（微生物学专业论文）l乳酸发酵菌的选育及发酵条件的研究.pdf

! _ 目目_ e ! s l - | ! e ! g e ! g g e 自目l _ ! $ 自目_ 自! ! ! 目g ! ! 自g 目目! i ! ! 自_ _：i _ l 一乳酸发酵菌的选育及 发酵条件的研究 硕士研究生：梁宝东 指导老师：张惟广副教授 ( 中文摘要) 本文根据l 一乳酸菌的特性，从自然界筛选高温高产l 一乳酸的同型乳酸发酵乳酸菌，对发 酵特性、培养基、发酵条件进行研究，菌株进行了鉴定最后通过紫外线对菌株进行诱变， 进一步提高菌株的产酸性能。 1 根据l 一乳酸细菌的特性和底物反馈抻制原理，设计了菌种富集培养基、选择性培养基 和筛选路线。在夏季广泛采集样品，筛选到2 8 株利用葡萄糖为碳源的产l 一乳酸的乳酸菌，5 2 发酵4 8 h ，l - 乳酸产量在6 0 9 l 以上。经过复筛及发酵试验，确定了1 株以葡萄糖为碳源的 乳酸菌为研究对象记为l b p ，l 一乳酸的产量达到了9 0 8 5 9 儿发酵液。测定了此菌株的生长 曲线和发酵液中p h 的下降趋势。筛选结果证明：在富集培养基和分离培养基中添加l 一乳酸钙 浓度在6 0 9 皿，分离菌种性能优良。 2 对菌株i b - p 的发酵培养基进行了优化：通过单因素试验，研究了不同碳源、氮源种类、 生长因子、无杌盐对i - l 酸产量的影响，并在单因素试验的基础上，利用响应面分析法优化 了培养基中影响l 乳酸产量的主要因素，得到了大米糖化液( x 1 ) 、蛋白胨( x 2 ) 、酵母粉( 憨) 对l 广乳酸产量( y ) 的回归方程： y = 9 0 3 9 + 1 1 7 x 1 + 5 3 6 x 2 + 3 1 0 x 3 - 1 4 8 x 1 2 - 1 9 2 x 2 2 - 1 5 5 x 3 0 6 6 x t + x 3 - 1 3 9 x 2 + x 3 根据响应值典型分析求得了大米糖化液( x 1 ) 、蛋白胨( x 2 ) 、酵母粉( x 3 ) 的最佳组合 分别为：1 2 5 2 5 9 l 、8 7 9 9 l 和3 5 8 9 l ，其对应的响应值( y ) 为9 4 7 8 3 9 l 。最终确定l b - p 的最佳发酵培养基：大米糖化液为1 2 5 2 5 9 l 蛋白胨8 7 9 9 l ，酵母粉3 5 8 9 l ，k 2 h p 0 43 v l ， 牛肉膏4 9 l ，m g s o t 0 1 9 l 。l - 乳酸的最高产量为9 4 7 8 9 l 发酵液，对糖的利用率达到9 5 。 3 对菌株l b - p 的培养条件进行了优化，确定了最佳接种量为8 ，最佳发酵温度为5 2 c ， 最佳种龄为1 6 h ，发酵培养基的最佳装液量为1 5 0 m l 2 5 0 m l 摇瓶。l 一乳酸的中和剂均采用灭菌 的碳酸钙。 4 对该菌株的菌落、菌体形态特征的观察发酵特性和生理生化特征，确定该菌株为嗜 西南火学坝l 学位论文摘要 热乳中f 菌( l a c t o b a i l l u st y e r m o p h i u sl b d j 。 5 利h 紫外线对野生菌株l a c t o b a i l l u st y e r m o p h i u sl b - p 进行诱变，利用碳酸钙平板和梯 度l 一乳酸钙培养基平板进行筛选，最终得到一株正向突变株l a c t o b a i l l u st y e r m o p h i u sl b p l ， 最高l 一乳酸的产量达到1 0 0 4 2 9 l ，比出发菌株提高了5 9 5 。 关键词：l 一乳酸乳酸菌乳酸发酵筛选 i i 西南大学碗j 二学位论文 a b s i ，- , a c t a b s t r a c t t h ep a p e rf o c u s e do us e l e c t i o n sa n db r e e d i n go ft h el a c t i ca c i db a c t e r i ap r o d u c i n gl - l a c t i ca c i d w i t hh o m o l a c t i cf e r m e n t a t i o nu n d e rh i g ht e m p e r a t u r ef r o mt h e n a t u r e f i r s t l yt h ef e r m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s ，f e r m e n t a t i o nc u l t u r em e d i u ma n dc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n so ft h i sl a c t i ca c i d b a c t e r i a w a ss t u d i e d t h e nt h i sl a c t i ca c i db a c t e r i aw a si d e n t i f i