（植物学专业论文）拟南芥保卫细胞特异表达的fbox蛋白dor负向调节耐旱性.pdf

中国农业大学博士学位论文 中文摘要 拟南芥保y - - m 胞特异表达的f b o x 蛋白d o r 负向调节耐旱性 中文摘要 o o r ( d是与金鱼草( 疗基因同源的拟南芥超家族的_rqughtr e s i s t a n c e ) s - l o c u sf - b o x s l f 成员a t s f l 3 5 该基因的t - d n a 插入突变可以导致拟南芥产生耐早性。离体叶片失水实验、m s + 甘油培养基实验和盆栽干旱实验都证明d o t 突变体和野生型相比表现为耐旱。d o t 的功能互补实 验进一步验证了该突变体表型是由于o o r 基因的t _ n n a 插入造成的，表明该基因编码一个耐旱性 的负调控因子。定量- p c r 结果证明d o r 基因组成型表达，但从d o r ：g u s 转化实验看出，d o r 基 因在叶子的保卫细胞中特异表达，提示d o t 表现出的耐旱可能与气孔有关。因此，我们比较了野 生型和突变体在正常情况下的气孔大小和干旱条件下删刀和删弼的表达，结果显示d o t 突变体 由于相对含水量高而表现为耐旱。为了研究凸凹基因突变后耐旱的分子机制，我们采用n o r t h e r n 杂交方法分析了与耐早相关的基因d r e b 2 a 、r d 2 9 a 、c o r i s a 和r d 2 2 在野生型和突变体中的表达， 结果表明d o r 突变体表现出的耐早可能与这些基因在干旱胁迫条件下的表达升高有关，提示d o r 基因在依赖a b a 和不依赖a b a 信号通路上都发挥作用。我们从转录水平还发现d o r 基因可能也参 与了抗寒途径。酵母共转化和p u l l d o w n 实验证明了d o r 在体内可以与a s k l 4 和c u l l i n i 蛋白形 成s c f 复合体。这些结果表明，在干早条件下) o r 作为耐旱负调控因子参与泛素2 6 s 蛋白小体降 解途径来抑制气孔关闭。 关键词：拟南芥，突变体，耐早，f - b o x 基因，d 3 a 信号通路，保卫细胞 ag u a r dc e l ls p e c i f i cf - b o xp r o t e i nd o rn e g a t i v e l yr e g u l a t e s d r o u g h tt o l e r a n c ei na r a b i d o p s i st h a l m n a a b s t r a c t d o r ( d r o u g h tr _ e s i s t a n c e ) i sa t s f l 3 5 ，am e m b e ro fa r a b i d o p s i sa t s f l $ - l o c u s f - b o x l i k e ls u p e r f a m i l yr e l a t e dt ot h ea n t i r r h i n u ms l o c u sf b o xg e n e ( s l f ) at - d n a i n s e r t i o n a lm u t a n to fd o rr e s u l t si nas i g n i f i c a n ti n c r e a s ei nt o l e r a n c et od r o u g h t d e t a c h e dl e a v e s ，m sp l u sg l y c e r o la n ds o i l g o w np l a n t sa l le x h i b i tad r o u g h t - t o l e r a n t p h e n o t y p ec o m p a r e d t ow i l d t y p ep l a n t s f u n c t i o n a lc o m p l e m e n ta c t i o n e x p e r i m e n t s h o w e dt h a td o rm u t a t i o nl e a d st ot h ed r o u g h tt o l e r a n c e ，s u g g e s t i n gt h a td o re n c o d e sa n o v e ld r o u g h tt o l e r a n c er e p r e s s o r q u a n t i t a t i v ep c rs h o w e dt h a td o re x p r e s s e d u b i q u i t o u s l ya t al o wl e v e l i n t e r e s t i n g l y , g u sr e p o r t e rg e n es t u d i e si n d i c a t e dd o ri s s p e c i f i c a l l ye x p r e s s e di ng u a r dc e l l ，s u g g e s t i n gt h a tt h ed o rm a yf u n c t i o ni