（微生物学专业论文）纤维多糖的酶法制备及纤维素酶解产物分析.pdf

： 。+ j 、靠 、 - j ：j 礓w-呵， 1 0 ， jji 。 i 二 、 ， 1 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东- - i l n 范大学或其他教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：叠鱼同期：型垒聋基 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东：i i n 范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保 存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 只期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：淄鱼互塑 电话： 邮编： 龙厢叶一，垒罄 矿 堰q_0ni摩， j1， l 口 一 、 摘要 玉米皮是玉米淀粉加工的副产品，其来源丰富，纤维含量高，植酸含量低， 易于通过化学、物理以及生物学的方法进行改性处理，是加工和生产纤维多糖的 极好原料。 本实验分别采用微生物酶法、化学法去除玉米皮中的淀粉和蛋白质。结果显 示：微生物酶法具有处理条件温和、选择性强、不破坏天然纤维结构、不损失具 重要生理功能的可溶性纤维素和半纤维素等优点；而化学法去除淀粉、蛋白质比 较彻底，但化学法导致可溶性纤维素、半纤维素都有不同程度的损失，导致产品 的整体生理活性降低。最终得到的最佳除玉米皮中结合淀粉和蛋白质的工艺为： 蛋白酶5 0 下反应3 小时，酶用量为1 0 0 0 u g ，反应后煮沸4 0 m i n 。 在本实验中，我们采用木聚糖酶和纤维素酶对去除淀粉和蛋白质后所得的玉 米皮膳食纤维作进一步处理，以得到可溶性纤维多糖。经产物分析得知，木聚糖 酶用量1 4 i u g ，纤维素酶用量4 o i u g ，反应温度5 0 ，反应时间2 5 h ，底物 浓度3 ，此时总转化率在6 0 以上并且几乎没有单糖生成，全部转化为我们所需 要的多糖及寡糖。通过此工艺，我们得到了分子量在3 1 5 6 0 、1 3 6 9 6 0 d 之间的可溶 性半纤维素和纤维素多糖。 关键词：玉米皮：膳食纤维：预处理：酶解 a b s t r a c t c o r nc o r t e x ，w h i c hi sab y p r o d u c ti nc o r ns t a r c hp r o d u c t i o n ，c o n t a i n sag r e a t d e a lo fd i e t a r yf i b e ra n dal o wc o n t e n to fp h y t i ca c i d w h a t sm o r e ，i ti se a s yt o i m p r o v et h ep r o p e r t i e so fc o r nc o r t e xt h r o u g hc h e m i c a lo rb i o l o g i c a lm e t h o d s s o c o r nc o r t e xi sak i n do fv e r yg o o dr a wm a t e r i a lt op r o c e s st h ed i e t a r yf i b e r ( d f ) i nt h i ss t u d y , m i c r o b i a le n z y m em e t h o da n dc h e m i c a lm e t h o dw e r ea d o p t e dt o r e m o v es t a r c ha n dp r o t e i ne x i s t e di nc o r nc o r t e xs e p a r a t e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h em i c r o b i a le n z y m em e t h o dh a sm a n ya d v a n t a g e si nt h em o d e r a t ec o n d i t i o n s ，t h e m a i n t e n a n c eo fn a t u r a ls t r u c t u r eo ff i b e ra n das t r o n gs p e c i a l t y , a n dt h ea c t i v e c o n t e n t ss u c ha ss o l u b l ef i b e ra n dh e m i c e l l u l o s ec a nb ep r o t e c t e de f f e c t i v e l yt o i m p