e d f i n a l l y , i no r d e rt oe n h a n c et h ea b i l i t yo f b a c t e r i ap r o d u c i n gl - l a c t i ca c i d ，t h eb a c t e r i aw a sm u t a t e db yu v t h ed e t a i l e dc o n t e n t sw e r ea s i o l l o w e d ： 1 b a s e do nt h eb a c t e r i ac h a r a c t e r i s t i cw h i c hi sh i 曲p r o d u c i n gl - l a c t i ca c i da n ds u b s t r a t e f e e d b a c kp r i n c i p l e ，t h ee n r i c h m e n tc u l t u r em e d i u m ，t h es e l e c t i v i t yc u l t u r em e d i u ma n dt h er o u t eo f s e l e c t i o nw e r ed e s i g n e d ，i nt h es u u l l t i o ra b m a d l yc o l l e c t e dt h es a m p l e s ，2 8s t r a i n su t i l i z i n gg l u c o s e p r o d u c i n gl - l a c t i ca c i dw e r eo b t a i n e d ，t h ey i e l do fl - l a c t i ca c i de x c e e d6 0 班u n d e r t h et e m p e r a t u r e 5 2 ci n4 8h o u r s b yt h es e c o n ds c r e e n i n ga n dt h ee x p e r i m e n to ff e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s ，1 s t r a i n su t i l i z i n gg l u c o s e ，w h i c hh a dah i g h e ry i e l do fl - l a c t i ca c i d9 0 8 5 “w e r ed e t e r m i n e d ，n a m e d l b - p t h eg r o w t ho l i v eo fs t r a i na n dt h ed o w m r e n do fp hw e r ed e t e r m i n e d t h er e s u l t so fs e l e c t i o n p r o v e d ：l - l a c t c ia c i dc a l c i u ma d d e d6 0 9 几t oe n r i c hc u l t u r em e d i u ma n ds e p a r a t ec u l t u r em e d i u m w a st h eb e s t ，t h ec a p a b i l i t yo fs t r a i nw a sb e t t e r 2 t h eo p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nm e d i aa b o u tt h es t r a i nl b - pw a sr e s e a r c h e d d i f f e r e n ts o r t s o f c a r b o na n dn i t r o g e nr e s o u r c e s ，g r o w t hf a c t o r s ，m e t a li o n so fi n o r g a n i cs a l tw e r es t u d i e db a s e do n t h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t t h r e ei n g r e d i e n t s ( r i c hs a c c h a r i f i n gl i q u i d ，p e p t o n e ，y e a s tp o w e r ) r a t i o o fm e d i u mw a so p t i m i z e dt h r o u g hr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s ( c e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g n ) t h e f u n c t i o n