（海洋生物学专业论文）西南印度洋中脊深海水体pahs降解菌的多样性分析.pdf

摘要 多环芳烃( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，p a r e ) 是指分子中含有两个或两个以上 苯环的烃类，具有毒性、致突变性、致癌性。深海是p a h s 污染物的一大归宿地，但 目前尚未有相关降解菌报道。为了解深海自然环境中的微生物在p a h s 污染中的自净与 修复作用，并寻找该深海环境中主要的p a h s 降解细菌，本论文对西南印度洋中脊深海 水样中降解菌的多样性进行研究。 三个采样点共十个不同层次的深海水样，深度从6 8 8 至3 1 1 4 米，分别以萘、菲、 葸和芘作为混合碳源富集得到十个p a h s 降解菌群。采用单菌分离鉴定及构建1 6 s r d n a 文库与d g g e 相结合的方法对这些菌群的结构进行了解析。十个菌群共分离到9 4 株不 同单菌，分属于3 1 个属3 9 个种，主要为变形菌纲a 和丫亚群，食烷菌、海杆菌、k a i s t i a ， 海旋菌、m a r i c a u l i s 和n i t r a t i r e d u c t o r 占优势，其中5 株菌可能属于新属，1 0 株菌属 于新种。 通过构建1 6 s r d n a 文库与d g g e 结合的方法，确定十个降解菌群中主要的主要 降解菌为食烷菌、海杆菌、海旋菌、新鞘氨醇杆菌、气单胞菌、赤细菌、解环菌及 p a r v u l a r c u l a ，并且发现仍有大量的降解菌未分离培养出来。其中解环菌仅在最底层的 水样中富集到，气单胞菌仅在菌群3 p c i 2 3 中发现，赤细菌仅在菌群3 p c i 3 9 中发现， p a r v u l a r c u l a 仅在菌群3 p c 9 9 中发现，其它四个属则在多个菌群中占优势。 通过比较测定十个降解菌群不同培养时间的菌体浓度及菌群结构变化，发现菌群 培养3 0 天达到最稳定状态。菌群培养4 0 天后培养基中的碳源萘和菲仅有微量残留， 蒽和芘则还有一半左右的残留量。 十个降解菌群中长势最好的菌群2 p c i 2 1 转接到7 种p a h s 单碳源及高环与低环 p a h s 组合碳源培养时，发现菌群以不同碳源组合培养时生长特别好，四环的芘和荧蒽 与三环的菲组合时降解效果特别好。 海旋菌和食烷菌在多个降解菌群中存在，特别是食烷菌更是在多个降解菌群中成 为优势菌，因此本文对此两个属的菌进行了系统的比较分析。 海旋菌在降解菌群中广泛存在，单菌功能验证暂未发现有降解能力，目前也未有 相关文献报道其功能。本研究对分离自不同海域的5 2 株海旋菌，以及3 个模式种，采 用1 6 s r d n a 、看家基因g y r b 及重复p c r 进行系统分类比较。结果发现它们的1 6 s r d n a 序列与相应模式种高达9 9 以上，少数为9 8 以上，但不同海域来源的菌株间的g y r b 差异确很大，可见海旋菌的多样性。通过g y r b 的系统发育树分析，可以将5 2 株海旋 菌中分出7 类可能的新种，目前正在进一步的鉴定中。重复p c r 的结果也支持g y r b 的分析结果，另外发现，g y r b 序列一样的菌株，其重复p c r 的带型也完全一样，g y r b 序列不一样的则带型存在差异，且g y r b 序列差异越大的其带型差异也越大，这也充分 证明重复p c r 技术的可靠性与灵敏性。 一株在十个p a h s 降解菌群中均有发现的食烷菌p 4 0 与5 株食烷菌模式种通过 1 6 s r d n a 和看家基因g y r b 的系统分类比较，结果发现菌株p 4 0 与a l c a n i v o r a xd i e s e l o l e i b 5 7 的1 6 s r d n a 相似度高达9 9 ，但毋怕相似度只有8 7 ，蛋白序列为9 6 ，而与 同样分离自深海的a l c a n i v o r a xd i e s e l o l e in 0 1 a 的1 6 s r d n a 的相似度也是9 9 ，g y r b 核酸相似度则高达9 9 ，蛋白序列更是达1 0 0 ，菌株p 4 0 和n o i a 可能是柴油食烷 菌的一个深海表型。 关键词：印度洋；深海；多环芳烃；生物降解；d g g e a b s t r a c t p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a h s ) a r eag r o u po fc o m p o u n d sc o m p o s e do ft w o o r m o r ef u s e da r o m a t i cr i n g s t h e ya r ep e r s i s t e n ti nt h ee n v i r o n m e n t ，a n da r et o x i c ，m u t a g e n i c a n d c a r c i n o g e n i c a i m so ft h i ss t u d yw e r et od e t e c tt