（水生生物学专业论文）启动子对hgmcsf基因在鱼腥藻7120中表达影响的研究.pdf

谭玮：启动了：对h g m - c s f 摹w 舟鱼腥藻7 1 2 0 中表达影响的研究 摘要 蓝藻是一种可以进行放氧光合作用的原核生物。它具有结构简单、培养成本低、 绝大多数不含毒素、营养丰富、分布广泛、环境适应能力强、便于外源基因转化、蛋 白酶活性低等优点。这些优点使蓝藻有可能成为较大肠杆菌和酵母更为理想的基因工 程宿主。随着蓝藻基因工程的发展，已有一批有应用前景的外源基因得到成功表达， 使转基因蓝藻可以在医药和环保问题上得到应用。而人粒细胞一臣噬细胞集落刺激因 子( h g m c s f ) 是第一个被克隆和利用重组d n a 技术生产的造血刺激因子，是一个 具有多项潜能的造血生长因子，具有十分重要的临床应用价值，在国际生物技术制药 市场上占有重要的位置。但是天然h g m c s f 因制备量少，纯度不够高等原因，远不 能满足市场需要。因此，用基因工程来生产h g m c s f 有其重要的经济、社会意义以 及独特的优越性。 外源基因在蓝藻细胞中表达效率较低一直以来都是制约蓝藻基因工程长足发展 的一个瓶颈。而影响蓝藻外源基因表达调控的关键就是转录和翻译水平上的调控，对 基因转录效率起决定作用的是由r n a 聚合酶与启动子之间相互作用所控制的起始过 程，所以启动子的选择对外源基因的表达至关重要。因此，本研究根据鱼腥藻7 1 2 0 中r n a 聚合酶的特性以及蓝藻内源启动子的结构性质，选用了两个蓝藻内源启动子 p 印和p g r o e s l 来起始转录表达外源基因h g m c s f 。运用p c r 方法，从蓝藻中成 功调出藻蓝蛋白b 亚基基因启动子p c p c f l 和热休克基因启动子p g r o e s l ，将外源基因 插入到启动子的下游后进一步与穿梭表达载体p d c 0 8 相连构建成两个穿梭表达载体 p d c c g m 和p d c - g - g m 。利用三亲接合转移法转化到鱼腥藻7 1 2 0 中，通过相应抗 生素筛选并经继代培养后得到能稳定遗传的含有目的基因和目的启动子的两个转基 因藻c g m 和g g m ，并对转基因藻的最适生长条件进行了优化筛选。测定了转基因藻 的生理活性、p c r 及w e s t e r nb l o t t i n g 的数据分析，以此来探测外源基因h g m c s f 在鱼腥藻7 1 2 0 中的表达效率。 本论文的主要内容及结果如下： 1 从聚球藻7 0 0 2 总d n a 中克隆出了p c p c , 8 启动子，然后从实验室中已构建好 的p d c - - g m 载体中将被修饰的外源基因h g m c s f 经双酶切切下，将其插入到载体 p u c e p c l 3 的启动子p c p c 归下游，最后将其连同启动子一起克隆到穿梭载体的p d c 0 8 的相应位点，成功的构建了穿梭表达载体p d c c g m ，并通过三亲接合转移方法转入 鱼腥藻7 1 2 0 中，通过抗生素筛选及继代培养后，获得了转基因藻e g m 。 上海师范大学颈士学位论文 摘要 2 从聚球藻7 9 4 2 总d n a 中克隆出了热休克启动子p g r o e s l ，然后从实验室中 已构建好的p d c - g m 载体中将经修饰的外源基因h g m c s f 经双酶切切下，将其插 入到载体p u c - g r o e s l 的启动子p g r o e s l 下游，最后将其连同启动子一起克隆到穿梭 载体的p d c - 0 8 的相应位点，成功的构建了穿梭表达载体p d c g g m ，并通过三亲接 合转移方法转入鱼腥藻7 1 2 0 中，通过抗生素筛选及继代培养后，获得了转基因藻 g g m 。 3 对两种转基因藻进行了d n a 水平检测，通过p c r 方法，测定了转基因藻c g m 基因组d n a 中已稳定存在启动子p c p c p 和外源基因h g m c s f ：转基因藻g g m 基因 组d n a 中已稳定存在启动子p g r o e s l 和外源基因h g m c s f 。 4 对两种转基因藻进行了优化培养，在本实验设雹的范围内，两种转基因藻e g m 和g g m 的适宜温度为3 0 c ，适宜p h 值为9 5 ，适宜光照强度为6 0 9 0 1 - t m o lm - 2 s o 5 对两种转基因藻进行了w e s t e r nb l o t t i n g 检测，表明在两种转基因藻中均表 达了具有免疫活性的h g m c s f 。利用软件分析结果，证实p c p c # 启动下的h g m c s f 比启动子p p s b a 下的h g m c s f 表达量提高9 0 ：证实p g r o e s l 启动下的h g m c s f 经过高温热诱导后比p p s b a 下的h g m c s f 表达量提高4 5 9 以上结果证明，替换了启动子的目的基因h g m c s f 在鱼腥藻7 1 2 0 中的表达效 率在一定程度上有了明显提高，尤其是热休克启动子p g r o e s l 启动下的h g m c s f 经 过热诱导后，表达量较p p s b a 下的h g m c s f 提高了4 5 9 为将来进一步利用蓝藻制 备h g m c s f 基因药物的口服剂和研究如何提高外源基因在蓝藻中的表达作一些基础 工作。 