（微生物学专业论文）不同剂型双歧杆菌制剂的制备技术及存活性能的研究.pdf

不同剂型双歧杆菌制剂的制备技术及存活性能的研究 两斐 为了提高双歧杆菌在生产、运输、贮存和消费过程中的活菌率，研究采用真空冷冻 干燥与微囊化技术相结合的方法制备活菌制剂。并测定了双歧杆菌培养及离心条件，优 化了冻干保护剂配方与微囊制备工艺，对几种双歧杆菌活菌制剂在模拟外界逆环境中的 耐受性以及在四种温度条件下的贮存特性进行了系统研究。主要内容和结果如下： 1 采用正交实验设计，得出制造双歧杆菌生长所需厌氧环境的试剂配方：在1 l 的 密闭容器中，次亚硫酸钠3 o g ，碳酸氢钠3 0 9 ，还原铁粉0 5 9 ，水0 4 m l ，可获得较 为良好的厌氧效果。 2 经筛选确定了双歧杆菌生长情况较好的基础培养基为t p y 液体培养基。采用单因 素和正交实验设计，得到最佳培养基配方：在t p y 液体培养基基础上，水解酪蛋白l ， 大豆蛋白0 5 ，酵母粉0 3 ，水苏糖0 2 ，乳糖o 1 ，蔗糖0 1 。测定双歧杆菌 培养过程中温度与p h 的影响，结果显示：培养温度3 7 c 、培养基初始p h6 5 的条件下， 双歧杆菌菌体浓度最高。用改良后的培养基培养双歧杆菌，并测定生长曲线及p h 变化， 得到增殖培养的最适终止时间约为2 4 h 。 3 实验确定了双歧杆菌的最适离心条件：在4 c ，转速5 0 0 0 r m i n 条件下离, 6 , 1 0 m i n ， b l r ( 乳酸双歧杆菌) 与b i y ( 婴儿双歧杆菌) 的离心得率分别为9 8 7 和9 7 2 。 4 筛选得到4 种效果较好的保护剂，通过正交实验得到复合保护剂的最佳配比： 1 0 的菊糖，6 的大豆蛋白，1 2 的海藻糖，1 0 的甘露醇的组合对b l r 起到最佳保护 效果。对于b i y 最优配方为：菊糖8 ，大豆蛋白8 ，海藻糖1 2 ，蔗糖8 。 5 实验确定了挤压法制备双歧杆菌微囊的最佳工艺。对b l r 而言，最佳制备条件是： 海藻酸钠浓度3 ，c a c l 2 浓度2 ，海藻酸钠溶液与菌悬液体积比例1 ：1 ，固定化时间 6 0 r a i n 。b i y 的微囊化最佳条件为：海藻酸钠浓度3 ，c a c l 2 浓度1 ，海藻酸钠与菌液 量比例1 ：1 ，固定化时间4 0 m i n 。在以上条件下制备加入复合保护剂的双歧杆菌冻干微 囊的菌体存活率分别为7 1 2 ( b l r ) 与7 0 3 ( b ) 。 6 乳化法制备双歧杆菌微囊的最佳工艺是：海藻酸钠浓度3 ，菌胶比1 ：2 ，乳化 时间1 0 m i n ，转速8 0 0 r m i n ，此工艺条件下，在制备双歧杆菌微胶囊时加入复合冻干保护 剂得到冻干微囊的菌体存活率为7 1 9 ( b l r ) 与7 1 7 ( b ) 。 7 以阿拉伯胶与p 环糊精为壁材，加入四种保护剂( 大豆蛋白，蔗糖，菊糖，甘油) ， 以b l r 为芯材，进行喷雾干燥，进风温度1 3 0 ，排风温度7 0 - - 8 0 。c ，塔内温度8 0 ， 物料收集温度4 0 * c 。所得微囊的回收率是5 7 8 ，相对菌体存活率为5 9 7 。 8 几种微囊化方法制备得到的双歧杆菌微胶囊，基本可在4 5 m i n 内溶解于人工肠 液中。人工胃液处理4 h 后，乳化法冻干微囊的活菌率为3 7 9 ( b l r ) 与4 0 6 ( b ) 。 经0 3 胆盐处理3 h 后，其存活率是6 8 1 ( b l r ) 与6 7 9 ( b ) 。6 的n a c l 溶液 处理1 2 h ，微囊的活菌率达到8 2 6 ( b l r ) 与8 2 1 ( b ) 。6 5 高温环境中贮存2 h 后取出测定b l r 与b i y 的冻干微囊仍有8 2 与8 1 的活菌率。各项指标检测结果均 明显高于对照。1 8 c ，4 c ，2 0 。c ，3 7 。c 四种温度下贮藏1 8 0 d 后测定活菌数，乳化法 冻干微囊于1 8 条件下保藏效果最好，活菌数可以达到2 2 7 1 0 9 c f u g ( b l r ) 和 2 1 4 x 1 0 9 c f u g ( b i y ) 。乳化法与真空冷冻干燥法相结合制备得到的双歧杆菌冻干微胶囊 具有较好的稳定性与逆环境耐受性。 关键词：双歧杆菌，微胶囊，冷冻干燥，保护剂，耐受性 t h es t u d i e so np r e p a r a t i o nt e c h n o l o g ya n dt h es u r v i v a lp r o p e r t i e so f d i f f e r e n tf o r m u l a t i o nm o d a l i t i e so fb i f i d o b a c t e r i u m a b s t r a c t a c o m b i n i n gm e t h o do fm i c r o e n c a p s u l a t i o nt e c h n o l o g yw i t hf r e e z e d r y i n gw a sa d o p t