r o v et h ep h y s i o l o g i c a la c t i v i t yo f t h ed eo nt h ec o n t r a r y , t h ec h e m i c a lm e t h o d s l e a dt oad r a s t i cr e m o v a lo fs t a r c ha n dp r o t e i nb u tap o o rs e l e c t i v i t yo ns u b s t r a t e s ，a n d t h eh e m i c e l l u l o s ei nc o r nc o r t e xc o u l dd i s s o l v ei na l la l k a l is o l u t i o n ，w h i c hm a k e s s o l u b l ef i b e ra n dh e m i - c e l l u l o s eh a v i n gi m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a la c t i v i t i e sl o s t f r o m t h er e s u l t so ft h et e s t ，w ec h o s et h eb e s tt e c h n o l o g yf o rt h et e s ti s ：p r o t e a s er e a c t i o n t e m p e r a t u r eo f5 0 f o r 3h o u r se n z y m ew a s1 0 0 0 u g ，b o i l e d4 0 m i na f t e rt h e r e a c t i o n s ot h ec o r nc o r t e xd fo b t a i n e df r o mt h ea b o v ei sd e c o m p o s e db yx y l a n a s ea n d c e l l u l a s ei no r d e rt og e ts o l u b l ef i b e rp o l y s a c c h a r i d e s t h ep r o d u c ta n a l y s i ss h o w e d t h a tt h ex y l a n a s ed o s a g e1 4 i u g ，c e l l u l a s ed o s a g e4 0 i u g ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e5 0 ，r e a c t i o nt i m e2 5 h ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o no f3 ，t h e nt h et o t a lc o n v c r s i o nr a t eo f 6 0 a n da l m o s tn os i n g l es u g a rp r o d u c t i o n ，a l lw en e e di n t op o l y s a c c h a r i d e sa n d o l i g o s a c c h a r i d e s t h r o u g h t h i sp r o c e s s ，w eg e tt h em o l e c u l a rw e i g h tb e t w e e n31 5 6 0 。 1 3 6 9 6 0 ds o l u b l ep o l y s a c c h a r i d eh e m i c e l l u l o s ea n dc e l l u l o s e k e y w o r d s ：c o r nc o r t e x ；d i e t a r yf i b e r ；p r e t r e a t m e n t ；h y d r o l y s i s n 0 - | i t 一 目录 中文摘要i 英文摘要i i 目录i i i 绪 论l 第一章玉米皮的脱淀粉、蛋白质的处理1 1 一材料与方法11 二结果与讨论1 3 第二章黑曲霉木聚糖酶固体发酵1 9 一材料与方法1 9 二结果与讨论1 9 第三章玉米皮多糖的制备2 l 一材料与方法2 1 二结果与讨论2 3 参考文献4 3 致谢4 6 i i i ，r l 心1 ，0 和 ， 产 东北师范大学硕士学位论文 引言 一、纤维素酶概述 1 、纤维素酶的研究概况 纤维素是植物纤维的主要成分，约占其干重的3 0 5 0 ，是目前分布最广的天 然碳水化合物，也是地球上最丰富、最廉价的可再生资源，随着世界人口的激增、 粮食和能源的短缺将同益严重，可再生纤维素资源的开发利用己引起全世界的普 遍关注。