（植物学专业论文）扁穗冰草agropyron+cristatumlgaertnpld的cdna克隆及干旱胁迫下pld基因的表达和作用.pdf

中文摘要 本研究利用r a c e 技术克隆得到了扁穗冰革a g r o p y r o n c r i s t a t u m ( l ) g a e r t n 。磷脂酶d ( p l d ) 基因的e d n a 全长穿列，利翔生物 信息学软件分析了扁穗冰草p l de d n a 的序列结构、p l d 的氨基酸组 成、结构及性矮，毖较分褥了不同物种p l d 豹氢基酸组成，预测了扇 穗冰革p l d 的二级和三级结构、疏水性和亲水性、跨膜区域和圆有无 序能性质，并且构建了至5 个物静的p l d 进化挝。用荧光定量p c r 技 术检测了p e g 6 0 0 0 模拟干旱胁迫时不同胁追时间鞠胁迫液浓度下p l d 基因的糖对表达量。测量了干旱胁追下痛穗冰草时片的6 项生理指标如 脯氨酸、p o d 、c a t 、m d a 、钙离子和可溶性糖等含量的变化口焉 s p s s l 3 0 软件对p l d 的相对表达量与生理援标的变化进行了才且关性分 析。主要研究结果如下： l 扇穗冰革p l d 基因e d n a 全长序列为2 9 6 7 b p 组成，其开放读码 框o 雕) 编码8 1 2 个氨基酸，起始密码子鸯a t g ，终止密码子为t a g ， 起始密码子上游有一个1 2 8 b p 的5 非编码区，终止密码予下游有一个 3 6 8 b p 靛3 非编褥区母其氯基酸廖别与己壳隆静蒙古泳革、醉淄毒麦、 水稻、玉米的p l de d n a 推导的氨基酸序列的同源性范围为8 9 9 9 。 2 推导出扁穗冰革p l d 的相对分子量为9 1 8 3 2 k d ，理论等电点为 5 3 3 5 ，p l d 是可溶性蛋奎，无跨膜域，无信号默，部分区域无序纯， 其二级结构主要以无规卷曲为主，三级结构在中间和靠近c 端处育p l d 标志窿列h k d 基序组成麴催纯活性部位。 3 扁穗冰草p l d 基因的转录水平上的相对表达量随干旱胁迫时间 的增加先上舞屠下簿荐上升再下降；隧胁追滚浓度鳇增加，p l d 基匿麓 表达先上升后下降再上升。 4 扇穗冰革p l d 基因转录水平上的榴对表达量与各颂生理指撼熬 相关性研究强示出不同胁迫时间和胁迫液浓度下p l d 基因的相对表达 量与脯氨酸、p o d 和哥溶蹩糖含量的变化显著裰关 本研究蓑明扁穗冰草p l d 参与到其抗旱生理过程中，发挥了重要 生理佟震。研究维暴楚深入探索p l d 基因的调节枧割和功能奠定了基 础，为提高植物的抗旱性提供了一些理论依据。 关键词；扁穗然草，p l d ，干旱胁迫，基因，克隆 a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , t h ef u l le d n as e q u e n c eo fp h o s p h o l i p a s edf r o m a g r o p y r o nc r i s t a t u m ( l ) g a e r t n w a sc l o n e d b y r a c et e c h n i g u e t h e s e q u e n c eo fp l dc d n a 。c o m p o s i t i o na n dc h a r a c t e r i s t i c so fa m i n oa c i do f p l dw e r ea n a l y z e dw i t hb i o i n f o r m a t i c ss o f t w a r e t h ep h y s i c a la n d c h e m i c a lp r o p e r t i e so fp l di nd i f f e r e n ts p e c i e sw a sa l s oc o m p a r e d t h e p r o t e i ns e c o n d a r y a n dt e r t i a r y s t r u c t u r eo fp l do f a g r o p y r o n c r i s t a t u m ( l ) g a e r t nw a sp r e d i c t e d t h es i g n a lp e p t i d e , h y d r o p h o b i c i t y , t r a n s m e m b r a n ed o m a i n ，l o c a ls t r u c t u r a ld i s o r d e ro ft h ep l dw e r ea n a l y z e d 。 a p h y l o g e n e t i ct r e ew a sd r o w na m o n gt h ep l dp r o t e i n sf r o m15d i f f e r e n t s p e c i e s 。