e d t oi m p r o v et h es u r v i v a lr a t eo fb i f i d o b a c t e r i u mi nt h ep r o c e s so fp r o d u c t i o n ，t r a n s p o r t a t i o n ， s t o r a g ea n dc o n s u m i n g m e a n w h i l e ，t h ec o n d i t i o no fc u l t i v a t i o na n dc e n t r i f u g a t i o n , t h e s c r e e n i n go ft h eh i g he f f i c i e n tp r o t e c t a n t s ，a n dt h ep r e p a r a t i o nt e c h n o l o g yo fm i c r o c a p s u l e s w e r es t u d i e d i na d d i t i o n ，i tw a ss t u d i e dd e t a i l e d l yo ft h ed i s t i n t e g r a t e dc h a r a c t e r i s t i co f m i c r o c a p s u l e su n d e rt h eh a r s hc o n d i t i o n sa n dt h es t o r i n gc h a r a c t e r i s t i c sw e r ea l s od i s c u s s e d s y s t e m a t i c a l l ya n dc o n c r e t e l y t h em a i nc o n t e n t sa n dr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h ea n a e r o b i cc u l t u r em e t h o do fb i f i d o b a c t e r i u mw a sd e t e r m i n e dt h r o u g ho r t h o g o n a l e x p e r i m e n t ：s o d i u mh y p o s u l f i d ew a s3 0 9 ，s o d i u mb i c a r b o n a t ew a s3 0 9 ，h y d r o g e n r e d u c e d i r o nw a s0 5 9 ，w a t e rw a s0 4 m li na 1 1a i r t i g h tc o n t a i n e ro f1 l 2 b a s em e d i u mw a sd e t e r m i n e dt ob et p ym e d i u ma f t e rh a v i n gb e e ns c r e e n e d t h e n ， t h ei n g r e d i e n ta n dd o s a g eo fm e d i u mw e r eo p t i m i z e db ys i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t a t i o na n d o r t h o g o n a ld e s i g n t h eo p t i m u mc u l t u r ew a sa sf o l l o w s ：c a s e i np e p t o n ew a s1 ，s o yp r o t e i n w a s0 5 ，y e a s te x t r a c tw a s0 3 ，s t a c h y o s ew a s0 2 ，l a c t o s ew a s0 1 ，s u c r o s ew a s0 1 ， o nt h eb a s i so ft h eb a s em e d i u m t h ee f f e c to ft h et e m p e r a t u r ea n dt h ep hv a l u eo nt h ec e l l g r o w t ho fb i f i d o b a c t e r i u mw a ss t u d i e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o nt oc u l t i v a t eb i f i d o b a c t e r i u m w a st h a tt h eb e s tt e m p e r a t u r ew a s3 7 ( 2a n dt h ei n i t i a lp ho fc u l t u r em e d i u mw a s6 5 a c c o r d i n gt ot h eg r