纤维素酶的研究为此丌辟了一条广阔的途径，特别是近l o 年来，随 着现代生物技术迅速发展，基因重组技术及一系列分子生物学技术的应用，使这 一领域的研究更为深入，并将在应用上展示出其潜在的价值。 纤维素酶的研究始于1 9 1 2 年，到现在大致经历了3 个高峰发展时期：五十 年代以前主要是研究防止微生物对天然纤维的破坏作用：六十到七十年代针对世 界人口的剧增，主要研究利用纤维素资源生产单细胞蛋白：七十年代以后，随着 能源危机和环境污染，研究的重点又逐渐转移到开辟新能源和防止环境污染上 来。近二、三十年来，在产纤维素酶菌株的选育、纤维素酶组分及降解机制、纤 维素酶合成的调节和控制以及纤维素酶应用等诸多分支课题都取得了很大的进 展。同时，对纤维素酶合成的机制，纤维素降解的生化过程，纤维素酶基因的克 隆和表达，以及一些纤维素酶分子d 结构的确定等方面均进行了深入的研究。 1 1 纤维素酶的性质 1 1 1 纤维素酶的结构 大多数纤维素酶都由一个或多个催化结构域( c d ) 和纤维素结合区( c b d ) 组 成，中间由一段可辨认的连接肤( 1in k e rp e p t i d e ) 连接h 1 ，只有少数微生物和高 等植物产生的纤维素酶不具有这类结构域，并且在有些外切和内切酶c b d 的结构 可能不是必需的畸。 ( 1 ) 催化结构域( c d ) ：迄今为止，所有已知的纤维素酶的结构域根据其氨基酸 序列的相似性可分为7 0 个家族m 1 。采用x 光衍射的方法，1 9 9 0 年r o u v m e n 1 对 t r e e s e ic b hi i 的催化域、1 9 9 2 年j u y 对c t h e r m o c e l1 u mc e l l ) 的催化域、 1 9 9 3 年s p e zi 0 1 9 1 对t f u s ee 2 的催化域、1 9 9 4 年d iv n e p o 对t r e e s e ic b hi 的 催化域进行了结晶和解析。三维结构的研究为内切酶和外切酶底物的特异性做出 了解析：内切酶的活性位点可结合纤维素链的任何部位并切断纤维素链：外切酶 的活性位点只能从纤维素链的非还原件术端切下纤维二糖。1 9 9 5 年y e i n k e p l 利 用蛋白质工程的方法将c 卢m j 外切酶c b h a 分子的l o o p 删除后，发现该酶的内 切酶活性果然提高，这进一步证实了上述分析。 ( 2 ) 纤维素结合结构域( c b d ) ：c b d 通常位于氨基酸序列的n 一术端或c 一末 端。根据c b d 氨基酸序列的相似性，c b d 可分为主要的5 个家族2 1 0c b d 家族i 由3 3 3 6 个氨基酸组成，其三维结构的主要代表来自于tr e e s e ic b hi 的c b d ， 已经用n m r 技术测定了其结构，是一个楔形不规则的口折叠结构，疏水面上有三 个保守的妙残基，主要与纤维素分子的结合有关。c b d 家族i i 约含有9 5 1 0 8 个 氨基酸残基，属于这类家族的有c e ll u l o m o n a sf i m i 和t h e r m o m o n o s p o r a c b d 叫 a c b d 家族i i i 位于那些可产生纤维小体的梭菌中。c b d 可以使参与纤维素降解的 各种酶高效地吸附于纤维素上，使其与各自的底物更加接近，待纤维素被纤维素 酶降解到一定程度时，各个酶就可以立刻有效地作用于各自的底物。目前人们通 过c b d 去除试验n 、化学突变和定点诱变、序列比较试验的研究引，推测c b d 可能通过芳香环与葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素上，由c b d 上其余的氢键形成 残基与相邻葡萄糖链形成氢键将单个葡萄糖链从纤维素表面解下，以利于催化区 的水解作用。 ( 3 ) 连接区( l d ) ：在有着催化结构域的c b d 的内切和外切纤维素酶中，催化结 构域和c b d 是通过连接肤连接而成的，这一段肤链对蛋白酶非常敏感，这是因为 它易暴露于水相，所以为了防止被蛋白酶水解，这一段肤链常常被糖基化。 纤维素酶结晶结构的证据表明：同一族的酶分子遵循相同的机制，这些酶水 解葡萄糖营键是通过一般的酸催化机制。相反，不同组的酶可能有不同的机制和 不同的折叠模型n 。人们又根据同源性将纤维素酶分成九个族。目前，a ，b ，c ， d ，e 族( 图1 1 ) 中己有酶分子的结晶结构得到解析。在已知结构的几个酶分子中， 同一族的分子具有相似的折叠模型，不同族间也可能有相似的折叠。但都遵循双 置换机制，这说明它们的活性位点具有相似的拓扑结构性质。 1 1 2 纤维素酶的组成 1 纤维素酶组分 纤维素酶不是单一酶，而是一种多组分的复合酶系，现已确定纤维素酶含有 三种主要组分： ( 1 ) 内切型一p 一葡聚糖酶( e c 3 2 1 4 ) ：也称c ，酶、c m c 酶、e g 。它能水 解溶解的纤维素衍生物或者膨胀和部分降解的纤维素，但不能作用于结晶的纤维 素。它以随机的形式在纤维素聚合物内部的三非结晶区进行切割，对末端键的敏 感性比间键小，主要产物是纤维糊精、纤维二糖和纤维三糖。 ( 2 ) 外切型一a 一葡聚糖酶( e c 3 2 1 9 1 ) ：也称c 酶素酶、c b hac ，酶是 纤维素酶系中的重要组分、纤维二糖水解酶或微晶纤维在天然纤维素的降解过程 中起主导作用，它能从纤维素链的非成可溶的纤还原性末端切割，产生纤维二糖。 2 ； t、：，硒 l r 一 ，。 l 、 东北师范大学硕士学位论文 ( 3 ) 纤维二糖酶( e c 3 2 1 2 1 ) ：也称c i j 或p 一葡绚糖营酶、b g 。它能水解 纤维一：糖和矩链的纤维寡糖生成葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解i 6 1 快，随 着葡绚槭聚合度的增j n l 水解速度下降。这种酶的专- - t ! _ - 比较差。 在将大然纤维素水解成葡萄糖的过程中，必须依靠三种组分的协同作用j 一 能完成。 1 1 3 纤维素酶的理化性质 虽然不同来源纤维素酶的组成和性质不尽相同，但是在理化性质方面有着较 大的相似性口钔。例如：分子量范围很广，内切型为2 3 x1 0 1 一1 4 6 x1 0 6 d ，外切 型为3 8 x1 0 4 _ 1 1 8x1 0 6d ，尽葡萄糖普酶为9 o x1 0 4 _ 1 o x1 0 6d ( 胞内酶) 和4 7 x1 0 4 - 7 6 x1 0 6d ( 胞外酶) ：其酶在p h 3 0 - 1 0 5 范围内稳定：最适作用温 度为4 0 6 5l c ：卤素化合物、重金属去污剂、染料、琉基试剂、表面活性剂等对 酶活有一定的激活或抑制作用瞳”捌；纤维素酶各组分多为糖蛋白，但含糖量不同， 主要有甘露糖、半乳糖、葡萄糖及氨基葡萄糖等；组成纤维素酶蛋白质部分的氨 基酸组分有所区别，但也有很多相似之处，其中a s p ，s e r ，t h r ，a l a ，g i u 和 g l y 的含量比较多，而含硫氨基酸( c y s ) 的含量较少。 2 纤维素酶降解机理 2 2 纤维素酶降解的机制 纤维素酶是一种复合酶，它使纤维素转化为葡萄糖的具体作用细节至今仍不 是很清楚，但普遍认为是纤维素酶各组分协同作用的结果啪。一般认为纤维素材 料要进行有效的酶解，首先纤维素酶应吸附于固体底物上，然后将底物剪切为小 的片断，再水解成纤维寡糖，直至葡萄糖。 1 9 5 0 年r e e s e 等人对纤维素酶的作用方式提出了c 卜c x 假说： 目前，对于纤维素各组分之间的协同降解方式主要有两种观点： 一种观点认为啪1 ，首先由c x 酶在纤维素聚合物内部起作用，在纤维素的非 结晶部分进行切割产生新的末端：然后再由c 1 酶以纤维二糖为底物由末端进行 水解，最后由纤维二糖酶将纤维二糖水解为葡萄糖( 图1 3 ) 。 另一种观点认为m 1 ，首先由外切型葡聚糖酶( c b hi 和c b h1 1 ) 水解不溶性纤 维素生成可溶性的纤维糊精和纤维二糖：然后由内切型葡聚糖酶( e gi 和e gi i ) 作用于纤维糊精，生成纤维二糖：再由纤维二糖酶将纤维二糖分解成二个葡萄糖 纤维素酶降解纤维素制备纤维寡糖机理。 2 2 天然纤维素与酶作用的关系 纤维素酶分解天然纤维素的先决条件需要酶与纤维素底物先相互接触形成 复合物，j 。能进一步发尘酶解作用：酶十底物h 酶一底物复合物一一 酶+ 产物。 天然植物纤维原料的组成为：纤维素占3 2 - 5 3 ，半纤维素占2 0 - 4 0 ，木质素 占1 2 2 5 ，灰分占1 0 1 5 。直链状大分子纤维素折迭起来，形成具有高结晶度的 3 东北师范大学硕士学位论文 基本构成单位，由这种琏本结构单位集中起来构成微小结构单位，再由很多这样 的微小单位构成纤维。在微小构成单位的周围被半纤维素，其次是半纤维素术质 素层的鞘所包围着。木质素虽然对纤维素酶反应没有损害作用，但它物理地阻止 纤维素酶对纤维素的进攻，因而影响了纤维素酶反应的敏感性。 纤维素酶容易水解纤维素的无定形区，而不易作用于结晶区。在酶水解纤维 素过程中，随着残余物结晶度的提高，对酶的进一步水解的抗性增大，所以结晶 区的结晶度越高，酶解越困难。 1 3 纤维素酶活力的测定 纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它往往不是单种酶，而 是起协同作用的多组分酶系，包括c 、酶、c x 酶和尽葡萄糖营酶这三类酶。不同 来源的纤维素酶其酶系在组成上有较大差别，即其协同组合酶之种类、比例往往 不同3 1 嗡删。 人们在研究中还同时都遇到了如何测定和评定纤维素酶各组分酶活力的问题， 国内外的测定方法很多，有代表性的是：1 ) c m c 糖化力，主要代表外切和内切酶 活力的总和。2 ) c m c 液化力，它是利用测定高分子溶液粘度从而导出其聚合度和 分子量的方法来表征内切酶活力，它可测得初速度，因而可确切反映内切酶活力， 灵敏度也高。3 ) 滤纸糖化力，则反映了三类酶组分的协同作用。 二、天然植物中半纤维素成分的概述 植物性纤维材料除了含有纤维素外，还含有半纤维素( 约1 5 3 0 ) 和木质 素( 约1 0 2 0 ) 。