（物理化学专业论文）acetobacter+xylinumnust42产细菌纤维素的发酵动力学初步研究.pdf

硕士论文a c e t o b o c t e r x y l i n u m n u s t 4 2 产细菌纤维素的发酵动力学初步研究 摘要 细菌纤维素由于具有高纯度、高持水性、良好的生物相容性和可生物降解性等优良 特性，而在在造纸、医药、生物医学工程和食品工业中具有广泛的应用。本文研究了实 验室自行筛选的细菌纤维素生产菌株a c e t o b a c t e rx y l i n u m n u s t 4 2 的发酵过程中，细菌 生长的测量方法，摇瓶发酵的条件优化，发酵动力学模型，以及以气升式发酵罐初步放 大a c e t o b a c t e r r y l i n u m n u s t 4 2 发酵中通气量的影响等内容。 在细菌生长的测量方法中，可先用纤维素酶降解发酵液中的细菌纤维素，释放产物 中的细胞，再用比浊法测定总的细胞浓度。 p l a c k e t t b u r m a n 实验得出发酵条件中的显著影响因素依次为：温度、初始p h 、装 液量。响应曲面分析法优化a c e t o b a c t e rx y l i n u m n u s t 4 2 摇瓶发酵条件中，运用 b o x b e h n k e n 设计考察温度、初始p h 和装液量三个主要影响因素对细菌纤维素产量的 影响，得出三个因素的最佳组合值：温度2 8 5 0 ，初始p h 5 8 6 ，装液量4 9 0 6 m l 和理 论最大产量5 9 9 9 4 9 l ，实测平均值为6 1 9 3 2 9 l 。在此基础上，构建了a c e t o b a c t e r x y l i n u m n u s t 4 2 发酵生产细菌纤维素过程中，菌体的非结构生长动力学模型、产物生成 动力学模型和限制性底物葡萄糖消耗的动力学模型。 气升罐的初步放大实验中，通气量对a c e t o b a c t e rx y l i n u m n u s t 4 2 的生长和细菌纤 维素的合成影响较大，发酵过程中应控制合适的通气量满足细菌生长需要，同时尽可能 使底物的能量流向细菌纤维素合成代谢途径。 关键词：a c e t o b a c t e r x y l i n u m n u s t 4 2 ，细菌纤维素，响应曲面分析法，发酵动力学， 气升式发酵罐 a b s t r a c t硕士论文 a b s t r a c t b a c t e r i a lc e l l u l o s eh a sw i d ea p p l i c a t i o n si np a p e ri n d u s t r y , m e d i c i n ei n d u s t r y , b i o m e d i c a l e n g i n e e r i n ga n df o o di n d u s t r y , b e c a u s eo fi t sk g hp u r i t y , h i g hw a t e rr e t e n t i o nc a p a b i l i t y , f a v o r a b l eb i o c o m p a t i b i l i t ya n db i o d e g r a d a b l ep r o p e r t y i nt h i st h e s i s ，m e a s u r e m e n tm e t h o do f c e l l sc o n c e n t r a t i o n , o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n si ns h a k ef l a s k , f e r m e n t a t i o n k i n e t i cm o d e l ，v e n t i l a t i o nv o l u m ei n f l u e n c ei nt h ep r e l i m i n a r ys c a l i n gu pt e s ti na i r - s t i r r e d f e r m e n t a t i o nt a n kd u r i n gp r o d u c t i o no fb a c t e r i a lc e l l u l o s eb ya c e t o b a c t e rx y l i n u m n u s t 4 2 ， w h i c hi ss c r e e n e db yo u r s e l v e sw a ss t u d i e d i nt h em e a s u r e m e n to fc e l l sc o n c e n t r a t i o n , i ti sb e a e rt od e g r a d eb a c t e r i a lc e l l u l o s eu s i n g c e l l u l a s ef i s r t ，t h e nt h et o t a lc