关键词：蓝藻基因工程；人粒一巨噬细胞集落刺激因子；鱼腥藻7 1 2 0 ；启动子；三亲 接合转移；转基因蓝藻 谭玮：启动了对h g m - c s f 基w 冉鱼删j i i7 1 2 0 中表达影响的研究 a b s t r a c t c y a n o b a c t e r i a a r ea u t o t r o p h i cp r o k a r y o t e sp e r f o r m i n go x y g e n i cp h o t o s y n t h e s i s ，w h o c a l lu s el i g h t , c a r b o nd i o x i d e a n do t h e ri n o r g a n i cn u t r i e n t se f f i c i e n t l y d u et ot h e i r p r o p e r t i e s ，s u c h 私谢d e s p r e a d ，s i m p l eg r o w t hr e q u i r e m e n t ，s i m p l es t r u c t u r e ，l a r g e s c a l e c u l t u r ea n dc l e a nb i o p r o c e s s e s ，c y a n o b a e t e r i ab e c o m eap o t e n t i a l l yp o w e r f u lm o d e ls y s t e m o fm o d e r nb i o t e c h n o l o g y , a sw e l la sf o rt h es t u d yo fh i g h e rp l a n tp r o c e s s e s c o n c e r n i n g t h e i rs i m p l es t r u c t u r ea n de a s eo fh a n d l i n g ，e y a n o b a c t e r i am a k ea ni d e a la n de c o n o m i c a l h o s tf o re x p r e s s i o no fv a l u a b l ef o r e i g np r o t e i n ss u c ha sg e n e t i ce n g i n e e r i n gm e d i c i n e h u m a ng r a n u l o c y t e m a c r o p h a g ec o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o r ( h g m c s f ) i st h ef a s t h a e m a t o p o i e t i cc y t o k i n e st h a th a sb e e nc l o n e da n db e e nu t i l i z e db yr e c o m b i n a n td n a t e c h n o l o g y i th a sp o t e n te f f e c t si ns t i m u l a t i n gp r o l i f e r a t i o n , m a t u r a t i o na n df u n c t i o no f h a e m a t o p o i e t i c c e l l i t o c c u p i e dl a r g ep e r c e n to fr e c o m b i n a t i o nm e d i c i n e m a r k e t h g m c s fe x p r e s s i o ni nc y a n o b a c t e r i ah a sb e e nr e s e a r c h i n gi no u rl a bs i n c e2 0 0 1 h o w e v e r , t h el e v e lo fe x p r e s s i o nf o rt h ep r o d u c to fh g m - c s fi nc y a n o b a c t e r i ah a m p e r s t h eu t i l i z a t i o no ft h e s et r a n s g e n i cc y a n o b a c t e r i a i no r d e rt oi m p r o v et h ee x p r e s s i o nl e v e lo ff o r e i g ng e n ei nc y a n o b a c t e r i a , b a s e do n t h ec h a r a c t e ro fa n a b a e n as p p c c7 1 2 0r n a p o