h ed i v e r s i t yo fp a h s d e g r a d i n gb a c t e r i a f r o md e e ps e aw a t e rn e a rk a i r e ih y d r o t h e r m a lv e n t sa ts o u t h w e s tr i d g eo ft h ei n d i a no c e a n t e np a h s d e g r a d i n gc o n s o r t i u mw e r eo b t a i n e d b ye n r i c h m e n tw i t ham i x t u r eo f n a p h t h a l e n e ，p h e n a n t h r e n e ，a n t h r a c e n ea n dp y r e n ea sc a r b o ns o u r c e sf r o mt h ed e e ps e aw a t e r o ft h ei n d i a no c e a n s t r u c t u r eo fb a c t e r i a lc o m m u n i t i e sw a s a n a l y z e db y1 6 sl i b r a r ya n d d g g e0 3r e g i o no f1 6 sr d n a ) c o m b i n e dw i t hi s o l a t i o no fe u l t u r a b l es t r a i n s t o t a lo f9 4 s t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o mt e nc o n s o f l i a ，t h e yw e r ei d e n t i f i e dt ob e3 1g e n u sa n d3 9s p e c i e s m o s to ft h e mb e l o n gt oaa n d1 ，p r o t e o b a c t e r i a t h ep r e d o m i n a n tg e n u sw e r ea l c a n i v o r a x , m a r i n o b a c t e r , k a i s t i a ，t h a l a s s o s p i r a ，m a r i c a u l i sa n dn i t r a t i r e d u c t o r t h e r ew c ef i v e s t r a i n sb e l o n g i n gt on e wg e n u sa n dt e ns t r a i n st on e ws p e c i e sf o rt h e i rl o w1 6 sr d n a s e q u e n c es i m i l a r i t yt ot h ek n o w nt y p es t r a i n s a f t e ra n a l y z e db yd g g ea n ds e q u e n c eo f1 6 sl i b r a r y , t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e p r e d o m i n a n td e g r a d i n gb a c t e r i ai nt h et e nc o n s o r t i u mw e r ea l c a n i v o r a x ，m a r i n o b a c t e r ， n o v o s p h i n g o b i u m ，a l t e r o m o n a s ，c y c l o c l a s t i c u sa n dp a r v u l a r c u l a a n dt h e r ew e r em a n y c l o n e st h a td i d n th a v et h e c o r r e s p o n d i n gi s o l a t e s t h eg r o w t ha n dd y n a m i c so fb a c t e r i ac o m p o s i t i o no ft h et e nc o n s o r t i u mw e r ed e t e r m i n e d a td i f f e r e n tc u l t u r et i m e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec o n s o r t i u mr e a c h e das t e a d y g o i n g s t a t ea f t e ram o n t h t h e r ew a sal i t t l eo fn a p h t h a l e n ea n dp h e n