（微生物学专业论文）产朊假丝酵母联产发酵生产s腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽研究.pdf

j：i ! 苏州大学学位论文使用授权声明 本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定， 即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸 质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献 信息情报中心、中国科学技术信息研究所( 含万方数据电子出版社) 、 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子 文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索。 涉密论文口 本学位论文属 。在年- 月解密后适用本规定。 非涉密论文囱 论文作者签名：j 孳尘i e l 导师签名：卫竺垒 日期：舅p ! ! 丝 产朊假丝酵 中文摘要 s 球苷甲硫氨酸( s - a d e n o s y l - - l - r n e t h i o n i n e ，s a m ) 和谷胱甘肽( g l u t a t h i o n e ，g s h ) 均是生物体内重要的含硫类小分子活性物质，分别在转甲基、转硫、转氨丙基和维持 细胞正常的氧化还原水平、细胞解毒等方面发挥关键作用，在医药、化妆品、保健品 行业都有着广泛的应用。 本文对产朊假丝酵母c a n d i d au t i l i s 中s a m 和g s h 的联产情况进行了研究，内容主 要包括三个方面：联产菌株的诱变筛选、突变株最适联产发酵培养基和培养条件的统 计学方法优化( 摇瓶水平) 及5l 发酵罐水平上s a m g s h 联产发酵条件探索。通过认 真细致的研究工作，得到了以下主要结论： 1 对出发菌株cu t i l i ss z u0 7 - 0 1 进行两轮紫外线诱变和一轮) ，射线诱变，并通过选择 性培养基( 含lg ll - 蛋氨酸，0 5g l l 硫氨酸，及2g ln a h s 0 3 的y p d 培养基) 进行分离培养后，筛选获得一株可联产s a m 和g s h 的高效正突变菌株cu t i l i sy 2 1 ， 中国专利菌种保藏中心保藏编号为c c t c cm2 0 9 2 9 8 。摇瓶发酵结果显示，其s a m 和g s h 产量分别达到3 2 4 0m g l 和2 2 0 5m g l ，较出发菌株分别提高了1 3 1 4 和 2 6 o ，而且该菌株经连续传代1 0 次后，遗传性状稳定，具有良好的产业化应用前 景。 2 响应面法优化结果显示，s a m 和g s h 联产最适发酵培养基为：蔗糖3 5 4g l ， ( n h 4 ) 2 s 0 41 0g l ，k h 2 p 0 41 2 3g l ，m g s 0 4 7 h 2 0o 0 5g l ，c a c l 20 0 5g l ，和l 一 蛋氨酸4 6g l ，优化培养基条件下，二者联产量达至1 j 5 8 9 3m g l 。正交试验结果 表明，二者联产最适条件为：温度3 3 * ( 2 ，摇床转速2 0 0r p m ，p h6 5 ，摇瓶装液量 4 0m l 5 0 0m l ，验证试验结果表明，在该最适条件下，s a m 和g s h 联产量达至1 j 6 3 0 m g l ，较优化前提高了1 5 7 。 ；联产发酵 作者：邵娜 指导老师：卫功元 产朊假丝酵母联产发酵生产s 腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽研究 s t u d i e so nt h ec o - p r o d u c t i o no fs - a d e n o s y l m e t h i o n i a n dg l u t a t h i o n eb yc a n d i d a u t i l i s a b s t r a c t s - a d e n o s y l m e t h i o n i n e ( s a m ) a n dg l u t a t h i o n e ( g s h 0 a r eb o t h i m p o r t a n t s m a l l m o l e c u l a rs u l f u rs u b s t a n c e si nv i v