e l l sc o u l db em e a s u r e db yt u r b i d i m e t r i cd e t e r m i n a t i o n t h er e s u l to fp l a c k e t t b u r m a nd e s i g ns h o w e ds i g n i f i c a t i o nf a c t o r sw e r et e m p e r a t u r e ， i n i t i a lp h ，l i q u i dv o l u m ei nt u r n i nt h eo p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n si ns h a k ef l a s k a p p l i e dr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y , b o x - b e h n k e nd e s i g ng a v et h eb e s tc o m b i n a t i o no f t e m p e r a t u r e ，i n i t i a lp ha n dl i q u i dv o l u m e ，w h i c hw e r e2 8 5 0 。c ，5 8 6 ，4 9 0 6 m li nt u r n , a n dt h e b e s tt h e o r e t i c a lp r o d u c t i o no f5 9 9 9 4 9 l ，w h i l ea v e r a g em e a s u r e dv a l u ew a s6 19 3 2 9 l t h e n an o n - s t r u c t u r em o d e lo fm i c r o o r g a n i s mg r o w t h , ap r o d u c t i o nf o r m a t i o nm o d e la n dal i m i t e d s u b s t r a t eo fg l u c o s ec o n s u m p t i o nm o d e lw e r ee s t a b l i s h e d i nt h ep r e l i m i n a r ys c a l i n gu pt e s ti na i r - s t i r r e df e r m e n t a t i o nt a n k , v e n t i l a t i o nv o l u m eh a d g r e a ti n f l u e n c e0 1 1g r o w t ho fa c e t o b a c t e rx y l i n u m n u s t 4 2a n ds y n t h e s i z a t i o no fb a c t e r i a l c e l l u l o s e as u i t a b l ev e n t i l a t i o nv o l u m es h o u l dm e e tt h en e e d so fc e l l sg r o w t ha n de n s u r e e n e r g yt o w a r d sb a c t e r i a lc e l l u l o s es y n t h e s i s k e yw o r d s ：a c e t o b a c t e rx y l i n u m n u s t 4 2 ；b a c t e r i a lc e l l u l o s e ；r e s p o n s e s u r f a c e m e t h o d o l o g y ；f e r m e n t a t i o nk i n e t i c s ；a i r - s t i r r e df e r m e n t a t i o nt a n k i i 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本学 位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或公布 过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使用过的 材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均己在论文中作了明 确的说明。 