a n t h r e n ew e r ed e t e c t e di nt h e m e d i u ma f t e r4 0d a y s ，b u th a l fo fa n t h r a c e n ea n dp y r e n es t i l lr e m a i n e d t h ec o n s o r t i u mo f2 p c i 2 1w a sg r o w i n gw e l lw h c nt r a n s f e r r e dt ot h em e d i u mw i t ht h e m i x t u r eo fd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e t h ep y r e n ea n df l u o r a n t h e n ew e t cd e g r a d e de f f e c t i v e l y w h e nc o m b i n e dw i t hp h e n a n t h r e n e t h a l a s s o s p i r aw e r ef o u n di nm a n yp a i l s d e g r a d i n gc o n s o r t i u mi no u rl a b ，b u tt h e yc o u l d n o td e g r a d ep a h sb yt h e m s e l v e s t h e r ew a sn o ta n yr e p o r tt os h o wt h e i rf u n c t i o n t o t a lo f 5 2s t r a i n so fg e n u st h a l a s s o s p i r aw e r ei s o l a t e db yo u rl a bf r o md i f f e r e n t0 e ：c a n ，t h r e et y p e s t r a i n sa d d i t i o n a l ，w e r ef h s ts t u d i e db a s e do n1 6 s ，g y r ba n db o x - p e r t h er e s u l t ss h o w e d t h a ts o m es t r a i n sw h i c hh a dh i g h1 6 ss i m i l a r i t yh a dal o wg y r bs i m i l a r i t y , a n dt h i sw a s f o u n dt ob er e l a t e dt ot h e i ri s o l a t i o np l a c e a f t e rp h y l o g e n e t i ca n a l y s i sb a s e do ng y r b ，s e v e n p o t e n t i a ln e ws p e c i e sw e r es e p a r a t e df r o mt h et o t a l5 2s t r a i n s t h er e s u l to fb o x - p c r c o m p a r i s o na l s os u p p o r t e dt h er e s u l ta n a l y s e db yg y r b a n dw ef o u n dt h a tt h es t r a i n sh a dt h e s a m ef i n g e r p r i n to fb o x - p c rw h e n t h e yh a dt h es a m eg y r bs e q u e n c e w h e nt h es t r a i n sh a d d i f f e r e n c ei ng y r bs e q u e n c e ，t h e yh a dd i f f e r e n tf i n g e r p r i n to fb o x p c rp r o d u c t f u r t h e r m o r e ，t h es t r a i n sh a dm o r ed i f f e r e n c ei ng y r bs e q u e n c e ，a n dt h e nt h e yh a dm o r e i a b s t n i c i d i s t i n c t i o ni nt h el a t t e r 1 1 i i ss t u d yp r o v e dt h a tt h eb o x 。