a lr e l a t i o n s h i pb e t w e e nm a i nf a c t o r sa n dr e s p o n s ev a l u e ( l - l a c t i ca c i dy i e l d ) w a se s t a b l i s h e d ， a n dt h er e g r e s s i o ne q u a t i o nw a so b t a i n e d t h er e g r e s s i o ne q u a t i o nw a s ： y = 9 0 3 9 + 1 1 7 x 1 + 5 3 6 x 2 + 3 1 0 3 1 4 8 x 1 2 - 1 9 2 x 2 2 1 5 5 x 3 2 + 0 6 6 x 1 * x 3 1 3 9 x 2 + x 3 t h r o u g ha n a l y z i n gt h er e g r e s s i o ne q u a t i o n ，t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o n so ft h ef a c t o r sw e r e o b t a i n ：r i c hs a c c h a r i f y i n gl i q u i d1 2 5 2 5 e e l , p e p t o n e8 7 9 9 l ，y e a s tp o w e r3 5 9 9 l a n dt h eo p t i m a l m e d i u mw a sa sf o l l o w e d ：1 2 5 2 5 9 t , p e p t o n e8 7 9 9 l , y e a s tp o w e r3 5 8 9 以k 2 h p 0 43 9 l , b e e f g r e a s e4 9 n _ , m g s 0 4 0 0 5 9 lw a t e r1 0 0 0 m 1 t h ey i e l do fl - l a c t i ca c i dr e a c h e d9 4 7 8 3 9 kt h er a t i o o fg l u c o s ea b o u t9 5 3 t h ec u l t i v a t i o nc o n d i t i o n so ft h es t r a i nl b - pw e r es t u d i e da n dt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r ea s f o l l o w e d ：t h ei n o c u l a t i o ns i z e8 t h ef e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e5 2 c ，t h ea g e1 6 h ，t h eq u a n t i t yo f f l a s k1 5 0 m l 2 5 0 m l ，t h en e u t r a l i z e rc a c 0 3 4 t h es t r a i nw a sj u d g e dt ob el a c t o b a i l l u st y e r m o p h i u sb yt h es t u d yo fl b - pc o l o b i a l ，c e l l m o r p h o l o g y , p h y s i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i ca n df e r m e n t a t i o ns p e c i a l i t ye c t i l l 西南大学硕h 学位论义 a b s t r a c t 6 t r e a t e db yu vi r r a d i a t i o n ，l a c t o b a i l l u st y e r m o p h i u sl b - pw a ss e l e c t e di nt h ed i f f e r e n t p l a t em e d i as u c ha st h em e d i u mw i t hh i g hc o n c e n t r a t i o no fl l a c t i ca c i dc a l c i u na n dc a c 0 3 a f t e r f e r m e n t i o nf o r4 8h o u r s ，l a c t o b a i u u st y e r m o p h i u sl b pp r o d u c e dl - l a c t i ca c i d ，t h eo u t p u ti s 1 0 0 4 2 9 lg l ，w h i c hi s5 9 5 h i g h e rt h a nt h a to ft h ep a r e n ts