（植物学专业论文）茶树植物和可可茶的遗传多样性研究.pdf

中山大学硕士学位论文 茶树植物和可可茶的遗传多样性研究 摘要 茶( 小叶茶) ( c a m e l l i as i n e n s i s ( l ) 0 k u n t z e ) 、普洱茶( 大叶茶) ( c a s s a m i c a ( m a s t ) c h a n g ) 及可可茶( c a m e l l i a p t i l o p h y l l ac h a n g ) 隶属山茶科山 茶属茶亚属茶组植物。传统饮用茶都来自普洱茶和茶，其嘌呤碱以咖啡碱为主， 并含微量的可可碱和茶碱。可可茶是1 9 8 1 年由张宏达教授发现的中国特有的茶 树资源，它的形态特征与茶和普洱茶接近，但其芽、叶的主要嘌呤碱不是咖啡碱 而是可可碱。为了探讨栽培茶树及可可茶的遗传多样性，本研究采用简单重复 间序列( i s s r ) 分子标记，对茶6 个群体品种、普洱茶4 个群体品种及可可 茶5 个种群共2 7 7 个个体进行了研究，探讨它们遗传变异和遗传分化的分子 数据，并比较它们之间的亲缘关系，为野生茶树的利用、茶树杂交育种、品 种鉴别、系统进化及起源演化的研究提供分子生物学依据。 从5 0 条i s s r 引物中筛选出9 条用于普洱茶4 个品种共7 1 个个体、茶6 个 品种共1 0 9 个个体及可可茶共9 7 个个体的i s s r p c r 扩增，共检测出1 9 4 个位 点，三个种各有一条特有带。在物种水平( s p e c i e sl e v e l ) 上，普洱茶、茶和可可 茶的多态位点百分率( p ) 分别为9 8 4 5 、9 6 8 9 和9 6 3 7 ，期望杂合度( h e ) 分别为0 3 3 9 3 、o 3 5 6 1 和0 3 4 0 7 ，香农信息指数( i ) 分别为0 5 0 7 6 、o 5 2 8 7 和 0 5 0 7 1 ：在种群水平( p o p u l a t i o nl e v e l ) 上，三个种的平均多态位点百分率( p ) 分别为8 0 9 6 、8 0 3 3 和8 1 4 5 ，平均期望杂合度( h e ) 分别为0 2 8 3 5 、0 2 8 2 5 和o 2 9 1 7 ，平均香农信息指数( i ) 分别为0 4 2 3 3 、0 4 2 1 0 和0 4 3 4 2 。表明这三 个种都具有较高的遗传多样性，这与茶树植物自交不亲和的异花授粉、木本、多 年生等生物学特性相符。 分子方差分析( a m o v a ) 和遗传分化系数g s t 分析均表明，大部分遗传变 异存在于种群内。这与h a m r i c k 总结的“以异交为主的木本植物其遗传变异大部 分存在于种群内”相符。 分子遗传距离的u p g m a 聚类表明，以广东毛蕊茶( c a m e l l i am “l m n ah a n d - m a z z ) 、香港毛蕊茶( c a m e l l i aa s s i m i l i sc h a m p e xb e n t h ) 为外类群，所有的 茶组植物聚在一起，表明茶组植物、毛蕊茶组植物均是自然类群。茶属凤凰水仙 ( f h ) 与可可茶相聚为一支，其余9 个茶树品种相互聚为一支。表明可可茶与 巾山大学硕+ 学位论文 茶树植物和可可茶的遗传多样性研究 凤凰水仙( f h ) 似有亲缘关系，推测引起可可茶种群分化的原因可能是基因突 变和与近缘种杂交的结果。i s s r 分析结果表明可可茶是一个独特的种。 普洱茶与茶在聚类图上之间没有分别独立聚为一支，与传统上形态分类有所 不同；同时将全部1 0 个品种的1 8 0 个个体进行聚类分析，结果表明个体间亦明 显存在差异，这些情况表明可能与群体品种的来源有关。茶树及可可茶遗传多样 性为茶树育种、品种创新提供了现实的可能性。研究中得到的分子遗传数据支持 茶树起源于我国的观点。 关键词：c a m e l l i as i n e n s i s ；c a m e l l i aa s s a m i c ac a m e l l i a p t i l o p h y l l a ；种群；遗 传多样性；i s s r ；亲缘关系；茶树种质资源 巾斑大警疆士学位论文茶争孽菝秘黎珥帮荣鹈遮棱多棒犍研究 a b s 譬r a c 室 c a m e l l i a s i n e n s i s ( l ) 0 k u n t z e ，ca s s a m i c a ( m a s t ) c h a n g a n dc p t i l o p h y l l ac h a n ga r es p e c i e s o fc a m e l l i a s e c t 。