l y m e r a s ea n dt h es t r n c t u r eo fp r o m o t e r w es e l e c tt w oc y a n o b a c t e r i ae n d o g e n e s i sp r o m o t e r s - - p c p c 多w h i c ht h e3 4 0b pu p s t r e a m f r a g m e n to fc p 醪g e n ee n c o d e st h ep - s u b u n i to fp h y c o c y a n i na n dah e a ts h o c kp r o m o t e r p g r o e s lw h i c hi n d w e l l si nt h eg r o e s lo p e r o no fs y n e c h o c o c c u ss p p c c7 9 4 2 t h et w o p r o m o t e r sw e r eo b t a i n e db yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c 鼢f r o mg e n o m i cd n ao f c y a n o b a e t e r i u ms y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 0 0 2a n ds y n e c h o c o c c u ss p p c c7 9 4 2r e s p e c t i v e l y t h e ni n t e g r a t i v ee x p r e s s i o nv e c t o rp d c - c - g mw h i c hc o n t a i n e dp r o m o t e rp c p c 晷a n d h g m - c s f f o r e i g ng e n e ，p d c - g - g mw h i c h c o n t m n e dp g r o e s la n dh g m - c s fg e n e ，w e r e c o n s t r u c t e d a n di n t r o d u c e di n t oa n a b a e n as p p c c7 1 2 0v i at f i p a r e n t a lc o n j u g a t i o n t r a n s f o r m a t i o n s e l e c t e db yn e o m y c i n ，t h es t a b l et r a n s g e n i cc y a n o b a c t e r i u mw e r eo b t a i n e d p c ra n a l y s i si n d i c a t e dt h ee x i s t e n c eo fv e c t o r sp d c c g m 、p d c g g ma n dw e s t e r n b l o t t i n gd e m o n s t r a t e dt h ee x p r e s s i o no f h g m c s fi na n a b a e n as p p c c7 1 2 0 t h ec o n t e n t sa n dr e s u l t so f t h i se x p e r i m e n to fw e r ea sf o l l o w s ： 1 p c p c pw a sc l o n e db yp c rf r o mg e n o m i cd n ao fm a r i n ec y a n o b a c t e f i u m s y n e c h o c o c c u ss p p c c7 0 0 2 t h e ni n s e r t e di ti n t ou p s t r e a mo f t h ef o r e i g ng e n eh g m - c s f a n dl i g a t e d 嘶t l lp d c - 0 8t oc o n s t r u c tt h es h u t t l e e x p r e s s i o n v e c t o r p d c c g m ， t r a n s f o r m e di ti n t oa n a b a e n as p p c c7 1 2 0b yt r i p a r e n t a lc o n j u g a t i o nm e t h o d s e l e c t e db y i i i 上海师范大学硕七学位论文摘薹 n e o m y c i n ，t h es t a b l et r a n s g e n i cc y a n o b a c t e r i u mc g mw a so b t a i n e d 2 o b t a i n e dt h ep r o m o t e rp g