o w t hc u r v ea n dt h ec h a n g eo fp h ，t h et e r m i n a lt i m ew a sa b o u ta t2 4h o u r s 3 t h eo p t i m u mc e n t r i f u g a t i o nc o n d i t i o nw a s5 0 0 0 r m i nf o r1 0 m i na t4 c ，a n dt h e h i g h e s tr a t e so fl i v i n gc e l l sw e r e9 8 7 f o rb l r ( b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i s ) a n d9 7 2 f o r b i v ( m f i d o b a c t e r i u mi n f a n t s ) 4 f o u rt y p e so fp r o t e c t a n t sw e r es c r e e n e do u t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep r o t e c t a n t s w e r ea sf o l l o w s ：10 s y n a n t h r i n ，6 s o y - p r o t e i n ，12 f u c o s e ，10 m a n n i t ef o rb l r ，a n d 8 s y n a n t h r i n ，8 s o yp r o t e i n ，12 f u c o s e ，8 s u c r o s ef o rb l r 5 a no p t i m a lm e t h o do fp r e p a r a t i o no fm i c r o e n c a p s u l a t e db ye x t r u s i o nt e c h n i q u ew a s s c r e e n e do u t a sf o rb l r ，t h ep r i m ed i r e c t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：s o d i u ma l g i n a t ew a s3 ， c a l c i u mc h l o r i d ew a s2 ，h a r d e n i n gt i m ew a s6 0 r a i n ，g l u e ：b a c t e r i u mw a s1 ：1 a n df o rt h e b i yt h ep r i m ec o n d i t i o nw a sa sf o l l o w s ：s o d i u ma l g i n a t ew a s3 ，c a l c i u mc h l o r i d ew a s1 ， h a r d e n i n gt i m ew a s4 0 r a i n ，g l u e ：b a c t e r i u mw a s1 ：1 t h es u r v i v a lr a t e so fb a c t e r i a sw e r e 71 2 ( b l r ) a n d7 0 3 ( b i y ) b yt h et h em o d i f i dm e t h o dw i t hp r o t e c t i v ea d d i t i v e s 1 l l 6 a no p t i m a lm e t h o do fp r e p a r a t i o no fm i c r o e n c a p s u l a t e db ye m u l s i f i c a t i o nt e c h n i q u e w a ss c r e e n e do u t t h ep r i m ed i r e c t i o n sw e r ea sf o l l o w e d ：s o d i u ma l g i n a t ew a s3 ，b a c t e r i u m ：g l u ew a s1 ：1 ，e m u l s if i c a t i o nt i m ew a s10 m i n ，s t i r r i n gs p e e dw a s8 0 0 r m i n t h es u r v i v a l r a t e so fb a c t e r i a sw e r e7 1 9 ( b l r ) a n d71 7 ( b i y ) b yt h em o d i f i dm e t h o dw i t hp r o t e c t i v e a d d i t i v e s 7 b if i d o b a c t e r i u mm i c r o c a p s u l e sw e r ep r e p a r e