ns t o m a t a l m o v e m e n tu n d e rd r o u l g h ts t r e s s f u r t h e r m o r e ，w ec o m p a r e dt h es t o m a t a la p e r t u r eu n d e r n o r m a lg r o w nc o n d i t i o na n dk a t a n dk a t 2e x p r e s s i o nu n d e rd r o u g h ts t r e s sb e t w e e n w i l d t y p ea n dd o rm u t a n ta n dr e v e a l e dt h a tt h ed o rc o u l dl i m i ti t st r a n s p i r a t i o n a lw a t e rl o s s i nr e s p o n s et od r o u g h ts t r e s s t oi n v e s t i g a t et h em o l e c u l a rm e c h a n i s m sf o rt h ed o ra c t i o n ， w ea n a l y s e dt h ed r e b 2 a , r d 2 9 a , c o r l 5 aa n dr d 2 2e x p r e s s i o nb yr n a g e lb l o t t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed o rm u t a n ti n d u c e dt h ee x p r e s s i o no fd r o u g h t r e s p o n s i v eg e n e s a f t e rp e gt r e a t m e n t ，i n d i c a t i n gt h a td o rm a yf u n c t i o ni nb o t ha b a d e p e n d e n ta n d a b a i n d e p e n d e n tp a t h w a y sf o rs t r e s s r e s p o n s i v eg e n ee x p r e s s i o n m e a n w h i l e ，w ef o u n d t h a td o ra l s of u n c t i o ni nc o l ds i g n a lt r a n s d n c t i o n y e a s tt w o h y b r i da n dp u l l d o w na s s a y s s h o w e dt h a td o r p r o t e i ni sc a p a b l eo fi n t e r a c t i n gw i t ha s k l 4 a n dc u l l i n l ，s u g g e s t i n g t h a ti tc o u l df o r ma l ls c ff s k p l l c u l l i no rc d c 5 3 f - b o x ) c o m p l e x t a k e nt o g e t h e r ，t h e s e r e s u l t ss u g g e s tt h a tt h eu b i q u t i n 2 6 sp r o t e a s o m e m e d i a t ep r o t e o l y s i sm e d i a t e db yd o r a c t san e g a t i v er e g u l a t o ro fd r o u g h tt o l e r a n c eb yi n h i b i t i n gt h es t o m a t a lc l o s u r eu n d e r d r o u g h ts t r e s s k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，m u t a n t ，d r o u g h t t o l e r a n c e ，f - b o xg e n e ，a b as i g n a l t r a n s d u c t i o n ，g u a r de e l 缩略词 a b a a b a a b f a b i a b r c a b r e a r e b a s k b z i p c b f c r t d r e d r e b e r d l e r f f f v l f r 0 2 h o s i c e l l o s s c f s t a i r t i g r a b a c i s i ca c i d a b a d e 丘c i e n t a b r e b i n d i n gf a c t o r a b a i n s e n s i t i v e a r a b i d o p s i sb i o l o g i c a lr e