t r a i n k e y w o r d s ：l - l a c t i ca c i dl a c t i ca c i db a c t e r i al a c t i ca c i df e r m e n t a t i o n s c r e e n i n g i v 独创性声明 学位论文题目： 垦：乳酸发醛菌鲍边宣丞发醛盘鲑鲍盈究 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 ，勿- 4 学位论文作者：史篙公、争签字日期：埘年护月o 5 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名鬈召- 4 -导师签名：瓣警弋， 签字日期：卯年一月d 日签字日期：口“年6 月s 日 学位论文作者毕业后去向： 。 工作单位：电话：( 2 通讯地址： 邮编： 文献综述 乳酸( l a c t i ca c i d ) j 。泛存在于人体、动物、植物平微生物中。 l 乳酸的理化性质 乳酸，学名a 羟基丙酸，又名2 羟基丙酸( 2 - h y d r o x y p r o p a n o i c a c i d ) 分子式为 c h 3 c h ( o h ) c o o h ，相对分子量为9 0 0 8 由于乳酸分子中含有一个不对称碳原子，所以存在 光学异构现象，有d 型和l 型两种，l 乳酸为左旋，但l 广乳酸盐或酯却是右旋，当d ( - ) - 乳酸和 u + ) 乳酸等比例混合时，即成为消旋的d b 乳酸【1 2 o o 乳酸和d - 乳酸分子结构式： c o o h c o o h l i h o c hh c o h l i c h 3 c h 3 l ( + ) 乳酸( 左旋) d ( ) 乳酸( 右旋) 乳酸的两种异构体及外消旋型乳酸的物理性质如下表i 所示： 表1 乳酸异构体的理化性质翻 t a b l e1 p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e s o fi s o m e ro fl a t i c a c i d 塑型堕盛f 兰2竖蕉堂鏖【! 】2 竺堡受堂墼鳖垡垫g 堕塑尘 l - * l 酸5 2 8 5 4+ 3 3 1 3 7 1 0 41 6 8 7 d 乳酸5 2 8 5 43 31 3 7 1 0 1 6 8 7 d l 乳酸1 6 8 - 3 301 3 7 + 1 旷1 1 3 5 乳酸通常为无色透明或浅黄色粘状液体。在溶液中以乳酸和丙交酯( c 6 1 1 1 0 0 s ) 混合形式 存在。纯净的无水乳酸是白色晶状固体，相对密度约为1 2 0 6 ( 2 5 ) ，熔点为1 6 8 c ，沸点 为1 2 2 c 。易溶于水、乙醇、乙醚、丙酮，不溶于氯仿、苯、汽油以及二硫化碳等有机溶剂。 不易结晶析出，乳酸浓度达6 0 以上，已具有很强的吸湿性。在2 5 一l m m h g 的真空条件f 反 复分馏，可得纯品乳酸结晶。 乳酸可以参与多种反应，如氧化反应、还原反应、酯化反应、缩合反应等p l 。由于l 乳酸 分子内含有羟基和羧基，所以分子问有酯化的能力，乳酸浓度越浓这种趋势越强，充分脱水 能聚合成聚乳酸，聚合l 一乳酸水解后总酸为1 2 5 。因此，在表示乳酸浓度时，往往用游离 酸和总酸( 包括水解后能滴定的聚台形式的总酸度) 来表示1 4 i 。l - 乳酸可分为1 ：业级、食品级 和药典级。工业级乳酸是乳酸含量为5 0 9 0 的溶液，具有吸湿性，食晶级乳酸的乳酸含量 西南大学硕上学位论文 文献综述 在8 0 以上，药典级乳酸的乳酸含量为8 5 0 - 9 0 0 。 国际上乳酸等级大致分为四种：技术级、食用级、塑料级及美国药典级【5 1 a 其规格如表2 ： 表2 乳酸的级别及规格 一 l ! ! ! ! ：望凼! 鲢! 堡! ! 型垡! ! ! 盥墼篷 2 乳酸的j 血用 乳酸是世界上公认的三大有机酸之一，楚重要的生物他工产品，它在醮逢、医药、食黯、 卷耀、安革、帮染、纯工等镁域有羞广泛懿疲塌 6 ，碉。 2 1 可生物降解材料聚乳酸 联+ 卜乳酸由于是生物可降解塑料一聚攀l 酸的原辩面备受关注。以b 巍酸为单体经化学食 戒戆生物工程耪辩聚。巍酸怒一类商势子枣| 辩，无毒、冤蜜j 激牲，可完全生物降解蔽牧。强度 商，可塑性好。它易被自然界中的各种微生物或动植物体内的酶分解代谢，最终形成= 裁化 碳和水，不污染环境，而且分解过程中的中间体能促进植物的生长，对农她有利。因而被认 瓷是最有蓑途豹霹生臻降解藏分子耪载，聚警0 酸夺望在不久鹣将寒筏警蒙己爝、聚毳爨、聚 苯乙烯等各种不可降解塑料，以消豫“白色污染”所造成的环境危机i 9 t ”1 。 目前，许多国家都在积极开发利用农副产品为原料发酵生产乳酸来生产各种塑料制晶。 疆本钟统公司以玉米为原料发黪生产乳酸，利用聚乳酸毒成生物降解性发泡材辩。该孝孝辩的 强度、匿缩巍力、缓j 孛经、辩药性等与聚苯乙烯塑辩穗阐，经焚烧螽不浮染环境，还可终8 辩。 