t h ee x p r e s s i o n o ft h ep l dg e n ew a sa n a l y z e db yr e a l t i m e f l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v ep c ru n d e rd if f e r e n td r o u g h ts t r e s st i m ea n dl e v e lo f p e g 6 0 0 0 s i x p h y s i o l o g i c a l i n d i c e so fl e a v eo f a g r o p y r o n c r i s t a t u m ( l ) g a e r t nw a sm e a s u r e du n d e rd r o u g h ts t r e s s ，i n c l u d i n gp r o l i n e ， p o d ，c a t , m d a ，c a 2 + a n ds o l u b l es u g a r c o r r e l a t i o nw a sa n a l y z e db e t w e e n t h er e l a t i v ee x p r e s s i o no fp l dg e n ea n dt h ep h y s i o l o g i c a li n d i c e sb y s p s sl3 0s o f t w a r e t h er e s u l t ss h o w e da sf o l l o w s ： lt h ef u l ll e n g t he d n aw a s2 9 6 7b pw h i c hc o n s i s to fo p e nr e a d i n g f l a m ee n c o d e d812a m i n oa c i d s ，12 8b p5 u n t r a n s l a t e dr e g i o n sa n d3 6 8b p 3 u n t r a n s l a t e dr e g i o n s t h es t a r tc o d o nw a sa t ga n dt h et e r m i n a t i o nc o d o n w a st a g t 蠢es e q u e n c ei d e n t i t yw a s8 9 - - 。9 9 c o m p a r e dw i t ha g r o p y r o n m o n g o l i c u m ，l o l i u mt e m u l e n t u m ，o r y z as a t i v aa n dz e am a y s 2t h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h to fp l do f a g r o p y r o nc r i s t a t u m ( l ) g a e r t nw a s9 1 8 3 2 k da n di t s i s o e l e c t r i cp o i n tw a s5 3 3 5 i tw a s d i s s o l v a b l ep r o t e i nw i t h o u ts i g n a lp e p t i d ea n dt r a n s m e m b r a n ed o m a i n 。t h e s e c o n d a r ys t r u c t u r eo fp l dw a sm a i n l yc o m p o s e do fr a n d o mc o i l t h e c a t a l y t i ca c t i v i t y - s i t ec o m p o s e do fh k d m o t i fn e a rc t e r m i n a la n di nt h e m i d d l e o ft e r t i a r ys t r u c t u r e 3t h e e x p r e s s i o no fp l dg e n eo f a g r o p y r o nc r i s t a t u m 盈，) g a e r t nw e n t t h r o u g h ta l lu p - d o w n - u p - d o w ns t y l ew i t ht h ei n c r e a s i n go f s t r e s st i m e t h e e x p r e s s i o no fp l dg e n ew a su p - d o w n - - u ps t y l ew i t ht h ei n c r e a s i n go fs t r e s s l e v e l 4 t h e t r a n s c r i p t i o n a l l e v e lw a s s i g n i f i c a n t l y c o r r e l a t e dw i t ht h e p h y s i o l o g i c a li n d i c e s ( p r o l i n e ，p o da n ds o l u b es u g a r ) u n d e r d