s o u r c ec e n t e r a b a r e s p o n s i v ee l e m e n t a b r e b i n d i n gp r o t e i n a t a b i d o p s i ss k p l 一l i k e b a s i c - d o m a i nl e u c i n ez i p p e r c - r e p e a t b i n d i n gf a c t o r c r e p e a t d e h y d r a t i o n r e s p o n s i v ee l e m e n t d r e b i n d i n gp r o t e i n e a r l r e s p o n s n r et od e h y d r a t l 0 n 1 e t h y l e n e r e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gf a c t o r f i e r y l f i e r y 2 h i g he x p r e s s i o no fo s m o t i c a l l yr e s p o n s i v eg e n e s i n d u c e ro fc b fe x p r e s s l o n l l o we x p r e s s i o no fo s m o t i c a l l yr e s p o n s i v eg e n e s s k p l c u l l i no rc d c 5 3 f - b o x s i o c t t sf - b o x - l i k e t h ea r a b i d o p s i si n f o r m a t i o nr e s o u r c e t h ei n s t i t u t ef o rg e n o m i cr e s e a r c h m 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论艾中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中围农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的i _ j 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：j 善移峨 时间：击n 了年，月形日 关于论文使用授权的说明 本人完伞了解中国农业大学有关保留、使f _ f j 学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁街，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式硅不同媒体e 发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此出议) 研究生签名： 弧4 嚼 时间：h ，年z 月臼 导师签名眨懑 k 。ji 0 _ ；i 。- 埘 时问：年月f 1 中国农业大学博士学位论文 引言 第一章引言 一、植物泛素2 6 s 蛋白小体降解途径研究进展 1 植物中的泛素化降解体系 植物和人类一样，生死都是不可逾越的屏障。对于组成生命最重要的蛋白质来说- 也需要经 历从合成到降解的过程。泛素2 6 s 蛋白小体降解途径在这一循环中发挥重要作用。泛素 ( u b i q u i t i n ，u b ) 是一个由7 6 个氨基酸组成的蛋白质，许多研究证明它作为一个重复使用的信 号为蛋白的降解循环服务。一般说来，多聚泛素化通过三步反应( e 1 一e 2 一e 3 ) 连接到底物上， 而这些底物可以分布在细胞质中、细胞核中或细胞膜上。泛素化的蛋白被2 6 s 蛋白小体降解，同 时释放出泛素单体。通过这个循环可以有效地清除体内不正常的蛋白或短时间存在的调节蛋白- 从而维持生物的正常生命活动( 图卜1 ，s m a l l ea n dv i e r s t r a ，2 0 0 4 ) 。 1 1 泛素的结构 作为降解体系中的标签分子，泛素首先从小牛胸腺中被分离出来，后来发现广泛存在于各种 生物有机体的各种组织中( 细菌除外) ，它也因此而得名。在拉丁文中“u b i q u e ”就是“到处都 有”的意思。 ( a ) ( b ) 图1 1 泛素分子的结构 泛素分子的示意图。( 引自w w w n o b e l t r i z c o r a ) ， 泛素分子的三维结构，b 折叠和n 螺旋分别用绿色和橙色表示。可以参与聚泛素化的赖氨 酸残基和c 末端7 6 位甘氨酸残基用红色表示。( 此图引自s m a l l ea n dv i e m t r a ，2 0 0 4 ) 泛素是迄今为止所有蛋白中结构最保守的，在所有的植物中泛素的氨基酸序列完全相同，与 酵母中的泛素只有2 个氨基酸的差别，与动物中的只有3 个氨基酸的差别( c a l l i se ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 泛素的三维结构呈球状，5 个b 折叠形成空穴，中间由n 螺旋连接，分子内有许多氢键，这种结 构在泛素降解途径中比较稳定，所以使得泛素可以被重复使用( 图1 一l a ) 。