dt h r o u g hs p r a y - d r y i n gt e c h n i q u e a r a c i a g u ma n d1 3 - c y c l o d e x t r i nw e r ec h o s e nf o rt h ew a l l m a t e r i a l s f o u rp r o t e c t a n t s ( s o yp r o t e i n ， s u c r o s e ，s y n a n t h r i na n d # y c e r i n ) a n db l rw e r ea d o p t e da s c o r e - m a t e r i a l s i n l e ta i r t e m p e r a t u r ea n do u t l e ta i rt e m p e r a t u r ew e r e13 0 ca n d7 0 - - 8 0 * ( 2 n l et e m p e r a t u r ei nt h e t o w e rw a s8 0 a n dt h et e m p e r a t u r eo ft h em a t e r i a l sw a s4 0 * ( 2 t h er e c o v e r yr a t eo ft h e m i c r o c a p s u l e sw a s5 7 8 a n dt h er e l a t i v es u r v i v a lr a t eo f b a c t e r i a sw a s5 9 7 8 b i f i d o b a c t e r i u mm i c r o c a p s u l e s ，w h i c hw e r ep r e p a r e db ys e v e r a lm e t h o d s ，h a db e e n d i s i n t e g r a t e dw i t h i n4 5 m i ni ns i m u l a t e di n t e s t i n a lf l u i d t h er e s u l to fu s i n gt h es i m u l a t e d g a s t r i cf l u i dt ot r e a tt h em i c r o c a p s u l e sw h i c hw e r ep r e p a r e db yac o m b i n i n gm e t h o do f f r e e z e - d r y i n gw i t he m u l s i f i c a t i o nf o r4 hs h o w e dt h a tt h es u r v i v a lr a t e so fb a c t e r i a sw e r e 3 7 9 0 3 l r ) a n d4 0 6 0 3 ) t h es u r v i v a lr a t e sw e r e6 8 i ( b l r ) a n d6 7 9 ( b i y ) w h e n t h em i c r o c a p s u l e sw e r et r e a t e di n0 3 b i l es a l ts o l u t i o nf o r3 h ，a n dt h es u r v i v a lr a t e sw e r e 8 2 6 ( b l r ) a n d8 2 i ( b i y ) w h e nt r e a t e di n6 n a c ls o l u t i o nf o r1 2 h w h e nt r e a t e di nt h e e n v i r o n m e n ta t6 5 f o r2 h ，t h es u r v i v a lr a t e sw e r e8 2 ( b l r ) a n d8 1 ( b ) t h e m i c r o c a p s u l e sw e r es t o r e da t - 1 8 ，4 ，2 0 a n d3 7 f o r1 8 0 da n dt h eb e s te f f e c tw a s s h o w e dw h e ns t o r e da t - 18 ( 2 ，u n d e rw h i c h ，t h ev i a b l ec e l lc o u n t sw e r e2 2 7x10 c f u g ( b l r ) a n d2 14x10 7 c f u g ( b i y ) t h em i c r o c a p s u l e sw h i c hw e r ep r e p a r e db yac o m b i n i n gm e t h o do f f r e e z e - d r y i n gw i t he m u l s i f i c a t i o nh a db e t t e