i f f e r e n ts t r e s s t i m ea n dl e v e l t h er e s u l t ss h o w e dp l do fa g r o p y r o nc r i s t a t u m ( l ) g a e r t np l a y e da c r u c i a lr o l ei nd r o u g h tr e s i s t i n gp r o c e l l t h i ss t u d yl a i daf o u n d a t i o nf o r u n d e r s r a n d i n gt h er e g u l a t o r ym e c h a n i s ma n df u n c t i o no fp l dg e n e k e yw o r d s ：a g r o p y r o nc r i s t a t u m ( l ) g a e r t n ，p h o s p h o l i p a s ed ，d r o u g h t s t r e s s ，g e n e ，c l o n e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果，尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也 不包含本人为获得内蒙古师范大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示感谢。 签名二茎塑日期：珈叼年j - 月zf 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解内蒙古师范大学有关保留、使用学位 论文的规定：内蒙古师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文 的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容 和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 摊嘲 言嵩差量删日 l 引青 1 引言 1 1 扁穗冰草研究概况 冰草属植物是北方草地普遍分布的禾草，有重要饲用价值、生态价值和遗传价 值【i ，翔。冰草返青旱、桔黄迟，被牛、羊、马等各种家畜喜食，其茎时柔软，营养 价值高，冬春保存良好；它适应性强，抗旱、耐寒、耐盐碱、耐贫瘠、耐沙埋、耐 践踏，是放牧和打革兼耀型牧草，对缓解饲草缺乏有十分重要的作用。冰草属植物 也是典型草原和荒漠草原改良沙质草地补播的首选牧草，可用来固沙保土改善生态 环境【3 】。作为小麦属的近缘种，对小麦遗传改良具有重要的潜在利用价值，冰革具 有麦类作物所缺乏的抗病、抗虫和抗逆等优良基因【4 】，这些基因可以通过远缘杂交、 染色体工程、基因工程等现代生物技术手段从野生种类中转移到栽培小麦中，从而 改良农作物【5 】，目前不同倍性水平的冰草与小麦杂交相继获得成功，已培育出一系 列染色体工程材料和优良品系【4 】。 扁穗冰草( a g r o p y r o nc r i s t a t u m ( l ) g a e r t n ) 也称冰草、野麦子、羽状小麦草， 须根系，根系发达，茎秆直立，丛生。在我囤东北、西北及内蒙古自治区等地有野 生种分布，并已栽培利用，在国外分布予欧洲、西债利亚、中亚地区和蒙吉，对 壤的适应性较广，是高寒、干旱、半干旱地区最耐旱的多年生优良牧草之一，在年 降水量2 3 0 3 8 0 m m 的地区生长良好。虽然扁穗冰革抗旱性较强，但对水分的反应 敏感，水分充足时，干草和种子产量可成倍增加。扁穗冰草耐寒性强，可在4 0 低 温下安全越冬。h e n r ya 等发现扃穗冰草在水涝、干旱和营养胁迫下根部渗出物有 苹果酸、反丁烯二酸、琥珀酸、草酸，它们结合土壤改变p h 值，通过微生物的辅 助代谢使有害有机物的分解作焉增强，从而增加了抗逆性猹】。j u b a u l tm 剩焉扇穗冰 草与小麦进行同源染色体配对利用，长散布重复序列的易位与电离辐射做对比，寻 找改良小麦的品质的方法【7 】。 1 2 植物干旱胁迫的研究进展 1 2 1 干旱对植物造成的伤害 干旱胁迫对植物的伤害有以下几个方面： 薹植物生长受到抑制 内蒙吉师范大学硕士学位论文 植物生长受到抑制是干旱胁迫所产生的最直观效应。干旱胁迫下植物的形态特 惩会发生变化。懿：干旱胁迫降低了冬小麦幼苗酶总根数、掇系总长、根系体积和 根系干重，限制了根系的生长【8 】。随干旱胁迫程度的增强，甘草地上地下各器官生 长均受到抑制，但对地上器官的生长抑制更加明显【9 】。玉米地上部茎时的生长对于 昂胁迫的反应比地下部根系敏感，中度干旱胁迫仅在苗期具有促进根系生长发育的 作用，面对不同品种玉米的其他各生育时期地上部茎叶和地下部根系的生长均有搀 制作用【1 0 1 。水分胁迫严重抑制了荔枝幼树地上部分和各级侧根的生长，使地上部枝 梢生长严重受阻，叶片数量、平均叶面积、叶片厚度均显著变小；根总干重、侧根 长度、根表面积显著减少【h 】。