分子中唯一突出的 中国农业大学博士学位论文引言 部分是羧基末端的甘氨酸，正是通过这个氨基酸，泛素分子同接下来的反应中的各种酶及最后的 目标蛋白相结合( 图1 一l b ) 。编码泛素蛋白的基因有一个非常特殊的性质，就是一个基因( u b q ) 同时编码多个泛素分子，多个泛素分子的编码区首尾相连一起被转录出来并翻译成融台的前体 蛋白，随后，融合蛋白被d u b 酶( d e u b i q u i t i ne n z y m e s ) 释放为泛素单体。一个多泛素基因中 串联在一起的编码区数目各异，例如在拟南芥中，含有4 ，5 ，6 个重复泛素单位的基因都存在。 另外，u b q 基因的启动子活性很高，在植物快速生长及胁迫时表达量提高。因此，这个启动子被 用于转基因技术，特别是用于禾本科植物的转基因。 1 2 泛素传递的级联反应 泛素通过a t p 依赣韵e 1 一e 2 一e 3 的催化途径连接到底物上。在有a t p 时，泛素被泛素活化酶 ( u b i q u i t i n a c t i v a t i n ge n z y m e ，简称e 1 ) 激活，在泛素c 端的甘氨酸和e l 的半胱氨酸之间形成一个 商能的硫酯键。e 1 将泛素转移到泛素偶联酶( u b i q u i t i n - c o n j u g a t i n ge n z y m e ，u b c ，简称e 2 ) 的丝氨 酸残基上。最后，通过泛索连接酶( u b i q u i t i nl i g a s e ，简称e 3 ) 的作用，泛素的甘氨酸与底物蛋白 质赖氨酸残基的e 氨基形成异肽键。通常一个底物蛋白质可以结合几个泛素分子( j a c k s o ne t a 1 ，2 0 0 0 ) 。下面分别介绍一下e 1 、e 2 和e 3 。 图卜2 泛索蛋白降解途径( 引自s m a l l ea n dv i e r s t r a ，2 0 0 4 ) e 1 ( 泛素活化酶) ：e 1 是泛素降解途径的起始因子，它不决定结台的底物特异性。e l 约由1 1 0 0 个氨基酸组成，具有一个保守的与泛素结合的半胱氮酸位点，同时还有一个保守的核苷结合位点， 可以与a t p 或a m p u b 结合( h a r t m a n n p e t e r s e ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 。因为它们的酶活性很高，因此 在细胞中，只要有很低的浓度就可以激活泛素。 e 2 ( 泛素偶联酶) ：在植物中，e 2 是一个大家族，例如在拟南芥中存在至少3 2 个e 2 ( b a e h m a i r e ta 上，2 0 0 1 ；d a h a n 口fa 1 ，2 0 0 1 ) 。e 2 具有一个1 5 0 个氨基酸的保守区域，这也是催化中心。 2 中国农业大学博士学位论文引言 一些e 2 只具有这个保守中心，另外有的e 2 在n 一端和c 一端具有延伸的序列，可以协助e 3 识别底 物。e i 与e 3 和e 2 结合的部位相同，暗示着在泛素降解途径中e 2 可能在e 1 和e 3 问穿梭 ( p i c k a r t ，2 0 0 1 ) 。在酵母和动物中，不同的e 2 与特异的e 3 结合后具有不同的功能。在植物中 虽然分离到很多e 2 ，但是它们的功能还不清楚( s m a l i ea n dv i e r s t r a ，2 0 0 4 ) 。 e 3 ( 泛素连接酶) ：e 3 主要功能为识别底物，使之泛素化，从而被降解。目前植物中已鉴定 的e 3 有5 类( 图卜3 ，m o o ne ta 1 ，2 0 0 4 ) ，h e c t ( h o m o l o g o u st oe 6 - a p c t e r m i n u s ) 、r i n g ( r e a l i n t e r e s t i n gn e wg e n e ) u b o x 、a p c ( a n a p h a s ep r o m o t i n gc o m p l e x ，后期启动复合体) 、s c f ( s k p l c u l l i no rc d c 5 3 f b o xp r o t e i n ) 复合体( d e s h a i e s ，1 9 9 9 ：h e r s h k oa n dc i e c h a n o v e r ， 1 9 9 8 ) 和c u l 3 一b t b ( p i n t a r de ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 h e c t 和r i n 6 u b o x 为单亚基，其它三种为多亚基e 3 。h e c te 3 均含有与人类e 6 a p 分子同源 的一段约为3 5 0 个氨基酸的区域。拟南芥中的7 个h e c te 3 的分子量为9 6 - - 4 0 5 k d 不等。它们用 唯一的半胱氨酸位点与泛素形成硫羟酸酯键，而后作为泛素的提供者在连接中起作用。 r i n g u b o xe 3 是一类具有r i n g 或u b o x 区域的蛋白。