夔国一家研究所研制成功把制乳酪后的废拜土豆转化为葡萄糖浆，再经细菌发酵成含乳酸发 酵液，经电渗析分离、加热使水分蒸发，得到可制薄膜的聚乳酸，可作保鲜袋及代替聚乙烯和 耱泰鳝翡雹装毒萼吃润薅，聚霉酸穗瓣其蠢蕤好懿魏理纯擎毪憩，毒久髂筑缳寿整驽麴生携狸 容性，在人体内能为人体缓慢代谢，不引怒变态反应，有相当的机械强魔和耐久性，可缀受各 2 髑薅大学硪士掌位涂义文献练迓 i i i i l l1, i 篡i 舅i 1 种消毒处理及良好的加工性能，光津副佟用锦。因此正在歼发艨用于生物医学领域的产龋， 镪乎零缝合线、黉摹l 淫定、维织修簸褥瓣、医瑙， 套、个a 蛩生弼赫及魏锯控翻释蔽体系餐罄l 。 2 。2 食品王她 由于乳酸辩太体无毒副柞磁，盛易吸收，可邈接参与体肉代谢，能健避消化，抑制肠邋 内鸯密缩蕊，羧瞧鬃帮盈稳定，鸯驹予绦护食赫的岛竦，强忿l 羧及箕掰坐翻游逐激澈鼗箕 它煮帆酸，牛# 为酸睬裁、慕藏剂、戡 艺刹、保鳟荆等广。泛瘦用予食品工业。 乳酸酸性瀑和爽快，能使食赫具霄徽酸性，嶷有髓好的食朋安全性t 在罐头、酸菜、饮 誊萼雯产孛翱入b 乳羧霹黢替霞对入体链壤霄霉露作用黪苯串酸镳；程峰灌酸避过程中，拥入 乳酸能调节p h 值，健避糖化及酵母菌发育。抑制杂菌感染，防止酒溜浊t 鼠能改善灞的风睬， 掇离睥酒赫缀，懿舞酒静羧率，延长缣震瓣。谯蒸酱禁l 乏偻糟磷装谎繁群镶，两全辩菠搦巍 酸 1 1 1 ；在调味晶如越油、醋、威蔡、色控中用佟防腐保鲜和调昧削，搜酸味盎然；在骚糕、磷 包、囱稍赫、荣冻、弱酪、桨蘸、椿淇辩、麓铡熬等食赭中糟乳酸采灞节p 薹垂壤霹戳撵蘩，黧 投像凄期，调昧等 在露龟、糕爨懿生产过疆审，翱入乳酸可以使蕊龟、糕镑松较可姻，蕊蠡 还能保鲜，防止霉变：乳酸在食晶工业巾为世界备函聱避使用的酸嗪荆，譬魏世界土的i l 黢 鸯2 措翅佟羧猿粼，主要粥予襞羧饮料、糕点、瀵滚鬏辩、栗鼗、罐头、糖果、溪裳串，缝玻 蛰食品风味，掷巷4 微生物、护龟、改散粘度、使抗氧化剂增效、虢腐藕起螫食的作爝。乳酸 常和甜味剂一起筏溺，向配铡缘念聱l 酸豫裁的秀囱发震。5 0 # t 馥港液1 8 0 m l 楣鸯予l o o g 柠 檬酸的酸度，又誉掩盏承果和蔬菜豹天然飙睬秘芳香，既宥酸优又是媵腐俸爝，所以乳酸鬻 用于僚持腌铜蔬蘩耱栗类的天然斑昧及芳香；程肉类豫鲜中，巍酸簸搓菇露懿类鸯鬟工黯翌敷 檬壤；在禽震番辩孛，裁羧多鞠佟黄油、巍懿、串奶等巍翻鹣露赣麴缀势辟“。“。 另外，l - - l 酸和d 乳酸在机体内的代谢途径不同，人体只含有l 乳酸脱氢酶过量食用 d 乳酸或d l 乳酸会导致人体代谢功能的紊乱，危害人体健康。特别是婴幼儿，由于部分脏器 发育不全，不能代谢d 乳酸，d 乳酸在体内的积累可能引起急性尿酸值升高。从健康角度考 虑，在欧共体( e o ) 的食品添加剂允许使用名单中，乳婴的强化牛奶，婴幼儿断奶食品中只 允许使用l - g l 酸和b 乳酸盐u “。 2 3 医药行业 在医药工业中。乳酸及乳酸盐可直接配制成药类或作为消毒剂，内服常用于肠内消毒。 乳酸除了可以直接用作消毒剂外还可以制成乳酸钠溶液，治疗酸中毒及高钾血症。乳酸具 有亲水性，能溶解蛋白质、角质和许多难溶于水的药物，且对病变组织腐蚀作用相当敏感， 能增加药物吸收量，防止副作用，可用于治疗喉头结核、白喉、狼疮等疾病。乳酸可制取红 霉素糖农，在收敛性杀菌方面用于含漱剂、涂布剂、注入剂、洗净剂等。u + ) 乳酸钙、u + ) 一 乳酸巫铁、u + ) 乳酸锌都是补充金属元素的良好药品。由聚乳酸制成的手术缝合线、生物植 片等在临床上都被广泛应用b6 i 。 3 西南大学硕士学位论文 文献综述 2 4 化妆品行业 乳酸是一种重要的羟基酸，为皮肤固有天然性保湿因子的一部分。乳酸及乳酸钠被广泛 用于许多护肤品的滋润剂、保湿剂，用于各种洗浴用品中，如沐浴露、肥皂和润肤蜜中。在 配制清洁霜、嫩肤霜、浴液时，乳酸用于p h 值调节，对改善皮肤组织结构，消除皱纹色斑、 治疗皮肤干燥、痤疮等有显著疗效。乳酸及还具有抗微生物的作用，被应用于抗粉刺产品中。 乳酸盐可作为新一代皮肤增白剂，与其它皮肤增白剂结合使用会产生协同效果。因此，乳酸 在化妆品配方中已备受青睐 1 5 , 1 6 1 。 2 。5 其它应用 程卷烟业中，用瑰酸能去除炳蕈中的杂质，清除苦辣睬提商烟草档次；在镱革业中，用 4 0 禽餐的乳酸能除去革鞣皮中的石灰，俗称脱灰。用乳酸脱获聪，皮革质量比用其它酸脱 灰好，因此，高级皮革多用乳酸处避 在毛纺工业中，乳酸可用予染料的预铬媒染，以降低 羊毛的铬盐含量鞫麓斑纾维载纯i 焱缝绸和a 逢熊瓣茬处理孛，斓巍酸捧搬调警麓，可用予 增艳和增加纱的色泽。乳酸铵可作为反刍动物的饲料添加剂乳酸铜可用于电镀业【州。 3 乳酸的生产方法 巍酸的生产方法主要有住学合成法、酶法和发簿法三静。 化学合成法生产的产品是外消旒乳酸，即d b 孥l 酸，其原料烹要来自于石油裂解。由于合 成法所用原料是乙醚和剧毒物氢氟躐，尽管美国食晶和药物管理局( f a d ) 已将化学合成法 生产熬巍羧列为安全产簇，毽发达潮家还是不戆巍豁捷琢合成法裁键戆襞酸l “。