研究生签名：舢 山p 年占月；l 日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上 网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送交并授权 其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对于保密论文， 按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：o b p 年石月以日 硕士论文 a c e t o b o c t e r x y l i n u m n u s t 4 2 产细菌纤维素的发酵动力学初步研究 1 绪论 1 1 细菌纤维素概述 1 1 1 细菌纤维素的生产菌株 产纤维素细菌主要分布在醋酸菌属( a c e t o b a c t e r ) 、土壤杆菌属( a g r o b a c t e r i u m ) 、 假单胞杆菌属( p s e u d o m o n a s ) 、无色杆菌属( a c h r o m b a c t e r ) 、产碱杆菌属( a l c a l i g c n c s ) 、 气杆菌属( a e r o b a c t e r ) 、固氮菌属( a z o t o b a c t e r ) 、根瘤菌属( r h i z o b i u m ) 、八叠球菌属 ( s a r c r i n a ) 和葡糖杆菌属( g l u c o n o b a c t e r ) 等属中【1 】，【2 】。 木醋杆菌( a c e t o b a c t e r x y l i n u m ) 是最早发现的纤维素生产菌株，人们对它的研究已 较为透彻，并且是目前已知的合成纤维素能力最强的菌株，它被确认为研究细菌纤维素 生物合成过程及机制的模式菌株。关于木醋杆菌的分类及命名经历过一些变动。在科学 出版社1 9 8 4 年翻译出版的第八版伯杰细菌鉴定手册中，醋杆菌属被放在细菌门第 七部分的“革兰氏阴性好氧杆菌和球菌 下“位置不定的属”中，却没有详细的高级分 类单元。之后，在由美国w i l l i a m sw i l k i n s 公司1 9 8 4 年出版的第一版“b e r g e y sm a n u a lo f s y s t e m a t i cb a c t e r i o l o g y ”中醋杆菌属被归类至薄壁菌门( g r a c i l i c u t e s ) 的醋杆菌科 ( a c e t o b a c t e r a c e a e ) 中。在19 9 4 年由h o l t k r i e g & s n e a t h 等主编的“b e r g e y sm a n u a lo f d e t e r m i n a t i v eb a c t e r i o l o g y 第九版中，结合细胞学、遗传学和分子生物学的鉴定结果， 木醋杆菌被归于醋杆菌科( a c e t o b a c t e r a c e a e ) 下一个新的属中，定位在原核生物界的变 形杆菌f - j ( p r o t e o b a c t e r i a ) ，a 变形杆菌纲( a l p h a p r o t e o b a c t e r i a ) ，红螺菌目 ( r h o d o s p i r i l l a l e s ) ，醋杆菌科( a c e t o b a c t e r a c e a e ) ，葡糖酸醋杆菌属( g l u c o n a c e t o b a c t e r ) 。 1 1 2 细菌纤维素的结构性质 细菌纤维素是由葡萄糖以b 1 ，4 糖苷键连接而成的高分子化合物。其基本结构中， 相邻的d 吡喃葡萄糖的6 个碳原子不是在一个平面上，而是呈稳定的椅状立体结构， 见图1 1 ( a ) ，再由邻近的p 1 ，4 葡聚糖链由分子链内、链间的氢键连接形成不溶于水 的稳定聚合物，见图1 1 ( b ) 。细菌纤维素不掺杂其它多糖，而植物纤维素则含有此类 物质：这是二者在组成上的主要差别。 1 绪论 硕士论文 a b 图1 1 细菌纤维素化学结构示意图 与天然纤维素相比，细菌纤维素有许多独特的性质与优点【3 】：( 1 ) 细菌纤维素是一 种“纯纤维素 ，有高化学纯度和高结晶度；( 2 ) 具有很强的持水能力；( 3 ) 具有较好 的生物相容性，在自然界可直接降解，不污染环境；( 4 ) 纤维直径在0 0 1 9 m - - , o 1 p m 之 间，纤维模量为一般纤维的数倍至十倍以上，抗拉强度高；( 5 ) 细菌纤维素生物合成时 具有可调控性；( 6 ) 可利用广泛的基质进行生产；( 7 ) 具有很强的亲水性和稳定性。因 为细菌纤维素具有以上特性，故其在造纸、医药、生物医学工程和食品工业中具有广泛 的应用前景。 1 2 细胞浓度测定方法 在整个细菌纤维素发酵生产过程中，微生物( 即发酵菌株) 占主体地位，所有过程 均是围绕着发酵菌株而运作。但是目前茵体的测量仍然存在较大的误差，因为细菌纤维 素发酵过程中，有一部分菌体被包裹在产物中，一般的测量方法不能真实地反映出这部 分结果【4 1 。因此，寻找一种快速、简便、准确的测定细菌纤维素发酵过程中菌体细胞浓 度的方法十分必要，这将有助于人们把握细菌纤维素发酵过程并对其进行实时有效的控 制。 目前，测定细菌量的主要方法列于表1 1 中。每种方法都有各自的优缺点：直接计 数法主要是测得微生物的总数，不区分细胞的死活，其中的比浊计数法是一种常用到的 细胞计数方法；间接计数法的特点是测定结果为活菌数量；重量法是通过测定细胞的一 些特定物质的质量并根据其与细胞质量的定量关系从而得到细胞的总质量，将细胞分 离、干燥测其质量也是一种常用的细胞量测定方法。 