p c rw a sr e l i a b l ea n ds e n s i t i v ei n t h ei d e n t i f i c a t i o no fd i f f e r e n ts t r a i n s h v et y p es t r a i n so fa l c a n i v o r a xg e n u sa n ds t r a i np 4 0w h i c hw a se m s t c di nt e n p a h s - - d e g r a d i n gc o n s o r t i u mw e l es t u d yb a s e do nh o u s e k e e p i n gg e n eg y r b 孔er e s u l t s i n d i c a t e dt h a ts t r a i nh a dh i g h1 6 ss i m i l a r i t y9 9 t oa l c a n i v o r a xd i e s e l o 如fb - 51 b u to n l y 8 7 s i m i l a r i t yo fg y r bn u c l e o t i d es e q u e n c ea n d9 6 s i m i l a r i t yo fg y r bp r o t e i ns e q u e n c e t h eo t h e rs t r a i na l c a n i v o r a xd i e s e l o l e fn 0 1 aw h i c hw a si s o l a t e df r o md e e ps e ah a dh i g h s i m i l a r i t yw i t hp 4 0a t9 9 ，9 9 ，1 0 0 o f1 6 s ，g y r bn u e l e o t i d es e q u e n c ea n dg y r bp r o t e i n s e q u e n c e , r e s p e c t i v e l y t h e r e f o r e w es p e c u l a t e d t h a tp 4 0a n dn o i aw o r ead e e p - s e a e c o t y p eo f a l c a n i v o r a xd i e s e l o l e l k e yw o r d s ：i n d i a no c a g a n ；d e e ps e a ；p a h s ；b i o d e g r a d a t i o n ；d g g e 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。 一躲磁磐仁 日期：7 刁年7 月萝自 f 国家海洋局第三海洋研究所 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解国家海洋局第三海洋研究所有关保留、使 用学位论文的规定，刊意本所保留并向国家有关部门或机构送交论文的复 印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权国家海洋局第三海洋研 究所可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于： 不保密口。 ( 请在以上方框内打“”) 学位敝作者签磋磐虚 眺硝7 月形 辱1 、多， d r v 月 j 、o j 名 年 醛 吖 老 ： 导 期 指 日 11 前言 1 1p a h s 对海洋环境的污染及其生物修复 1 1 1p a l l s 的化学特性及生物危害作用 多环芳烃( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，p a h s ) 是一类广泛分布于环境中的 含有两个苯环以上的有毒有害污染物，主要来源于人类活动和能源利用过程。目前 p a h s 作为持久性有机污染物，因具有以下特性而被大家所关注：( 1 ) p a l - l s 具有极强 的“三致”效应，即致癌性、致突变性及致畸性【1 一l 。人类及动物癌症病变有7 0 9 0 是环境中化学物质引起的，而p a h s 则是环境中致癌化学物质中最大的一类；( 2 ) p a h s 对微生物的生长有强抑制作用【3 1 。p a h s 因水溶性差及其稳定的环状结构而不易被生 物利用，它们对细胞的破坏作用抑制普通微生物的生长；( 3 ) p a h s 经紫外照射后毒性 更大( 光毒效应) 1 4 l 。p a h s 吸收紫外光能后，被激发成单线态及三线态分子，被激发分 子的能量可以通过不同途径损失其中一部分被激发的p a h s 分子将能量传给氧，从而 产生反应能力极强的单线态氧，它能损坏生物膜；美国环保局在8 0 年代把1 6 种未带 分支的多环芳烃确定为环境中的优先污染物( 图1 1 ) ，我国也把多环芳烃列入环境优 先监测的污染物黑名单中。如何有效清除p a l - i s 造成的环境污染，长期以来是一个世 界性的热点与难题1 5 j 。 