r o e s lw a sb yp c rf r o mg e n o m i ed n ao f s y n e e h o c o c c u ss p p c c7 9 4 2 t h e np l a c e dt h ef o r e i g ng e n eh g m - c s fi n t ot h e d o w n s t r e a mo fp g r o e s la n dl i g a t e dw i t hp d c - 0 8t oc o n s t r u c tt h es h u t t l ee x p r e s s i o nv e c t o r p d c g g m ，i n d u c e di t i n t oa n a b a e n a s p p c c 7 1 2 0 b yt r i p a r e n t a lc o n j u g a t i o n t r a n s f o r m a t i o n s e l e c t e db yn e o m y c i na n do b t a i n e dt h es t a b l et r a n s g e n i cc y a n o b a e t e r i u m g g m 3 p c ra m p l i f i c a t i o no fw i l dt y p ea n dt w ot r a n s g e n i ca n a b a e n as p p c c7 1 2 0 c e l l s ( e g ma n dg g ms t r a i n ) w i t hs p e c i f i cp r i m e r sr e v e a l e dn ob a n di nw i l dt y p ea n d p l a s m i df r e ec e l l s ，w h e r e a st r a n s g e n i cc g mc e l l sy i e l d e daa b o u t7 5 0b pb a n d ( p 叩印a n d h g m - c s f ) a n dt r a n s g e n i cg g mc e l l sy i e l d e daa b o u t6 2 5b pb a n d ( p g r o e s la n d h g m c s f ) 4 r e s u l t so ft h eg r o w t hc u r v eo fc e l l so v e rt i m ew e r es h o w e da sf o l l o w s ：i nt h e e x t e n s i o no ft h i se x p e r i m e n t ，t h eo p t i m a lg r o w t ht e m p e r a t u r ea n dp ho fc g ma n dg g m t r a n s g e n i ca n a b a e n as t r a i na r e3 0 6 c ，9 5r e s p e c t i v e l ya n dt h ea p tl i g h ti n t e n s i t yi s 6 0 9 0 p m o lm - 2 s t h e s em e s s a g e sw i l lh e l pu st oo p t i m i z eg r o w t ho ft h et w ot r a n s g e n i e c y a n o b a c t e r i a , f u r t h e re x p r e s sm o l eh g m c s fi nt h et r a n s g e n i cc e l l s 5 w e s t e r nb l o t t i n gg m m 、c g ma n dg g mt r a n s g e n i ca n a b a e n as t r a i na n a l y s i sf u r t h e r c o n f i r m e dt h a th g m c s fi se x p r e s s e di nt h et w ot r a n s g e n i ca n a b a e n as p p c c7 1 2 0 h a r b o r i n gp d c - c - g ma n dp d c - g g m m o r e o v e r , t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fh g m - c s fi n e g ms t r a i nw i t hp r o m o t e rp c p c f li s9 0 a sc o m p a r e dt og m is t r a i nw i t hp p s b aa n dt h e e x p r e s s i o nl e v e lo f h g m c s fi ng g ms t r a i nw i t hp r o m o t