强瓣，由予用 于化学合成生产乳酸的原料主要来自于石油的裂解，所以在资源酗益紧张的今天，使合成法 生产警l 酸受到限制；酶法虽然可以樽到i 广乳酸，但工艺比较复杂，应用到工业上还有待于研 究；发酵法生产乳酸霹以通过蓥秘鞠培券条静豹选择获得王，乳黢，嚣且其原辩来滚广泛、生 产成本骶、产晶必学鲢廑商，霞诧成为目蘸翻k 酸生产的重要方法l l ，l 。 3 1 化学合成法 纯学合残法包攒乳耩法和嚣烯麟法两静刚，嚣靛大多采翻巍羹i 孽法。蠡1 8 6 3 攀w i l c e n u s 耀乙 醛和鬻亿氢反应制褥裁腈后再水解擞成乳酸后，茨豳m o n s a n t o 公司开发出院工甓鲍工韭纯生 产方法。目前世界上较大的乳酸生产企业如美潮的m o n s a n t o g l 黢厂和日本武藏野化学公司 均采用拢种方法。乳腈法是乙醛与氯氟酸经碱性催化荆作用生成乳腾，这是一个液相反应，在 常舔1 f 避行，辍巍稼遴遘蒸镶霞浚缝傀荠禹滚盐酸斌硫酸承解舞魏酸，还产生楣凌静氮基酸刮 产物，粗乳酸用甲醇酯化得乳酸甲酶，精馏后再水解为乳酸。 乳酸的其它一些可行的化学台成法有糖的碱性催化水解、掰烯己二醇氧化、艺= 醇的硝 酸氧绽等。 4 两南入学硕士学位论文文献环述 3 2 酶法 酶法合成b * l 酸有1 2 - 氯丙酸酶法转化和丙酮酸酶法转化，前者是酶法中蹦于生产l - 乳 酸的主要方法。 3 2 11 ，2 - 氯丙酸酶法转化 日本东京大学的本崎等【2 l j 人研究了用酶法生产乳酸他们分别从恶臭假单抱菌c 池b p u t i d e ) 和假单孢菌细胞中提取纯化l 2 氯代酸脱卤酶( 简称为l 酶) 和d l 2 一卤代酸脱卤酶f 简 称为d l 酶) ，作用于底物d l - 2 一氯丙酸，即可制得l - - * l 酸或d 乳酸。l 酶催化l - 2 卤代酸脱卤， 而d l - 酶既可以催化i , - 2 卤代酸脱卤，又可以催化d - 2 卤代酸脱卤，在催化时可发生构型的转 化。 3 2 2 丙酮酸酶法转化 h u m m e l - 等 z 1 】从d 哥l 酸脱氢酶活力最高的混乱乳口c c d ，哦”) d s m 2 d 1 9 5 菌体中得到d ， 乳酸脱氢酶，以无旋光性的丙酮酸为底物得到d 乳酸。 3 3 发酵法 发酵法生产乳酸的历史悠久，因其没有有害物质摄入、食用安全，而在世界范围内广泛 采用。自1 8 8 1 年a v e r y 首创乳酸生产后，乳酸发酵己成为较重要的工业。1 9 8 2 年全世界乳酸产 量为2 4 2 8 k t ，其中5 0 左右是由发酵法生产的。发酵法用玉米粉、薯干、蔗糖、甜菜糖或糖 蜜为原料。生产过程是以蔗糖、甜菜糖或糖蜜为原料，糖化接入产乳酸菌株p h 5 0 - 5 5 ，温 度5 0 c 左右，发酵3 4 天，用碳酸钙中和乳酸生成乳酸钙，趁热过滤分离存在于混合液中的固 体c a c 0 3 和c a ( o h ) 2 等。通过精制得到乳酸钙。用硫酸酸化乳酸钙生成乳酸和硫酸钙，过滤， 滤液约含1 0 的粗乳酸，浓缩到5 0 ，再用活性碳除去有机杂质，最后用离予交换树脂除去微 量杂质，再浓缩过滤得成品。 从各文献报道来看，产。乳酸的菌种很多，但具有生产价值的目前只有两类：一类是丝状 真菌中的根霉；另一类是细菌中的乳酸菌及部分芽胞杆菌。也有用嗜热脂肪芽孢杆菌和凝结 芽孢杆菌生产l 乳酸的报道。 3 3 1 细菌的乳酸发酵 用于工业生产的乳酸菌主要有以下四个属中的四十余种，乳杆菌( l a c t o b a c t i l l u s j ，链球菌 ( s t r e p t o c o c c u s ) 、明串珠菌属仁“c 删、足球菌属( & 一d i o c o c c u s ) 。也有用嗜热脂肪芽孢 杆菌和凝结芽孢杆菌生产l 乳酸的报道。表3 为一些主要产l - * l 酸的微生物： 细菌的乳酸发酵主要采用同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧乳酸发酵 5 两南人学硼j 二学位论文 文献综述 袭3 一些主骤产。乳酸的微生物口1 l t a b l e3s o m em o s t l ym i c r o b e sp r o d u c i n gl - l a c t i ca c i d 籀种发酵温度 根霉菌属( r h i z o p e s ) 米根霉( r o r y z a c ) 黑搬霉( r n i g r i c a n s ) 甘薯壤霉浓b a t a t ) 小麦曲根霉嘏t r t i c 0 e l 本根霉( r j a p o n i c u s l 乳酸菌属( l a c t o b a i t l u s ) 予聚孚l 括蓥( 纛l a c i ) 嗜热乳秆菌犯t y e r m o p h i u s ) 嗜酸乳杆菌a c i d o p h i l u s ) 消酒乳杆茁( 己s a k e ) 睡液l 抒蕊缀s a t i v a r i u s ) 波糖季l 轩菡( l p e n t o s u s ) 术糖乳杆菌( 五b i f i d u s ) 链球菌属( s t r e p o l o c c u s ) 嗜热链球菌阻t h e r m o p h i l u s ) 粪链球菌( s f a e