o s a ma c t sr o l e so fm e t h y l ，s u l f u ra n da m i n o p r o p y l t r a n s f e r sw h i l eg s h s i g n i f i c a n t l yp e r f o r m e di nt h em a i n t e n a n c eo ft h er e d o xb a l a n c ei n c e l l s s a ma n dg s hw e r ew i d e l yu s e di nt h ef i e l d so fm e d i c i n e ，c o s m e t i c sa n dh e a l t h p r o d u c t s i nt h i st h e s i s ，c a n d i d au t i l i sw a sf i r s t l yu s e df o rt h es t u d yo fs a ma n dg s h c o - p r o d u c t i o ni nd o m e s t i c t h es t u d yw a sc a r r i e do u ti nt h r e em a j o ra s p e c t s ：m u t a g e n e s i s a n ds c r e e n i n gf o rt h ep o s i t i v em u t a n to fs a ma n dg s hc o - p r o d u c t i o n ；o p t i m i z a t i o no f m e d i u mc o m p o s i t i o na n dc u l t u r ec o n d i t i o n sf o rt h em u t a n tb yu s i n gs t a t i s t i c a lm e t h o d s ； e x p l o r a t i o no ft h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rt h ec o - p r o d u c t i o no n a5l f e r m e n t o rl e v e l t h e m a i nc o n c l u s i o n so b t a i n e dw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h ep a r e n ts t r a i ncu t i l i ss z u0 7 - 0 1w a st r e a t e db yt w ot u r n so fu va n do n c ey - r a y i r r a d i a t i o nf o rc o m p l e xm u t a g e n e s i s ，f o l l o w i n gb yc u l t i v a t i n ga n ds c r e e n i n go nt h e s e l e c t i v em e d i u m ( y p dc o n t a i n i n g1g ll - m e t ，0 5g le t h i o n i n ea n d2g ln a h s 0 3 ) f o rap o s i t i v em u t a n tcu t i l i sy 21 ，w h i c hw a sl a t e l yc o l l e c t e da n dn u m b e r e da sc c t c c m2 0 9 2 9 8 t h ep r o l i f e r a t i o no fcu t i l i sc c t c cm2 0 9 2 9 8w a st h e nc a r r i e do u ti n f l a s k s ，a n dt h ep r o d u c t i o n so fs - a d e n o s y l - - l - m e t h i o n i n ea n dg l u t a t h i o n ew e r e3 2 4 0 m g la n d2 2 0 5m # l ，r e s p e c t i v e l y , w h i c hw e r e1 3 1 4 a n d2 6 。