e rp g r o e s lb y4 2 ci n d u c e dl h i s4 5 9 a sc o m p a r e dt og m is t r a i n t h ea i mo ft h ep r e s e n ts t u d yi st om a k eah i g h e r - l e v e le x p r e s s i o no fh g m - c s fi n c y a n o b a e t e r i ac e l lb yr e p l a c i n gs t r o n g e rp r o m o t e r sa n do p t i m i z eg r o w t ho ft h et w o t r a n s g e n i ec e l l sb yi n v e s t i g a t i n gv a r i o u sc o n d i t i o n s i naw o r d ，a l lt h er e s u l t sp r o v e dt h a t t w op r o m o t e r s w e r ec l o n e da n dh e i g h t e n e dt h el e v e le x p r e s s i o no fh g m c s fi na n a b a e n a s p p c c7 1 2 0 t h ec o n c l u s i o n so f f e rt h ee v i d e n c e sf o rt h ef u r t h e rp r o d u c e g e n i e e n g i n e e r i n gm e d i c i n ea n dh o wt oe n h a n c et h ee x p r e s s i o no ff o r e i g ng e n ei nc y a n o b a e t e r i a k e yw o r d s ：g e n i ee n g i n e e r i n go fc y a n o b a c t e r i a ；h u m a ng r a n u l o c y t e m a c r o p h a g ec o l o n y s t i m u l a t i n gf a c t o r ；a n a b e a b as p p c c7 1 2 0 ；p r o m o t e r ；t r i p a r e t a le o n j u g a t i v e t r a n s f e r ；t r a n s g e n i cc y a n o b a c t e r i a ； 谭玮；启动子对h g m - c s f 基因在鱼腥藻7 1 2 0 中表达影响的研究 符号与缩写表 a m p a m p r b p b s a c d n a c m c m 7 c p d n t p e b e d l a e g f g m c s f c g m 藻株 g g m 藻株 g m 藻株 h i t f k b k d a k a k n m m m t i n a m p i c i l l i n 氨苄青霉素 a m p i c i l l i nr e s i s t a n t 氨苄青霉素抗性 b a s ep a i r 碱基对 b o v i n e $ e r u ma l b u m i n 牛血清蛋白 c o m p l e m e n t a r yd n a 互补d n a c h l o r a m p h e n i c o l 氯霉素 c h l o r a m p h e n i c o lr e s i s t a n t 氯霉素抗性 c h l o r o p l a s t 叶绿体 d e o x y r i b o n u c l e o t i d e 脱氧核糖核苷酸 e t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a e e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e p i d e r m a lg r o w t hf a o t o r 表皮生长因子 g r a n u l o c y t e m a e r o p h a g ec o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o r 粒巨嗜细胞集落 刺激因子 t r a n s g c n i ca n a b e a n as p p c c7 1 2 0h a r b o r i n gp d c c g m 转 p o c c o m 基因的鱼腥藻7 1 2 0 t r a n s g e n i ca n a b e a n as p p c c7 1 2 0h a r b o r i n gp d c g - g m 转 p d c g n i m e n g m 基因的鱼腥藻7 1 2 0 t r a n s g e n i ca n a b e a