（植物学专业论文）外源基因在集胞藻6803中高效表达及调控的研究.pdf

d i s s e r t a t i o nf o rd o c t o r a ld e g r e e ，2 010 u n i v e r s i t yc o d e ：10 2 6 9 s t u d e n ti dn o ：5 2 0 7 13 0 0 0 0 4 e a s tc h i n an o r m a l u n i v e r s i t y s t u d yo nt h eh i g he x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o no fe x o g e o u sg e n e si n t h ec y a n o b a c t e r i u ms y n e c o c h c y s t 西s p s t r a i np c c6 8 0 3 p c a n d i d a t e ：w e il a n z h e n m a r2 0 1 0 62洲0删44帅7fiiii洲y 华东师范大学学位论文原创性声明 郑重声明：本人所呈交的学位论文外源基因在集胞藻6 8 0 3 中高效表达及调控 的研究是在华东师范大学攻读博士学位期间，在导师的指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰 写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说 明并表示谢 作者签名： 华东师范大学学位论文著作权使用声明 外源基因在集胞藻6 8 0 3 中高效表达及调控的研究系本人在华东师范大学攻 读博士学位期间在导师指导下完成的博士学位论文，本论文的研究成果归华东师范大 学所有。本人同意华东师范大学根据相关规定保留和使用此学位论文，并向主管部门 和相关机构如国家图书馆、中信所和知网“送交学位论文的印刷版和电子版；允许 学位论文进入华东师范大学图书馆及数据库被查阅、借阅；同意学校将学位论文加入 全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出 版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于( 请勾选) ( ) 1 经华东师范大学相关部门平均数核定的“内部”或“涉密”学位论文，于 年月日解密，解密后适用上述授权。 本人签名： ，沙f 口年b “涉密”学位论文应是已经华东师范大学学位评定委员会办公室或保密委员会审定过的学位论文 ( 需附获批的华东师范大学研究生申请学位论文“涉密”审批表主为有效) ，未经上述部门审 定的学位论文均为公开学位论文。此声明不填写的，默认为公开学位论文，均适用上述授权。 魏兰珍回堂博士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 米华玲研究员中科院上海植生所主席 张大兵教授上海交通大学 何培民教授上海海洋大学 王幼芳教授华东师范大学 朱瑞良教授华东师范大学 题 目： 专业： 导师： 研究方向： 研究生： 外源基因在集 植物学 王全喜教授 藻类生物学 魏兰珍 摘要 蓝藻是一类能进行光合放氧作用的原核生物。集胞藻6 8 0 3 ( s y n e c h o c y s t i ss p s t r a i n p c c6 8 0 3 ) 是一种单细胞蓝藻。该株系具有天然d n a 转化系统，细胞结构简单，生 长速度快，适应性强，是第一个完成基因组序列测定的光合生物。另外，它还能利用 简单无机物合成有机物，并且表达的外源基因产物不易形成包含体。因此，利用转基 因蓝藻制备基因工程药物的下游加工过程相对简化，是理想的基因工程研究的模式 藻。但是，蓝藻中外源基因的表达效率低下，一直制约着蓝藻基因工程的长足发展。 本研究以增强型绿色荧光蛋白基因e g o , ( e n h a n c e dg r e e n f l u o r e s c e n t p r o t e i n ) 作为 外源基因，构建适用于插入各种调控元件的同源重组整合平台p 0 载体；然后利用 该整合平台，通过插入各种已知的和未知的调控元件、自然转化、继代筛选，从而获 得了多种转基因株系；通过比较各种转基因株系中外源基因的表达水平，对各种调控 元件进行评价，从而筛选出能高效表达蓝藻外源基因的调控元件，具体步骤如下： ( 1 ) 利用p 0 载体，在其报告基因上游分别插入聚球藻7 9 4 2 中g r o e s l 基因的温度 诱导型启动子以及s d 序列( g g a g a g ) ，转化集胞藻6 8 0 3 ，得到转基因p g 和p g - s 藻株。利用蛋白免疫印迹，研究不同生长时期、不同温度以及不同诱导时间下转基因 株系中外源馏勿基因的表达情况。研究结果表明，处于衰退期的转基因株系中外源基 因的表达水平最高；并在此生长时期下，该启动子最适宜的诱导条件是在4 2 0 c 诱导 3 0 分钟。通过比较各转基因藻中外源基因的表达情况发现：添加s d 序列后则使外源 基因的表达水平提高了1 6 倍，而含g r o e s l 基因启动子和s d 序列的p g s 藻株中外 源基因的表达水平比未添加启动子的p o 藻株提高了2 0 倍。综上所述，在集胞藻6 8 0 3 中，异源g r o e s l 基因启动子和s d 序列的串联可明显提高蓝藻细胞中外源基因的表 达水平。 ( 2 ) 利用p o 载体，在报告基因上游插入聚球藻7 0 0 2 中印印基因的光诱导型启动 子，并转化集胞藻6 8 0 3 ，获得转基因藻p c 。通过蛋白免疫印迹，研究不同光强、不 同诱导时间以及不同c 0 2 浓度对转基因株系中外源e g c p 基因的表达情况。结果表明： 1 0i t e m - 2 s 1 的光强诱导4 小时后，转基因株系中外源基因的表达水平达到最高，而且 摘要 低浓度的c 0 2 也可以明显增强外源e g f p 基因的表达。 ( 3 ) 通过基因芯片数据和生物信息学的分析，初步确定n d h c k j 操纵子可能的启 动子区域，并插入到p 0 载体报告基因的上游区域，转化集胞藻6 8 0 3 ，获得转基因株 系p 3 3 0 。通过蛋白免疫印迹，研究不同生长时期、不同高光诱导时间以及二氧化碳浓 度下转基因株系中外源基因的表达情况。结果表明，该未知启动子在高光诱导4 小时， 低二氧化碳培养条件下，使外源e g f p 基因的表达水平达到最高。