0 h i g h e rt h a nt h o s e o fcu t i l i ss z u0 7 - 0 1 i na d d i t i o n ，i ts h o w sh i 曲g e n e t i cs t a b i l i t ye v e na f t e r1 0 g e n e r a t i o n so fc u l t i v a t i o n ，w h i c hi n d i c a t e st h a tt h em u t a n tcu t i l i sc c t c cm 2 0 9 2 9 8 o b t a i n e di nt h i ss t u d yh a ss t a b l ec a p a c i t yf o rh i g hc o - p r o d u c t i o no fs a ma n dg s h ，a n d c a nb eu s e da si n d u s t r i a ls t r a i ni nt h en e a rf u t u r e p h5 0 ，s t i r r i n gs p e e d 4 5 0r p m ，a e r a t i o n1w m a tt h e o p t i m i z e dc o n d i t i o n s ， c o - p r o d u c t i o no fs a m a n dg s hr e a c h e d5 9 8 7m g l t h e n ，t h ec o n t r a d i c t i o n so fs a m a n dg s h c o - p r o d u c t i o nc o u n t e r e di nt h e b a t c hf e r m e n t a t i o n sw e r et r i e dt ob ea n a l y z e d k e y w o r d s ：c a n d i d au t i l i s ；s - a d e n o s y l m e t h i o n i n e ；g l u t a t h i o n e ；c o - p r o d u c t i o n w r i t t e n b y ：n as h a o s u p e r v i s e db y ：g o n g - y u a nw e i 目录 第一章文献综述 1 1 概述 1 2 谷胱甘肽的性质和用途 1 2 1 谷胱甘肽的结构与性质 1 2 2 谷胱甘肽的代谢途径 1 2 3 谷胱甘肽的功能与应用 1 3s a m 的基本性质和临床应用 1 3 1s a m 的理化性质 1 3 2s a m 体内代谢途径 1 3 2 1s a m 的合成途径 1 3 2 2 转甲基作用 1 3 2 3 转硫作用 1 3 2 4 转氨丙基作用 1 3 3s a m 的稳定性 1 3 4s a m 的临床应用 1 3 4 1 用于关节病治疗 1 3 4 2 抗抑郁功能 1 3 4 3 用于肝病治疗 1 4s a m 与g s h 的主要生产方法及研究进展 1 4 1 发酵法生产g s h 的研究进展 1 4 2 发酵法生产s a m 的研究进展。 1 4 3 发酵法联产s a m 和g s h 的研究进展。 1 5 本研究的意义和主要内容 第二章材料与方法 2 1 实验材料一 2 1 1 实验药品 2 1 2 菌种及保藏1 2 2 1 3 培养基12 2 2 实验方法1 2 2 2 1 培养条件1 2 2 2 2 胞内s a m 的提取1 3 2 2 3 胞内g s h 的提取1 3 2 3 分析方法1 3 2 3 1 酵母生物量的测定1 3 2 3 2s a m 定量分析1 3 2 3 3g s h 定量分析1 4 2 3 4 残糖浓度测定1 5 2 3 5l _ 蛋氨酸浓度的测定1 5 2 3 6 其它1 6 第三章紫外线吖射线复合诱变筛选s a m 和g s h 联产发酵菌株1 7 3 1 前言1 7 3 2 材料与方法一1 8 3 2 1 紫外线诱变1 8 3 2 2 ) ，射线诱变1 8 3 3 结果与讨论1 9 3 3 1 菌悬液稀释率的确定1 9 3 3 2 紫外线照射时间和丫射线辐照剂量的确定1 9 3 3 3 选择培养基组分及其浓度的确定2 0 3 3 3 1l - m e t 最适浓度的选择。