n as p p c c7 1 2 0h a r b o r i n gp d c g m 转 p d c g m 基因的鱼腥藻7 1 2 0 h o u r 小时 i n t e s t i n a l1 h f o i lf a c t o r 小肠三叶因子 虹1 0 - b a s e p a i r 千碱基对 虹l o - d a l t o n 千道尔顿 k a n a m y c i n 卡那霉素 k a n a m y c i nr e s i s t a n t 卡那霉素抗性 m i n u t e 分钟 m e t a l l o t h i o n e i n - i 小鼠金属硫蛋白 n e o m y c i ns u l f a t e 硫酸新霉素 - 二墅塑堕堕堂堡圭丝兰 堕茎 n e o n e o m y c i nr e s i s t a n t 新霉素抗性 n t n u c l e o t i d e 核苷酸 o d o p t i c a ld e n s i t y 光密度 o r i o r i g i n 复制起点 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e e t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p e p c p h o s p h o e n o l p y r u v a t ec a r b o x y l a s e 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 p g a 3 - p h o s p h a t e d g l y c e r a t e3 磷酸甘油酸 p g i g l u c o s e 一6 - p h o s p h a t ei s o m e r a s e 葡萄糖6 磷酸异构酶 p g k p h o s p h o g l y c e r a t ek i n a s e 磷酸甘油酸激酶 p h b p l o t - 3 一h y d r o x y b u t y r a t ep o l y m e r a s eb 羟丁酸聚合酶 p r o - u k p r o - i l r o k i n a s e 尿激酶原 p t r c t h eh y b r i dt r p l a ep r o m o t e ro f e e o l i 大肠杆菌t r p l a c 杂合启动子 r m i n r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 每分钟转数 s s e c o n d 秒 s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 s o d s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 超氧化物歧化酶 t r i s t r i s 一 ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o 】m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 v t v i t a m i n 维生素 w t w i l dt y p ea n a b e a n as p p c c7 1 2 0 野生型鱼腥藻7 1 2 0 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中 除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声 明并表示了谢意。 作者签名： 日期： 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部 或部分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后 遵守此规定。 作者签名：导师签名： 日期： 谭玮；启动子对h c x - c s f 基斟各鱼腥藻7 1 2 0 孛表达影畴的研究 i 文献综述 1 1 蓝藻基因工程 蓝藻( b l l l e g r e e na l g e ) 又称蓝细菌( c y a n o b a c t e r i a ) 是一类能进行植物型放氧 光合作用的原核生物，其种类繁多，分布极广，适应性强，兼具植物及细菌的一些特 性。具有类似高等植物的光合作用系统，含有异型胞的种类还可进行生物固氮。由于 蓝藻在细胞结构、代谢、遗传和进化等方面表现出独特的性质，多年来被作为一种理 想的实验模型广泛地应用于研究光合作用、固氮作用、叶绿体起源以及植物进化等重 大生物学研究中。特别是近年来，随着基因工程的兴起和蓝藻分子生物学的深入研究， 提出蓝藻是一种独特的基因工程受体系统，通过重组d n a 技术人工构建藻类新株系 及生产蓝藻基因工程产物，成为蓝藻基因工程的两大目标，并取得重大突破( 姜鹏等， 1 9 9 8 ) 。 