干旱及高温干早严重抑制了辣椒的生长，研究者认为 这可能与细胞壁的硬化( 指不可逆伸展能力，即伸展性) 响应有关，在于旱条件下细 胞壁硬化有效限制了辣椒绿叶面积的扩大，因而也显著降低了植株的蒸腾失水，使 摭株有可能长时间存活，丽且在发生水分胁追时，分生组织细胞分裂减慢或停止， 细胞伸长受到抑制，生长速率下降【l 烈。 2 活性氧对植物的氧化伤害 在正常情况下，植物细胞可通过多条途径，如分子氧单电子还原过程、某些酶 催化过程和某些低分子化合物的自动氧化不断产生超氧阴离子自由基( 0 2 ) 、过氧化 氢( h 2 0 2 ) 和羟自由基( o h + ) 等活性氧类( r o s ) 物质。植物体内r o s 的产生与清除处于 动态平衡，一般不会导致伤害。在水分胁迫下，活性氧自由基的产生能力增强，特 别是o - 2 产生的速率增加，生成量持续增大，o 。2 又与h 2 0 2 发生h a b e rw e i s s 反应， 生成更多活性氧自由基【l 引，破坏膜结构和抑制酶的活性，导致细胞氧化胁迫而伤害 细胞。膜系统先受活性氧的袭击，使生物膜中脂质过氧化、膜上孔隙变大、通透性 增加、离子大量泄漏和叶绿素含量明显降低，严重时导致植物死亡【l 4 1 。 3 改变膜酶结构及透性 细胞膜系统易受到脱水伤害，膜功能的丧失与极性脂组分的相变有关，也可能 蠢不同水合特性的膜组分的相互混含造成。极性脂的楣变是可逆的，不是致命的。 然而不同水合特性的膜组分相互混合可能导致膜结构某些部分的蛋白质丢失，甚至 导致膜结合蛋白不霹逆外流，从而带来严重损害。当植物细胞脱水时，原生质膜透 性增加，大量无机离子和氨基酸、可溶性糖等小分子被动向组织外渗漏【聆，l6 1 。 4 光合作用伤害 干旱胁迫对植物光合作用的影响较复杂，不仅使光合速率降低，而且还抑制光 会作用光及应中原初光能转换、电子传递、光合磷酸化和光合作用暗反应过程，最 2 1 引言 终导致光合作用减弱。在干旱胁迫条件下，植物叶表面大部分气孔关闭，从而阻止 c 0 2 进入体内，导致光合作用下降【1 5 】。窦耨永等用p e g 处理麻疯树幼苗，随p e g 浓度增加，麻疯树叶片净光合速率( p n ) 、气孔导度( g 。) 、胞间c 0 2 浓度( c i ) 、p si i 实 际光化学量子产量( * p s l i ) 、光化学猝灭国p ) 和表观光合电子传递速率( e t r ) 都下降， p si i 原初光能转化效率( f 胛m ) 轻微下降；在高浓度p e g ( 1 5 ) 处理下，c i 随p e g 浓度增加蔼显著上升，p ”g s 和水分利用效率( 骈陋) 持续下降，f , , f m 、( i ) p s l l 、 口p 和e t r 下降幅度明显增大，初始荧光显著上升，而非光化学猝灭( n p q ) 下降。 分析低浓度p e g 处理导致麻疯树叶片p n 下降主要由气孔因素造成；高浓度p e g 处 理使p n 下降则由非气孔和气孔因素共同作用造成【l 疆。 5 其他方面的影响 干旱时植物组织闻按水势大小竞争水分，一般幼叶向老叶吸水，促使老叶枯萎 死亡。有些蒸腾强烈的幼叶向分生组织和其它幼嫩组织夺水，* 影响这些组织的物质 运输。干旱对呼吸作用的影响较复杂，一般呼吸速率随水势下降而缓慢降低。有时 水分亏缺会使呼吸短时间上升，而后下降，因为开始时呼吸基质增多。干旱使植物 体内静蛋自质分解加速，合成减少，与蛋翻质合成酶的钝化釉能源物质渔 ) 酌减 少有关。干旱促使r n a 酶活性增加，使r n a 分解加快，而d n a 和r n a 的合成 代谢燹| l 减弱。干翠时细胞分裂素含量降低，脱落酸含量增加，两种激素对r n a 酶 活性有相反效应，前者降低r n a 酶活性，盾者提高r n a 酶活性。脱落酸含量增加 与干旱时气孔关闭、蒸篱强度下降宣接相关隔羽。 l 。2 2 植物在干旱胁迫下的形态变化和生理晌应 1 形态变化 在干旱条件下，植物在细胞、器官、个体和群体等各个水平上都会出现相应的 变化。植物受到干旱胁迫时，根向深处生长，以吸取土壤深处的水分维持自身生长。 如果长时间水分亏缺，植物对于旱会产生适应性，根系水势较低，利于根系吸水， 且根冠比增大，利于植物有效利用土壤中水分，保持水分平衡。植物的旱性结构多 种多样，不同檀物闻存在差异，同植物也因适应性不同丽有所不同，如长期生长 在干旱少雨的地区的一些牧草，为适应恶劣环境条件，形态上会发生变化，如株型 紧凑、叶直立、檄系发达、较大的掇冠比、时片被腊脂、角质层厚、气孔下陷等， 以此抵抗水分胁迫【1 9 】。干旱条件下叶片适应性的主要变化有利于保水和提高水分利 用效率，在时发育过程中受到水分胁追时，细胞增大受抑制，使时面积比正常情况 3 内蒙古师范大学硕士学位论文 下小，以减少水分的过分散失。在叶片生长达最大面积后缺水会引发叶片发生萎蔫 或卷曲运动等缓解太阳直接辐射，防止叶温升高和水分亏缺，水分胁迫也加速叶片 衰老而脱涔坫】。如柠条在干旱胁迫条件下受到阳光照射时，透明的蜡可反射出大量 太阳光，柠条的叶只能接受少量的光，叶面的温度不致很高，水分蒸发也少，从而 保证了叶片水分状况良好【2 0 1 。又如干旱胁迫下山黧豆幼苗减小气孔导度来维持体内 水分，气孔导度下降直接导致蒸腾速率随之下降以达到“避旱”【2 。 2 生理响应 ( 1 ) 脯氨酸 脯氨酸( p r o l i n e ) 是重要和有效的渗透调节物质。植物受到干旱胁迫时细胞会积 累脯氨酸，比胁迫开始时含量增加几十倍甚至几百倍。