2 0 3 3 3 2 乙硫氨酸最适浓度的选择2 l 3 3 - 3 3n a h s 0 3 最适浓度的选择2 2 3 3 4 紫外线与丫射线复合诱变结果2 2 3 3 5cu t i l i sc c t c cm2 0 9 2 9 8 遗传稳定性试验2 3 3 3 6cu t i l i sc c t c cm 2 0 9 2 9 8 摇瓶发酵联产s a m 和g s h 一2 4 3 4 小结2 4 第四章s 触，g s h 联产发酵条件优化2 6 4 1 前言2 6 4 2 材料与方法2 6 4 2 1 菌种2 6 4 2 2 其它2 6 4 2 3 实验设计方法2 6 4 2 3 1p l a c e t t - b u r m a n 设计2 6 4 2 3 2b o x - b e h n k e n 设计2 8 4 2 3 3 正交实验设计2 9 4 2 4 数据分析方法3 0 4 3r s m 法优化s a m g s h 联产发酵培养基的结果与讨论3 0 4 3 1 单因素实验3 0 4 3 1 1 碳、氮源种类及浓度的影响3 0 4 3 1 2 无机盐离子的影响3 2 4 - 3 1 3l 蛋氨酸浓度的影响一3 3 4 3 2p b 实验筛选影响s a m g s h 联产量的显著因素3 3 4 3 3 b b 设计结果3 3 4 3 4 模型的验证3 7 4 4 正交设计法优化s a m g s h 联产发酵条件的结果与讨论3 7 4 5 小结3 9 第五章分批发酵过程中s a m g s h 联产的发酵条件4 l 5 1 前言4 l 5 2 材料与方法4 1 5 - 2 1 培养基4 1 5 2 2 发酵过程控制4 1 5 3 结果与讨论4 2 5 3 1p h 对s a m g s h 联产发酵的影响4 2 5 - 3 2 氧供应情况对s a m g s h 联产发酵的影响4 4 5 3 3 温度对s a m g s h 联产发酵的影响4 5 5 4 小结4 8 总结与展望4 9 参考文献。51 攻读硕士学位期间取得的学术成果。5 7 致谢5 8 谷胱甘肽是一种广泛存在于自然界的活性三肽化合物，具有还原型( g s h ) 和氧化 型( g s s g ) 两种形态，其中在生物体内起主要作用的是g s h 1 1 。g s h 分子结构如图1 1 ， 其中含有) ，珞氨酰基和活性巯基，可参与多种生物学反应，对于维持胞内适宜的氧化 还原环境具有重要意义【2 j 。由于g s h 具有解毒 3 1 、抗氧化和防衰老【4 1 等重要生理功能， 在临床医药、食品加工以及化妆品等领域具有广阔的应用前景。 骈p 。瓣 0 3 0 t l 0h 毒是a 垂r c d 明 t h 0 z c 答氯酸半腱氰酸甘氟馥 g s h h 0 0 8 s a m 图1 1 谷胱甘肽( g s h ) 和s 腺苷也蛋氨酸( s a m ) 结构式 f i g1 1s t r u c t u r e so fg l u t a t h i o n e ( g s h ) a n ds - a d e n o s y l - l - m e t h i o n i n e ( s a m ) s 娘苷七一甲硫氨酸( s - a d e n o s y l - l - m e t h i o n i n e ，s a m ) 也是生物体内一种具有重要 生理功能的活性物质，广泛分布在动物、植物和微生物体内，最早由c a n t o n i 于1 9 5 1 年发现【5 】。其在生物体内的合成是 s a m 合成酶 e c 2 5 6 】催化甲硫氨酸和a t p 反应生 成【6 】，化学名称为5 m ( 3 s ) - 3 氧基- 3 梭基_ 丙基】甲基- ( s ) 砜】- 5 - 脱氧腺苷，分子式为 c 1 5 h 2 2 n 6 0 5 s ，分子量3 9 9 ，其结构式如上图所示。s 球苷甲硫氨酸是双手性物质，有 2 种异构体，( r ，s ) - - s a m 和( s ，s ) - s a m 。其中只有( s ，s ) - - s a m 才具有生物活性【7 】。由结构 式可知，s a m 分子内活性高能锍基的存在，使其具有很高的生理活性，参与生物体 内4 0 多种生化反应过程，主要起着转甲基、转硫、转氨丙基作用，是半胱氨酸、牛磺 酸、谷胱甘肽、辅酶a 等重要物质的前体【8 】。近年的临床研究表明，s a m 在抑郁症、 关节炎、纤维头痛等许多疾病的治疗上具有显著的疗效，还可明显消除肝损伤，有利 甜 阻。钳 h 舡刚“ k 曙 文献综述产朊假丝酵母联产发酵生产s 一腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽研究 于肝病患者的康复【9 】。s a m 自1 9 9 9 年获得美国f d a 认证以来，已在保健品市场占有非 常巨大的销售份额，近年来，国外对s a m 的利用转向了肝病及抑郁症的治疗，获得 非常理想的效果u o q 2 1 。 