2 硕士论文 a c e t o b o c t e r x y l i n u m n u s t 4 2 产细菌纤维素的发酵动力学初步研究 表1 1 细菌数量测定方法 分类主要方法 涂片染色法、血球计数板计数法、比例计数法、比浊 直接计数法 计数法 平板计数法、稀释液体计数法( 又称m p n 法) 、薄膜 间接计数法( 测定活菌数) 计数法 干重法、细胞含n 量法、d n a 含量法、其它生理生 重量法( 测细胞的质量) 化指标法 m o s m 籼【5 】发明了一种m t t 比色分析法，这种方法主要是根据活细胞内的琥珀酸脱 氢酶能够将淡黄色的m t t 3 ( 4 ，5 ) 双甲基2 噻唑( 2 ，5 ) 二苯基溴化四氮唑蓝 还原 成蓝紫色的甲躜( f o r m a z a n a ) ，但是死细胞没有这种效应。在一定的范围内，这种有色 结晶形成的量与活细胞数量成正比关系，不溶于水，可溶于一些有机溶剂如二甲基亚砜 ( d m s o ) ，并在5 7 0 n m 处有吸收峰。m 订法简单、灵敏、快速，最突出的特点是可以 测活细胞的数量，目前，一些生物活性因子的活性检测、细胞毒性试验、大规模的抗肿 瘤药物筛选以及肿瘤放射敏感性测定等领域已广泛采用这种方法。王栩等1 6 j 将m t t 法 应用于大肠杆菌计数中，探讨了此法的可行性，结果显示细菌数在3 8 1 07 m l 1 2 1 0 9 m l 范围内时，吸光度值与细菌浓度呈良好的正相关，证明了m t t 比色分析法适用 于活菌数量的检测。任娇蓉等【7 】使用改进的m t t - 四氯化碳萃取法测定活菌数，得出的 结果与传统的平板稀释法和比浊法的测定结果一致。 魏培莲等【s j 在固态发酵中，将核酸、麦角固醇和氨基葡萄糖三种细胞组分作为生物 量测定指标的可行性进行了比较研究，结果表明，核酸因在细胞中含量稳定，可较好地 反映出生物量的变化，氨基葡萄糖受培养基成分的影响只适合表征固定成分培养基中的 生物量，而细胞中麦角固醇的含量不太稳定，不适宜作测定生物量的指标。袁洪水等【9 】 用超声波破碎细胞，并用二苯胺显色法测定产黄青霉d n a 量，结果证明此法很好地反 映了发酵中微生物的量的变化情况。张李阳i lo j 在m o n a s c u s 3 液体发酵中考察了干菌 d n a 含量和菌体干重的关系，结果表明，两者变化的趋势一致，且d n a 含量占单位菌 体干重的0 3 左右。 张兆起掣1 1j 采用高效液相色谱法测定青霉素g 发酵过程中，茵体所占发酵液体积的 比例。该法测定数据直观，速度快，给发酵工艺控制和产量产率计算提供依据，但是对 仪器有较高的要求，一定程度上限制了这种方法的推广。 熊海燕等1 1 2 】采用浊度法测量发酵液浓度，先测定菌液在6 0 0 n m 波长下的吸光度，再 根据标准曲线查出菌体浓度，该方法因其简单、快速、准确度高等特点，成为测定菌体 浓度的一种较理想方法。高丹等i l3 】进行的一系列实验，确定了比浊法测定氧化亚铁硫杆 3 1 绪论 硕士论文 菌生长过程的条件以及步骤，结果表明，比浊法与传统的化学法相比，是一种快速且行 之有效的方法。严益引1 4 】探讨了光导纤维电极比浊法测定发酵液菌体浓度的波长、稀释 剂等的选择，选定6 2 0 n m 波长下，以正丁醇、乙醇、氯仿的混合液为稀释剂，测定样品 吸光度进行定量，此法测量相对误差小于3 ，相对标准偏差小于3 ，精密度和准确度 高，适合于实验或工业生产的监控。 易绍金等【l5 】使用长江大学制造的s p b j h 型产表面活性剂菌( s p b ) 测试瓶测定各 样品中的s p b 菌数，结果与m p n 法测得值基本一致，略低于平板法测得结果。细菌瓶 法测定采用绝迹稀释法原理，即将待测水样逐级注入测试瓶中稀释培养，直到测试瓶中 无菌生长为止，根据稀释的倍数换算出原样品中的细菌数目。 此外，随着计算机及自动化技术的发展，一些软测量技术以及在线检测在菌体浓度 测量中也得以实现。利用发酵液在无线电频率范围内的电容率是测量频率与菌体浓度的 函数这一关系，乔晓艳掣1 6 1 提出了一种实时在线检测发酵过程菌体浓度的新方法，研究 者还根据这一原理设计出检测传感器和自动检测系统，并且进行实验验证了此种方法的 可行性。王贵成掣r 7 】针对难以在线实时检测细胞浓度这一状况，采用遗传算法和b p 神 经网络相结合的方法( g a b p 网络) 对其进行软测量，通过对谷氨酸生产工艺过程的分 析，找到影响菌体细胞浓度的过程参数，从现场历史数据中选取样本，建立软测量模型。 1 3 细菌纤维素的发酵生产 目前国内外已有许多学者对细菌纤维素进行了研究，并且已经证明了这种新型生物 材料在许多应用领域的优越性，那么提高细菌纤维素的产量必然是扩大与推广它的应用 范围的前提条件，而筛选优良菌株、优化培养条件则是常用的方法。 w u 等【1 8 】采用高静水压诱变方法得到8 株变异菌株其细菌纤维素产量均在1 3 0 0 0 9 l ( 湿重) 以上，其中m 4 3 8 表现出最高的产纤维素能力( 湿重1 5 8 5 6 9 l ) 以及五代内最 低的变异率( 2 4 ) 。