后两者的存在，阻止了纤维素酶接近纤维素，使之难于被分解。 所以在纤维素酶转化农业废物时，常常用酸或碱进行预处理，以除去半纤维素和 木质素。但这种处理方法不仅造成环境污染，原料浪费，同时由于成本过高，经 济上过不了关，难于达到商品化生产的目的。七十年代后期以来，人们提出了“生 物量的全利用”的观点，在这一背景下，半纤维素与半纤维素酶的研究逐渐受到 观注。 半纤维素的研究结果表明，降解半纤维素可以获得各种戊糖。其中最主要的 是木糖，木糖可以经过异构化后，由酒精酵母发酵成酒精，或由管束酵母直接转 化成酒精。戊糖还可以生产糠醛，木糖醇，2 ，3 一丁二醇，又是葡萄糖异构酶和 木聚糖酶的良好诱导物及原料，在塑料工业、医药工业和食品工业上有着重要的 应用。近年来每年都有几百篇的有关文献资料在刊物上发表。引起人们愈来愈大 的重视。 半纤维素和木聚糖的理化性质概述 1 8 9 1 年e s c h u l z e 最先指出：在植物中与纤维素共生的植物细胞壁多糖， 可被碱水溶液抽提，酸水解较纤维素容易得多。对半纤维素而言，这一概念无论 在化学结构或生物功能方面都比较含糊。近二十多年来，随着多糖分离纯化的改 4 叮 ； 山 譬 ， r k l 东北师范大学硕士学位论文 进以及各类色谱、光滑、核磁) 乓振、质谱和电子显微镜等的心用，人们对半纤维 素的知识h 益深入。g c a s p in a ll1 9 6 2 年叙述，“半纤维素足来源于植物的聚糖 类，含有d 一木糖基，d 一甘绺糖毖与d 葡萄糖壤或d 一半乳糖毖的基础链，其它糖 基可成为枝链基而连接于此基础链上”。t e t i m e l l1 9 6 4 年叙述：“半纤维素是 低分子量的聚糖类( 平均聚合度近2 0 0 ) 和纤维素一起，j 下常地产生在植物组织 之中，他们可以从原来的或脱去木素的物料中被碱水溶液抽提而分离出来”。与 纤维素不同，半纤维素不是由一种单糖组成的均一聚糖，而是以不同的几种糖单 元组成的共聚物。半纤维素就是这样一群共聚物的总称。陆生植物的大多数半纤 维素虽常有各种短枝链，但主要还是线状的，它是由有限的几种糖基构成的，如 d 一木糖，d 一甘露糖，d 一葡萄糖，d 一半乳糖，l 一阿拉伯糖，4 一氧一甲基一d 一葡萄糖尾 酸，d 一半乳糖尾酸，d 一葡萄糖尾酸及较少量l 一鼠李糖，l 一岩藻糖和各种氧一甲基 化了的中性糖基。 半纤维素中最主要的聚糖为木聚糖，木聚糖由卜吡喃木糖基通过b 一1 ，4 一 糖苷键联接成的“骨架”组成，具有分枝侧链，分枝侧链含有不同量的l 一呋喃 阿拉伯糖，d 一木糖，d 一葡萄糖和d 一吡喃半乳糖基及糖醛酸组成，在天然木聚糖 中的许多木糖基被乙酰化，但在碱抽提中，这些替代物往往被除去。 图为小麦杆木聚糖的结构简图。 d x y l p i 。 4 d x y l p i 4 d x y l p i 。 4 d x y l p i 。 4 d x y l p 33 2 fff 111 d x y l p l 。 4 d x y l p l a r a f d g i u p a 图l小麦杆木聚糖结构简图 d x y l p - - - d - p 比哺木糖基 l a r a f - - - l - 呋哺阿拉伯糖基 d g i u p a - - - d - p 比哺葡萄糖尾酸基 我国每年可产生几千万吨秸秆等农业废料，如玉米芯、玉米秸杆、稻草、麸 皮、蔗渣乜1 等，此外，玉米加工生产淀粉的过程中产生了大量的玉米芯，它们均 含有丰富的半纤维素物质。例如，玉米b 3 是世界三大粮食作物之一，自2 0 世纪 5 0 年代以来，世界上的淀粉、淀粉糖和酒精工业愈来愈多地用玉米作原料，这 大大地促进了玉米作为工业原料的进程。美国是世界上第一玉米生产大国，年产 2 亿多吨，我国玉米产量1 1 亿吨左右，居世界第二位，在玉米生产时会产生占 玉米质量5 0 的玉米芯，由于玉米芯中半纤维素成分占很大比例，约4 5 以上， 而纤维索成分只占到1 3 左右，因此玉米芯的合理利用受到人们的极大关注。 玉米芯作为一种产量大综合利用价值还不高的谷物加工副产品，已成为我国需优 先研究和丌发的膳食纤维源之一。 5 东北师范大学硕士学位论文 玉米芯中纤维含量高，纤维质结构好，是难得的物美价廉的食物纤维源。李 凤敏等人比较了化学法和酶法去除纤维素与木质素等物质，结果表明，酶法处理 的效果史好。处理后的玉米芯，采用木聚糖酶水解精制工艺，可以得到低聚木糖。 我国是农副产品生产大国，提高其综合利用水平和高技术含量一直是农副产品加 工研究的一个热点。 三、玉米皮纤维多糖概述 纤维多糖：系指在人体内难以被酶解消化的高分子多糖类物质的总称：从具 体的组成成份看，包括阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯聚糖、半乳聚糖、阿拉伯木聚糖、 木糖葡聚糖、纤维素和木质素等。 我国每年可产生几千万吨秸秆等农业废料，如玉米芯、玉米秸杆、稻草、麸 皮、蔗渣乜1 等，此外，玉米加工生产淀粉的过程中产生了大量的玉米皮，它们均 含有丰富的半纤维素物质。