t h e a 稿0d y e r t e a i sf r o m c u l t i v a t e dt e at r e e so fc a s s a m i c aa n dos i n e n s i s ，b o t ho fw h o s e p r e d o m i n a n tp u r i n e a r ec a f f e i n en o r m a l l y cp t i l o p h y l l ad i s c o v e r e db yp r o f e s s o rc h a n g h u n g - t ai n1 9 8 1 i s p e c u l i a ra n do n l yd i s t r i b u t e d i n c h i n a a l t h o u g hop t i l o p h y l l a i sc l o s et o a s s a m i c aa n d s i n e n s i si nt h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c , i t sp r e d o m i n a n tp u r i n e i st h e o b r o m i n co t h e rt h a nc a f f e i n e 。t oi n v e s t i g a t et h eg e n e t i cd i v e r s i t ya m o n go a s s a m i c a 。os i n e n s i sa n do p t i l o p h y l l a , i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ( t s s g ) w a s c a r r i e d t h a tt h em o l e c u l a ri n f o r m a t i o nm a yb eu s e df o rc o n s e r v a t i o na n du t i l i z a t i o n o fw i l dt e a ，b r e e d i n g ，c u l t i v a r si d e n t i f i c a t i o n ，a n de x p l o r e t i o no f o r i g i na n de v o l u t i o n o ft e at r e e s 2 7 7i n d i v i d u a l sw e r e c o l l e c t e d ，i n c l u d i n g 7 1o f 4e u l t i v a r so fo a s s a m i c a ，1 0 9o f 6c u l t i v a r so fcs i n e n s i s 。a n d9 7o f5p o p u l a t i o n so fe p t i l o p h y l l a 。a m o n g5 0 p r i m e r ss c r e e n e d ，a t o t a ln u m b e ro f1 9 4 a m p l i f i e dd n af r a g m e n t s w e r ep r o d u c e d b y 9e l e c t e da n do n ee s p e c i a l 耗砖w a so w n e db ye a c hs p e c i e s a ts p e c i e sl e v e l 。t h e p e r c e n t a g eo fp o l y m o r p h i cl o c i 羚o f a s s a m i c a ，cs i n e n s i sa n dgp a t o p h y l u w a s 9 8 4 5 ，9 6 8 9 a n d9 6 3 7 ，r e s p e c t i v e l y , t h ee x p e c t e dh e t e r o z y g o s i t y ( h e ) w a s 0 3 3 9 3 ，趣3 5 6 1a n d 0 3 4 0 7 ，r e s p e c t i v e l y , a n dt h es h a n n o n r s i n f o r m a t i o ni n d e x 国w a s 0 5 0 7 6 ，0 5 2 8 7a n d0 ，5 0 7 1 ，r e s p e c t i v e l y m e a n w h i l e ，a tp o p u l a t i o nl e v e l ，t h em e a n so f t h ea b o v et h r e ei n d e x e so ft h et h r e es p e c i e sw e i e8 e 9 6 。8 0 3 3 嚣sw e l la s8 1 。4 5 ，0 。勰3 5 ，0 + 2 8 2 5 a sw e l la s 0 。2 9 l t a n do 4 2 3 3 ，0 4 2 1 0 鹅w e l la s 0 。