国 h 印m _ _ 啊叫_ - 毋c c d 凸脚 n m b f 圆圆 p 妒捣舄 n 国撼母秽 图1 1 美国环保局确定的环境中优先治理污染物的1 6 种p a h s 分子结构图 f i g 1 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo ft h e1 6p o l y c y c l i ca r o m a t i c sh y d r o c a r b o n s ( p a h s ) c o n s i d e r e da sp r i o r i t yp o l l u t a n t sb yt h ea m e r i c a ne n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na g c n c y ( e p a ) 1 1 2 海洋p p d - l s 污染的来源 尽管p a h s 广泛存在于自然界中，比如石油，但是就进入环境中的由于人类活动 造成的污染而言，应当首推石油燃料的不完全燃烧1 6 1 。芳香化合物是石油中第二丰富 的组分，其中包含多种p a h s ，比如萘、菲以及它们的烷基取代物m 。每年有大量的 原油被开采并通过海洋运输到世界各地。据估计每年大约有总产量的0 1 进入海洋 环境。其中最具灾难性的是海上泄油事故。泄油事故发生后，易挥发的组分蒸发进入 大气，剩下的难挥发的、水溶性又差的组分一部分被光氧化，另外一部分成为黏附于 近岸沉积物的风化物质【8 l ，这类物质中最令人担忧的就是p a h s 。除石油以外，p a i l s 还是木馏油、煤焦油的主要组分【9 ，l o 。在它们的生产、使用过程中都会对环境造成污 染。 p a i - i s 污染环境还有很多途径包括：液化气的生产、木材处理( 用木馏油作防腐 剂) 、汽车尾气以及垃圾焚烧等。而p a h s 进入海洋环境则主要通过如下过程【1 1 l ：石 油运输过程中的意外泄露、石油产品的使用和加工、海洋渗流以及森林火灾。p a i l s 是疏水性物质，易于吸附到颗粒物质上，因此，沿岸和海洋沉积物是p a h s 最终的归 宿1 1 2 1 。，。 1 1 3 海洋p a l - i s 污染环境的生物修复 目前清除海洋石油污染( 尤其是其中的难降解成分p a i l s ) 的方法主要有物理方 法、化学方法和生物修复。物理方法、化学方法比较快速，但缺点是过于昂贵m ，而 且容易造成二次污染( 比如，泄漏到海面上的石油被一种吸油毡集中后，如果焚烧处 理会污染空气，如果深埋会对地下水、土壤造成二次污染) 。而生物修复能够利用降 解微生物将污染物转化、降解为无毒的终产物从根本上消除石油污染。具有成本低、 效率高、原位降解及不易造成二次污染等优点。因此，微生物降解被认为是清除p a h s 污染最有效的手段之一。 虽然自然界中广泛存在能够降解p a n s 的微生物，但是p a h s 的降解速率和效率 会受到很多条件的限制。包括p a l l s 本身的特性以及环境嗣子。以p a l - i s 污染的土壤 或沉积物的生物修复为例：由于p a h s 具有很强的疏水性，所以很容易结合到土壤或 沉积物的有机颗粒中，使得它们的生物利用度大大降低。因此，在治理过程中加入表 面活性剂、溶剂、腐质酸等才会使p a n s 更加容易被降解微生物利用【1 3 t 蠊1 6 1 。而 在海洋石油污染的生物修复中，限制降解的主要因子是海水中相对缺乏的氮、磷元素 x t i 。很多研究表明，在海水中添加氮、磷元素无机肥料，表面活性剂可以大大提高降 解的效果。 2 生物修复也有它自身的一些限制，比如清除p a h s 不彻底，一些有毒的降解中间 产物的积累1 1 8 , 1 9 j 0 】等等。所以，在实际应用中还是要结合多种手段的对污染环境进行 综合治理 2 1 , 2 2 1 。 利用海洋环境中土著微生物降解p a i l s 进行生物修复的可行性在于：海洋微生物 作为一个整体具有高度的代谢多样性，这带来的结果是：很多生物有害、难处理有机 污染物( 有的是自然界原本不存在，而是由人类合成的，比如p c b s ) ，包括p a i l s 都 可以被转化或降解。 1 1 3 1 海洋p a i l s 降解菌的种类 海洋环境尤其是深海环境蕴藏着众多不为人类所知的微生物，它们具有数量巨 大，代谢类型多样和适应突变能力强等特点，是海洋污染环境生物修复的主体，任何 存在污染物的地方都会出现相应的降解微生物，并存在着或强或弱的生物降解作用 【冽。因此，了解海洋环境中多环芳烃降解微生物组成，并从中分离筛选高效的降解菌 株必然能更加有效地促进p a h s 污染的生物修复进程。 目前研究者们已经从环境中获得了一些p a l h s 降解微生物，常见微生物有红球菌 属( r h o d o c o c c u s ) t u l 、假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) i 瑚、分枝杆菌施m r f 蜊) 2 6 1 、芽 孢杆菌属( 砌c 讲珊) 明、黄杆菌属( 6 叩衙m 埘) 【矧、鞘氨醇单胞菌属( s p h i n g o m o n a s ) 1 2 9 1 、新鞘氨醇杆菌属( n o v o s p h i n g o b i u m ) 【刈、气单胞菌属0 e r d m d 刀册) 【3 1 l 、弧菌属 ( 1 4 b r i o ) 3 2 1 、拜叶林克氏菌属 拈朋c t 幻) 【3 3 】、棒状杆菌属( c b ，) 坍p 6 口c 耙一堋) 【州、微球 菌属( 舭阳卵淞) 、蓝细菌( o 伽d 6 a 耙，砷【3 6 1 和诺卡氏菌属( d 伽砌口) 【卅等。