近三十年来，科学家对蓝藻的光合作用、固氮、细胞分化等复杂过程进行了大量 的分子水平的研究，为蓝藻基因工程的发展奠定了基础。由于蓝藻的细胞结构和遗传 特性与革兰氏阴性细菌类似( s t a n i e r , 1 9 7 7 ) ，部分种类具有天然转化系统和有效重 组系统，适用于大肠杆菌的分子生物学操作同样也适用于蓝藻细胞( 王业勤等，1 9 9 1 ) a 由于蓝藻结构简单便于基因操作，在进化上又处于细菌与高等植物的过渡期，加之集 胞藻s y n e c h o c y s t i ss p p c c6 8 0 3 和鱼腥藻a n n a n a e n as p p c c7 1 2 0 基因组全序列测定 的完成( k a n e k o 。1 9 9 6 ；k a n c k o 。2 0 0 1 ) ，吸引越来越多的科学家把蓝藻作为模式生物， 在分子水平解释植物光合作用、固氮、细胞分化等生命现象，甚至用来帮助解释动物 体内复杂的信号传导途径。如，许多蓝藻中参与光合作用的基因被克隆以用作高等植 物的探针( h o u m a r d ，1 9 8 8 ) ：2 0 0 0 年，c h c n 等人，通过对蓝藻s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 的研究，发现h c 0 3 是可溶腺苷酸环化酶的唯一调控因子，这一发现，对哺乳 动物c a i v i p 信号传导通路的进一步研究及对与该传导通路有关的疾病的探索有重大 的意义( c h e n 2 0 0 0 ) 。 除作为模式生物用于基础理论研究外，蓝藻还可作为外源基因的表达宿主，用于 生产基因工程药物或环保。与常用的表达宿主如大肠杆菌( h o c k n e y , 1 9 9 4 ) 、酵母 ( b u c k h o l z , 1 9 9 3 ) 或哺乳动物细胞( l e v i n s o n ，1 9 9 0 ) 宿主相比，蓝藻具有环境适应 能力强、培养成本低、不形成包涵体、不含内毒素、本身含有对人体有益的营养成分 等优点。 蓝藻基因工程是指利用重组d n a 技术定向获得蓝藻新品种、蓝藻基因表达产品 或实现其他社会服务的研究与开发行为，即包括针对蓝藻自身特点的基因工程方法学 上海师范大学硕士学位论文 文献综述 研究，也包括基因工程体系的产业化应用。严格地讲，蓝藻基因工程主要是研究蓝藻 来源的目的基因的克隆、向蓝藻中转移外源基因所需载体的构建、转移方法和检测方 法的建立等等( 刘永定。2 0 0 1 ) 。 正是由于蓝藻作为模式生物及表达宿主的优越性与必要性，为蓝藻基因工程的发 展准备了可能性。 1 1 1 蓝藻基因组概述 1 9 9 4 年日本k a z u s a d n a 研究所以t a b a t a 博士为首的研究集体开始了蓝藻基因 组研究工作( k o t a n ie la 1 ，1 9 9 4 ) 。并于1 9 9 6 年首次完成了集胞藻6 8 0 3 基因组序列 的测定。2 0 0 1 年又完成了鱼腥藻7 1 2 0 ( a n n a n a e n as p p c c7 1 2 0 ) 基因组全序列的 测定( k o t a n i e t a l 2 0 0 1 ) ，继a n n a n a e n as p p c c7 1 2 0 之后，海洋蓝藻s y n e c h o c o c c u s p c c7 0 0 2 的染色体物理图谱也已完成。使得蓝藻基因工程研究进入到后基因组时 代。另外，自1 9 8 7 年t a n d e a ud em a r s a e 等成功地把芽孢杆菌杀幼蚊毒素基因转化 到组囊藻( a n a c y s t i sn i d u l a n s ) 以来，已有一批具有应用前景的外源基因在多种蓝藻 中表达成功( s h e s t a k o ve la 1 。1 9 7 0 ；刘风龙等，1 9 9 9 ；戴巍等，2 0 0 1 ) 。这表明蓝藻基因 工程正在显示出其潜在的社会效益和经济效益。 鱼腥藻( a n n a n a e n as p ) 7 1 2 0 是一种丝状蓝藻，它不仅具有营养细胞，而且还有 异型胞，因此既能进行光合作用，又能进行固氮作用，常用作研究光合作用和固氮作 用的模式生物。在八十年代至九十年代初建立了较完善的遗传分析系统，是一维生物 体细胞分化研究的模式之一，是继集胞藻6 8 0 3 之后第二个完成全基因组序列测定的 蓝藻( k a n e k oe t a l 。2 0 0 1 ) 。鱼腥藻7 1 2 0 基因组大小为6 4 m b ，另外含有六个内源性 质粒，分别为：a l 口h a ，4 0 8 ，1 0 1 b p ；b e t a ，1 8 6 ，6 1 4 b p ；g a m m a ，1 0 1 ，9 6 5 b p ；d e l t a ， 5 5 ，4 1 4 b p te p s i l o n ，4 0 ，3 4 0 b p ：z e t a ，5 ，5 8 4 b p 。 集胞藻( s y n e c h o c y s t i ss p p c c6 8 0 3 ) 是一种单细胞蓝藻，具有自然转化系统。 在适宜碳源存在下，能够进行光能异养生长，因此被作为光合系统分子生物学研究的 模式生物之一( b r y a n t , 1 9 9 4 ) 。