在拟南芥中已分离到很多这样的蛋白，如 s i n a t 5 通过指导n a c i 的降解，参与侧根的形成( x i ee ta l ，2 0 0 2 ) ：a r c i ，参与孢子体自交 不亲和( s t o n ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。e 2 结合到r i n g 或u - b o x 位点后使泛素化由e 2 转移到底物上。 在这一类蛋白中还存在其它的结构，例如w 和w d 4 0 ，它们可能在识别特异底物中起着重要的作 用( k o p i t oe ta 1 ，2 0 0 0 ；y a he ta l ，2 0 0 3 ) 。 a p c 也是一种普遍存在的e 3 ，它们一般至少含有1 1 个亚基。在拟南芥中各个亚基已经被分 离出来( c a p r o ne ta l ，2 0 0 3 ) ，a p e 的大部分亚基是由同一个基因编码。通过实验分离到a p c 的两个识别亚基c d c 2 0 f i z z y 和c o h l f i z z y r e l a t e d 。在酵母和动物中，这些因子利用w d 4 0 位 点识别含有d - b o x ( c d c 2 0 ) 或k e n - b o x ( c d h l ) 降解信号的底物。在酵母中只有一个c d c 2 0 和c d h l 亚基，而在拟南芥中分离到了c d c 2 0 和c d h l 家族，暗示着在植物中的a p c 可能识别更多的底物 ( c e b o l l ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 s c f 复合体由四个亚基组成，包括s k p l 、c d c 5 3 ( 或c u l l i n ) 、f - b o x 蛋白和r b x ( 或r o c i 和 b r t i ) 。在s c f 复合体中，s k p l 结合在c d c 4 的f b o x 结构域，并与c d c 5 3 的n 端相互作用( p a t t o n e fa l 。1 9 9 8 ) 。同时c d c 5 3 中部的一个保守区域将e 3 复合体- s c f 与e 2 分子的c d c 3 4 联系起来。 最终一个r i n g 指蛋白r b x l 分别独立的与c d c 4 和c d c 5 3 作用，稳定了e 2 e 3 复合体。与a p e 相比，s c f 复合体是一个组成型的活跃e 3 分子，并且只有磷酸化的底物才被识别并被泛素化。因 此s c f 家族将蛋白质的磷酸化网络系统与蛋白水解的过程紧密联系起来。c u l 3 一b f b 复合体与s c f 相似也是以c u l l i n 蛋白作为骨架，但s k p 和f - b o x 蛋白被单一的b t b ( b r o a d c o m p l e x ，t r a m t r a c k ， b r i c - a - b r a c ) 蛋白代替。目前已知的植物中的b t b 蛋白e t 0 1 在乙烯合成过程中起作用( w a n ge t a 1 2 0 0 4 ) 。 2 2 6 s 蛋白小体 2 6 s 蛋白小体的分子量约为2 m d a ，是一种a t p 依赖的蛋白复合体，降解被泛素化的蛋白底物。 人们对2 6 s 了解最初来源于酵母和动物，植物中的2 6 s 蛋白小体的结构与酵母和动物中的相同。 3 中国农业大学博士学位论文引言 但是植物中的2 6 s 蛋白小体的亚型多于动物和酵母( f ue ta 1 ，1 9 9 8 ：f ue ta 1 ，1 9 9 9 ；s e r i n o ga n do e n gx w ，2 0 0 3 ；z h a oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 2 6 s 蛋白小体由两个亚复合体组成，这两个亚复合体主要含3 1 个亚基。其中一个为2 0 s 核心 蛋白酶( c o r ep r o t e a s ec p ) ，另外一个是1 9 s 调节亚基( r e g u l a t o r yp a r t i c l er p ) 。c p 是一个 广光谱的a t p 一和u b 一依赖的的蛋白酶。2 6 s 蛋白小体呈柱状结构，由4 个7 聚指环结构组成。7 个相关的a 基组成位于边上的7 聚指环。七个相关的b 亚基组成两个中心指环结构。像动物和 酵母中的c p 一样，植物中的c p 活性位点对2 6 s 蛋白酶抑制剂m g l l 5 ，m g l 3 2 ， s i n g l es u b u n i t h e c tr i n g _ ，i j b o x m u l t is u b u n i t ： = u b i q u i t i l l a p cc u l 3 b t bs c f 图1 - 3 植物中的e 3 结构示意图( 引自m o o ne ta 1 ，2 0 0 4 ) l a c t a c y s t i n 和e p o x o m y c i n 敏感( y a n ge ta 1 ，1 9 9 9 ) 。每一个a 一亚基的指环结构都形成 一个小的通道，所以只有没有折叠的蛋白才可以进入该通道。