随着人们对生活水平和质量要求的日益提高，对s a m 和g s h 的需求量将迅猛增 加，对二者的研究也将具有越来越重要的意义和价值。 1 2 谷胱甘肽的性质和用途 1 2 1 谷胱甘肽的结构与性质 谷胱甘肽，即) ，也珞氨酰七畔胱氨酰- 甘氨酸( y - l - g l u t a m y l - - l - c y s t e i n y l - g l y c i n e ， g s h ) ，于1 8 8 8 年首次由p a i l h o d e 在酵母抽提物中发现，其结构如图1 1 左。g s h 为白 色晶体，熔点为1 9 2 1 9 5 c ，分子量r 3 0 7 3 ，比旋光度【q 】芦= 1 9 。( c = 4 6 5 3 ，h 2 0 ) 。g s h 有一个来源于半胱氨酸的活泼巯基，因此很容易被氧化成其二硫化物形式g s s g 而丧 失生理活性。该反应式如下【1 3 1 。 一u 、 g s h + g s i - i 、, + 2 h = 2g s s g 1 2 2 谷胱甘肽的代谢途径 谷胱甘肽在生物体内的合成由3 种前体氨基酸经过两步缩合形成，如图1 2 。首先 为) ，珞氨酰胺的y - c o o h 与半胱氨酸的a - n h 2 缩合形成) ，搭氨酰半胱氨酸，再与甘氨酸 缩合形成还原型谷胱甘肽g s h 。) ，硌氨酰半胱氨酸的合成是g s h 合成的限速步骤，半 胱氨酸是其限制性前体。胯氨酰半胱氨酸合成酶及g s h 合成酶是参与g s h 合成的关 键酶。 g s h 可通过自身氧化为g s s g 而发挥还原力作用，是细胞中多种氧化还原酶的辅 因子。g s s g 可在谷胱甘肽还原酶作用下由n a d p h 提供还原力重新还原为活性g s h 。 2 谷胱甘肽是细胞内存在最丰富的小分子硫醇类化合物。还原型谷胱甘肽是细胞内 非蛋白类巯基的主要组成部分，在生物体内具有多种重要的生理功能，特别是对于维 持生物体内适宜的氧化还原环境起着至关重要的作用。例如：作为保护酶和其它蛋白 质的硫氢基的抗氧化剂 1 4 - 1 5 】；其分子结构中的) ，珞氨酰基具有转运氨基酸的作用；通 过谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 和谷胱甘肽硫转移酶( g s t ) 的作用来保护细胞 抵御高温胁迫或紫外线照射下形成的活性氧自由基的氧化损伤【1 6 - 1 9 。因此，g s h 是细 胞抗损伤及代谢调节的关键物质之一。 由于谷胱甘肽在细胞中的重要作用，其在临床、食品、运动保健等多个领域得到 越来越广泛的关注和应用。临床上l 2 0 i g s h 可以迅速提高机体免疫力，在辐射、肿瘤、 癌症、氧中毒、衰老和内分泌失调的治疗中效果明显且无副作用；在食品加工领域【2 1 1 ， g s h 具有增强食品营养价值和强化食品风味等功能；在体育运动领域【2 2 】，g s h o 邑够提 高体内血红蛋白含量并保护红细胞免遭氧化性破坏。此外，g s h 还具有改善性功能和 消除疲劳等作用，近年来还发现g s h 具有抑制艾滋病病毒的功效。 3 文献综述产朊假丝酵母联产发酵生产s 一腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽研冗 1 3s a m 的基本性质和临床应用 1 3 1s a m 的理化性质 s a m 在生物体内的合成过程如图1 3 所示。即来自于a t p 的腺苷部分攻击l - m e t 的 硫原子，生成高能量、活泼的有机锍化合物，因此，s a m 是甲硫氨酸的衍生物，作 为蛋氨酸的活性形式发挥各种重要的生理功能。 图1 3s 辣苷七蛋氨酸的生物合成 f i g1 3b i o s y n t h e s i so fs - a d e n o s y l - - l - m e t h i o n i n e n i - 1 2 在s a m 的分子中有四个可解离基团，即：嘌呤环上的氨基( p k a = 3 4 ) 、甲硫氨 酸残基上的羧基( p k a - - 1 8 ) 、氨基( p k a = 7 8 ) 以及活性锍基( p k a - - 1 2 5 ) 。其中锍 基具有很强的极性，带有永久的正电荷 2 3 1 。s a m 等电点为7 2 4 ，其重要生理功能很大 程度上在于其分子结构中的活性甲基和高能金属锍原子。s a m 盐为白色结晶或结晶 性粉末，易溶于水，微溶于甲醇、乙醇，不溶于乙醚、丁酮等，其固体在常温下极易 吸潮，需严格密封保存。 