逆境下脯氨酸积累的原因主 要有三：一是脯氨酸合成加强；二是脯氨酸氧化作用受抑，且脯氨酸氧化的中间产 物还会合成脯氨酸；三是蛋白质合成减少，抑制了脯氨酸掺入蛋白质的过程。脯氨 酸在干旱胁迫下有三个作用：一是作为渗透调节物质，保持原生质与环境的渗透平 衡，它与胞内一些化合物形成聚合物，类似亲水胶体，防止水分散失；二是保持膜 结构的完整性：三是脯氨酸与蛋白质的相互作用能增加蛋白质的可溶性、减少可溶 性蛋白沉淀，增强蛋白质的水合作用【1 5 , 2 2 】。 ( 2 ) 可溶性糖 可溶性糖是另一类渗透调节物质，包括蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖等。干旱 胁迫下植物体内常积累大量可溶性糖。可溶性糖主要来源于淀粉等碳水化合物的分 解以及光合产物。水分胁迫下紫花苜蓿半纤维素增加，淀粉分解为糖，可溶性糖显 著增加，胁迫后期大量积累【2 3 】。 ( 3 ) 丙二醛 干旱胁迫下细胞膜的反应最敏感，干旱对细胞膜的伤害程度因物种、干旱强度、 干旱持续时间而异。遭受逆境胁迫时，细胞内活性氧产生与清除之间的平衡受到破 坏，导致活性氧和自由基积累，加速膜脂过氧化，其产物丙二醛的含量增加。在一 定胁迫强度内，各种保护机制使丙二醛含量维持在一定水平，胁迫强度超过特定阈 值后，细胞内代谢失调，膜脂过氧化程度加大，丙二醛含量升高，加剧质膜损伤， 因此丙二醛含量高低能反映细胞膜脂过氧化程度及对逆境反应的强弱2 4 , 2 5 】。如研究 烟草抗旱性时采用实验室盆栽处理控制浇水量模拟自然状况下的干旱胁迫，发现干 旱胁迫使烟草叶片的丙二醛含量呈现先升后降趋势，而细胞膜透性则表现为持续升 高；复水后细胞膜透性能很快恢复正常，而丙二醛含量需较长时间才恢复【2 6 1 。 4 1 引言 ( 4 ) 保护酶系统 保护酶系统主要包括超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 、过氧化氢酶 ( c a t ) 。活性氧对于植物的叶绿体、线粒体、细胞膜甚至d n a 等都有非常强的氧 化破坏作用。s o d 几乎存在子所有好氧组织的细胞中，是防止氧化胁追的关键酶。 s o d 催化0 2 形成h 2 0 2 和0 2 ，防止h o - 的形成，清除活性氧的毒害作用。比如玉 米、甘薯、夏腊梅随干旱胁追的程度的增加，其s o d 活性升高【2 3 2 7 , 2 8 1 。当生物受 到盐、低温、干旱和病原菌侵害等胁迫时会引起活性氧大量产生【l 孤。p o d 可参与环 境胁迫应答反应，清除活性氧分子。骆驼蓬的p o d 活性在轻度和中度胁迫下随胁 迫时间延长先升后降，重度胁迫下持续下斛矧。在过氧化物体( 微粒体) 中脂肪酸b 氧化、乙醛酸循环( 光呼吸) 和嘌吟代谢中都会产生h 2 0 2 ，c a t 对于清除过氧化物体 ( 微粒体) 中h 2 0 2 具有十分重要的作用f 2 2 】。 ( 5 ) 钙离子 许多研究工作证明植物细胞内游离钙离- 子( c a 2 + ) 是细胞信号转导过程中重要第 五信使之，c a 2 十能响应胞外刺激信号的作用而发生变化，且这种变化可调节细胞 的生理活动。干旱信号a b a 的转导中也存在依赖c a 2 + 的途径【翊，g i l r o y 等利糟钙 荧光指示剂f u r a 2 发现a b a 诱导鸭跖草下表皮细胞的胞质中游离c a 2 + 浓度迅速升 高，在保卫细胞内存在依赖钙信号的转导途径泌h 。干旱刺激使胞外或胞内钙痒即使 少量c a 2 + 进入胞基质，也会引起基质中c a 2 + 浓度大幅增加，达定阈值会引起生理 反应，从而起到传递胞外信号的作用；当完成信息传递后，c a 2 + 又被迅速泵出胞外 或泵进胞内钙库，胞基质中的c a 2 + 又回落到静息态水平，同时c a 2 十与受体蛋白分离 0 0 ，3 2 硐。 1 3 植物的磷脂酶d 1 3 。1p l d 基因的结构特点与生化特性 磷脂酶d ( p h o s p h o l i p a s e d ，简称p l d ) 即磷脂酰胆碱磷脂水解酶( e c 3 1 4 4 ) ，是 檀物中的主要磷脂酶，也是催化磷酸二酯键水解和碱性基团交换的一类酶的总称。 早在1 9 4 7 年h a n a h a n 和c h a i k o f f 就从胡萝卜和白菜叶的提取物中发现了具有活性 的p l d i s 5 】，p l d 的多型性和不稳定性傻之此后很长一段时间没有充分研究和利用。 直到1 9 9 4 年k a n s a s 州立大学的王学敏教授利用萌发中的蓖麻种子的子叶作为材 料，经提取、分离与纯化，获雩罨了有活性的p l d ，并利用反转录获得了e d n a 【弘】。 内蒙古师范大学硕士学位论文 现已从白菜、胡萝卜、黄瓜【3 7 1 、罂粟【3 8 1 、草莓【3 9 1 、甘蓝【柏1 、花生 4 1 1 、番茄【4 2 1 、水 稻【4 3 1 、玉米【4 3 1 和葡萄 删等多种植物中提取p l d 并克隆了基因。 p l d 基因属于多基因家族，有多分子异质性，植物的p l d 至少有6 种类型1 2 个成员，即p l d a l ，p l d o l 2 ，p l d a 3 ，p l d l 3 1 ，p l d l 3 2 ，p l d ? i ，p l d t 2 ，p l d ? 