通过比较p g s 与p 3 3 0 藻株中外源基因的表达情况，揭示n d h c k j 操纵子可能的肩动子区域对外源基因的 启动效果更为显著；p 3 3 0 藻株中外源基因的表达水平比p g s 藻株提高4 2 倍，比p 0 藻株提高8 2 倍；蛋白定量结果表明，在转基因p 3 3 0 藻株中，外源e g f p 基因的表达 量可达总蛋白的i 7 2 5 。 本研究在构建同源重组双交换平台的基础上，分析来源于聚球藻7 9 4 2 的g r o e s l 基因启动子、聚球藻7 0 0 2 的印印基因启动子、s d 序列以及集胞藻6 8 0 3 自身n d h c k - j 操纵子可能的启动子区域对集胞藻6 8 0 3 中外源基因表达水平的影响。蛋白免疫印迹 结果表明，这些调控元件均在一定程度提高了集胞藻6 8 0 3 中外源基因的表达效率， 其中，n d h c k j 操纵子可能的启动子区域对外源基因表达水平的提高幅度最大。以上 结果为最终解决蓝藻细胞这一新型宿主系统中外源基因表达效率低下的问题注入了 新的希望，为将来利用转基因蓝藻制备基因工程药物奠定了实验基础。 关键词：集胞藻6 8 0 3 ，增强型绿色荧光蛋白，g r o e s l 基因、c p c , a 基因、启动子、 s d 序列 捅要 t i t l e ：s t u d yo nt h eh i g he x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o no fe x o g e o u sg e n e si nt h e c y a n o b a c t e r i u ms y n e c o c h c y s t i ss p s t r a i np c c 6 8 0 3 m a j o r ：b o t a n y s u p e r v i s o r ：w a n gq u a n x i r e s e a r c hd i r e c t i o n ：p h y c o l o g y p h dc a n d i d a t e ：w b il a n z h e n a b s t r a c t c y a n o b a c t e r i aa r ea u t o t r o p h i cp r o k a r y o t e sp e r f o r m i n go x y g e n i cp h o t o s y n t h e s i s s i m i l a rt ot h a to fh i g h e rp l a n t s s y n e c h o c y s t i ss p s t r a i np c c6 8 0 3 ( s y n e c h o c y s t i s6 8 0 3 ) i sa u n i c e l l u l a rc y a n o b a e t e r i u m ，a n di t sc o m p l e t eg e n o m ei sf i r s tc h a r a c t e r i z e di n p h o t h o s y n t h e t i co r g a n i s m s m o r e o v e r ，t h i su n i c e l l u l a rc y a n o b a c t e r i u mp o s s e s s e sm a n y c h a r a c t e r i s t i c s ，i n c u d i n gt h en a t u r a ld n a t r a n s f o r m a t i o ns y s t e m ，s i m p l ec e l ls t r u c t u r e ，f a s t g r o w t h ，s t r o n ga d a p t a b i l i t y , a n do b t a i n i n gt h eu s e f u lo r g a n i cp r o d u c t sw i t hl i t t l e e x p e n d i t u r eo fe n e r g ya n dr e s o u r c e s a l s o ，t h ep r o d u c t s t h a te x o g e n o u sg e n e se x p r e s s e di n c y a n o b a c t e r i aa r en o te a s yt og e n e r a t et h ei n c l u s i o nb o d i e s ，a n dm o s to fc y a n o b a c t e r i aa n d t h e i re x t r a c ta r en o n t o x i ct ot h eh u m a n sa n da n i m a l s o nt h eb a s i so ft h e s ec h a r a c t e r i c t s ， c y a n o b a c t e r i aa r ef o u n dt ob et h ep e r f e c tm o d e la l g a ef o rs t u d i n gt h eg e n e t i ce n g i n e e r i n g a l t h o u g hm a n ye x p r e s s i o np l a s m i d so fc y a n o b a c t e r i a lc e l l sh a v eb e e ne x t e n s i v e l yr e p o r t e d ， t h ee x p r e s s i o nl e v e l so ff o r e i g ng e n e sh a v en o tb e e no p t i m i z e d t h e r e f o r e ，h o wt oe n h a n c e e x o g e n o u sg e n ee x p r e s s i o nl e v e l si nc y a n o b a c t e r i a lc e l l sr e m a i n s u n c l e a r t h ea i m so ft h i ss t u d yw e r et oe n h a n c et h ee x p r e s s i o nl e v e l so fe x o