rs t o r a g es t a b i l i z a t i o na n dt o l e r a t i o ns u b j e c t e dt o t h eh a r s hc o n d i t i o n s k e yw o r d s ：b i f i d o b a c t e r i u m ，m i c r o c a p s u l e s ，f r e e z e - d r y i n g ，p r o t e c t a n t ，t o l e r a n c e 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：羞臣垄指导教师签名： 之：乡 2 口卵年易月| 日2 明年莎月f 1 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西 北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 二正 思0 学位论文作者签名：加堂 2 0 0 7 年多月i1 日 两北人学硕f j 学位论文 第一章绪论 双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u m ) 是人和哺乳动物消化道内最重要的生理性细菌之一， 属于微生物学上的原籍菌群，与人类许多病理及生理现象有密切关系f 。近年来，受到 医学、生物学、食品与营养学、免疫学等领域研究人员的广泛关注【2 ，3 ，4 1 。 1 1 双歧杆菌概述 1 1 1双歧杆菌的形态和生理生化特性 法国巴斯德研究所的h e n r yt i s s i e r 于1 8 9 9 1 9 9 0 年从母乳婴儿粪便中分离得到双歧 杆菌，并命名为双歧芽孢杆菌( b a c i l l u sb i f i d u s c o m m u n i s ) 1 5 1 。后续研究发现此类细菌 生长过程中不产生芽孢，奥拉詹森于1 9 1 9 年将其更名为双歧细菌。1 9 8 5 年光冈等根据 双歧杆菌的菌体及培养特征，设置了独立的双歧杆菌属，确立了其分类体系。第9 版伯 杰氏手册( 1 9 9 4 ) 载入双歧杆菌属的2 4 个种。生物学各学科的迅速发展以及基因芯片【6 1 、 p c r 等技术的出现促进了双歧杆菌的分类学研究，至今已有超过3 0 多个种被发现和报 道【7 1 。 双歧杆菌革兰氏染色阳性，不生成芽孢、鞭毛、荚膜以及菌丝体。其细胞形态随培 养条件、生长阶段以及菌株特性而改变【8 1 。初分离的菌株多呈现v 形、y 形、球棒形或匙 形，传代培养后，菌体常为弯曲状或杆状，单个或v 型、栅栏状、星状排列9 1 。g l i c k 发 现n 乙酰氨基糖含量影响两歧双歧杆菌菌体形态变化，将添加量从少量逐渐增至足量， 细胞形态从鳞茎状、树节状变为杆状【8 】o 双歧杆菌生长的最适p h 值为6 5 - - 7 0 ，在p h 8 0 - - 8 5 以上或4 5 5 o 以下几乎不生长，最适温度3 5 4 1a c 【9 1 ，部分分离于动物体的双歧 杆菌可生长于4 6 。c 以上环境中【1 0 】，低于2 0 c 大多不生长。双歧杆菌可发酵葡萄糖、蜜二 糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖，不发酵棉子糖、阿拉伯糖、木糖、核糖，不产气，产生一定 量的乳酸和乙酬9 1 。双歧杆菌严格厌氧，部分菌株在c 0 2 存在时有一定耐氧性【9 1 ，对氧的 敏感程度有种间甚至株间差异【】。s i m p s o n 等从猪盲肠分离得到召芦妒j j l 阳p 唧j l i f ，“聊可以 生长于有氧条件下的固体培养基表面【1 2 ，1 4 】。k a w a s a k i 等发现曰t h e r m o p h i l u m 和b b o u r n 在 8 0 n 2 7 | ： 1 2 0 0 2 条件下的生长状况优亏：1 0 0 n 2 条件【1 3 1 4 1 。 1 1 2 双歧杆菌的生理功能 双歧杆菌是利用宿主自身环境生存的生理性菌【1 5 】，其生理功能主要表现在以下几个 方面： 第一章绪论 ( 1 ) 维持肠道正常菌群平衡、生物屏障和生物拮抗作用 双歧杆菌是肠道中的优势菌群，可缓解乳糖不耐i l 、腹泻、便秘症状，改善胃肠道 功能( ，博1 。双歧杆菌细胞壁中的磷壁酸可与肠粘膜的上皮细胞特异性结合，占据肠粘膜 表面位点，构成有害微生物的定植阻力【1 6 】。其次，双歧杆菌生长代谢过程中通过双歧支 路发酵糖类产生乙酸、乳酸等有机酸，降低周围环境的e h , 币1 p h 值，一定程度上抑制病 原菌的生长和繁殖，减少了肠道毒素的产生和吸收【l9 1 。再次，双歧杆菌还可以分泌 b i f i d o l i n 及b i f i l o n g 等抗菌类物质以及胞外糖苷酶，降解肠粘膜上皮细胞上的复杂多糖， 阻止潜在致病菌及其毒素对肠粘膜上皮细胞的粘附2 0 , 2 1 】。另外，双歧杆菌会与外来菌群 竞争营养物质，从而一定程度上抑制致病菌的生长和繁殖【2 2 1 。 ( 2 ) 抗肿瘤作用 双歧杆菌具有抗癌活性【2 3 1 。菌体及其表面分子可以吸附并降解致癌物质，通过促进 肿瘤细胞凋亡相关基因的表达来诱导肿瘤凋亡【1 7 】。双歧杆菌还可以产生s o d 、n a d 氧 化还原酶以及多种抗突变物质，增强机体抗癌能力【r 7 1 。另外，双歧杆菌能够促进n k 细 胞的增殖，发挥抗肿瘤作用，也可以通过巨噬细胞产生的免疫活性因子抑制肿瘤细胞的 生长1 1 9 】。双歧杆菌细胞壁可以使干扰素的水平得到提高【2 4 】，其脂磷壁酸具有较强的免疫 应答作用，可以抑制白血病细胞端粒酶活性从而抑制其繁殖【1 9 】。完整肽聚糖( w p g ) 可以促进巨噬细胞对t n f a 、n o 及i l 1 的分泌，降低肿瘤细胞的增殖活力【1 9 】。王立生 等研究发现w p g 使大肠癌裸鼠移植瘤的b c l 2 基因表达下调，b a x 基因表达增强，诱导 肿瘤细胞凋亡，其抑瘤效率可达5 1 4 1 t 2 4 1 。另外有研究显示双歧杆菌能够影响p 葡萄 糖醛酸酶和b 一葡萄糖苷酶的活性，降低了致癌前体物质转化为致癌物质的可能性【l 9 1 。 ( 3 ) 免疫调节功能 双歧杆菌能够增强人体免疫力【2 5 1 。用含双歧杆菌的奶粉喂养早产儿4 周，可以明显 改善其肠道通透性，使i g a 抗体浓度增加2 倍【2 6 ，2 7 1 。双歧杆菌可以增强各种抗体和细胞 因子的产生，能够激活巨噬细胞的b 半乳糖苷酶，加强其吞噬作用；可增强辅助型t 细 胞的平衡应答作用，刺激t g f 1 3 和i l - 1 0 的表达，具有一定的抗过敏作用f 2 8 2 9 1 。双歧杆 菌还可以产生具有免疫调节作用的活性因子【1 6 l 或菌体本身作为非特异性免疫调节因子， 激活淋巴细胞，使血液中免疫球蛋白的含量增加，调节机体免疫应答，增强肠道非特异 性免疫能力与宿主免疫监视功能【1 7 , 3 0 。另外，双歧杆菌可以分泌抗菌物质，有助于t h l 应答，影响t h l 和t h 2 平衡【3 l 】，减少婴儿过敏性疾病的发生，调节小儿的免疫系统【2 2 3 2 1 。 双歧杆菌与精氨酸、葡萄糖酸、寡糖配合，可以发挥特有的免疫功能【4 l ，并且对免疫系 2 两北人学硕t j 学位论文 统具有双向调节作用。日本研究发现每天摄入大量双歧杆菌有助于预防流感，有利于增 加体内白细胞数量，提高免疫力f 3 3 l 。 ( 4 ) 营养作用 双歧杆菌对人体具有营养作用【3 4 】，能在肠内合成多种生物酶3 5 1 和维生素类物质，如 叶酸、尼克酸、k l 、维生素b i ，b 2 ，b 6 ，b 1 2 等，其代谢产生的醋酸和乳酸可以使肠 道酸化，利于维生素d 、钙铁离子和磷的吸收利用，并且能够以氨为氮源合成尿素和氨 基酸，提高蛋白含量并降低血氨浓度，对门静脉肝硬化有缓解作用【1 7 , 2 0 , 3 6 。双歧杆菌可 产生1 3 半乳糖苷酶，有利于乳糖在机体内的消化吸收；还可以产生磷蛋白磷酸酶，分解 a 一酪蛋白，从而促进乳蛋白的吸收【3 们。另外，双歧杆菌代谢产生的乳酸全部为人体可以 利用的l 型乳酸。 ( 5 ) 抗衰老功能 双歧杆菌可以减少有害物质产生，延缓机体衰老。人体内的双歧杆菌能够利用人体 自身代谢产生的胺、酚、硫化氢、氨、硝基化合物等有害物质，合成对人体有益的超氧 化物歧化酶( s o d ) 、维生素、糖类、微量元素、氨基酸、核酸等多种抗衰老物质，并 减少自由基参与的氧化反应，提高机体抗氧化能力【1 6 】。m e e i 等研究发现长双歧杆菌的胞 内提取物具有较高的抗氧活性【1 9 】。日本研究表明，长期饮用双歧杆菌发酵制品能够增强 老年人心脏、肝脏功能，延年益寿【1 7 】。双歧杆菌代谢产物及其菌体成分可以促进胆固醇 转变为胆酸盐，降低肠道对胆固醇的吸收，有利于延缓机体衰老【3 7 1 。 1 2 双歧杆菌制剂概述 随着对双歧杆菌各种生理功能的发现，其基础研究与应用，在美国、法国、德国、 俄罗斯、日本等国家受到较高的重视【1 6 】。上世纪5 0 年代起我国也开始了对双歧杆菌的研 究。双歧杆菌已被广泛应用于食品、饲料、医药等各个领域 3 8 , 3 9 】。然而，双歧杆菌对生 存环境要求苛刻柏1 ，在生产、贮存以及运输过程中，活菌含量下降迅速，其液体制剂在 几天内活菌数就会下降一个数量级，并且不能耐受人体肠胃道环境的损伤，消费过程中 难以保障足够的活菌数到达人体肠道定植【3 0 】。因此，双歧杆菌高效活菌固体制剂逐渐被 开发并成为研究热点【3 0 1 ，国内外已经有7 0 多种双歧杆菌制剂应用于医药与食品等行业。 真空冷冻干燥与微囊化技术可以比较有效的保护菌体活力【4 1 1 ，成为制备活菌固体制剂的 重要方法。 3 第一章绪论 1 2 1真空冷冻干燥技术制备双歧杆菌制剂 真空冷冻干燥技术是制备高活性菌粉制品的一种重要技术，得到越来越广泛的应用 1 4 2 1 。真空冷冻干燥简称冻干，是冷冻技术与真空技术相结合的干燥脱水技术。其基本原 理是热力学相平衡理论，水的三种相态水、冰、水蒸气三者可以共存且保持平衡，将物 品预冻到共晶点温度以下，在真空条件下，不断补充升华热能，使物品中的冰升华直接 变为气相而得到干燥 4 3 , 4 4 1 。