周伶俐等【1 9 】采用均匀设计法优化了自行筛选的菌株a c e t o b a c t e r x y l i n u m n u s t 4 的基础培养基，并向其中添加了m 9 2 + 、f e 2 + 、对氨基苯甲酸、烟酸、生 物素、乙醇，结果比s h 培养基发酵细菌纤维素的产量提高了1 2 倍，达到9 8 7 9 。b a s a v a r a j s h u n g u n d 等【2 0 】从腐败苹果中筛选出一株e n t e r o b a c t e ra m n i g e b u sg h 1 ，优化了培养基 组成，使纤维素产量由2 5 9 l 提高到4 1 9 l ，并向培养基中添加一些金属离子及有机试 剂，发现z n 2 + ，m 9 2 + ，c a 2 + ，以及甲醇、乙醇对这株菌产纤维素都有一定的促进作用。 c h e n g 等【2 l 】研究了各种添加物对细菌纤维素产量的影响，包括琼脂、羧甲基纤维素、微 晶纤维素和海藻酸钠，其中相对于空白组1 3 9 l 的产量，添加羧甲基纤维素组产量最高， 达8 2 9 l 。 向培养基中加入一些促进发酵的成分是比较有效的办法，但是从另一方面来讲，这 必然会提高生产成本，因此，又有一些学者研究了利用天然培养基、农业或工业生产的 4 硕士论文a c e t o b a c t e r x y l i n u m n u s t 4 2 产细菌纤维素的发酵动力学初步研究 废料来发酵生产细菌纤维素，这无疑是一种降低成本的好办法。 k u r o s u m i 掣2 2 1 研究了不同水果汁对a c e t o b a c t e r x y l i n u m n b r c l 3 6 9 3 发酵生产细菌纤 维素的影响，结果显示橘汁和日本梨汁最适宜于细菌纤维素的发酵生产。k o n g r u a n g 2 3 】 研究了三株木醋杆菌a x y l i n u m t i s t r 9 9 8 、a x y l i n u m t i s t r 9 7 5 和a x y l i n u m t i s t r 8 9 3 分别利用椰子汁和菠萝汁生产细菌纤维素，结果显示，利用椰子汁发酵时t i s t r 9 9 8 产 量最高，达5 5 3 3 3 9 l ( 湿重) ，利用菠萝汁发酵时t i s t r 8 9 3 产量最高，达5 7 6 6 6 9 l ( 湿重) 。 除培养基组成以外，影响微生物合成代谢产物的可变因素还很多，例如温度、p h 、 溶氧、种龄、接种量、发酵周期等【2 4 j 。酶是各种生化反应必需的条件，酶反应需要适宜 的温度，因此，温度对发酵来说必然是非常重要的条件，而p h 和溶氧也是细菌纤维素 发酵生产中比较重要的影响因素。 在所报道的大多数实验中，细菌纤维素生产的适宜温度范围是2 8 3 0 ，不过齐 香君等【2 5 j 筛选的菌株在2 0 时产细菌纤维素量最高。 j a g a n n a t h 掣2 6 j 在利用响应面法研究p h ，蔗糖和硫酸铵浓度的作用时得出结论，细 菌纤维素的发酵生产中p h 相对于蔗糖和硫酸铵浓度有着更加显著的影响。因菌株的不 同，发酵的最适p h 值也不同，许多报道中都提到a c e t o b a c t e rx y l i n u m 发酵生产细菌纤 维素的初始p h 需要在7 o 以下【2 7 1 。s a t o s h im a s a o k a 等【2 8 】研究发现，发酵的初始p h 在 4 o o 时细菌纤维素的产量较高。发酵过程中，由于微生物将葡糖糖转化为葡萄糖酸， 致使发酵液的p h 逐渐降低。v a n d a m m e 等【2 9 】使用原位控制方法来控制发酵过程中的p h ， 将乙酸添加到发酵液中，乙酸作为能源物质替换了葡萄糖，从而减弱了葡萄糖转化为葡 萄糖酸引起的发酵液p h 下降，保证了发酵过程中培养液p h 值稳定在5 5 左右。 k u n i h i k ow a t a n a b e 等【3 0 j 研究了氧分压对细菌纤维素发酵生产的影响，结果表明氧分 压为大气压的1 0 旷1 5 时产量最高，并且随着氧分压的升高，c 0 2 的浓度也升高，这 是细胞呼吸作用增强的结果。t o h r uk o u d a 等【3 l 】研究表明，高的c 0 2 分压会抑制细胞生 长从而降低细菌纤维素的产率与得率。 考虑到细菌纤维素发酵生产的特点，采用新型发酵方式或独特的反应设备已成为改 善细菌纤维素发酵生产的一个新的突破口。 本课题组【3 2 】发明了一种动静结合制备细菌纤维素的方法，先进行通气培养，以获得 大量的生长良好且活力高的菌种，再进行静置培养，工艺简单合理、操作方便、细菌纤 维素产量达到了1 3 6 轧。 s h e z a d 掣3 3 j 首次采用静态分批补料发酵方式在一个没有叶轮的3 l 发酵罐中发酵细 菌纤维素，结果得到的细菌纤维素产量比分批发酵的细菌纤维素产量要高出2 3 倍。 用浅层发酵培养方法来生产细菌纤维素，可以使用普通的发酵罐，但由于细菌纤维 素在合成过程中会下沉，因此，罐上一般要求安装一些固定部件，以使细胞混合。