研究者 就微生物对多环芳烃的降解效果及其影响因素也进行了大量深入的研究，如聂麦茜等 a s l 从焦化废水污染的污泥中分离出1 株优势短杆菌，研究表明f e 3 + 对该菌株降解菲、 葸、芘3 种多环芳烃有明显的促进作用。夏颖【3 9 】对筛选自石油污染土壤的两株菲降解 菌z x 4 和e v a l 7 进行了较为系统的研究，将邻苯二酚2 3 一双加氧酶编码基因在ec o l i b l 2 1 进行了成功表达，初步检测结果显示，重组菌株的酶表达量要明显高于出发菌 株。 1 1 3 2p a h s 降解途径研究 由于p a h s 的降解取决于其化学结构的复杂性和降解酶的适应程度，降解的难易 程度与p a h s 的溶解性、苯环数目、取代基及其位置等因素均有关系，而且不同的微 生物对各类p a h s 的降解机制也有很大的差异。近年来，p a h s 的代谢途径研究比较 清楚的只有萘、菲这样简单的e m - s ，而四环及以上的p a h s 的生物降解机理还正处 于研究阶段。 3 前言 p a h s 微生物的代谢途径调控机制大致为：丝状真菌产生单加氧酶，对p a l - i s 降 解的第一步是羟基化p a h s ，即把一个氧原子加到底物中形成芳烃化合物，继而氧化 为反式双氢乙醇和酚类；根据白腐真菌对菲、蒽等的降解产物，可推测降解途径和酶 促反应机制，整个降解过程包括第一阶段的分解代谢和第二阶段的结合反应。 l e a b e z a l e l 等删通过细胞质和微粒体中的酶活性测定发现，在菲前阶段的分解代谢中 起作用的酶有细胞色素p 4 5 0 单加氧酶和开环酶。细菌对p a i l s 的降解第一步是苯环 的裂解，催化这一反应的酶称作p a h s 双加氧酶，是由还原酶、铁氧还蛋白、铁硫蛋 白组成的酶复合物，它把两个氧原子加到底物中形成双氧乙烷，进一步氧化为顺式双 氢乙醇，双氢乙醇可继续氧化为儿茶酸原儿茶酸和龙胆酸等中间代谢物，接着苯环断 开产生琥珀酸、延胡索酸、乙酸、丙酮酸和乙醛。降解中的产物被微生物用来合成自 身的生物量同时产生c 2 0 和h 2 0 ( 于秀艳，2 0 0 4 ) 4 1 l 。s i m o nm j 1 4 2 】通过对含有n a h 质粒的恶臭假单胞菌g7 株和含有p d t g l 质粒的恶臭假单胞菌n c i b 9 8 1 6 - 4 菌株的研 究发现：在萘的降解途径中，首先发生作用的酶是萘加双氧酶，并已经获得萘加双氧 酶的纯化制品。高分子量p a h s 最初的氧化即苯环加氧比较缓慢，此后降解进程加快， 没有或很少有中间代谢物的积累。p a h s 的酶降解具有很强的区域性和选择性。 除了对降解多环芳烃的相关酶类深入研究外，研究人员同时对与多环芳烃代谢紧 密相关的遗传组分也做了深入的研究，研究发现一些代谢多环芳烃的相关基因在细菌 染色体上，如m i c h i e i s 等( 2 0 0 4 ) 1 4 3 l 以基因n i d a 为探针，对m y c o b a c t e r i u ms p $ 6 5 基 因组d n a 进行u t h 锄杂交发现染色体组存在有2 个独立降解的芘的基因簇。研究 发现还有一些代谢多环芳烃的相关基因除存在于染色体上外，在细菌质粒上也发现了 此类基因，其中与萘代谢相关的质粒大小从3 0 k b 到1 7 5 k b ，其中约3 0 k b 是与萘降 解相关的基因，这方面研究最深入的质粒是恶臭假单胞菌( 3 7 株的n a h 7 质粒。其基 因分为恶臭假单胞菌g 7 株的n a h 7 质粒。其基因分为两个操纵子，“上游”操纵子的 编码，是将萘转化为水杨酸盐的基因，丽“下游”操纵子编码是进一步将水杨酸盐间位 断裂为丙酮酸和乙醛的基因，即n a h 7 质粒“上游”的操纵子将芳香烃转化为芳香酸， 而“下游”途径的操纵子将芳香酸转化为三羧酸循环产物，最终矿化为c 0 2 和h 2 0 ( 杨 永华，1 9 9 5 ) 【卅。 相对于有氧降解来说，p a h s 的无氧降解进程较慢，其降解途径目前还处于研究 阶段。c o a t e sj d 等( 1 9 9 7 ) 【4 5 】研究表明，在硫酸盐还原环境中p a i l s 的微生物降解 还是存在的，它以硝酸盐和硫酸盐作为电子受体，可以降解萘、菲、荧葸等。 此外，p a h s 降解基因的克隆与高效表达研究工作的开展也为降解关键酶的进一 4 步研究以及降解p a l - i s 的基因工程菌构建奠定了基础。张杰等( 2 0 0 3 ) 脚】采用特异性引 物，以菲、芘降解菌株z l 5 的代谢性质粒为模板，扩增出邻苯二酚2 ，3 双加氧酶( c 2 3 0 ) 基因。将该基因和表达载体p e t - 3 0 a ( + ) 连接，转化e c o l i j m l 0 9 ，获得了高效表达的转 化子。 为了提高降解菌的降解效率，工程菌的构建目前也成为了众多研究者的研究焦 点。