4 3 4 芝 r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h et h r e es p e c 耙sh a v eh i g h l yg e n e t i cd i v e r s i t y b a s e do nt h e i rh a b i t so f l o n g - l i v e d ，w o o d y ，a n do u t c r o s s i n g ， i tw a sr e v e a l e db ym r a l y s i so fm o l e c u l a r v a r i a n c e ( a m o v a ) a n d g s tv a l u e st h a t m o s tv a r i a t i o nw a sw i t h i np o p u l a t i o n s ，i ti sc o n s i s t e n tw i t hh a m r i c k so p i n i o nt h a t m o s tv a r i a t i o ni se x h i b i t e dw i t h i n p o p u l a t i o n t ow o o d ya n dh e t e r o g e n o u sc r o s s e d p l a n t s f 1 山大学硕十学位论文 茶树植物和可可茶的遗传多样性研究 u n w e i g h t e dp a i r g r o u pm e t h o du s i n ga r i t h m e t i ca v e r a g e ( u p g m a ) a n a l y s i so f g e n e t i cd i s t a n c e sw a s u s e dt og e n e r a t ead c n d r o g r a m ，i n c l u d i n gt w oc l u s t e r s o n ew a s a l lt h ep o p u l a t i o n so f s e c t t h e a ，a n o t h e rw a st h eo u t g r o u pp o p u l a t i o n so fcm e l l i a n a h a n d 一m a z 2a n dc a m e l l i aa s s i m i l i sc h a m p e x b e n t h f h ( f e n g h u a n gs h u i x i a n ) w a s c o a l e s c e n tw i t h5p o p u l a t i o n so fc p t i l o p h y l l aa so n ec l u s t e r , a n do t h e r9p o p u l a t i o n s o fcs i n e n s i sa n dca s s a m i c aw e r ea s s e m b l e dt oa n o t h e rc l u s t e lt h er e s u l t so ft h i s s t u d ys h o w e dt h a tcp t i l o p h y l l aw a sau n i q u es p e c i e s ca s s a m i c aa n dcs i n e n s i s d i dn o tf a l li n t ot w od i s t i n c t c l u s t e r s ，w h i c hw a sv e r yd i f f e r e n tt ot h et r a d i t i o n a l c l a s s i f i c a t i o n i na d d i t i o n a l lt h ei n d i v i d u a l so fca s s a m i c aa n dcs i n e n s i sw e r e a n a l y z e db yi s s ra n dd i f f e r e n c ew a se v i d e n ta m o n gt h ei n d i v i d u a l s t h eg e n e t i c d i v c r s r y o ft e at r e e sw o u l dh a v e l a r g e s tp o s s i b i l i t y t o b r e e d i n g a n dc u l t i v a r s i n n o v a t i o no ft e a t r e e s m e a n w h i l e ，t h er a n g eo fg e n e t i cd i s t a n c e so ft h e 1 8 0 i n d i v i d u a l so fcs i n e n s i sa n dca s s a m i c aw e r ef r o m0 0 6 3 9t o0 7 1 4 w h i c h s u p p o r t e dt h a tt e ai so r i g i n a t e df r o m c h i n aa tt h em o l e c u l a rl e v e l