每个缅胞外围绕着一层粘质鞘， 为细胞分泌的水溶性、多阴离子硫酸多糖。细胞内有一个大而呈星状的载色体，内含 有各种色素，主要为藻红素和藻蓝素，环境变化可使细胞颜色略起变化。研究紫球藻 亚显微结构发现，星状载色体是该属的主要鉴别特征( g a n t t ，1 9 6 5 ) 。藻胆体附着在叶 绿体的类囊膜表面，细胞核常偏生在细胞内的一侧。此外细胞内还含有线粒体、内质 网、高尔基体等其它细胞器。比较培养