例如，玉米n 1 是世界三大粮食作物之一，自2 0 世纪 5 0 年代以来，世界上的淀粉、淀粉糖和酒精工业愈来愈多地用玉米作原料，这 大大地促进了玉米作为工业原料的进程。美国是世界上第一玉米生产大国，年产 2 亿多吨，我国玉米产量1 1 亿吨左右，居世界第二位，在加工玉米淀粉时会产 生占玉米质量1 4 - - 2 0 的玉米皮，由于玉米皮中半纤维素成分占很大比例， 约4 0 以上，而纤维素成分只占到1 3 左右，因此玉米皮的合理利用受到人们 的极大关注。玉米皮作为一种产量大综合利用价值还不高的谷物加工副产品，已 成为我国需优先研究和开发的纤维多糖源之一。 玉米皮组织是由纤维素、半纤维素、木质素及类物质组成，其中半纤维素主 要是由l - - n 拉伯糖和糖构成。玉米皮含较高的l 一阿拉伯糖。玉米皮经生物、 化学、物理加工前，难以显示其活性多分的生理活性，这已经为国外的研究证实。 必须将玉米皮中的淀粉、蛋白质、脂肪通过分离手段获得较纯玉米皮活性多糖。 考虑对活性多糖的生性的影响不提倡对玉米皮使用化学方法，因为化学试剂能使 其生理活性降低。目前很多人使用酶法提取，日本研究者使用酶制剂酶解玉米皮， 使淀脂肪、蛋白质降解而除去，精制玉米皮纤维，其维素含量达6 0 一8 0 ，将 这种食物纤维制成饼含量在2 时，口感极好。玉米皮食用纤维具有性、吸收性 好的特点，在添加到豆酱、豆腐、肉品中，能保鲜并防止水的渗出，用于粉状制 品) 可作载体，用于饼干中可使生面团易于成型。我国利用玉米加工的副产品玉 米皮，通过生化氮等一系列的酶来提取阿拉伯木聚糖和玉米纤维，其中的阿拉伯 木聚糖和玉米纤维具有很高生物活性可广泛应用于医疗和食品工业。我国玉米皮 资源虽然富，但是相关的研究起步较晚，基础研究和应用较低。近年来一些学者 也对包括玉米皮在内的许物来源的纤维多糖进行了研究，比较集中于对提艺和生 理功能的研究，主要是采用化学方法和简生物酶处理法来提高纤维多糖的含量以 及改善其性质。玉米皮活性多糖的提取与纯化植物来源的活性多糖是极性大分子 6 可 0 i 、， 一 r k t 东北师范大学硕士学位论文 化合物，掘报般采用以下力法抛墩，第一，采用不6d 温度的水、溶液提取，尽量 避免在酸性条件下提取，以防引昔键的断裂。稀酸提墩时，时f n j 宜短，温度不宜 5 0 。由于水浸提时问长且效；钲低，酸碱浸提易多糖的立体结构及活性。第二， 现在有的采用酶取多糖，即采川复合酶一热水浸提相结合的方复合酶多采用一定 比例的纤维素酶及中性蛋白酶此法具有条件温和、杂质易除和提取率高等优点。 还有采用超声波强化提取多糖，超声波提取玉米皮活性多糖效率明显高于传统依 靠提取剂的方法，同时超声波能够缩短提取时间，如果结合高温提取效果更佳。 超滤法提取活性多糖也已取得较好效果。据提取方法对活性多糖得率及多糖含量 的影响作比较酶水提取 酶提 超声波提取 水提。酶水提取是最佳工艺，该法多 糖得率高、杂质少且条件温和、提取时短，不过此法多停留在实验室研究阶段， 工业化应用较少。目前也有用可降解纤维素、木质素的微生物来促进活性多糖提 取的研究。例如应用白腐真菌一裂褶菌酵玉米皮提取液来提取活性多糖。裂褶菌 是一种食用菌，具有很高的药用和食用价值。菌体自生能够产生胞外多糖，裂褶 菌具有很强的降解纤维素和木质素能力，将其接种到经过处理的玉米皮中，利用 玉米皮中的一些营养物质，裂褶菌能够很好的生长。裂褶在生长过程能产生一个 复合酶系把纤维素的碳链打断，使不溶的变成可溶的。此方法除得到玉米皮多糖 外，还能够得到裂褶菌胞外多糖。国外的研究表明，每1 9 玉米皮能得到裂褶菌 胞外多糖5 5 土2 5 m g 和玉米皮活性多糖2 0 6 士2 1 m g 。而且，经过此番生物作用 后，提取糖后的玉米皮残渣中富含菌体蛋白、氨基酸、维生素、矿物质以及多种 活性酶，作为畜禽饲料的价值也得以提高。多糖提取之后，一般要经过适当的纯 化以提多糖的纯度。最常见的纯化方法是利用乙醇或丙酮进行反复沉淀洗涤以除 去小分子杂质。由于多糖聚合度不同，我们得到的多糖的结构也不同，在用乙醇 沉淀时，控制乙醇的浓度可得到不同聚合度多糖。进一步的纯化则可分别采用 d e a e 一纤维素、葡聚糖凝胶、子交换色谱等方法进行分子水平分离。国外有报 道采用l k b 柱层析系统。多糖纯度和结构鉴常用的方法包括梯度离心法、毛细管 泳、高效凝胶色谱、核磁共振、紫外光谱、红外光谱等。 纤维多糖是一种天然高分子化合物，是由许多失水b 一葡萄糖组成的非淀粉 类多糖，它包括纤维素、半纤维素、果胶和甲壳素类物质。纤维多糖虽不能被人 体消化吸收，但其在维持人体健康方面有着不可替代的生理作用，能预防和治疗 许多疾病，高血压、高血脂、糖尿病、便秘、肥胖症、冠心病等都与纤维多糖的 摄入量不足有关。因此，许多科学家将纤维多糖推崇为“人类第七营养素”。纤 维多糖的生理作用及其在人体中具有不可替代的地位玉米纤维多糖是从玉米中 提取的微黄色物质。具有新香气味，其纤维含量较高。是理想的食用纤维资源。 