刘志高等( 2 0 0 6 ) 1 4 7 1 采用原生质体电融合技术，在葸降解菌和土生菌之间实行原 生质体电融合，并从再生的融合予中筛选到后期生长稳定并具高效蒽降解能力的后代 菌株。魏明宝等( 2 0 0 6 ) 【柏l 也通过此方法获得了既能高效降解蒽，又同时能产生生物 表面活性剂的能力的融合子。 1 1 3 3 实际应用的案例 1 9 8 9 年在美国阿拉斯加海岸e x x o i i v a l d e z 号泄油事故发生后，调研事故现场发现 有大量土著降解菌。加入含氮、磷无机盐溶液和亲脂性肥料，石油中几乎全部正烷烃 在六周内被全部降解。海岸上又黑又粘的岩石变成白色【4 9 1 。 1 2p a h s 降解研究中分子生物学技术的应用 。 在前期，研究者对p a h s 的研究降解大多都集中在可培养降解菌的分离筛选及降 解特性的研究上，然而微生物菌群作为一个整体其作用更是不可忽视的。在自然环磬 中，尤其是海洋环境中绝大多数微生物在实验室条件下都是未培养的和不可培养的 1 5 0 l 。仅仅通过筛选到的部分降解菌来全面认识降解过程和机理是不行的。因此，随着 技术的日新月异，一些不依赖传统培养方法的研究手段应运而生，逐步实现了对降解 菌群的组成结构的解剖和对降解过程中菌群动态变化的跟踪，为全面研究p a h s 的微 生物降解提供了有力保障。 1 2 1 海洋微生物多样性研究的传统方法 2 0 世纪4 0 年代以来，人们一直采用分离培养的方法来研究海洋微生物的多样性，即 将海洋微生物从环境中分离纯化。然后通过一般的生物化学性状或者特定的表现型来 分析其多样性。然而，随着人们对海洋微生物研究的不断深入，发现这种方法并不能全 面地反映海洋微生物多样性的现状，因为海洋中微生物往往集结在一起，一些微生物经 常处于“活的非可培养状态”( v i a b l eb u tn o n c u l t u r a b l es t a t e ，v b n c ) ，而且用于分离培 养的培养基具有很强的选择作用1 5 1 1 ，这些都导致了建立在微生物纯培养技术上的传统 方法只能反映极少数微生物的信息，不能充分全面反映海洋微生物的生态功能，也使大 量的具有极大应用价值的海洋微生物资源被埋没了。a m a n n 等1 5 2 l 根据微生物原位的、 不依赖于培养的微生物系统发育学的研究结果认为：通过实验室人工培养方法已经分 5 离和描述的海洋微生物物种数量仅占估计数量的1 - 5 。而其余9 5 9 9 的微生物类 群仍然未被分离和认识。 1 2 2 海洋微生物多样性研究的现代方法 由于传统研究方法的局限，研究人员开始尝试其他的方法，从而避开对纯培养技术 的依赖。这几种方法虽然在一些方面具有传统方法无可比拟的优越性，但也存在着很 大的局限性【5 3 1 ：( 1 ) 荧光显微镜直接计数法，此方法通过荧光染色和滤膜浓缩相结合， 以研究环境中微生物的丰度，但由于不能提供关于微生物形态的准确信息，所以无法 在微生物分类上提供足够信息。( 2 ) 扫描电镜法，只能揭示微生物外部形态，并不能提 供进行微生物分类的足够信息。( 3 ) 透射电镜法，此法的限制性类似于扫描电镜法，且 十分昂贵。“) 微生物醌指纹法，通过分析微生物醌的组成，可以定量评价海洋环境中 微生物的群体组成和微生物多样性。该方法简单方便，灵敏度高，其局限性是不能反映 具体哪个属或哪个种的变化。( 5 ) 微生物微量板鉴定分析技术，主要是通过微生物对 微量板上各类碳源的代谢能力进行检测而建立起来的一系列微生物数值分类鉴定系 统，如美国的b i o l o g 、b b lc r y s t a l 、英国的s e n s i t i t r e 、法国的b i o m e r i e u x 等微生物鉴 定系统。此外还有美国m i d i 微生物鉴定系统，通过菌体脂肪酸气相色谱分析，利用菌 体膜脂肪酸构成差异来进行微生物鉴定。这些分类鉴定技术可以应用于海洋微生物多 样性的分析研究，但由于种种限制，应用得并不广泛。 1 2 3 分子生物学技术在海洋微生物多样性研究中的应用 自1 9 8 5 年p a c e 等利用核酸序列的测序来研究微生物的进化问题以来，对微生物 多样性的研究便进入了一个崭新的阶段【剐。采用聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ，p e r ) 、1 6 sr d n a 序列分析以及a r d r a ( a m p l i f i e dr d n a r e s t r i c t i o n a n a l y s i s ) 等现代分子生物学技术在基因水平上研究海洋微生物多样性，可以克服微生物培养技 术的限制，能够对样品进行比较客观的分析，较精确地揭示海洋微生物的多样性。目前， 分子生物学技术在海洋微生物多样性研究中的应用主要集中于以下几个方面。 ( 1 ) 分子杂交法( m o l e c u l a rh y b d d i z a f i o n ) 包括膜杂交和原位杂交方法等。其原理是：人工合成能与某类群微生物特征基因 序列互补的寡聚d n a 或r n a 探针，并以荧光或放射性标记该探针，然后利用探针与微 生物基因杂交，通过荧光显微镜技术或放射自显影技术对微生物的群落结构进行研 究。