r p 与c p 的一个或两个末端链接， 决定了2 6 s 蛋白小体的a t p 依赖性和l y s 4 8 连接的聚合泛素链与底物连接的特异性。c p 由1 7 个 核心亚基组成，并可以进一步分为帽子和基部两个亚复合体。基部单位位于a 一指环通道的上方， 包含由6 个从a h t p a s e 组成的环状结构和3 个非a t p a s e 亚基。帽子结构由非a t p a s e 亚基组成 ( f ue ta 1 ，2 0 0 1 ：g 1 i c k a a ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。r p 协助识别和解折叠底物，而后把连接在底物上 的泛素解离掉，打开a 一指环通道把解折叠的多肽转入该通道后被降解。目前为止，只有部分r p 亚基的功能已经清楚。例如，r p t 指环与c pa 一指环结合，然后用a t p 的水解功能实现通道的开 放和蛋白的解折叠( h a r t m a n n - p e t r s e ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 。r p n l1 在降解底物的时候协助解离泛素 4 中国农业_ 夫学博士学位论文引言 ( v e r m ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 。r n p l 可以结合u b l 区域把底物转运给2 6 s 蛋白小体( e 1 s a s s e re t a 1 ，2 0 0 2 ) 等。其它一些r p 亚基可能起着特异的功能，例如招募特异的e 3 s ，或运送被泛素化的 蛋白到2 6 s 蛋白小体等。除了c p 与r p 外在2 6 s 蛋白小体的外部还松散的结合着许多其它的蛋自， 暗示着2 6 s 可能是一个由c p ，r p 稳定核心组成的大的复合体( l e g g t te ta 1 ，2 0 0 2 ；v e r m ae t a 1 2 0 0 0 ) 。 泛素2 6 s 蛋白小体降解途径在蛋白更新过程中起着重要的作用。在细胞的生命周期中，它 负责清除编码错误的蛋白、变性的蛋白、被射线破坏的蛋白，错误加工的蛋白及疾病蛋白( h e r s h k o a n dc i e c h a n o v e r ，1 9 9 8 ) 。同时还可以清除应急用的寿命很短的调节蛋白( v i e r s t r ar d ，2 0 0 3 ) 。 泛素2 6 s 蛋白小体降解途径在多方面控制着生命的动态平衡与发育( s m a l l ea n dv i e r s t r a 2 0 0 4 ) 。 二、植物中f b o x 蛋白的研究进展 全序列分析表明，酵母中共有1 1 个f - b o x 蛋白，线虫中推测有3 2 6 个，果蝇中有2 2 个，人 类至少有3 8 个。拟南芥测序完成后，序列分析表明，拟南芥中存在更多的卜b o x 蛋白。g a g n ee t a 1 ( 2 0 0 2 ) 鉴定出共有6 9 4 个可能的f - b o x 基因。与此同时，k u r o d ae ta 1 ( 2 0 0 2 ) 的工作表 明拟南芥基因组共编码5 6 8 个f - b o x 蛋白。如此众多的f b o x 蛋白存在于植物中，说明f - b o x 蛋白在植物中有着更为广泛的作用。 l _ f b o x 蛋白的发现 f - b o x 最先在1 9 9 5 年被发现，k u m a r 和p a r i e t t a 比较c d c 4 ，b t r c p ，m e t 3 0 ，m d 6 和s c o n 2 的 同源性发现，所有这些蛋白都存在一个同源区域。当时，这个同源区域的作用并没有受到足够重 视。1 9 9 6 年，b a i 等的工作揭示这个同源区域是一个广泛存在的结构，它在白一蛋白相互作用中 是必需的。由于c y c l i nf 中存在这样的结构域，所以b a i 等将其命名为f - b o x 。 2 f b o x 蛋白的结构和分类 f - b o x 蛋白一般由两部分组成，f - b o x 结构域一般位于n 端，与s c f 复合体中s k p l 结合从 而和复合体中的其它几个组分连在一起。c 端一般存在一些蛋白相互作用结构域，用于底物的特 异性识别。 f - b o x 结构域大约由4 0 5 0 个氨基酸组成，有几个位置的氨基酸残基比较保守：位置8 ( 多 为亮氨酸或甲硫氨酸) ，位置9 ( 脯氨酸) ，位置1 6 ( 异亮氨酸或缬氨酸) ，位置2 0 ( 亮氨酸或 甲硫氨酸) ，位置3 2 ( 丝氨酸或半胱氨酸) 。缺少严格的保守序列使我们很难用肉眼鉴定f - b o x 结构，目前广泛用来鉴定这一结构的数据库是p r o s i t e 和p f a md a t a b a s e g a g n ee ta 1 ( 2 0 0 2 ) s 中国农业大学博士学位论文引言 根据他们所鉴定的6 9 4 个拟南芥f - b o x 蛋白的f - b o x 区域的进化关系将这些f - b o x 蛋白分为5 大 类( a ，b ，c ，d 和e ) 2 0 亚类。 