k e y w o r d s ：c a m e l l i a s i n e n s i s ，c a s s a m i c a ，c p t i l o p h y l l a ，p o p u l a t i o n ，g e n e t i c d i v e r s i t y , i s s r ，r e l a t i o n s h i p ，g e r m p l a s mr e s o u r c eo f t e at r e e s 中山大学硕士学位论文 茶树植物和可可茶的遗传多样性研究 第一章引言 1 1 茶组植物及其遗传多样性研究进展 1 1 1 茶组植物分类、演化与分布 茶树是一种重要的经济作物，狭义的茶树仅指广泛栽培的茶c a m e l l i a s i n e n s i s ( l ) 0 k u n t z e 和普洱茶ca s s a m i c a ( m a s t ) c h a n g ，而广义的茶树包 括山茶属茶组植物共3 2 种3 变种。 茶组植物属于山茶科t h e a c e a e 、山茶属g e n u sc a m e l l i al i n n ，为常绿乔 术或灌木；花1 3 朵腋生，白色，中等大小或较小，有花柄；苞片2 或较多， 生于花柄基部，早落；萼片5 6 枚宿存：花瓣6 1 1 枚，近离生：雄蕊多数， 2 3 轮，外轮近离生；子房3 5 室，有或无茸毛，花柱3 5 浅裂或深裂， 下半部连生；蒴果有中轴( 中国植物志，1 9 9 8 ) 。茶组植物是山茶属的特殊类 群，这一分类单位及其范畴，从1 8 世纪以来经过一系列的演变。1 7 5 3 年林 奈( c l i n n a e u s ) 以t h e as i n e n s i sl 为模式建立了茶属g e n u st h e al 。1 8 7 4 年w d y e r 将茶属合并到山茶属下作为一个组茶组s e c t t h e a ( l ) d y e r 。 1 9 5 8 年s e a l y 在其专著山茶属的修订中记载该组有5 种1 变种。1 9 8 1 年 浙江农业大学庄晚芳等( 1 9 8 1 ) 提出栽培茶树的变种分类方法，他们将茶树 分成2 亚种7 个变种。随着茶组新种的陆续发现，1 9 8 1 年中山大学张宏达( 张 宏达，1 9 8 1 a ；张宏达，1 9 8 1 b ) 将茶组植物1 7 种3 变种分成五室茶系s e r q u i n q u e l o c u l a r i sc h a n g 、五柱茶系s e t p e n t a s t y a ec h a n g 、秃房茶系s e r g y m n o g y n a ec h a n g 和茶系s e r s i n e n s e sc h a n g 等4 个系，1 9 8 4 年他根据云南 等地资源考察中发现的大量材料，在原来的系统框架内，茶组植物已达3 2 种3 变种( 张宏达，1 9 8 4 ) ，1 9 9 0 年又发表5 种茶组植物( 张宏达，1 9 9 0 ) 。 1 9 9 2 年中国科学院昆明植物研究所闵天禄( 1 9 9 2 ) 在张先生系统基础上将茶 组和秃茶组s e c t g 肠b e r r i m ac h a n g 共4 7 种和3 变种进行归并，认为茶组植 物仅有1 2 种和6 变种。现在中国植物志中茶组植物为3 2 种( 中国植物志， 中山大学硕士学位论文 茶树植物和可可茶的遗传多样陛研究 1 9 9 8 ) 。 茶组植物的系统演化表现在心皮或子房室的数目、子房是否被毛、花冠 大小及树型、枝叶等特征，弗以此为演化线索和种类划分依据( 陈亮等，2 0 0 0 ) 。 茶组植物花在花梗处己分化出小苞片和萼片。茶组植物内部的演化趋向表型 为花梗由短至长，花由大而小，花瓣由多数到较少，5 7 枚，子房由5 室到3 室，由秃净到被毛，果由大至小，果皮由厚到薄( 张宏达等，1 9 8 8 ) 。陈亮等 ( 2 0 0 0 ) 在茶组植物分类与演化的讨论中提出了原始茶距属植物的2 条演化 线路：子房5 室的原始茶亚属植物一子房5 室、无茸毛的大厂茶一子房3 室、无茸毛的秃房茶；予房5 室的原始茶亚属植物一子房5 室、具茸毛的 厚轴茶、大理茶一花小子房3 室、多茸毛的普洱茶、白毛茶和茶。 茶组植物为山茶属茶亚属的代表组，共有3 2 种，除2 种扩散到越南和缅 甸外，其余均产我国，主要分布于我国南部和西南部。子房5 室的茶全部分 布于中国。茶组以云南和广西为分布中心，其中云南共有2 2 种，广西有1 1 种，约8 5 的种类都集中于此分布中心，并由此向四周扩散到川黔粤等地， 个别适应性强的还向东北扩散到湘闽皖等地( 石祥刚，2 0 0 3 ) 。在茶组植物中， 只有普洱茶ca s s a m i c a 及茶cs i n e n s 括作为茶叶，并久经栽培。 1 1 - 2 茶组植物遗传多样性研究进展 生物多样性包括了遗传多样性、生态环境多样性和物种多样性，其中遗 传多样性是生物多样性的基础和核心( 王中仁，1 9 9 6 ) 。 通常遗传变异最直接的表达形式就是遗传变异水平的高低。