与后面将要介绍的其它方法相比，特点是不需要对目标基因进行p c r 扩增，因此可 以避免p c r 过程中产生的误差；但是同样由于未对目标基因进行扩增，目标基因浓度 较低，有时会给检测带来困难；且有时目标类群的目标基因序列并非完全同一，而是有 6 亚类群之间的差异，结果所设计的探针d n a 序列与某些亚类群的目标基因互补性较差， 从而导致对该类群的估计过低【5 5 】：而更重要的不足之处是，只能用来检测事先估计到 其存在、已知其目标基因序列、并为之设计好引物的类群。 ( 2 ) 聚合酶链式反应法( p c r ) 实际上除上面的分子杂交法之外，下面将要介绍的几类分子生物学方法都需要对 目标基因进行p c r 扩增，然而仅依靠在p c r 试验中使用具有类群特异性的引物，不进 行酶切、变性、克隆和电泳等后续手段，也能够用来鉴别特定微生物类群的存在冈。 p c r 法与后面几种方法是紧密联系的，它的优缺点也影响着后面将要介绍的几种方法 的质量。其原理是利用人工合成的引物介导的d n a 聚合酶链式反应，根据不同水平的 特异性，仅需知道两段已知序列，就可以扩增出未知的d n a 区段。微生物多样性研 究中对p c r 法的应用包括定性和定量研究，定量的p c r 分析方法较为复杂，可分为： 稀释p c r ( l i m i t i n gd i l u t i o np c r ) 5 7 。8 l 、动力学p c r ( k i n e t i cp c r ) 和竞争性 p c r ( c o m p e t i t i v ep c r ) 。p c r 法实验操作简单快捷，灵敏度高，对样品的要求低，只要 有完整的靶序列即可。失活的样品也同样适用。但p c r 也具有其显著的局限性：首先， t a q 酶缺乏3 一5 端的外切酶活性，因而不能纠正反应中发生的错误的核营酸掺入，发 生“错配”使p c r 产物有一定比例的错误序列，而且随着反应循环数的增加，错配将不， 断积累；其次，当扩增目标是所有微生物时，p c r 的高灵敏度也容易导致污染，可 能出现假阳性的结果；而在抑制剂等影响下也可能出现假阴性结果。在定量p c r 分 析中存在的问题是：由于不同种群的基因组大小和每个细胞复制子数量的差异，单 个细胞中1 6 sr d n a 的数量难以估计，进而造成对种群丰度估计的偏差。 ( 3 ) 克隆基因文库分析法 其原理是：提取微生物的基因组d n a 并以p c r 法扩增保守序列，然后建立基因 文库，最后通过分析基因文库获得关于微生物群落多样性的信息。基因文库分析的具 体方法有以下几种：( 1 ) 以菌落杂交法( c o l o n yh y b r i d i z a t i o n ) 利用具有类群特异性的 d n a 探针对文库进行快速扫描【5 9 删，通过观测每一种基因型的拷贝数，可以估计各 类群微生物的丰度，应用此方法的前提是已知群落中各类群的特征基因序列，并针对 特征序列合成探针，但实际上预测各类群的特征序列比较困难；( 2 ) r f l p 分析：对各 个克隆进行r f l p 指纹图谱分析，此方法较d n a 测序法节省时间，但本身不能确定 各菌种的分类地位。( 3 ) d n a 测序：能够提供关于各个克隆分类地位的可靠的信息， 但需要很长的试验周期、大量的试验材料，实际工作中对所有的克隆进行测序难以实 现，通常需要与r f l p 法或t - r f l p 法结合，或者只随机挑选部分克隆进行测序；而 7 且根据克隆的拷贝数估计种群丰度将导入随机误差。 ( 4 ) 基因指纹图谱技术 1 ) 单链构象多态性法( s s c p ) ，此技术1 9 8 9 年由o d i n 6 1 垮首先采用，其基本原理 是：对p c p 产物进行变性处理，使双链d n a 变为单链，然后进行非变性凝胶电泳，单 链d n a 在非变性条件下通过分子内力形成与其碱基序列有关的二级结构，此二级结 构的形成影响d n a 分子的电泳迁移速率，从而可以将序列有差别的单链d n a 分离开 来。s s c p 法中对p c r 产物的显色可以使用硝酸银或溴乙啶。也可以对p c r 引物或产 物进行荧光或放射性标记，以提高方法的灵敏度。s s c p 法的优点是操作比较简便，价格 低廉，而且s s c p 分离的p c r 产物可以直接用来进行序列测定。s s c p 法的弱点在于其 灵敏性随p c r 产物d n a 长度的增加而下降。 2 ) 变性梯度凝胶电泳法( d g g e ) ，1 9 9 3 年m u y z e r 【6 2 】首先采用变性梯度凝胶电泳法 分析1 6 sr d n a ，其原理是通过在电泳凝胶中建立由低到高的变性条件梯度，使变性 条件不同的d n a 依次变性，产生电泳迁移速率的差异，从而将其分离开来，由于 d g g e 法不依赖限制性酶切，从而能够保证目标d n a 的完整性，分离所得的目标 d n a 片段经纯化后可直接用来测序，是该法的优点。但是到目前为止，对没有进行 荧光或同位素标记的d n a 的染色技术灵敏性相对较低，造成d g g e 法的灵敏度较 低；与可以使用内标法的t - r f l p 法相比，d g