与此 1 绪论硕士论文 类似，由于细菌在颗粒表面形成的菌膜可能会限制氧气的传递，因而需要向培养基中加 入一些不溶于水的小物质，比如沙子、硅藻土或是玻璃球等，以提高细菌纤维素的产率 2 9 1 o t o m i t a 等【3 4 】提出，细菌因产生纤维素而向相反的方向移动，因此如果能提高细菌移 动的速率，相应地细菌纤维素的产率也会提高。他们用具有较好导向性的模具来发酵细 菌纤维素，结果显示产率有所提高，同时所生成的纤维素在形态及性能上都与一般的细 菌纤维素有差别。另外研究中还发现添加羧甲基纤维素钠有助于提高纤维素产生菌的移 动速率。 杨发禄等1 3 5 】以毛细管为模板成功获得了定向生长的束状细菌纤维素，并获得定向生 长束状细菌纤维素的最佳时间为1 0 d 。通过s e m 、f t - i r 分析得知，以毛细管为模板定 向生长的束状细菌纤维素改变了细菌纤维素的微观结构，但是并没有改变其化学结构。 与网状细菌纤维素相比，这种束状细菌纤维素作为一种新型的细菌纤维素材料，可望在 伤口缝合线、高强度增强纤维等方面得到应用。 使用专门的发酵罐，可以对细菌纤维素的合成进行较好的控制。b u n g a y 和s e r a f i c a t 3 6 1 通过使用一个直径为1 2 c m 的1 l 转盘反应器来生产细菌纤维素时发现，最适的糖浓度 为1 0 9 l ，盘的转速为1 2 r m i n ，p h 值为5 0 。k r y s t y n o w i c z 等f 3 7 】以木醋杆菌e 2 5 菌株为 菌种，用一个装有3 lh s 培养基的l l l 的转盘反应器来合成细菌纤维素，其结果显示 反应器的1 1 个直径1 2 c m 的盘的最佳转速为3 r m i n ，经过7 d 时间，最后得到了4 2 9 l 的细菌纤维素产量。 s o n g 等【3 8 】用改进的气升式反应器一球形鼓泡式反应器进行发酵，因其具有较高的 氧传递率和较低的剪切力而获得相对高的细菌纤维素产量。 在不断地搅拌及通气的发酵罐中大规模生产细菌纤维素常常会遇到许多问题，如会 自发出现c e l 突变株，这会使细菌纤维素产量下降；涡流的存在会对细菌纤维素的聚合 及结晶产生不良影响，从而导致多糖的产量下降，因此有必要对搅拌及通气条件进行优 化。j u n g 等【3 9 j 研究了利用具有六片叶轮的发酵罐发酵生产细菌纤维素时，分析了细菌纤 维素生产菌和突变菌的比例关系，结果显示，在一定的转速范围内，生产菌的比例随着 叶轮转速的提高而增加，似乎细菌被自身产生的纤维素所保护着，免受较大的剪切力的 影响；同时，向培养基中加入乙醇时，在保持较高的生产菌比例情况下可以提高前面所 述的最大的叶轮转速，从而提高生产菌的比例。 近年来，随着纳米材料的发展，其在细菌纤维素发酵技术中也有所涉及。y a n 等【4 0 】， 研究了在碳纳米管存在的条件下动态发酵生产细菌纤维素，所得的产品在结构和性能 上，均不同于普通静态和动态发酵得到的产品，这也使得细菌纤维素在将来会具有更为 广阔的应用前景。 6 硕士论文 a c e t o b a c t e r x y l i n u m n u s t 4 2 产细菌纤维素的发酵动力学初步研究 1 4 细菌纤维素发酵动力学 目前微生物发酵动力学一般包含三部分内容：微生物生长的动力学模型；微生 物代谢产物生成的动力学模型；底物消耗的动力学模型。 1 4 1 菌体生长模型 一般人们提到的微生物生长动力学模型指的是确定论模型，在此基础上，目前多采 用非结构模型来描述微生物的生长过程1 4 。 现代微生物生长动力学理论起源于m o n o d 方程： ：上 ( 1 1 ) k 。+ s 其中，肛为菌体比生长速率，p = d x ( x d t ) ；x 为菌体质量浓度；为菌体细胞的最 大比生长速率；s 为底物质量浓度；k s 为底物抑制常数。 目前，该方程仍在理论上占有重要地位。m o n o d 方程是一个经验性方程，其建立的 基本假设是：微生物生长中，生长培养基中只有一种物质的浓度会影响其生长速率，这 种物质被称为限制性基质，并且认为微生物为均衡生长且为简单的单一反应。根据这些 假说，微生物的比生长速率p 仅取决于限制性基质的浓度，此时，微生物的生长速率随 着限制性基质的浓度变化而呈抛物线变化【4 2 1 。 m o n o d 方程并不完全符合微生物的生长规律，仅适用于细胞生长较慢和细胞密度较 低的环境，故m o n o d 方程不适于木醋杆菌的动力学描述。而v e r h u l s t p e a r l 提出的l o g i s t i c 方程是目前应用较为普遍的方程之一，常用于单细胞生长动力学的描述。 l o g i s t i c 生长曲线原系比利时数学家e e v e r h u l s t 于1 8 3 8 年推导出来的，但长期被淹 没，直到2 0 世纪2 0 年代才被r p e 砌和l j r e e d 重新发现，目前它已广泛应用于动植 物的饲养、栽培、资源、生态、环保等方面的模拟研究。其特点是开始增长缓慢，而在 以后的某一范围内迅速增长，达到某限度后，增长又缓慢下来，曲线略呈拉长的“s ”， 因此，也叫s 型曲线。其表达式如下： 等= # r e x ( 1 一争) ( 1 2 ) a f a ” 其中，x m 为最大菌体浓度；t 为时间。 