然而，对任 何一个物种来说，个体的生命很短暂，而由个体组成的种群或种群系统( 亚 种、种) 才在时间上连绵不断，才是进化的基本单位。这些种群或种群系统 在自然界有其特定的分布格式，故遗传多样性不仅包括遗传变异的高低，也 包括遗传变异的分布格式，即种群的遗传结构( g e n e t i cs t r u c t u r e ) ( h a m r i c k ， 1 9 8 7 ) 。一个物种的遗传变异愈丰富，对环境变化的适应性就愈大。反之，遗 传多样性贫乏的物种通常在进化上的适应性就弱，也就是说，群体内的遗传 变异反映了物种的进化潜力。 2 中山大学硕士学位论文 茶树植物和可可茶的遗传多样性研究 从进化的角度看，个体必须组成种群或种群系统( 地理宗、生态型、变 种、亚种等) 才具有进化意义，遗传上有差别的个体再组成种群或种群系统 时形成各种各样的群体遗传结构( h a m r i c k ，1 9 8 9 ) ，产生新的遗传多样性。 高度的遗传多样性是维持物种长期生存的基础和发展的前提，这是因为由单 一纯合个体组成的群体对环境不断变化的压力不能有效地适应。物种的遗传 多样性是探讨其适应性、生存力的基础，也是分析濒危物种致濒机理的基础， 从而帮助制定科学有效的保护策略和措施。对遗传多样性的研究具有重要的 理论价值和实际意义，有助于进一步探讨生物进化的历史和适应能力，有助 于推动保护生物学研究，有助于生物资源的开发、保存和利用。 随着生物科学技术的进步和边缘学科的发展，遗传多样性的研究经历了 一个从简单到复杂、从宏观到微观、从表型到本质的过程。遗传多样性的研 究通常从4 个水平进行：形态学水平：细胞学一染色体水平：蛋白质水平： 分子一d n a 水平。人们对遗传多样性的检测最初是从形态学开始的。随着染 色体的发现及其结构和功能的澄清，人们又把研究的重点转向染色体上。上 世纪6 0 年代，酶电泳技术以及特异性组织化学染色法应用于群体遗传和进化 研究，使科学家们从分子水平来客观地揭示遗传多样性成为可能，并极大地 推动了该领域的发展。进入8 0 年代，分子生物学和分子克隆技术的发展带来 了一系列更为直接的检测遗传多样性的方法，即直接测定遗传物质本身 d n a 序列的变异( a v i s e ，1 9 9 4 ) 。目前，在分子水平上检测遗传多样性的方 法很多，包括等位酶( a l l o z y m e ) 分析、限制性片断长度多态性( r f l p ) 分 析、随机扩增多态d n a ( r a p d ) 分析、扩增片断长度多态性( a f l p ) 分析、 微卫星分析、简单重复区间序列( i s s r ) 分析和d n a 序列分析等。分子标 记技术的飞速发展为遗传多样性的检测和研究提供了更为丰富的手段。 虽然茶树植物和其他生物一样，都能准确地复制自己的遗传信息d n a ， 将自己的遗传信息一代代地遗传下去，保持遗传性状的相对的稳定性，但在 减数分裂发生基因重组，使后代的每一个个体都可能存在差异，从而导致茶 树的遗传多样性。 茶树是种重要的经济作物，茶叶从最初的药用发展到今天饮用，已有 5 0 0 0 余年的历史，现已成为一种全球性饮料，有关其形态解剖、分类、生理、 3 中山大学硕士学位论文 茶树植物和可可茶的遗传多样性研究 生化方面的文献极其丰富。在茶树育种实践、茶树品种以及与茶树品种相联 系的制成的各种风格的茶中，表明了茶树植物广泛的遗传多样性。但是有关 分子遗传多样性和遗传结构的研究则起步较迟。近年来，由于分子生物学技 术的快速发展，很多分子标记技术被用于茶树植物物种遗传学研究。目前， 国内外利用同工酶技术在研究茶树起源、演化、品种资源鉴定和分类、杂交 方面取得了较大的进展( 鲁成银等，1 9 9 1 ；鲁成银等，1 9 9 2 ；王仲朗等，1 9 9 2 ： 李素芳等，2 0 0 1 ；王平盛等，1 9 9 8 ；w e n d e le la ，1 9 8 2 ：w e n d e le la 1 ，1 9 8 5 ： m a g o m a e t a l ，2 0 0 3 ；m i r c h r a e t a l ，2 0 0 1 ) 。除了同工酶分子标记方面的工作， d n a 分子标记近年来也开始被大量用于茶树植物遗传多样性研究。w a c h i r ae t 口f ( 1 9 9 5 ) 用r a p d 分子标记方法对茶( cs i n e n s i s ) 、普洱茶( ca s s a m i c a ) 和尖萼茶( ca s s a m i c as s p 1 a s i o c a l y x ) 共3 8 个无性系茶树品种的遗传多态 性进行研究，得到多态性为6 2 ，并认为来自中国的茶和柬埔寨的尖萼茶类 型内的变异大于印度的普洱茶。陈亮等( 1 9 9 8 ：2 0 0 2 ) 、段红星等( 2 0 0 4 ) 、 沈程文等( 2 0 0 2 ) 、邵宛芳等( 2 0 0 3 ) 分别采用r a p d 标记对各自的茶树材 料进行了遗传多样性分析，结果显示供试引物多态性程度在7 9 3 3 1 0 0 ， 证明了中国茶树品种资源在d n a 分子水平上具有很高的遗传多样性，这表 明我国是茶树的原产地和起源中心有密切的关系。