1 3 2s a m 体内代谢途径 s a m 是体内重要的代谢中间体，具有转甲基、转硫、转氨丙基等作用，是半胱 氨酸、牛磺酸、谷胱甘肽、辅酶a 等重要物质的前体。s a m 作为体内一种重要的甲基 供体可向多种分子提供甲基，例如儿茶酚胺和其它生物胺、脂肪酸、神经递质、核酸、 多糖、蛋白及膜磷脂等。s a m 去甲基后生成s 塬苷同型半胱氨酸，经过转硫途径生成 同型半胱氨酸，随后分解代谢生成体内关键的抗氧化及解毒物质一半胱氨酸，进而作 为前体合成另一种关键的抗氧化解毒物质谷胱甘肽。此外，s a m 还可以通过脱羧提 供氨丙基参与多胺的生物合成过程。具体代谢途径如图1 4 。 4 产朊假 图1 4s a m 的合成和代谢途径 f i g1 4s y n t h e s i sa n dm e t a b o l i cp a t h w a y sf o rs a m 1 3 2 1s a m 的合成途径 s a m 在生物体内由l - 蛋氨酸和a t p 在s a m 合成酶的作用下合成，其中l - 蛋氨酸是 其限制性底物。该限制性底物l 一甲硫氨酸一方面可通过细胞外摄取直接获得，另一方 面可通过微生物细胞内的蛋氨酸再生途径获取，而这一再生途径与细胞内叶酸碳循 环途径紧密相关( 如图1 4 ) 。细胞代谢过程中间体同型半胱氨酸可接受叶酸循环提供 的甲基而实现l - 蛋氨酸的再生，为s a m 合成补足前体。此外，s a m 转氨丙基后生成 的中间体甲基硫代腺苷也可再生为蛋氨酸，这是维持甲硫氨酸保持一定量的又一快速 抢救通路。 s a m 在体内的降解途径主要有转甲基、转硫和转氨丙基过程。 1 3 2 2 转甲基作用 在多数细胞甲基化反应中，s a m 是唯一的甲基供体。许多细胞含有不同甲基转 移酶，这些酶转移s a m 的甲基到蛋白质、磷脂、核酸和生物胺等小分子或大分子的 氧、氮、硫原子上。目前己发现至少有3 5 种不同的甲基转移酶反应需要s a m 作为甲 基供体 2 4 1 。尽管每种甲基转移酶专一催化一个反应，但此类甲基化反应的产物都是腺 苷高半胱氨酸( s a l l ) 2 5 1 。i 扫s a m 提供甲基的蛋白质羧基的甲基化是蛋白质功能修复的 重要因素1 2 6 。s a m 提供甲基的磷脂酰乙醇胺甲基化转化为卵磷脂，与细胞膜的流 动性与完整性密切相判明。另外，s a m 参与的d n a 的甲基化程度与染色体稳定性 5 文献综述 产朊假丝酵母联产发酵生产s 一腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽研究 相关。最后，生物体内负责神经传递的一元胺，在合成和失活过程中也需要s a m 提 供甲基【2 8 - 2 9 。因此s a m 参与的甲基化过程与细胞中蛋白质、脂类、核酸和神经递质 的代谢活动及功能密切相关，是生物体内核心小分子活性物质。 1 3 2 3 转硫作用 3 0 - 3 1 】 s a m 是s a h 和g s h 等含硫化合物的活性前体( 如图1 4 ) 。通过甲基作用，s a m 生成s a h ，再经过转硫过程，转变为半胱氨酸，进一步合成g s h 。g s h 是体内硫储存 库和细胞内主要的抗氧化物。在慢性肝病患者中，g s h 水平会下降，其部分原因是 s a m 合成减少。 1 3 2 4 转氨丙基作用 转移s a m 的氨丙基合成多胺是s a m 的另一个重要代谢作用。在这个途径中，s a m 首先被转化生成脱羧s a m ，并将氨丙基转移到腐胺，然后转移到亚精胺和精胺，以 形成多胺。同时，反应生成甲基硫代腺苷，它随之转化成m e t 。这个途径是维持m e t 保持一定量的快速抢救通路。而且也能确保快速移去甲基硫代腺苷，它是腺苷高半胱 氨酸水解酶的有效抑制剂【3 2 1 。在正常情况下，转氨丙基所消耗的s a m 不会超过总量 的5 ，但在肝脏再生时，随着多胺合成的增加，这个百分率会明显增长。亚精胺和 精胺能控制细胞的生长，并且具有止痛、抗炎作用。 1 3 3s a m 的稳定性 由于s a m 分子中高能锍的存在，使其表现出极端的不稳定性3 3 埘】，在亲核试剂 的进攻下，与s 原子相连的c 原子被活化导致s - c 键极易断裂而发生裂解反应，此外， 甲硫氨酸部分的氨基、羧基以及嘌呤环的氨基都存在一定的不稳定性。无论是溶液或 是干燥状态，室温或高于室温，中性或碱性p h 条件下，均会发生降解。s a m 的降解 途径主要包括：水解反应、裂解反应和消旋反应，如图1 5 。 在s a m 分子中包含多个可解离基团，导致其稳定性受p h 影响很大。