干燥之前的预冻过程可以防止起泡、沸腾等过程对菌体的损 伤，影响干燥速率以及产品质量。主要影响参数有冻结方式、冻结时间、冻结速度等【4 5 1 。 冻结速度越快，结晶越小，对菌体损伤越小1 4 2 1 。也有研究认为慢冻和速冻对原核微生物 存活率影响不显著，而真核微生物适宜慢冻【4 6 1 。应根据实际情况选择适当的冻结速率。 冻结之后，迅速进行升华干燥，要求真空度很快达到升华压力，并保持升华压力低于三 相点压力，同时及时供给热能来维持升华温度，但温度上升不能超过共融点防止物料溶 解 4 4 , 4 5 】。升华干燥可以除去全部水分的9 0 ，最后进行解析干燥，除去剩余的水分，此 阶段要保持足够高的物料温度和较高的真空度【4 4 , 4 5 】。冻干过程在较低的温度下进行，有 利于保持菌体活性与原有结构，减少污染与伤害，并使菌体处于低水分环境中，有利于 菌体保存【4 7 1 。但是冻干是一个多步骤过程，会产生冻结应力、低温应力、干燥应力等等 多种外力使样品变性【4 7 1 ，为了得到高活性的菌粉制剂，必须采取一定的保护措施，常加 入抗冻干保护剂以提高菌体活力【4 引。 1 2 2 微囊化技术制备双歧杆菌制剂 微囊化是近5 0 年才发展起来的新技术，1 9 3 6 年大西洋海岸渔业公司在液体石蜡中制 备的鱼肝油明胶微胶囊，开启了此项技术的先河【4 3 】。1 9 4 9 年w u r s t e r 发明了微胶囊的空气 悬浮法【4 3 】。1 9 5 4 年g r e e n 完成了微囊化技术的工业化生产【4 3 1 。微囊化是采用特殊方法将 固、液、气物质包埋而成微小致密胶囊的技术【4 9 1 。成膜材料，即壁材一般采用对人或菌 体无毒副作用的食用材料( 如海藻酸钠、阿拉伯胶、壳聚糖、卡拉胶、b 一环糊精、明胶 等) ，需要保护的物质作为芯材包埋其中【4 9 】。微胶囊产品具有良好的功能性质，壁材提 供了有利于菌体存活的微环境，可以减轻外界不利环境对菌体的损伤，减少噬菌体的伤 害，增强了产品在生产、贮存、运输、消费过程中的稳定性与适应性【4 9 1 。研究表明，4 。c 贮存条件下双歧杆菌冻干菌粉活茵数很快下降1 个数量级，微囊化后其活菌数在8 周内仅 下降了0 5 个数量级【5 0 1 。微胶囊制品可以用于菌体保藏，又可作为食品、医药添加剂加 入到液态或固态基质中，具有广阔的应用前景【4 3 】。一 一 4 两北人学硕j ：学位论文 微囊化过程要求温和，不损伤细胞，具有较高的产量，生成微囊粒径均一并具有一 定的机械强度5 1 1 。目前几种常见的双歧杆菌微囊化的方法主要有挤压法、乳化法、喷雾 干燥法等等。 ( 1 ) 挤压法：由s e h u l t z 于1 9 5 6 年提出，是将菌体与亲水性胶体混合，通过针或者喷嘴挤 出细胞悬液，逐滴滴入固定液中形成微囊【5 2 1 ，微囊大小取决于液滴落下的距离、针孔的 直径与亲水性胶体的浓度与组成【5 3 l 。 ( 2 ) 喷雾干燥法：将菌液与壁材、保护剂均匀混合，经雾化器作用，喷成非常细微的雾 滴，依靠干燥介质与雾滴进行热交换和质交换，使溶剂气化从而使物料得到干燥【5 4 1 。壁 材种类与喷雾温度以及菌体种类对微生物的存活率均有影响【5 4 】。 ( 3 ) 空气悬浮法：由美国威斯康星大学的w u r s t e r 教授发明，又称w u r s t e r 法，是用流化 床将芯材物质( 固体粉末) 悬浮于空气中，再把壁材溶液以喷雾的形式加到流化床上， 在悬浮滚动的状态下，逐步将芯材包覆干燥形成微囊【5 2 1 。 ( 4 ) 乳化法：是物理化学法的一种，通过改变p h 值、温度、加入电解质等，使溶解状 态的成膜材料从溶液中聚集沉淀，包裹芯材成为微囊【5 3 1 。将少量的细胞悬液( 不连续相) 添加到大量的植物油( 连续相) 中，经过均质形成油一水乳化液，加入凝胶剂后，在油 中形成不溶性的微小胶粒，将双歧杆菌包埋其中形成微胶囊【5 3 】。 1 3 双歧杆菌微囊化技术的国内外研究进展及开发利用 美国对微囊化技术的研究一直处于领先地位，日本在6 0 一7 0 年代也逐渐发展，8 0 年 代中期开始了双歧杆菌微囊化的研究【4 3 1 。横田丰一等采用喷雾冷却法得到粒径4 0 6 0 t m 的双歧杆菌胶囊，在人工胃液中存活率达到9 0 以上【5 5 1 。日本森下仁丹公司采用疏 水微胶囊技术研制的活菌制品，可以将十亿个活菌一次性安全通过胃环境送至肠道【4 3 1 。 k a i l a s a p a t h y 研究发现微囊化大大提高了双歧杆菌在酸奶中储存的存活率，比未经微囊化 的菌体提高一个数量级【5 6 1 。r o d r i g u e z 等以混合胶体包埋双歧杆菌同时加入龙舌胆汁进行 喷雾干燥得到较高的存活率与低温贮存稳定性【5 1 。p i c o t 等研究得到微囊化后的双歧杆菌 对胃液、肠液等外界极端环境抵抗力大大提高【5 8 】。a n l l a n 等分别以与钙离子交联后的海 藻酸盐和明胶为壁材包埋双歧杆菌增强了菌体对逆环境的抵抗力5 9 1 。0 z e r 等用挤压法与 乳化法制备得到的双歧杆菌微胶囊在干酪中的存活率比未包埋的菌体提高2 个数量级 唧】。