它是最早完成全基因组序列分析的几种微生物之一， 在光合生物中则是第一个。在其3 6 m b 的基因组中，有3 1 6 8 个可能的蛋白编码基因， 占基因组总长的8 7 4 ；还有两个r r n a 基因丛和4 2 个t r n a 基因，基因组中有9 9 个类似插入因子( i s ) 的结构，只有2 6 个可能编码完整的转座酶( k a n e k o ，e l a l ，1 9 9 6 ) 。 聚球藻( s y n e c h o c o c c u ss dw h 8 1 0 2 ) 是一种单细胞蓝藻，基因组大小为2 7 2 m b ， 有2 4 2 6 个蛋白编码基因。与其他聚球藻种类一样，广泛分布于全世界的海洋中，是 地球上主要的原初生产者之一，不具有任何明显的胞外结构，却能推动自身以 2 5 r a m s e e 速度在海水中运动，可进行遗传操作( b r a h a m s h a ，1 9 9 6 ) 。 2 谭玮：启动了对h g i l - c s f 雉埘牲鱼雕蒹7 2 0 中表达影响的研究 表i - 1 全部或部分测序的蓝藻及其研究组和数据库 t a b l e 1 - 1 c y a n o b a c t e r i aw i t hp n r t i a n yo rc o m p l e t e l ys e q u e n c e dg e u o m e s 点形念珠藻( n o s t o cp u n c t i f o r m e ) a t c c 2 9 1 3 3 是一种丝状固氮蓝藻。点形念珠 藻除异型胞分化外，还可以进行异养生长，产生厚壁孢子和藻殖段，侵染并与植物共 生( m e e k ，1 9 9 8 ) 。在鱼腥藻7 1 2 0 中发展起来的基因转移系统和转座子诱变方法均 适用于该种，但转座诱变效率较低( c o h e n ，1 9 9 4 ) 。其基因组大小为9 2 m b ，有7 4 3 2 个蛋白编码基因。 到2 0 0 4 年，加上测定的几种原绿藻的基因组序列，总共已经完成了9 种蓝藻基 因组全序列的测定工作，使得蓝藻基因工程的研究已经进入后基因组时代。表1 1 为 上海师范大学硕士学位论文 文献综述 目前为止全部和部分测序的蓝藻及其研究组和数据库。 1 1 2 蓝藻基因工程载体 载体是指携带外源基因并导入到受体细胞中的中间介质，它是影响外源基因表达 效果及表达稳定性的重要因素，也是基因工程的关键所在。 自1 9 7 3 年，a s a t o 和g i n o z a 首次在一种单细胞聚球藻中发现了染色体外存在共 价闭环d n a 以来，已经证明在至少有5 0 种单细胞和丝状体蓝藻中有质粒存在。蓝 藻中质粒数目从1 1 0 不等。大小在1 3 k b 1 3 0 k b 之间，但也有巨大质粒，大小在 4 0 0 k b - 1 0 0 0 k b 之间。虽然有些质粒已完全测序，并用于杂种质粒的构建，但是对蓝藻 质粒遗传研究的进展仍然很缓慢。蓝藻的许多功能，如对抗生素的抗性，对高盐或重 金属的抗性，毒素的产生，限制性内切酶合成等，据推测均与质粒有关，但无明确的 证据，所以说蓝藻的质粒是隐秘的。质粒的去除对细胞表型无明显影响。有证据表明， 蓝藻质粒可能含有可运动的元件，如转座子、插入因子等，从而可以在不同种间转移。 近年的分析发现在大约9 个不同属的5 0 个藻种中含有1 5 个型序列特异的限制性 内切酶，通过对这些酶序列的分析，发现了1 7 种新的限制性内切酶。其中一些在d n a 研究中特别有用。蓝藻中可能存在限制修饰系统，从而使染色体d n a 能抵抗限制性 内切酶的降解。v a n d e nh o n d e l 等最早使用蓝藻质粒来构建克隆载体( v a n d e ne la 1 ， 1 9 7 9 ) ，他们将大肠杆菌质粒p r l 4 6 上带有氨苄青霉素抗性基因的t n 9 0 1 转座子与聚 球藻( s y n e c h o c o c c u ss p p c c7 9 4 2 ) 的质粒p u h 2 4 重组，首次获得了可在转化的蓝 藻中表达氨苄青霉素抗性的重组质粒p c h i 及衍生质粒p u c i ，此后大量载体在体外 构建成功。 目前在模式蓝藻中，常用的载体有三种类型：一种是可以在蓝藻中自我复制的载 体，常使用的是穿梭表达载体。一种是整合载体和转座子，不能在蓝藻中自我复制， 但可以整合到蓝藻基因组d n a 上，并随着基因组d n a 的复制而复制。第三种是噬 菌体载体。 1 1 2 1 穿梭表达载体( s h u t t l ee x p r e s s i o nv e c t o r ) 用蓝藻质粒构建穿梭表达载体的工作已引起人们广泛的兴趣。目前，已构建了 许多既能在大肠杆菌中复制又能在蓝藻中复制的穿梭质粒转运载体，但对于这些载体 的宿主范围没有做过全面的检测。因此，对于这些复制子的种属特异性还所知不多， 在一个藻种中起作用的复制子在另外的藻种中是否发挥功能还不确定。由于蓝藻表达 载体的扩增要在大肠杆菌中完成，因此，该载体上要同时具有大肠杆菌和蓝藻的复制 起点，是一种穿梭质粒。目前，利用蓝藻内源质粒与e c o l i 质粒及其衍生的质粒载体 重组构建穿梭载体( s h u a l