水解反应在 p h6 时受到强烈抑制，p h 达到4 5 以下则几乎完全消除。而裂解反应在p h 降至1 5 以下 才完全解除。另外，消旋反应受p h 的制约非常微弱，其反应速率与温度的关系非常 密切。综上，在p h g l y c e r o l g l u c o s e e t h a n o l s t a r c h t r i s o d i u m c i t r a t e s o d i u ma c e t a t e ，其中后三种碳源基本无法被产朊假丝酵母利用，从而造成其 培养条件下细胞密度和目标产物联产量都极低。相比甘油和葡萄糖，蔗糖除了可被该 突变菌株很好利用以外，其原料也相对廉价，因此，选用蔗糖作为最佳碳源。结合图 4 2 ，a ，结果表明，当蔗糖浓度从1 0g l 提高至2 0g l 时，s a m 和g s h 积累量由9 1 5m g l 提高至u 2 7 7 9m g l ，增加了2 0 0 ，说明，当碳源浓度为2 0g l 以下时，细胞处于严重 的饥饿状态，生长和产物合成严重受阻；随后随着糖浓度增加，s a m 和g s h 积累量 有小幅上升，当蔗糖浓度增加至5 0g l 后，联产量对糖的得率显著降低，因此，最终 确定蔗糖浓度为3 0g l 。 如4 1 ，b ，发现c c t c cm2 0 9 2 9 8 可以有效地利用n h 4 + 、n 0 3 。及尿素等氮源，而像 蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物这些成分较复杂的复合氮源利用效率则很差。对氮源浓 度的进一步实验结果表明，当( n h 4 ) 2 s 0 4 浓度为1 0g l 时，s a m g s h 联产量达到最大 值，说明此时为细胞生长代谢提供了最适的c n t t 。 3 l 4 0 0 3 0 0 2 0 0 1 0 0 05l o1 5加 k h 2 p 0 4 t e a , ) 0 0o 10 20 30 40 5 m g s 0 4 7 1 - 1 2 0 ( g l ) 0 0 50 - l0 1 502 4 6 8 c a g e ( g ，凹l - m e t h i o n i n e ( e j l ) 图4 3 无机盐离子k l 蛋氨酸对s a m 和g s h 联产的影响 f i g4 3e f f e c t so fi n o r g a n i cs a l t sa n dl - - m e t h i o n i n e o nt h ec o - p r o d u c t i o no fs a ma n dg s h ( a ) k i - 1 2 p 0 4 ；( b ) m g s 0 4 7 h 2 0 ；( c ) c a c l 2 ；( d ) l - - m e t h i o n i n e 如图4 3 ，( a ) 所示，k + 对s a m 和g s h 联产量影响的拐点出现在1 0g l ，这可能是 由于k + 等一价阳离子为s a m 合成酶活性所必需，它有利于s a m 合成酶及时地释放已 3 2 栅 | 毫 瑚 哟 一，ism)咨山o+乏v 一1嚣一耷o+窆v 枷 昙 姗 啪 拿昌一(1山o+茅访v 1g一吝o+蚕rs 产朊假丝酵母联产发酵生产s 一腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽研究 第四章 合成的s a m ，但过高的k + 浓度又会打破酵母细胞的n a k 泵平衡，不利于细胞代谢。 图( b ) 和( c ) 充分表明，适当浓度的二价阳离子，如m 9 2 + 和c a 2 + 可促进s a m 、g s h 的联 产，在大肠杆菌s a m 合成酶的研究中发现，m 9 2 + 和c a 2 + 等二价金属阳离子可与s a m 合成酶活性中心的a s p 残基结合从而发挥活性作用，可见其与s a m 的合成密切关联。 最后，三种无机盐离子的最适浓度分别为：k h 2 p 0 41 0g l ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 5g l ， c a c l 20 0 5g l 。 4 3 1 3l 蛋氨酸浓度的影响 s a m 的生产一般是在富含l 一甲硫氨酸的培养基质中进行。酵母细胞内l 一甲硫氨酸 的转录受s a m 及胞# j l 一甲硫氨酸浓度的调控。当细胞生长在外源l 一甲硫氨酸丰富的基 质中、在s a m 大量合成的条件下，胞内自身的l 一甲硫氨酸合成将受到抑制。