k a u n d u ne ta 1 ( 2 0 0 0 ) 研 究了来自韩国、日本和台湾共2 7 个上等茶( cs i n e n s i sv a i l s i n e n s i s ) 的多态 性，发现在种群内多样性比例( 7 1 ) 显著高于种群间多样性比例( 2 9 ) ， 这一结果与w a c h i r ae ta 1 ( 1 9 9 5 ) 和p a u l 等( 1 9 9 7 ) 用a f l p 研究印度与肯 尼亚茶( cs i n e n s i s ( l ) o k u n t z e ) 种群的变异度与遗传分化结果基本一致， 表明茶树植物具有很高的异型杂交特性。b a l a s a r a v a n a ne t a l ( 2 0 0 3 ) 用a f l p 标记方法分析南印度4 9 个茶树品种的遗传多样性，得到品种间的多样性为 3 7 7 6 ；然而，m i s h r a 和s e n m a n d i ( 2 0 0 4 ) 用a f l p 法研究大吉岭茶树品 系的遗传多样性时得到的结果与之相反，中国、阿萨姆和柬埔寨三个种质类 型之间及内部的变异程度分别为6 3 和3 6 。 微卫星分子标记技术已成功用于c a m e l l i ai a p o n i c a 的研究( u e n oe t a l ， 1 9 9 9 ) ，但是对茶组植物的研究很少。m o n d a l ( 2 0 0 2 ) 对2 5 个不同的茶( c s i n e n s i s ( l ) o k u n t z e ) 品种个体用i s s r 分子标记方法评估其遗传多样性为 4 中山大学硕士学位论文 茶树植物和可可茶的遗传多样性研究 8 4 ，也是首次将i s s r 方法应用于茶树遗传研究，同时也揭示了此方法适 合于茶树基因型的遗传变异研究。以上这些研究对茶树植物进化历史和种群 遗传结构提供了有用的分子信息和数据。 1 2 i s s r 分子标记及其在植物遗传研究中的应用 1 2 1 简单重复问序列( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，i s s r ) 分子标记技术 2 0 世纪8 0 年代中期以来，随着p c r 技术的出现，具有快速而且对d n a 需要量少的大量的分子标记技术相继出现。3 个广为应用的以p c r 为基础的 是r a p d 、s s r 和a f l p 技术。每种标记技术都有它自身的优点和不足。r a p d 技术快速、简便、经济但缺乏可重复性：a f l p 分辨力高、重复性好，但劳 动强度大，成本高，对技术要求苛刻：微卫星特异性强，多态性高，重复性 好，但需要知道重复序列两端的d n a 的序列来设计专门的引物，因而只能 局限于一些经济上重要的物种。 i s s r ( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) 又称简单重复间序列，是由 z i e t k i e w i c z ( 1 9 9 4 ) 于1 9 9 4 年根据s s r 的特点创建的一类新型的分子标记技 术。i s s r 技术是以p c r 技术为基础，利用真核生物基因组广泛存在的简单 重复序列( s s r ) 来设计引物，而无需预先克隆和测序。用于i s s r p c r 扩 增的引物通常为1 6 1 8 个碱基序列。扩增产物经聚丙烯胺凝胶或较高浓度的 琼脂糖凝胶电泳分离获得扩增指纹图，从而可以揭示样本问的遗传多样性。 i s s r 可以揭示出比r f l p 、r a p d 更高的多态性，结合了r a p d 和s s r 的优 点，具有模板需要量少，多态性丰富，无需试剂盒，结果记录方便，实验成 本低，操作简单，实验稳定性较高等优点，而且可以揭示整个基因组的一些 特征，并呈孟德尔式遗传，是非常理想的分子标记。因此，该技术现已在种 质资源鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化、系统发育、分子标 记育种等研究方面被广泛应用。 中山大学硕士学位论文 茶树植物和可可茶的遗传多样性研究 1 2 2 i s s r 技术在植物遗传研究中的应用 1 2 2 1 品种和种质资源鉴定 i s s r 技术可以比r f l p 、s s r 、r a p d 等技术更多地揭示基因组中的多 态性，是一种很好的d n a 指纹标记，因此，该技术在种质资源鉴定方面产 生出比其它方法更高的优越性，目前涉及到的植物包括草莓( a r n a ue t 口f ， 2 0 0 2 ) 、玉米( k a n t e t y e l a l ，1 9 9 5 ) 、小麦( n a g a o k a e l a ，1 9 9 7 ) 、柑橘( f a n g e t a l ，1 9 9 8 ) 、葡萄( m o r e n oe l a l ，1 9 9 8 ) 、无花果( a m e l e l a l ，2 0 0 4 ) 等。 p r e v o s te ln l ( 1 9 9 9 ) 仅用4 个1 s s r 引物就可产生大量的多态性条带，其中 两个最富信息量的引物均能将3 4 个西红柿栽培品种区分开，任意两个引物复 合使用均能鉴别所有的栽培品种。