g e n o u sg e n e ， e n h a n c e dg r e e n f i u o r e s c e n tp r o t e i n ( e g f p ) g e n e ，i ns y n e c h c o s y s t i s6 8 0 3b yc h a n g i n g d i f f e r e n tr e g u l a t o r ye l e m e n t s t h e s ei n t r e s t i n gf i n d i n g sa r el i s t e da sf o l l o w s ： f i r s to fa l l ，t w oh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nv e c t o r s ，p - g r o e s la n dp - g r o e s l - s d ， w e r ec o n s t r u c t e db yi n s e r t i n gt h eg r o e s lp r o m o t e rg e n e ，i n d u e db yt e m p e r a t u r e ，o r i g i n a t e d f r o ms y n e c h o c o c c u s7 9 4 2 ，a n dt h eg r o e s lp r o m o t e rg e n ea n ds ds e q u e n c e ( i e ， g g a g a g ) i n t h eu p s t r e a mo fe g 勿，r e s p e c t i v e l y s u b s e q u e n t l y , t h e s e2v e c t o r sw e r e t r a n s f e r r e dt os y n c h o c y s t i s6 8 0 3t oc o r r e s p o n d i n g l yg e n e r a t e2t r a n s g e n i ca l g a e ，p ga n d p g - s f u r t h e r ，t h ee x p r e s s i o nl e v e l so fe x o g e n o u sg e n e ，嘶，i np ga n dp g 。sw e r e i n v e s t i g a t e du n d e rd i f f e r e n tg r o w t hp h a s e s ，t e m p e r a t u r e s ，a n dt i m ep o i n t sb yu s i n g i m m u o b l o t t i n g t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rt h ee x p r e s s i o no fe g f g i ns y n e c h o c y s t i s6 8 0 3 w e r ea t4 2 。cf o r3 0m i n u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，c o m p a r i s o n s n l ! ! i j ! 一 _ _ _ _ _ - - - _ - _ - - i _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ - - _ l - _ - - _ - 一。 o ft h ee x p r e s s i o nl e v e l so fe g f pi np g ，p g ss t r a i n si n d i c a t e dt h a ti na d d i t i o nt os ds e q u e n c e i np g - se n h a n c e d1 6t i m e st h a nt h a tp ga n dt h ea p p l i c a t i o no f g r o e s lp r o m o t e rg e n ea n d t h es ds e q u e n c ei np g se n h a n c e d2 0t i m e st h a np 0s t r a i n t a k e nt o g e t h e r ，t h e s er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h eg r o e s l s dt a n d e mw a sm o r ee f f i c i e n tf o rt h ee x p r e s s i o no fe g f pi n s y n e c h o c y s t i s6 8 0 3 s e c o n d l y , ah o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nv e c t o r , p 0 一c p c 8 ，w a sc o n s t r u c t e db yi n s e r t i n g t h ec p c bp r o m o t e rg e n ei nt h eu p s t r e a mo fe g f pg e n e s u b s e q u e n t l y , t h ev e c t o rw a s t r a n s f e r r e dt os y n e c h c y s i 括6 8 0 3 ，b yu s i n gn a t u r et r a n s f o r m a t i o ns y s t e m ，t og e n e r a t et h e t r a n s g e n i ca l g a ，p e f u r t h e r , t h ee x p r e s s i o nl e v e l so fe x o g e n o u sg e n e ，馏勿，i np c w e r e i n v e s t i g a t e du n d e rd i f f e r e n tl i g h ti n t e n s i t i e s ，t i m ep o i n t sa n dc 0 2 c o n c e n t r a t