3 ， p l d i 5 ，p l d e ，p l d i 和p l d 0 2 t 4 s 】，由不同基因编码，具不同作用。植物所有的p l d 基因都包括2 个h x k x d 基序( m o t i f ) h k d l 和h k d 2 ，2 基序间隔3 2 0 个氨 基酸，h k d 基序是p l d 的标志序列，也是催化水解的活性部位【4 6 1 。 图1 - 1 不同p l d 的氨基酸结构特点 。代表c 2 结构域；o 代表p i p 2 结合位点；x x ( x ) 代表个别a a 残基发生了替换 h g 1 - 1s t r u c t u r a lc h a r a c t e r so fa m i n oa c i do fd i f f e r e n tp l d 。r e p r e s e n tc 2s t r u c t u r a ld o m a i n ；od e n o t ep i p 2b i n d i n gs i t e ；x x ( x ) i n d i c a t ea ar e p l a c e d 按p l d 共有结构域可将其归为两大类：一类为绝大多数p l d 类，包括拟南芥 p l da 、b 、y 、6 和及其它植物p l d 所共有的结构，包括p l d 家族h k d 结构 域，与c a 2 + 调控密切相关的c 2 结构域，所有的植物p l d 的n 末端均含c 2 区域( 见 图l 一1 ) ，该结构域含1 3 0 个氨基酸残基，由8 个1 3 折叠组成三明治式结构，每个b 折叠由4 5 个氨基酸残基组成，是c a 2 + 、磷脂以及其它效应物结合的区域。c a 2 + 可 与c 2 区域内几个保守的酸性氨基酸残基结合，定位于一个双向环状结构内。p l d 1 3 与p l dy 的c 2 区域内分别有4 5 个结合c a 2 + 的保守的酸性氨基酸残基，而p l d q 的c 2 区域内有2 个结合位点( x x ) 分别被带正电和中性氨基酸所取代，改变了p l d a 与c e + 结合的专一性【矧。因此，c 2 区域的不同可能是p l da 、p l d1 3 和p l dy 不同生化特性的结构基础。绝大多数p l d 含有磷脂酰肌醇类调节有关的p i p 2 结构 域和潜在的与磷脂结合有关的i y i e n q f f 结构。多数p l d 有两个p i p 2 结合位点， 一个是近n 末端的c 2 域，一个是近c 末端的催化域附近的多磷脂酰肌醇( p p i ) 结合 单元。无c a 2 + 或c a 2 + 浓度较低时，p i p 2 结合在p l d l 3 l 的c 2 域，而当c a 2 + 浓度较高 时，与c 2 域的结合受到抑制，促使p i p 2 结合在p l d d i 的催化区，这种结合进一步 6 m 1 孳l 富 促进p l d l 3 l 与p c 结合 4 。八。p l d l 3 上含结合单元 r x x x x k x r r ( 最0 精氨酸x x x x 赖氨酸 x 精氨酸糖氢酸) 和一个反转序列单元【褂& 凝x x x x r 】娜】。在p l d ￥中这4 个保守氨 基酸残基中保存3 个，而p l d 谯中保守性最低( 有的被酸性残基取代) 。p l dy 中有 令十隧酰基化m g x x x ( m y r i s t o y l a t i o n ) 保守序y t j 4 飘。另一类则为擞南芥p l d 冬及 哺乳动物p l d 所共有的结构，没有c 2 结构域，却多了p x 和p h 结构域，p h 域由 约1 2 0 个氨基酸构成，熊与多种磷黯酰飘醇缝合弹9 】。p l d 基因斡n 端为催化活性 部位，c 端为信号刺激感受以及膜运输部位【5 0 】。相关研究表明p l d 蛋白结构上的 这些共性及差异与相应的功熊及调控密切相关。 1 3 2p l d 的调控和在信号转导中的作用 p l d 广泛分布在植物的各个部位( 根、茎、叶、种子等) 中，在成熟初期的种子、 萌发初期的幼苗及生长载谢活跃部位中酶含量更丰富。上世纪粥年代以后，人们 逐渐发现p l d 在植物体中参与机械损伤、激素响庶、瘸原蓥侵染和渗透胁迫等一 系到缨胞反应过程 4 5 , 5 t ，箕参与信号转导的功能零 超人们广泛关注。 p l d 信号转导途径是通过与蒸它磷脂酶及c a 2 + 信号途径闯复杂的相互作用焉 形成麴信号慰络( s i g n a l i n gn e t w o r k ) 弱l 。干旱胁追下不阕细胞信号转导过程中p l d 戆 功能和p l d 与其它信使物质之间的关系较为复杂。p l d 酶永解磷脂生成p a 和1 个 h e 赫印峨絮膣碱) l 姗，p a 是细胞内信息传递的重要瀚第二信号分子，有很多作用f 图 1 2 ) ，p a 可激活蛋白激酶k ( p r o t e i nk i n a s e ，p r k ) 系列中的c a 2 + 依赖性和非依赖性 激酶，如蛋自激酶e ( p r o t e i nk i n a s ec ，p k c ) 、缨胞分裂激活蛋自激酶、p i p 5 激酶、 p l c 和p l a 2 等【5 2 。大豆悬浮培莽细胞中，p a 引起一个被机械损伤激活的健有丝 分裂蛋白激酶( m a p k ) 活性增加，用1 丁醇处理减少p a 的形成，燹l j 抑制桃械按伤对 这种激酶的激活【5 3 1 。