f - b o x 蛋白c 端含有多种蛋白相互作用结构域，例如l r r ( 1 e u c i n e r i c h r e p e a t ) ，w w ( t r p t r p ) ，t p r ( t e t r a t r i c o p e p t i d e ) ，k e l c h 重复或w d 4 0 重复( b e t a t r a n s d u c i n r e l a t e d ) 。k u r o d ae ta 1 ( 2 0 0 2 ) 根据c 端结构域的不同，将拟南芥的f b o x 蛋白分为1 9 类。 此外，他们还发现了3 个新的保守结构域，可能也参与蛋白相互作用。他们所发现的现有f - b o xc 端蛋白相互作用结构域如图卜5 。 图1 5 拟南芥f - b o x 蛋白的二级结构。( 引自k u r o d ae ta 1 。2 0 0 2 ) 6 中国农业大学博士学位论文引言 缩写：k e l c h ，k e l c hr e p e a t s ；l r r s 1 e u c i n e r i c hr e p e a t s ；a r n i ，a r m a d i l l or c p e a t s ；w d 4 0 ，w d 4 0 r e p e a t s ；a e f i a ，a c f i nf a m i l y ；h s eh e a ts h o c kf a c t o r ；m y b ，m y b 4 i k ed n a b i n d i n gd o m a i n ； z f - m y n d ，m y n dz i n cf i n g e r ；h l h ，h e l i x l o o p h e l i xd n a - b i n d i n gd o m a i n ；r i n g ，r i n gf i n g e r ； s n f 2 一n ，s n f 2a n do t h e rn - t e r m i n a ld o m a i n s ；h e l i c c ，h e l i c a s es u p e r f a m i l yc - t e r m i n a ld o m a i n ； p p r ，p e n t a t r l c o p e p t i d er e p e a t ；t u b ，t u bf a m i l y ；r v t ，r e v e r s et r a n s c r i p t a s e ；s e u ，s e l l l i k e r e p e a t s ；c r f a , c o n s e r v e dr e g i o no f f b o xp r o t e i n c r f b ，c o n s e r v e dr e g i o o f f - b o x 3 植物f b o x 蛋白的功畿 虽然植物中有大量f - b o x 基因，模式植物拟南芥中至少有6 0 0 多个，但迄今为止得到功能鉴 定的只有1 5 个，它们分别在多种途径中起着至关重要的作用。下面分别加以详述。 3 1 在植物生长发育过程中的作用 31 1 自交不亲和性 自交不亲和性( s e l f i n c o m p a t i b i l i t y ，s i ) 是高等植物在长期进化过程中形成的抑制自交 的机制。绝大多数植物的自交不亲和性受控于单一遗传位点( 称为s - l o c u s ) 。根据花粉不亲和 表型的遗传控制方式的不同，这类自交不亲和又可分为两类：孢子体型( s p o r o p h y t i c s e l f i n c o m p a t i b i l i t y ，s s i ) 和配子体型( g a m e t o p h y t i cs e l f i n c o m p a t i b i l i t y ，g s i ) ( d e n e t t a n c o u r t ，2 0 0 1 ) 。在茄科、玄参科和蔷薇科植物中的g s i 中，s - r n a s e s 控制花柱的自交不亲 和性，但是控制花粉自交不亲和性的基因却一直都没有找到。l a ie ta 1 ( 2 0 0 2 ) 在金鱼草s 位 点中找到一个f b o x 基囚，这个基因被称作a h s l 卢西，位于s ：r n a s e 基因下游9 k b p ，花粉特异 表达，具有花粉s 基因的基本特性。随后，类似的花粉特异的s 位点f - b o x 基因相继在许多蔷薇 科( u s h i j i m ae ta 1 ，2 0 0 3 ：y a m a n ee ta 1 ，2 0 0 3 ：e n t a n ie ta l ，2 0 0 3 ) 和茄科( w a n ge tu 1 ， 2 0 0 3a n d2 0 0 4 ：s i j a c i ce ta 1 ，2 0 0 4 ：q i a oe ta 1 ，2 0 0 4 a ) 植物中被发现。近来，s i j a c i c e ta 1 ( 2 0 0 4 ) 通过转化实验证实矮牵牛( p e t u n i ai n f l a t a ) p i s l f s z 蛋白控制花粉部分的白 交不亲和性。o i a oe ta l ( 2 0 0 4 a ) 也证明金鱼草a h s l f - s 。