用i s s r 技术还可区分些葡萄柚栽培品 种，研究者们发现i s s r 技术是第一个区分某些葡萄柚栽培品种的标记系统 ( f a n g e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。因此，i s s r 技术是一种准确、可以产生足够的多态位 点的方法，可用于大规模d n a 指纹分析，在植物品种和种质资源鉴别中将 发挥越来越大的作用。 1 2 2 2 遗传作图和基因定位 遗传作图研究的目的是寻求足够的多态分子标记，从而将所有基因座定 位到特定染色体的特定区域，最好是在染色体步查距离内。由于i s s r 标记 可以揭示高度多态性，又遍布于染色体上，因此它是绘制遗传连锁图的理想 标记，从k o j i m a ( 1 9 9 8 ) 等首先将i s s r 标记用于一粒小麦遗传作图以来， 目前已用于鹰嘴豆( c h oe t a l ，2 0 0 2 ) 、西瓜( 易克等，2 0 0 3 ) 、欧洲草莓( c e k i c e la 1 ，2 0 0 1 ) 、柑橘( s a n k a r e ta 1 ，2 0 0 1 ) 等的遗传作图。 1 2 2 3 研究遗传多样性与亲缘关系 i s s r 技术在生物学中摄主要的应用是分析和评估种群的遗传多样性。由 6 l | i 山大学硕士学位论文 茶树植物和可可茶的遗传多样性研究 于i s s r 技术能提供较大数目的d n a 片断，可以扫描基因组内的多态位点， 因而也是一种用于分析物种、种群、不同品系、甚至是个体间遗传差异的理 想方法( z i e t k i e w i c z ，1 9 9 4 ；a r n a ue tn t ，2 0 0 2 ) 。该方法已成功用于种间和种 内水平上评估遗传多样性的植物包括水稻( j o s h i e ta 1 ，2 0 0 0 ) 、小麦( n a g a o k a e ta 1 ，1 9 9 7 ) 、粟( s a l i m a t h e l 口f ，1 9 9 5 ) 、豇豆( a j i b a d ee l a l ，2 0 0 0 ) 、马铃 薯( h u a n g e ta 1 ，2 0 0 0 ) 、车前草属( w o l f f e t 以，1 9 9 8 ) 、杨梅( 邱英雄等， 2 0 0 2 ) 、银杏( 葛永奇等，2 0 0 3 ) 、华山新麦草( 杭焱等，2 0 0 4 ) 等。h u a n g e t 口f ( 2 0 0 0 ) 根据i s s r 标记和c p d n a 限制酶图谱分析，对番薯属( i p o m a e a ) 进行了研究，发现i s s r 标记可以产生丰富的多态位点，从而揭示种间、种 内遗传变异情况，分别用这两种标记构建的番薯属系统树具有相似的拓扑结 构，但i s s r 标记的高多态性可以更好地区分种下分类群问的关系。b l a i re t a l ( 1 9 9 9 ) 发现i s s r 技术每个p c r 反应均产生足够多的多态性条带来区分5 9 个水稻变种，所有的变种平均产生7 8 o 的多态性条带。结果说明，i s s r 技 术不仅可评估水稻品系间的遗传多样性，同时能区分水稻栽培品系、亚种基 因型及检测每个亚种间的多样性水平。t s u m u r ae la l ( 1 9 9 6 ) 用i s s r 方法研 究了日本雪松( c r y p t o m e r i a j a p o n i c a ) 和花旗松( p s e u d o t s u g a m e n z i e s i i ) 之 间的亲缘关系。结果发现2 4 个i s s r 引物有8 7 1 0 0 的引物在这些物种中 为多态性引物，但物种间的多样性无差异。同时还发现，海岸边的花旗松变 种比内陆变种的杂台性高。n a g a o k ae t 以( 1 9 9 7 ) 等对比由i s s r 标记和r f l p 标记得到的小麦样品间的遗传关系，发现i s s r 的数据提供了与r f l p 标记相 似的分析结果。 1 2 2 4 分子标记育种 分子标记的应用为植物育种学开辟了崭新的研究和应用领域，它使植物 育种学家能直接从分子水平了解种间的差异，可使人们在育种筛选过程中节 省时间及大量的人力、物力。分子标记辅助育种就是分子标记在植物育种应 用中最重要的一面。通过与目标基因连锁的i s s r 标记来辅助育种在桑树 ( m o u s s p p ) ( v i j a y a ne t a l ，2 0 0 3 ) 、小麦( t r i t i c u ma e s i v u m ) 、椰子( c o c o s 7 中山大学硕士学位论文 茶树植物和可可茶的遗传多样性研究 n u c i f e r a ) 、鹰嘴豆( c i c e r a r i e t i n u m ) 等已有初步研究报道。 1 3 茶树分类及其研究概况 1 3 1 茶树分类 茶树属于山茶科植物是没有争论的，但属下分类单位包括种的界定存在 不同观点。 