h o m a y o u n i 等应用藻酸钙凝珠包埋的嗜酸乳杆菌与乳酸双歧杆菌，制备得到合生元 冰激凌，2 0 条件下贮存1 8 0 d 其菌体存活率比未包埋菌株提高3 0 1 6 1 1 。k l a y r a u n g 等加 5 第一章绪论 入羟丙甲纤维素酞酸酯与海藻酸钠制备的双歧杆菌干燥型片剂，具有较好的抗张强度与 溶解性，提高了菌体存活率，延长了货架期【6 2 1 。 我国的研究起步较晚，近年来也发展迅速【5 5 1 。江南大学食品学院对壁材的选择以及 微囊化工艺参数进行了优化，取得较好效果；华南理工大学食品与生物工程学院成功研 制活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊制剂【4 引。曹永梅等采用明胶果胶为壁材，制备得到肠 溶性微胶囊化双歧杆菌，菌体存活率高，保存时间长【6 3 1 。杨汝德等制成耐酸肠溶双歧杆 菌微胶囊在人工胃液中处理2 h 后，菌体仍具备很高的存活率，在人工肠液中释放良好【5 2 】。 李武明等以壳聚糖海藻酸钠为壁材制各得到的双歧杆菌微囊再培养后菌体仍可以保持 较高活性【4 8 ，删。姚卫蓉等应用多孔淀粉吸附双歧杆菌，再喷雾干燥得到活菌粉，装入肠 溶胶囊，提高了菌体存活率及贮藏稳定性【6 5 】。黄序等以丙烯酸聚合物为壁材，采用空气 悬浮法制备肠溶性微胶囊在人工肠液中4 5 m i n l 勾崩解完全，包埋效率是5 7 ，包囊率达 到8 8 【硎。秦湘红等应用药用成膜材料作为壁材，与冻干技术相结合，在冷冻干燥的同 时包埋制备得到双歧杆菌微囊，其含菌量比普通冻干菌粉高几百亿个克，于3 7 条件下 可以有4 个月保存删6 7 1 。唐宝英等采用双层包埋法制备微囊，用棕榈油包埋双歧杆菌， 再用明胶溶液包裹得到双层微囊，其活菌率可达7 0 2 ，室温保存7 个月后仍然有一定的 活菌数【6 引。谭颖嫦等发现在4 c 和1 0 * c 条件下，微囊化双歧杆菌在保质期内的酸奶中活 菌数基本没有减少，具有较高的稳定型6 9 】。有研究加入明胶、可溶性淀粉、脱脂奶粉以 及阿拉伯胶等物质用喷雾干燥法制备的双歧杆菌微胶囊在p h 为2 0 的模拟胃液以及2 胆汁环境中耐受性远远大于未经微囊化的产品，并发现微囊化的保护效果因菌种而异 【7 0 】。我国在双歧杆菌微囊化技术方面的研究发展较快，但距离美国，日本等国家还有一 定差距。 目前双歧杆菌微胶囊制剂多处于研究阶段，国内外上市产品较少，主要用于食品、 医药以及畜牧业【。7 1 】。法国应用婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌与嗜酸乳杆菌制备的合生元 制剂主要应用于药品行业；日本的b i f i n a l 0 产品也采用双歧杆菌作为主要菌种；我国的 微囊化双歧杆菌产品主要应用于药品与保健品行业，常用菌种为两歧双歧杆菌、短双歧 杆菌与青春双歧杆菌，如生态宝等【5 2 1 。双歧杆菌微囊化技术的研发具有广阔的应用前景。 1 4 双歧杆菌制剂存在问题 双歧杆菌制品的研制发展迅速，目前其液体制剂、菌粉制剂已经有一定程度的应用。 由于双歧杆菌本身的特性，菌体在生产、运输、贮存以及消费过程中容易失活，影响产 6 两北大学硕i j 学位论文 品质量的稳定性。制剂中的活菌数量是其发挥作用的根本保证，而液体制剂的水分含量 高，菌体分散于溶液中，得不到任何保护，耐受性低，保藏期短；菌粉制剂干燥性好， 贮存期较液体制剂大大延长，但在应用的过程中，完全释放于溶液中，无法阻隔外界环 境对菌体的不良影响，两种制剂均难以保障有足够的活菌数到达消化道。微囊化技术可 以制备有较高活性的活菌制剂，使菌体与周围环境分开，一定程度上得到保护【5 2 1 ，但是 制备得到的多数为新鲜胶囊，对运输等过程造成一定不便，贮存过程中活性也易降低。 双歧杆菌活菌制剂中存在的诸多问题，一定程度上限定了其应用与发展。 1 5 本研究的目的及主要内容 1 5 1 研究目的 双歧杆菌是人和动物肠道中重要的益生菌，具有抑制致病菌生长、调节肠道微生态 平衡、增强营养、提高免疫力、抗肿瘤和延缓衰老等重要的生理功能【7 2 】。然而，双歧杆 菌专性厌氧，对氧气、p h 、温度、湿度等外界不良环境因素极为敏感【7 2 】，并且多不能 抵抗动物消化道低p h 值的胃酸、胆盐及多种消化酶的作用，难以保证有足够的活菌数到 达肠道而发挥其益生作用【7 3 1 。利用微囊化技术保护双歧杆菌是目前国内外研究的热点 【7 4 1 ，微囊化可以一定程度上阻隔外界逆环境对双歧杆菌的杀伤力，对菌体起到保护作用 6 1 , 6 6 】。目前许多研究采用多种方法制备的微胶囊多为未经干燥过的新鲜胶囊，水分含量 高，对长期保藏和运输、消费造成一定困难；而采用冷冻干燥、流化床干燥等技术生产 的多为菌粉制品，菌体在液体中是完全释放的，受周围氧气影响较大，对生产过程中的 高温、高渗、高湿环境缺乏抵抗力，进入消化道后难以耐受t l 毛p x j 值的胃酸以及胆盐和各 种消化酶的作用，在作为添加剂使用时也受到一定的限制，并且不利于长期贮存。因此， 本研究应用多种方法制备双歧杆菌活菌制剂并进行一系列指标检