c a l i s l 乳链球菌佤l a c t i s ) 孢芽杆菌属( b a c i l l u s ) 嗜热脂肪芽孢杆菌( 日s t e a r a t h e m o p h i l u s ) 凝结芽孢杆菌阻c o a q u l a n s l 3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 2 8 3 2 5 0 6 0 3 5 3 8 3 0 o 3 5 4 0 3 和3 2 3 0 4 0 4 0 4 5 4 5 - 5 0 3 0 5 0 6 0 5 肚6 0 3 3 1 1 同型乳酸发酵 同型乳酸发酵( h o m o f e r m e n t e t i o np a t h w a y ) 是微生物以葡萄糖为底物通过e m p 途径降解 为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下还原为乳酸，其反应式为： e m p 途径乳酸脱氢酶 2 c h 3 c h o h c 0 0 h + 2 a t p 2 ( a d p + p i1 n a d h + h 在同型乳酸发酵过程中，微生物利用1 m o l 葡萄糖可以生成2 m o l 乳酸，理论转化率为1 0 0 。 但由于发酵过程中微生物有其他生理活动存在，实际转化率不可能达1 0 0 ，一般认为转化率 在8 0 以上者即视为同型发酵。 专性同型乳酸发酵乳酸杆菌，将葡萄糖经e m p 途径几乎全部发酵为乳酸，这类乳酸苗具 有1 ，6 - 二磷酸果糖醛缩酶，但没有磷酸酮解酶，因此不能发酵葡萄糖酸和戊糖【2 2 】。 葡萄糖经e m p 途径生成丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下几乎全部生成乳酸外。亦 经过丙酮酸脱氢酶系进入t c a 循环提供蕴体生长足够的能量及中间产物，主要的酸性末端副 产物为丙酸、乙酸、丁酸、甲酸和微量的丙酮酸，因此，根据乳酸杆菌代谢机制，高产l 乳 酸的菌株要有较高的乳酸脱氢酶活性；在菌体生长完全后具有弱化的丙酮酸脱氢酶；耐高浓 6 度的葡萄糖和乳酸，不具有以乳酸为唯一碳源生长的能力：不能利用丙酮酸作为碳、氮源生 欧。 3 3 1 2 异型乳酸发酵 异型乳酸发酵( h e t e r o f e r m e n t a t i o np a t h w a y ) 是某些乳酸细菌经h m p 途径，分解葡镯糖为 5 - 磷酸核酮糖，再经差向异构酶作用变成5 磷酸木酮糖，然后经磷酸酮解酶催化裂解反应，生 成3 一磷酸甘油醛和乙酰磷酸。磷酸酮解酶是异型乳酸酵的关键酶。乙酰磷酸进一步还原为乙醇， 同时放出磷酸。而5 磷酸甘油醛经e n t 途径转化为乳酸，同时产生两分子a t p ，扣除发酵时激 活葡萄糖消耗的1 分子a t p ，因此，由葡萄糖进行异型乳酸发酵，其产能水平比同型乳酸发酵 低一半。异型乳酸发酵产物除乳酸外还有乙醇、二氧化碳和a t p ，其发酵途径如下： h m p 差向异构酶磷酸酮解酶 ，乙酰磷酸乙醇 葡萄糖+ 6 一磷酸葡萄糖。t = 5 - 磷酸术酮糖弋 l c 0 2 3 - 磷酸甘油醛 丙酮酸脱氢酶 乳酸+ 一丙酮酸 其总反应式为： c d - 1 1 2 0 6 + a d p + p i _ c h 3 c h o h c o o h + c h 3 c h 2 0 h + c 0 2 + a t p 此过程l m o l 已糖生成l m o l 乙酸、l m o l 二氧化碳和l m o l 乳酸，乳酸对糖的转化率只有5 0 。 3 3 1 3 双歧发酵途径 双歧发酵( b i f l d u mp a t h w a y ) 是双歧杆菌发酵葡萄糖的一条途径 囝黑攀辚靛_ 乏攘 甲6 _ 辩黯果艟一t 磷醚寿警耀 韵黼0 电，矽乙戴磷葺毒哼己酝 3 6 畿秘果勰瑚酸度建2 嗡酝甘油畦每嚣自酸 b 陵 【! 。b 孵曲鐾蝌黛哺剩晦尊5 罅瞎朱附掰磷精州排椰 发酵总方程式为：2 c 6 h 1 2 0 6 2 c h 3 c h o h c o o h + 3 c h 3 c o o h 在此发酵过程中，2 m o l 的葡萄糖生产2 m o l 乳酸和3 m o l 的乙酸，乳酸转化率理论为5 0 3 3 2 根霉的乳酸发酵 根霉属中常用的菌种主要有米根霉( r h i o r y z a e ) 、行走根霉皿h i s t o l o n i f - e 0 、小麦曲根霉 f r h i r i t i c i ) 和美丽根霉( p h i e l e g a n s ) 。 根霉发酵属好氧异型发酵，其途径与细菌异型发酵不同，是通过糖酵解途径，发酵产生 l 乳酸的同时产生乙醇、寓马酸、琥珀酸、苹果酸、乙酸等其它产物吲，其主要的代谢途径 有以f 几种反应： ( 1 ) 正常呼吸：c 6 h 1 2 0 6 + 3 0 2 6 c 0 2 + 6 h 2 0 ； 7 西南，i 学坝士学位论义文献绿述 ( 2 ) 富马酸发酵：c 越1 2 0 6 + 3 0 2 一c 4 1 - l 0 4 + 2 c 0 2 + 4 h 2 0 ； ( 3 ) 酒精发酵：c 6 h 1 2 0 6 2 c 2 h s o h + 2 c 0 2 ； ( 4 ) 乳酸发酵：c 6 h 1 2 0 6 2 c 3 h e 0 3 ； ( 5 ) 同化作用( 生成菌体) ：干菌体量的9 5 来自碳水化合物 此过程乳酸对糖的理论转化率只有7 5 。 