细胞的生 长将与s a m 合成竞争利用l 一甲硫氨酸，同时酵母的生长与代谢也会消耗一定量的 s a m ，这是导致l 一甲硫氨酸转化率低的根本原因。作为s a m 合成的前体，外加的l 一 甲硫氨酸浓度对s a m 产量有显著影响，如图4 3 ，( d ) 所示。可以看出，在前体l - 甲硫 氨酸浓度达n 5g l 时，其s a m 、g s h 联产量为对照的2 0 0 以上，继续增大l - 蛋氨酸 的添加量则会导致联产量较大幅度下降，因此，前体l 甲硫氨酸最适浓度为5g l 左右。 4 3 2p b 实验筛选影响s a m g s h 联产量的显著因素 可能影响s a m g s h 联产的培养基组分包括蔗糖、( n h 4 ) 2 s 0 4 、k h 2 p 0 4 、 m g s 0 4 7 h 2 0 、c a c l 2 以及前体l _ 蛋氨酸，对这6 个因素进行全面考察，选用n = 1 2 的p b 设计，并添j j h 3 个空列用于误差估计，每个因素取高( + 1 ) 、低( 一1 ) 2 个水平，高低 水平的设置依据单因素实验结果进行。运用s a s 8 1 软件分析计算各因素的效应值，并 对各因素进行t 检验，选择置信度较高的因素作为显著因素进一步实验。 p b 设计及实验所测得的s a m 和g s h 产量见表4 1 ，各因素所代表的参数、水平及 因素效应见表4 2 。 一般来说，p r t 值小于0 0 5 表示模型或参数有显著影响。由表4 2 可以看出，在 9 5 置信水平以上( p r t 值小于o 0 5 ) ，蔗糖、k h 2 p 0 4 和l 一蛋氨酸被认为是影响 s a m g s h 联产的显著因素，将通过b b 响应面法作进一步的研究。 4 3 3 b b 设计结果 b b 响应面设计被用来考察三个显著因素( 蔗糖、k h 2 p 0 4 和l 蛋氨酸) 的交互作 3 3 第四章 产朊假丝酵母联产发酵生产s 腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽研究 用和最佳水平。实验结果汇总于表4 4 。 实验数据使用m i n i t a b 软件进行二次回归分析，得到以下方程 y = 5 8 0 + 4 3 0 x l + 2 4 4 x 2 + 2 1 o x 3 4 1 3 * x 1 2 + 9 0 5 x l * x 2 3 3 6 x 2 2 + 1 2 i * x l * x 3 + 9 0 7 * x 2 * x 3 5 0 1 x 3 2 式中y 代表响应值s a m g s h 联产量，x j 、憝、曷分别代表蔗糖、l m 2 p 0 4 和l - 蛋 氨酸。 通过进行回归分析来验证模型及各参数的显著度见表4 5 。 表4 5 回归模型参数估计 t a b l e 4 5c o e f f i c i e n te s t i m a t e sb yt h e r e g r e s s i o nm o d e l t e r mc o e f f i c i e n ts ecoeft p r 1 4 c o n s t a n t5 7 9 94 2 6 71 3 5 9 t 值小于o 0 5 ) 。表 产朊假丝酵母联产发酵生产s 一腺苷蛋氦酸和谷胱甘肽研究 第四章 所以，可以使用该模型来分析响应值的变化。 表4 6 方差分析结果表 t a b l e4 6a n a l y s i so fv a r i a n c e v a r i a n c es o u r c e sd fs sm sf p r e g r e s s i o n 92 6 8 6 2 82 9 8 4 85 4 6 4 0 0 0 0 1 r e s i d u a le r r o r52 7 3 15 4 6 t o t a l1 42 7 1 3 5 9 酽9 7 2 c o n f i d e n c el e v e lo ft h er e g r e s s i o nm o d e l “d p d e g r e eo ff r e e d o m ； “s s s u mo f s q u a r e ； “m s ”m e a l ls q u a r e 4 5 0 5 0 0 5 5 06 0 0 a c t u a l 图4 4c u t i l i sc c t c cm2 0 9 2 9 8 菌株s a m 和g s h 联产量( m g l ) 预测值一实验值对照表 f i g u r e4 4p l o to fp r e d i c t e dv sa c t u a ls a m a n dg