玉米纤维多糖进入人体消化系统后，产生特殊的生理代谢功能，可以清除体内垃 圾，起到防止便秘、脂肪排积的功能，由于离子交换和胶体的形成减少了对有 7 东北师范大学硕士学位论文 毒及致癌物质的吸收，又可调节胆固醇水平，降低肠内b 一葡萄糖酸酶活性，排 除血管硬化诱因及养颜作用。目前，同本、美国、西欧等一些发达国家很重视 这个问题。研究开发出系列食品纤维保健食品。我国食物纤维的丌发正在起步亟 需为食品、医药工业提供优良性能的食物纤维原材料。这就需要我们加强该领域 的基础理论研究，探求进一步工业化生产的可行路线阁近些年，随着生活水平的 不断提高，人们的健保健意识在逐渐增强，对具有显著生理活性的多糖类产品的 需求在不断上升。我国玉米皮资源丰富，目前开发利用的还相当不充分，而由国 内外的初步研究证实玉米皮活性多糖的生理活性还是比较突出的。 三木聚糖酶的研究现状 由于木聚糖酶有如此广泛的应用价值，国内外有很多研究者致力于木聚糖酶 的开发研究，研究集中在高产菌的选育、工程菌的构建、优化培养条件、分离耐 高温、耐酸碱n 叫、无纤维素酶污染的木聚糖酶菌株、寻找便宜的原料来源等多个 领域。 已报道的产木聚糖酶的微生物分布很广，有细菌、链霉菌、曲霉、青霉、木 霉等。很多研究者已筛选出产木聚糖酶活性较高的菌株，并对菌株进行诱变， 如同本的入江利夫n 2 1 等人对球毛壳霉菌株进行诱变，大幅度提高了该菌株的产木 聚糖酶能力，诱变后菌株的木聚糖酶酶活从出发菌株的2 1 u g 培养物提高到 2 4 l o u g 培养物，酶液用于水解桦木木聚糖得到的水解产物的低聚木糖与木糖之 比也从原来的3 4 6 6 上升到7 2 2 1 。他们进一步以玉米芯为原料，利用球毛壳变 异菌株l1 6 1 进行固态发酵生产木聚糖酶。目前已将该项技术用于低聚木糖的工 业化生产。 孙迅“3 1 等人以小麦秸半纤维素为碳源，从土壤中分离和筛选了一株木聚糖酶 发酵周期短、酶特性良好、酶活力高的短小芽孢杆菌菌株l o l ，细菌繁殖快，酶 专一性强，对纤维素破坏程度小，该菌在3 2 c 振荡培养4 8 h ，总半纤维素酶活力 达2 3 5 6 0 m l ，木聚糖酶活力达11 6 4 2 u l i i l 。酶反应的最适温度为5 0 ，最适 酸碱度为p h 6 5 ，n a + 、m 9 2 + 等离子可提高木聚糖酶的水解活性，而z n 2 + 、c u 2 + 等离 子则对木聚糖酶活性有明显的抑制作用。 吴克1 等人经自然筛选分离得到一株产高木聚糖酶活力的拟青霉属菌，初步 鉴定为宛氏拟青霉菌，该菌所产的木聚糖粗酶液分别经硫酸铵、乙醇沉淀， s e p h a d e x g 一1 0 0 ，d e a e s e p h a d e x a - 5 0 分离纯化后得4 个组分，各组分酶反应最 适温度和p h 值都具有一定的差异。这说明该菌产生的木聚糖酶是由多组分构成 的。与丝状真菌产生的木聚糖酶都属于多组分构成的分离结果相似。 刘月英n 勒等人报道了棒曲霉u a 一2 木聚糖酶的蔗渣固态发酵，蔗渣的半纤维 素含量约为3 0 ，主要成分为木聚糖，可被微生物产生的木聚糖酶降解生成木 8 c 1 l i d l 东北师范大学硕士学位论文 糖和少量的其它单糖，该菌株经紫外线诱变，选疗得到一株能在p h 9 0 蔗渣嘲态 培养基上很好生长，且其术聚糖酶活力比出发菌株提高3 6 3 的变株u a 一2 ，2 8 培养1 0 8 h ，其木聚糖酶、滤纸降解酶和羧甲基纤维素酶的活力分别为2 6 9 5 6 、 2 8 5 、4 2 7 u g 蔗渣，酶反应的最适p h 5 0 ，最适温度5 0 ，在p h 4 0 一1 1 o 内 酶活性十分稳定。5 0 保温l h ，酶活剩余5 5 ，8 下放置2 3 d ，活力几乎不变。 为了适应工业化生产的需要，许多研究者进行耐酸碱、耐高温菌株的筛选。 例如，b a d a lc s a h a 等人从土壤中筛选到一株降解玉米纤维木聚糖的菌f u s a r t u m p r o t f e r a r u m , 通过s d s - p a g e 测其酶分子量为2 2 4 0 0 ，最适温度为5 5 ，在 p h 5 0 - 7 5 之间稳定，该酶水解木聚糖来源比较广泛，且没有木糖生成，而且， 此酶不需要金属离子维持其活性和稳定性。r p n a s c i m e n t o 等人分离出 s t r e p t o m y c e ss p a m t - 3 菌株，该株细菌在以工农业副产品和废料等为原料时有 较高的胞外木聚糖酶活性，最佳产酶温度为6 0 ，最适p h 值6 0 ，在5 5 条件 下保温2 0 小时存留5 0 酶活力，因此该木聚糖酶被认为是很有效的耐热生物催 化剂。周世宁n 们等人通过碱性选择平板分离到耐碱的芽孢杆菌b 一1 4 1 菌株，该菌 在碱性p h l o 条件及木聚糖存在下能产生胞外木聚糖酶，该酶最适反应温度为6 0 ，酶反应的最适p h 为3 - 7 ，但在碱性条件下稳定，在p h i o 环境处理6 0 m i n ， 仍保持约7 0 的活性。从t l c 分析可知，该酶作用于燕麦木聚糖时，主要产物 为大于三体的寡糖。 此外，在发酵条件、优化工艺方面有许多探索。