这种s 型曲线能很好地反映分批发酵过程中因菌体浓度的增加对自身生长存在的抑 制作用。邵伟4 1 1 、黄丹【4 3 1 、齐香君【4 4 1 、m h o m u n g l 4 5 】等人用此方程均较好地拟合了细 菌纤维素分批发酵过程的菌体生长规律。 木醋杆菌发酵生产细菌纤维素中乙酸对菌体的生长形成一定的抑制，同时由于细菌 纤维素的积累限制了氧的传递从而对细胞生长造成抑制。因此，马霞等【删采用c o n t o i s 7 1 绪论硕士论文 模型表示菌体生长动力学。其表达式为： 坐：箜 ( 1 3 ) m k s x + s 从方程的形式上看来，c o n t o i s 模型是在m o n o d 方程的基础上，将底物抑制常数磁 乘以x 菌体浓度。表示发酵过程中的抑制作用并非是固定不变，而是随着发酵过程中菌 体浓度的变化而变化。这一点是符合实际发酵情况的，是对m o n o d 方程的一个改进。 实际上，发酵过程的影响因素众多，除了上述方程中已经反映出来的菌体浓度、底 物、产物因素外，还有其它一些因素也会影响到所建立发酵动力学方程的准确性，如发 酵过程中气体的挥发，发酵液中溶解氧等都会对菌体生长产生影响，如果要将这些因素 也体现在动力学方程中，将能够更准确的预测发酵过程的变化。另一方面，菌体的测量 仍然存在较大的误差，因为细菌纤维素发酵过程中，有一部分菌体被包裹在产物中，一 般的测量方法不能真实地反应出这部分结果，还需要对测量方法进行改进以期达到更好 的测量结果，提高方程的准确度。 1 4 2 产物生成模型 根据产物形成与菌体生长的关系，g a d e n 将产物形成分成3 类：产物形成与细胞 生长相偶联；产物形成与细胞生长部分偶联；产物的形成与细胞生长没有关系。 l u e d e k i n g 和p i r e t t 4 7 】为此总结出如下方程来描述产物形成与细胞生长的关系： 一d p ：a 坚+ , o x ( 1 4 ) d lm 其中，p 为产物浓度；a ，b 为常数。当a = 0 ，啪时，产物形成与细胞生长无直接关系， 在微生物生长阶段无产物积累，当细胞停止生长时产物大量生成；当卿，b o 时，产 物形成为生长部分偶联型；当w e 0 ，p ：0 时，产物形成为生长偶联型，产物生成与细胞 生长呈相关的过程，产物是细胞能量代谢的结果。 邵伟【4 、黄丹1 4 3 1 、齐香君【删等人根据干膜产量曲线的变化趋势与相同时间内的生物 量变化趋势相类似，推测出细菌纤维素合成应属于生长偶联型。而马霞等】认为，细菌 纤维素的合成与木醋杆菌细胞的生长和细胞的浓度都有相关性，因此细菌纤维素发酵过 程应属于生长部分偶联型。 因为发酵生产细菌纤维素是一个极其复杂的过程，里面包含大量的生物化学反应， 人们对此过程的认识并不是非常清楚，细菌纤维素的生成与菌体生长之间的关系还不确 定，导致在产物形成的问题上存在分歧。同时，不同的研究人员在进行实验时条件( 菌 株、p h 值、底物浓度、底物类型、温度、反应器类型等) 不尽相同，这是造成研究人 员提出不同宏观方程的重要原因。 8 硕士论文 a c e t o b a c t e r x y l i n u m n u s t 4 2 产细菌纤维素的发酵动力学初步研究 1 4 3 底物消耗模型 根据物料平衡，限制性底物的消耗通常分为三部分，即用于菌体生长的、用于产物 合成的和用于细胞内源维持的消耗。基于此，研究者们建立了类似于l u e d e k i n g p i r e t 方 程的模型： 一一d s ：上坚+ m x m x + 上塑 ( 1 5 ) 一= + + 一 l 1 ，) d f y x f s d l y p f s d t 其中，为菌体对底物的得率系数；y p s 为产物对底物的得率系数；m 为细胞维持系 数。 上述模型在微生物发酵过程中是最为常用的底物消耗模型，b o v e e j 4 8 】在微生物发酵 生产酒精过程中，将底物的消耗与发酵体系中底物浓度和产物浓度相关联，提出了较为 简单的底物消耗模型： 一d s ：您a 尸声 ( 1 6 ) 以 其中，k 为底物消耗常数；a ，1 3 为常数。 模型( 1 6 ) 的形式虽然比模型( 1 5 ) 较为简化，但模型( 1 5 ) 从三个方面考虑了 底物的消耗途径，因此较为准确。 事实上，底物的消耗不仅仅限于模型( 1 5 ) 所考虑的三个方面，发酵生产细菌纤维 素过程中，底物仍然有其它的消耗途径。例如，用葡萄糖作碳源发酵细菌纤维素时还会 产生大量的副产物葡萄糖酸等。 1 4 4 溶氧的发酵动力学影响模型 微生物发酵产生纤维素是一个需氧的过程，在延滞期过后，细菌纤维素的生成和葡 萄糖消耗过程都会受到氧气扩散的制约【4 9 1 ，因而溶氧对发酵的影响也是不可忽视的。 k e w e iz u o l 5 0 1 等人在研究气升式发酵罐发酵细菌纤维素的流体力学时发现，随着反 应的进行，细菌纤维素的量不断增加，发酵液的粘度也不断增大，在发酵的后阶段溶氧 不断减少，特别是在葡萄糖耗尽之时。且微生物的比生长速率与体积氧传递系数k l a 之 间存在一定的关系。