p a 与其特异性蛋囊结合可介导n a d p h 氧化酶的活化【5 引。p a 还是某些油脂生物合成的中心前体，因此可以改变膜的成分。如p a 可以去磷酸化 形成d a g 和自由脂脐酸( f r e e 魏a c i d ，f f a ) ，也可通过乙酰水解酶藏p l a 形成t y s o p a f 捌。植物处于水分胁迫时或用a b a 处理组织，p l d 激活，其基因表达会增加，a b a 处理可增加p l d 基因酶启动子转录活性、m r n a 水平和膜结合活性骖瓤。p l d 在调 节果实衰老的可能枫理是分解磷脂、加剧细胞膜降解和衰老；下游产物激活其它一 些与果实成熟衰老相关的酶，知脂氧合酶等，共同作用加速果实艉成熟衰老；参与 乙烯、脱落酸等衰老因子的信号传导，促进果实的成熟衰老骑q 。 7 内蒙古师范大学硕士学位论文 睨外信号 p l d 淑活 机制 代 噻i 信号 作用 垒 ：或发育i ! i 程中l 界王1 、j ! 曩物 质, q a b a 乙；苒) 刮潋t- 7 i “、。“、 p p i 水平g 虽自缁联缩咆溶堰 弓高鞠刊丘( 船非 的变化受体鑫勺瀚活子浓睦增加片扶疆质) l ，多二一一一。 p l d g , j i 舌化 缩胞碰骀重堑与l ；方话c 与给复 反应增碴反应 生长发育与你眠与 褒老粜实的增碴反 成熟应 图1 2 植物p l d 激活和信号转导机制 f i g 1 2a c t i v a t i o na n ds i g n a lt r a n s d u c t i o nm e c h a n i s m so fp l d 1 3 3p l d 对环境胁迫和植物激素的响应 磷脂酶d 的催化活性表现在脂类代谢、膜再建、脂类信号分子( i p 3 、d a g 、p a ) 和游离脂肪酸( f f a ) 等的产生。近年来的研究表明磷脂酶几乎在植物所有的生命阶 段及对环境的应答中都起重要作用【5 1 ，5 5 ，5 7 5 9 1 。拟南芥p l dc l 缺失株的抗旱力比野生 型的j 1 氐 5 4 , 5 5 】。抗旱性强的更苏( c r a t e r o s t i g m a p l a n t a g i n e u m ) ，经脱水处理检测出p l d 活性增加【删。尽管更苏的许多脱水反应都能够受a b a 诱导，但用外源a b a 处理不 能快速激活p l d 。经脱水处理后，更苏中鉴定出2 种p l d o t ，其中一种的m r n a 增 加，受外施a b a 诱导。用豇豆作模式植物比较干旱胁迫下耐旱品种与干旱敏感品 种中p l d 的结果表明，干旱敏感型品种的p l d 比耐旱品种中增加的多，说明植物 受到干旱胁迫时，p l d 可及时将外界的变化传递到植物体内，其水解产物p a 可促 进a b a 及其调控的相关基因的表达，促进气孔关闭，从而减轻植物受害程度【6 1 1 。 郑风荣等研究水分胁迫下a b a 、p l d p l c 的抑制剂新霉素硫酸盐和a b a 合成的抑 制剂a n c y m i d o l 在玉米幼苗根系渗透调节物质积累中的信号作用的结果表明，水分 胁迫下，p l d p l c 对脯氨酸、可溶性糖和游离氨基酸积累有一定的促进作用。水分 胁迫下a b a 有可能通过其他第二信使对渗透调节物质进行调节【6 2 1 。 1 4 实时荧光定量p c r l 引言 实时荧光定量p c r ( r e a lt i m ef l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v ep c r ，r e a l t i m eq p c r ) ， 技术在1 9 9 6 年巍美国a p p l i e db i o s y s t e m s 公司推邀，在p c r 反应体系中加入荧光 染料或荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个进程，最后通过标准曲线或其他方 法对未知模板浓度进行定量分析。其特点有：( 1 ) 对扩增产物璧进行实时动态连续的 荧光监测。( 2 ) 通过荧光染料特异结合目的检测物大大提高了检测的灵敏度、特异性 和精确性。r e a l t i m eq p c r 可以用于m r n a 表达水平的研究、d n a 拷贝数的检测、 单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒 感染的定量监测。 1 4 1 实时荧光定量p c r 技术的基本原理 实时定量p c r 包括p c r 反应、荧光标记和监测系统三部分。加入荧光染料后 实时监测p c r 过程中扩增产物的积累，荠7 解p c r 产物动态增加的全过程。实验 过程中仪器检测荧光的强度，通过计算机软件确定荧光强度的基线r n 。和记录每个 隧闫点的荧光强度r n + ，透过公式a r n = m n + - r n 。得到每个时闻点确切的荧光强度增 加值，即每个时间点扩增产物的增加值，最终得出a r n 相对于循环数的曲线( 图 1 3 ) ，该曲线反映了p c r 产物累积过程【6 3 1 。 