蛋白是s 核酸酶介导的自交不亲和 反应中花粉部分的决定因子。另外，q i a oe ta 1 ( 2 0 0 4 b ) 还发现a h s l f s 2 同s - r n a s e s 相互 作用，在亲和授粉中，a h s l f - s 2 可以与s - r n a s e 作用，并且可能通过s c fa h s l f - - s 2 复合体降解 s r n a s e 。 3 1 2 花的发育 在花分生组织中，各种调节子的时空分布表明，开花部分是受转录后的调节机制控制的。拟 南芥的u f o ( u n u s u a lf l o r a lo r g a n s ) 及其金鱼草同源基因f i m ( f i 尬r i a t a ) 的发现证明了这一点。 它们都是f - b o x 蛋白，对控制花瓣和雄蕊发育的b 一类基因的功能非常重要( s a m a c h e ta l ， 1 9 9 9 ；z h a oe ta 1 2 0 0 1 ) 。u f o 和r i m 突变体的表型提示，相应的s c fe 3 可能降解b 一功 7 能基因的抑制子，例如，金鱼草的c h o 、d e s p 和拟南芥中的同源基因( w i l k i n s o ne t a l ，2 0 0 0 ) 。 3 1 3 衰老 因为在衰老的过程中涉及到很多蛋白的循环，尤其在植物的叶片中，所以人们推测泛素2 6 s 蛋自小体可能参与了这一过程。最近通过对衰老突变体的研究发现，一种含l r r 的f - b o x 蛋白o r e 9 在衰老中起重要作用。它可以与a s k l 相互作用，推测其可能通过形成s c f ”复合体起作用( w o o p fa 1 ，2 0 0 1 ) 。植物的衰老与动物中的细胞程序性死亡( p c d ) 很相似。在果蝇中，泛素2 6 s 蛋 白小体通过降解d i a p l 参与p c d ，在植物中通过分析衰老延缓突变体发现泛素2 6 s 蛋白小体在植 物衰老过程中的作用与其在动物p c d 相似。泛素2 6 s 蛋白小体可能也参与了植物的p c d ( k i me t a 1 ，2 0 0 3 ) ，例如在植物细胞成熟阶段，泛素2 6 s 蛋白小体水解某些特定的蛋白，使其失去活性 从而形成死的水传导组织一管胞( w o f f e n d e ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 3 1 4 表皮毛的形态建成 在表皮细胞发育的过程中，需要很多抑制因子和激活因子协调作用来启动表皮毛的形态建 成。撮近的研究发现在拟南芥中h e c t - e 3u p l 3 参与表皮毛侧枝的形成和核内d n a 复制( d o m e se t a 1 ，2 0 0 3 ) 。u p l 3 功能丧失后可以增加表皮毛的侧枝数量和核d n a 含量。由这个表型推测，u p l 3 的靶蛋白可能是侧枝形成与核d n a 复制的激活因子。 3 2 在激素应答中的作用 3 2 1 生长素( a u x i n ) 泛素2 6 s 蛋白小体降解途径参与激素应答反应是在生长素应答反应途经中首次被发现的。 a u x i 从是生长素早期应答反应基因是一类大的基因家族，编码核蛋白，主要是做为转录因子 介导了生长素的特异反应。很多a u x i 从蛋白的半衰期很短( 6 - s m i n ) ，其迅速降解对于生长素 反应是十分重要的。研究发现，a u x i 从蛋白是s c g “1 酏的底物，s c v ”1 调控了其迅速降解的过 程。在s c f ”“功能丧失突变体中，a u x i a a 家族蛋白半寿期延长，抑制了生长素反应( g r a ye ta 上 2 0 0 1 ) 。t i r l 蛋白作为生长素受体首次被发现( s t e f a ne ta 1 ，2 0 0 5 ：n i h a le ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 3 2 2 赤霉素( g i b b m l l i ng a ) 与生长素反应相似，在赤霉素信号反应的早期也存在一个减小核定位抑制子活性的过程。核 蛋白d e l l a 是植物中一类高度保守的赤霉素信号抑制子。在拟南芥和水稻中，当用2 6 s 蛋白小体抑 制剂m g l 3 2 处理后，d e l l a 转录因子的丰度升高。最近，通过筛选g a 不敏感突变体在拟南芥和水稻 中分离到与g a 信号途径相关的f b o x 蛋i 刍s l y l ( 拟南芥) 和g i d 2 ( 水稻) 。与它们相关的s c fe 3 s 启动d e l l a ，r g a ( r e p r e s s o ro f g a l 3 ) 和s l r l ( s l e n d e rr i c e l ) 的降解( m c g i n n i se ta 1 ，2 0 0 3 ： s a s a k ie ta l 2 0 0 3 ) 。在水稻中，s l r i 被g a 激活的蛋白激酶磷酸化，被磷酸化的s l r l 被s c # ”2 识别后降解( s a s a k ie ta l ，2 0 0 3 ) 。拟南芥中，s l y i 则通过d e l l a 蛋白c 端的g r a s