3 3 _ 3 细菌乳酸发酵和根霉乳酸发酵的比较 细菌与根霉相比，细菌发酵生产l 乳酸具有明显的优势：细菌发酵的理论转化率为1 0 0 ， 在实际工业生产中可达至u 9 0 以上，而根霉发酵的理论转化率仅为7 5 ：细菌发酵属于厌氧发 酵，发酵过程中不需通风搅拌，可大大降低能耗，而根霉发酵属于好氧发酵发酵过程中需 要良好的通风搅拌，能耗大：细菌发酵无副产物，而根霉发酵有较多副产物，增加了发酵过 穰控制、乳酸提取和精制的难度；细菌乳酸发酵可以和产物提取相耦合，采用原位分离技术 在发酵过程中进行产物提取，减少了工艺流程，而根霉发酵生产乳酸主耍采用的工艺是气升 式反应器和固定化方法1 6 i 。 所以，根霉发酵生产乳酸的工艺目前仍存在着投资成本和生产成本较高以及可操作性较 差的缺点。而l - * l 酸产生细菌为同型乳酸发酵菌，剥糖的理论转化值为1 0 0 ，发酵温度在 4 4 以上，厌氧发酵，可以避免采用空气系统带来的生产成本较高的问题，对于提高乳酸产 率和降低产品的提取成本都是有利的。 4l 乳酸的研究进展及生产现状 4 1 研究现状 只有同型乳酸发酵才有工业上的意义，菌种也只有乳酸菌属( l a c t o b a c i l l u s ) 、链球菌属 ( s t r e p t o c c o c c u s ) 、乳球菌属( l a c t o c o c c u s ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 。随着对细菌发酵l 乳酸优点 的认识，细菌发酵k 乳酸成为国内外研究热点。 k a r i n h o f v c n d a h 等人采用乳酸乳球菌发酵1 0 6h 产l 乳酸l o g g ，l ；用德氏乳杆菌发酵1 0 0 h 产l 乳酸9 5g ，l ：z h a n g 等 2 q 研究了食淀粉乳杆菌n r r l b 4 5 4 2 直接从淀粉发酵生产l 乳 酸的条件淀粉的起始浓度为1 2 0 9 l ，从液化淀粉出发，可在2 0 h 生产出浓度为9 6 2 9 l 的乳 酸。d a n n e r 等【2 5 l 采用嗜热脂肪芽孢杆菌i f a 6 h 和i f a 9 在以葡萄糖为碳源，6 5 分批培养发 酵生产l 乳酸，转化率分别为6 0 ，5 。8 4 o 和9 8 7 。h u j a n e n 等【2 6 l 对千酪乳杆菌n r r l b 4 4 1 产l - ? l ，在1 6 0g l 葡萄糖时，最高乳酸浓度达到1 1 8 6g 儿。徐子钧0 7 荆用紫外 线、亚硝基肌、硫酸二乙酯( d e s ) 等理化因子对从自然界筛选到的乳酸菌进行复合诱变，再 用高浓乳酸钙平扳、纯乳酸平板、琥珀酸平板筛选得到一株高产l 乳酸的正向突变菌株m 7 ， 平均发酵产量为9 0g l ，比原菌株产量提高3 0 ，对糖的转化率为8 8 9 。乐晓沽等网利用紫 外线诱变方法，对出发菌株干酪乳杆菌y b q l 1 进行诱变处理，筛选得到一株正向突变株 y b q h2 - 1 4 ，其l 乳酸产量达到9 3g l ，对糖转化率达到7 7 5 ，比出发菌株产酸提高4 8 5 。 8 西南大学硕上学位论义文献综述 路福平 2 9 1 可使凝结芽孢杆菌7 2h 产乳酸餐达6 7 8e , l ，其中l - 乳酸占9 6 以上。 随着基因工程的发展，通过改变菌株的代谢途径，选育出l 乳酸的高产菌株，也成为一 种重要的育种手段。d o n z 等1 3 0 i 报道了基冈t 程茁e , c o l ir r i 的构建研究结果。从干酪乳杆菌 中提取的l 乳酸脱氢酶被转移到缺少d 乳酸脱氢酶和磷酸转乙酰酶的受体菌株中，这个重新 整合的菌株只产生l 4 l 酸，而不产生d - 孚l 酸。 表4 利用传统发酵：亡艺生产l 乳酸的近期报道 ! i g ：! 墼! ! ! ! ! ! p ! 查! ! p 型2 1 i 坚生! ! ! 堂! ! 型! z ! ! ! 塑! 婴型堡翌! ! ! ! ! i ! ! ! ! g ! 塑垂鹜 一 研究者菌种l 乳酸产量 c a k e r b e r g ( 1 9 9 8 )干酪乳杆菌8 9 9 l z h a n g ( 1 9 9 9 )食淀粉乳杆菌9 6 2g l s u n h o o nk w o n ( 1 9 9 9 ) 鼠李糖乳杆菌 1 2 5 9 l jk a r i nh o f v e n d a h ( 2 0 0 0 ) 德氏乳杆菌9 5g l o h nj f i t z p a t r l c k ( 2 0 0 0 ) 干酪乳杆菌 5 7 7 5 9 l m h u j a n e n ( 2 0 0 1 ) 干酪乳杆菌 1 1 8 6 9 l 徐子