c t 值( t h r e s h o l dc y c l e ) 指产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数，是在 p c r 循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。 荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的l o 倍。一般认为在荧光阈值 以上所测出的荧光信号是个可信的信号，可用于定义一个样本的c t 值。通常用 不同浓度的标准样品的c t 值来产生标准曲线，然后计算相对方程式，通过软件可 从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量州】。 1 4 2 实时荧光定量p c r 技术的分类 目前r e a l - t i m eq - p c r 使用的荧光化学方法主要有四种，分别是d n a 结合染料 法、水解探针法、杂交探针法、荧光引物法。s y b rg r e e nl 是d n a 结合染料法的 一种，也是r e a l t i m eq - p c r 的最简单的方法，在p c r 反应体系中，加入过量s y b r g r e e nl 荧光染料，荧光染料特异性地掺入d n a 双链后，发射荧光信号。荧光染料 的优势在于它能监测任何d s d n a 序列的扩增，不需设计探针，检测方法简便，检 9 内蒙古师范大学硕士学位论文 图1 3 荧光定量p c r 扩增曲线 f i g 1 3a m p l i f i c a t i o nc u r v eo fr e a lt i m ep c r 测成本低。然而正由于荧光染料能和任何d s d n a 结合，因此也能与非特异d s d n a ( 女f i 引物二聚体) 结合，使实验产生假阳性信号，所以实验者需优化p c r 反应条件，提 高反应质量【6 5 】。 1 4 3 实时荧光定量p c r 技术的定量方法 1 标准曲线法相对定量法 此方法中，定量表达相对于某个参照物的量而言，相对定量的标准曲线较容易 生成，只要知道标准品的相对稀释度即可。在实验中样本靶序列的量来自于标准曲 线，最终须除以参照物的量，即参照物是l 的样本，其它的样本为参照物量的n 倍。 实验中为标准化加入反应体系的r n a 或d n a 的量，往往在反应中同时扩增一内源 控制物，如在基因表达研究中内源控制物常为一些管家基因。 2 比较c t 法的相对定量法 比较c t 法与标准曲线法相对定量法的不同之处在于运用了数学公式来计算相 对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物量，比较不同待测样本d n a 的c t 值 与对照样本d n a 的c t 值的变化，即可对未知样本靶基因的原始拷贝数作出判断。 但此方法以靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为前提，效率偏移将影响实际 拷贝数的估计【6 6 , 6 7 】。 3 标准曲线法的绝对定量法 此方法与标准曲线法的相对定量的不同之处在于其标准品的量预先已知。质粒 l o 1 引言 d n a 和体外转入的r n a 常作为绝对定量标准品的制备之用。标准品的量可根据 2 6 0 n m 的吸光度值著用d n a 或r n a 的分子量来转换成其拷贝数来确定。 1 5 本研究的目的和意义 水分亏缺一真以来是限制农业生产的主要因素之一，p l d 对干旱胁迫有应答反 应，受到越来越多的关注，p l d 对植物细胞生长及抗性生理缀重要，且在多种代谢 途径中有调控作用，近年来p l d 在信号转导中的作用成为研究的热点。目前p l d 详尽研究只限予模式植物，如拟南芥、烟草等，麸扁穗冰草中克隆p l d 基因和研 究干旱胁迫下其p l d 基因表达及作用未见报道。 该研究在基础理论方面可为棱物对环境信号的感知、传导和反应等方面提供实 验依据，有助于深入阐明植物对逆境信号适应性调节机制，实践上可为内蒙古地区 筛选优良的抗旱崩穗冰革资源提供理论依据，也可为牧草进行遗传改良提供实验基 础。 内蒙古师范大学硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 植物材料 扁穗冰草种子由中国农科院草原研究所提供。 2 2 仪器设备 e p p e n d o r f5 4 1 7 r 低温高速离心机；美国m j 的r t c 一1 0 0p c r 仪；北京六一的 d y y - i i 型稳压稳流电泳仪；b i o r a dm o l e c u l a ri m a g e r 凝胶成像分析系统；l r h - 1 5 0 b 生化培养箱，广东省医疗器械厂；h y b 恒温摇床，武汉科学仪器厂；h i t a c h iz 8 0 0 0 原子分光光度计；b i o r a di q 5 荧光定量p c r 仪。 2 3 试剂及菌种 r n a i s or e a g e n t ( t a k a r a ) ；r n al ap c r t mk i t ( t a k a r a ) ；3 - f u l lr a c e k i t ( t a k a r a ) ；5 - f u l lr a c ek i t ( t