据此，他们在搅拌式发酵罐的菌体动力学方程基础上建立了气升式 发酵罐生产细菌纤维素的后阶段包含溶氧因素的菌体动力学方程： p 肝：, u + 0 0 0 9 6 ( k 丁l a 胛- k l a s r ) ( 1 7 ) 其中，队p 为气升式发酵罐生产细菌纤维素的微生物比生长速率；k l a n p 为气升式发酵罐 中的体积氧传递系数；k l a s t 为搅拌式发酵罐中的体积氧传递系数；“为发酵前期测得 的微生物比生长速率。 9 l 绪论 硕士论文 1 5 论文的主要研究内容和意义 目前通过筛选优良菌种、优化培养基组成等方法，已获得较高产的优质细菌纤维素。 而发酵动力学的研究是实现工业化规模生产的前提，因此有许多学者着手对细菌纤维素 发酵过程的动力学研究并建立了相关的数学模型。发酵动力学主要是研究发酵过程中诸 如菌体浓度、底物浓度、产物浓度等状态变量随时间的变化规律及其控制变量( 温度、 p h 值和溶氧等) 之间的关系。发酵动力学是实现发酵过程最优控制的前提条件，也是 研究发酵过程放大及从分批发酵过渡到流加发酵，连续发酵的理论基础。数学模型的建 立能够以简化的形式表征发酵过程行为，可用于进行工艺优化和计算机模拟，检测出可 能重要但被忽视了的参数，并且有助于阐明反应机理和代谢过程。 在微生物反应中，底物消耗和产物生成受微生物生长状态及代谢途径的影响很大。 被摄入到微生物细胞内的底物中，一部分转化为代谢产物，还有一部分则转化为新生细 胞的组成物质。因此，对微生物反应动力学进行研究，至少要对底物、菌体和产物3 个 状态变量进行数学描述。 本文主要研究内容有：细菌纤维素发酵过程中细胞浓度的测定方法，细菌纤维素发 酵条件的优化以及细菌纤维素发酵过程中茵体生长、底物消耗和产物生成的动力学模型 建立，气升罐生产细菌纤维素发酵条件的初步研究。 1 0 硕士论文a c e t o b a c t e r x y l i n u m n u s t 4 2 产细菌纤维素的发酵动力学初步研究 2 细菌纤维素发酵过程中细胞浓度的测定 2 1 材料与方法 2 1 1 菌株 a c e t o b a c t e rx y l i n u m n u s t 4 2 由本实验室筛选并保藏。 2 1 2 试剂 所用试剂中：纤维素酶为生物试剂，其他均为分析纯试剂。 斜面培养基( w v ) ：葡萄糖3 0 ，蛋白胨1 0 ，柠檬酸0 1 1 5 ，磷酸氢二钠0 2 7 ， 硫酸镁0 0 2 5 ，琼脂1 8 ，自来水定容，调节p h 至6 0 。 种子液培养基( w v ) ：葡萄糖2 o ，玉米浆0 6 ，磷酸氢二钾0 1 ，硫酸镁0 0 4 ， 硫酸铵o 6 ，自来水定容，调节p h 至6 0 。 p b s 溶液：氯化钠8 9 ，磷酸氢二钾1 1 5 9 ，磷酸二氢钾0 2 9 ，去离子水定容至1 0 0 0 m l ， 调节p h 为7 2 。 m t t 溶液：称取1 0 0 m g m t t 于小烧杯中，加2 0 m l 配置好的p b s 溶液使其充分溶 解，用0 2 2 v , m 的微孔过滤器除菌，2 0 避光密封保存备用。 纤维素酶液：取1 9 纤维素酶( 国药集团化学试剂有限公司) 用p h 4 8 柠檬酸柠檬 酸钠缓冲液溶解，定容至1 0 0 m l ，4 c 冰箱保存备用。 2 1 3 仪器 试验中所用到的仪器设备均列于表2 1 中。 表2 1 实验仪器和设备 2 细菌纤维素发酵过程中细胞浓度的测定 硕士论文 2 1 4 比浊计数法 取待测液稀释一定倍数，在6 0 0 n t o 下测吸光度，以0 2 2 p r o 的微孔过滤器过滤除菌 的发酵液作为空白对照。 2 1 5m t t 比色法 取l m l 发酵液，稀释一定倍数后加入o 1 m l m t t 溶液，混匀，3 7 下避光静置反 应2 h ，加入2 m l d m s o 振荡萃取，静置，取下清液于5 7 0 n m 波长下进行吸光度测定。 空白对照组以0 2 2 p r o 的微孔过滤器过滤除菌的发酵液进行相同处理。 2 1 6 实验步骤 培养方法：种子培养基中接入斜面母种后2 9 c ，1 5 0 r m i n ，培养2 4 h ，取出静置5 m i n ， 待絮状纤维素沉淀，吸取上部澄清培养液转接至新的种子培养基中，2 9 c ，1 5 0 r m i n ， 培养一定时间，待测。 实验方法：取出发酵种子液，均分为两份，一份静置待絮状纤维素沉淀，取上部澄 清发酵液进行比浊计数、血球计数板计数、平板计数和m 1 v r 实验；另一份取均匀发酵 液进行m t t 实验和比浊计数( 因均匀发酵液中有部分细菌被包裹在细菌纤维素中，因 此在采用比浊计数法前，先加入纤维素酶液，4 0 c 振荡水解2 h ) 。 2 2 结果与讨论 2 2 1 比浊法测定细胞浓度 创 巢 鼙 oo 5 1 1 522 533 544 5 血球计数板计数( 1 0 仰m 1 ) 图2 1a c e t o b a c t e rx y l i n u m n u s t 4 2 吸光度一血球计数板计数线性关系 由图2 1 可看出，对于细菌纤维素生产菌a c e t o b a c t e r x y l i n u m n u s t 4 2 ，在排除发酵 液中的产物絮状纤维素影响后，发酵液的吸光度与血球计数板得出的结果有较好的 线性相关性，发酵液的