茶树的学名首先由瑞典植物分类学者林奈于1 7 5 3 年在他著的植物种 志中命名为t h e as i n e n s i sl ，1 7 6 2 年林奈在再版植物种志中，把茶树 再划分为武夷茶种t h e ab o h e a 和绿茶种t h e av i r i d i s 。1 8 1 8 年s w e e t 首次提出 山茶属c a m e l l i a 与茶属t h e a 两属合并为山茶属的主张。1 9 0 8 年乔治瓦特 采纳了c a m e l l i ar h e a u i l l 【作为学名，并提出了著名的4 个变种，即绿叶变种 或尖叶变种v a r v i r i d i s 、武夷变种v a r b o h e a 、直叶变种v a r s t r i c t a 和毛萼变 种v a r 1 a s i o c a l y x 。1 9 1 9 年c o h ns t u a r t 认为c a m e l l i a 与t h e a 两属亲缘接近， 主张合并使用c a m e l l i at h e i f e r a ( g r i f i t h ) d y e r 茶种学名。在种以下有4 个变种，即武夷变种v a lb o h e a 、中国大叶变种v a r m a c p o p h y l l a 、阿萨姆变 种v a r a s s a m i c a 和掸邦变种v a r s h a nf o r m 。 1 9 5 8 年英国皇家植物园的s e a l y 在山茶属的修订的专著中，茶组中 包括茶c a m e l l i as i n e n s i s ( l ) 及近缘种的滇缅茶c a m e l l i ai r r a w a d i e n s i s 、大理 茶c a m e l l i at a l i e s i s 和毛肋茶c a m e l l i ap u b i c o s t am e r r i l l 及细柄茶c a m e l l i a g r a c i l i p e sm e r r i l l 等。在茶c a m e l l i as i n e n s i s ( l ) 0 k u n t z e 下面分为两个变种： 茶变种v a r s i n e n s i s 和阿萨姆变种v a r a s s a m i c a ( m a s t ) k i t a m u r a 。 s e a l y 从当时的相关资料对茶组植物进行修订，而1 9 4 9 年后在中国大陆 植物资源调查发现了许多新种，其中在广西、云南最多。1 9 8 1 年山茶属植 物的系统研究在该属的研究上是一个里程碑，依张宏达系统山茶属分成4 个亚属，1 9 个组，组下再分系。茶( c a m e l l i as i n e n s i s ( l ) o k u n t z e ) 属于 茶哑属( s u b g e a t h e a ( l ) c h a n g ) 茶组( s e c t r h e ad y e r ) 茶系( s e r n s i n e n s i s c h a n g ) 。模式种( t y p u s ) 为cs i n e n s i s ( l ) o k u n t z e 。下有1 个原变种和3 8 中山大学硕士学位论文 茶树植物和可可茶的遗传多样性研究 个变种： 原变种茶v a t s i n e n s i s ：原产中国南部，现在热带、亚热带地区广泛栽培。 颇多变异，枝、叶及花有毛或无毛，叶片大小亦不一，通常栽培的植株远较 野生的原种为小。 普洱茶v a la s s a m i c a ：这个变种具有秃净的枝、叶和花，叶片较宽大，野 生状态为高1 4 米的乔木。据参与1 8 2 6 年英国东印度公司去阿萨姆进行茶树调 查的勃鲁士的报告，阿萨姆的茶树是当地掸族人从远东带回去栽培的。 白毛茶v a r p u b i l i m b ac h a n g ：本变种和原变种及其余变种的区别在于叶 膜质椭圆形，枝、叶及花均披毛。 长叶茶v a t w a l d e n s a e ( s y h u ) c h a n g ：本变种和正种及其他变种的区别 在于叶片倒披针形，上面多少发亮。至于花的形态并无特殊差异。 以上是茶树分类的演变和进展( 中国农业百科全书( 茶业卷) ，1 9 8 8 ) 。但 是，1 9 8 4 年张宏达教授将普洱茶从变种上升为种( ca s s a m i c a ( m a s t 1 c h a n g ) ，因为其嫩枝及叶片下面均有柔毛，顶芽被白毛，叶片干后变褐色， 而茶( c s i n e n s i s ( l ) 0 k u n t z e ) 嫩枝及叶均秃净，叶片较厚，干后灰绿色，二 者有明显的区别( 中国植物志，1 9 9 8 ) 。 我国的茶区辽阔，地跨热带、亚热带和温度，生态条件千差万别。长期 来，在复杂的自然条件影响下，茶树不断发生演化，尤其在人工栽培的情况 下，茶树经过世代繁衍和广泛的传播，经受这多种多样的环境和生产条件的 长期影响，以及人i - 到t l 化和自然杂交的作用，演变成了十分丰富的茶树资源 ( 陈宗懋等，1 9 9 2 ) 。 1 3 2 茶树品种资源研究概