如培养基最佳碳源组成，最 佳氮源，接种量、温度、p h 等参数对产酶的影响。我国陈惠忠n 等人对黑曲霉 ( a s p e r g i1 l u sn i g e r ) c - 2 菌株的突变株a n - 7 6 的发酵条件进行了研究。结果 表明此菌在以葡萄糖等为碳源时，可检测到很低水平的胞外酶活，而只有在木聚 糖、木糖和麸皮这类含木糖苷类的诱导物中培养，才大量合成胞外酶。且半纤维 素在低浓度范围内，酶活随其浓度增大而升高，当浓度超过4 ，酶活趋缓至下 降，表现出高浓度下的“阻遏”作用。初始p h 5 5 - 6 5 、2 8 ，产酶量最高。v i n o l a r e d d y n 町等人研究了通风对t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u ss s b p 产酶的影响，结果表 明，在一定限度内，通风量越大，酶产量越高，但当通风量大于1 o v v m 时，增 大通风量反而酶产量降低。 木聚糖酶作为一种工业酶制剂在我国j 下逐步形成规模化生产。吴克【1 。1 等人报 导了黑曲霉a 3 菌株固体发酵培养的产酶过程，发酵3 d 产木聚糖酶活最高，固体 曲最适浸提比为1 ：7 ( w v ) ，通过6 0 - 6 5 饱和度的硫酸铵盐析，获得的木聚 糖酶活力最高，冻干酶粉活力为1 5 4 0 0 u g ，得率为7 l ，4 0 烘干酶粉活力为 1 5 3 9 5 u g ，得率为5 1 ，酶反应最适温度5 5 ，最适p h 4 6 ，酶对四种不同底 物半纤维素水解作用得亲和性为麸皮最强，稻草最弱。还原糖生成量为麸皮最高， 蔗渣次之，其次是稻草，最后是玉米芯。此外，蔡敬民啪1 等人报道了木聚糖酶及 9 东北师范大学硕士学位论文 固定化酶的性质和应用，研究壳聚糖吸附和戊二醛交联对木聚糖酶固定化条件， 将酶液加入到经醋酸溶液处理过的脱乙酰壳聚糖的p h 4 8 的悬液中，加入浓度为 o 3 一0 4 的戊二醛溶液，室温下，8 h 后得到固定化酶。固定化酶的半失活温 度比游离酶高，由5 1 升至7 l ，i ( - 值由游离酶的1 2 m g m l 增加到1 5 m g m l ， 最适反应温度也由5 5 增加到7 1 ，而最适反应p h 由4 6 下降到3 8 ，该固定 化木聚糖酶可用于制造低聚木糖，经过1 0 次连续应用实验后，该固定化酶的活 力保持8 l 。黑曲霉木聚糖酶的固体发酵及其粗酶制剂的制备在中小型企业中 易于推广应用，因此，其应用潜力也较好。 l o ； c f 囊 i ， 、 东北师范大学硕士学位论文 第一章玉米皮的脱淀粉、蛋白质的处理 一、材料与方法 1 、材料及设备 1 1 材料玉米皮：加工玉米淀粉后的副产品( 长春市大成玉米公司) 化学试剂： 0 5 ，1 ，2 的氢氧化钠溶液 o 5 ，1 ，2 盐酸溶液 酶制剂： 3 0 0 0 u m l 的淀粉酶 2 9 0 0 u m l 的蛋白酶 1 2 仪器设备：电控恒温摇床、电控恒温箱、电控恒温水浴、电热恒温干燥箱、 小型电动粉碎机、离心机、电子天平，分光光度计，凯氏定氮仪 2 方法 简单工艺流程：玉米皮一洗净煮沸烘干一磨碎过1 0 0 目筛一不同方法脱淀粉蛋白 质一测定淀粉和蛋白质的含量。 2 1 玉米皮的前处理：取1 9 玉米皮磨碎在水中浸泡过夜，出去其表面的杂质， 测定其中的结合淀粉和蛋白质含量。 2 2 化学法出去玉米皮中的结合淀粉和蛋白质 2 2 1 碱法去除结合淀粉和蛋白质：配置浓度为0 5 ，1 ，2 的n a o h 溶液按 料液比1 ：1 0 加入前处理后玉米皮在不同条件下作用，测定其中的剩余淀粉和蛋 白质的含量。 2 2 2 酸法去除结合淀粉和蛋白：配置浓度为o 5 ，1 ，2 的h c l 溶液按料 液比1 ：1 0 加入前处理后玉米皮在不同条件下作用，测定其中的剩余淀粉和蛋白 质的含量。 2 3 酶法去除玉米皮中的结合淀粉和蛋白质 2 3 1 不同加酶方法下去除结合蛋白质和淀粉。 2 3 1 1 只加蛋白酶煮沸：1 0 0 0 u g 原料加入蛋白酶，p h 7 5 的磷酸缓冲溶液配制 浓度为1 的底物4 0 反应2 h 测定其中的剩余淀粉和蛋白质的含量。 东北 2 3 1 2 只加淀粉酶：按4 0 0 0 u g 原料加入淀粉酶，p h 6 0 的磷酸缓冲溶液配制浓 度为1 的底物1 0 0 反应2 h 测定其中的剩余淀粉和蛋白质的含量。 2 3 1 3 先加蛋白酶后加淀粉酶：上述相同条件下，先加入蛋白酶反应后用热水 漂洗出去蛋白酶后加入淀粉酶继续作用测定其中的剩余淀粉和蛋白质的含量。 2 3 1 4 先加淀粉酶再加蛋白酶：在上述相同条件下先加入淀粉酶反应后用热水 漂洗除去淀粉酶后加入蛋白酶继续作用测定其中的剩余淀粉和蛋白质的含量。 2 4 蛋白酶煮沸法除去玉米皮中的结合淀粉和蛋白质最佳工艺研究 2 4 1 煮沸时间：按l o o o u g 原料加入蛋白酶4 0 。c1 底物浓度反应2 h 分别煮 沸2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 ，7 0 m i