i o n sb yu s i n g i m m u o b l o t t i n g t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o re x p r e s s i n gt h e e x o g e n o u sg e n e ，p 罟彦，w e r eo ne x p o s u r eo fp c c e l l st ot h el i g h to f10b t e m - 2 s - 1f o r4 hw i t h l o wc 0 2c o n c e n t r a t i o n t h i r d l y , o nt h eb a s i so f t h eg e n ec h i pd a t aa n db i o i n f o r m a t i c sa n a l y s e s ，t h ep r o m o t e r r e g i o n ( 3 3 0 b p ) i nt h en d h c k jo p e r o nw a s d e t e r m i n e dp r e l i m i n a r i l y n e x t ，ah o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o nv e c t o r , p 0 3 3 0 ，w a sc o n s t r u c t e db yi n s e r t i n gt h e3 3 0 一b pp r e d i c t e dp r o m o t e r i nt h eu p s t r e a mo fe g f pg e n e ，a n dt h e nt h i sv e c t o rw a st r a n s f e r r e di n t os y n c h o c y s t i s6 8 0 3 c e l l st og e n e r a t et r a n s g e n i ca l g a ，p 3 3 0 f u r t h e r , t h ee x p r e s s i o nl e v e l so fe x o g e n o u sg e n e ， p 功，i np 3 3 0w e r ei n v e s t i g a t e du n d e rd i f f e r e n tg r o w t hp h a s e s ，t i m ep o i n t su n d e rh i g hl i g h t ， a n dc 0 2c o n c e n t r a t i o n sb yu s i n gi m m u o b l o t t i n g t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h em a x i m u m l e v e l sf o rt h ee 曲e x p r e s s i o nw e r eo b t a i n e du n d e rt h ee x p o s u r eo fp 3 3 0c e l l st oh i g hl i g h t a n dl o wc 0 2f o r4h c o m p a r i s o no f t h ee x p r e s s i o nl e v e l so f e g 勿i np 3 3 0a n dp g 。s ( c o n t r 0 1 ) ，i tw a s f o u n dt h a tt h ee x p r e s s i o na m o u n t si np 3 3 0w a sa p p r o x i m a t e l y 4 2t i m e s t h a nt h a ti np g s a n d8 2t i m e st h a nt h a ti np 0 ；a n da t t a i n e d1 8 i nt o t a lp r o t e i n ，i n d i c t i n g t h a tan o v e lp o t e n t i a lp r o m o t e r ，p 3 3 0 ，i sm o r ee f f i c i e n tf o re x p r e s s i n ge x o g e n o u sg e n e si n c y a n o b a c t e r i at h a no t h e r ，i d e n t i f i e dp r o m o t e r ss u c h a sg r o e s l ，c p c 归 i nt h i ss t u d y , o nt h eb a s i so ft h ec o n s t r u c t i o no ft h eh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n p l a t f o r m ，t h ee f f e c t so fm a n yr e g u l a t o r ye l e m e n t s ，i n c l u d i n gg r o e s lp r o m o t e ro r i g i n a t e d f r o ms y n e c h o c o c c u s7 9 4 2 ，c p c | bp r o m o t e ro r i g i n a t e df r o ms y n e c h o c o c c u s7 0 0 2 ，s d s e q u e n c e ，a n dn o v e lp o t e n t i a lp r o m o t e r , p 3 3 0 ，c o n t a i n e di nt h en d h c _ k - jo p e r o n ，o nt h e i v e x p r e s s i o nl e v e l so fe x o g e n o u sg e n e ，劝，w e r ea n a l y z e d b a s e do nt h er e s u l t so f i m m u n o b l o t t i n g ，w ef o u n dt h a ta l lt h e s er e g u l a t o r ye l e m e n t sc a n e n h a n c et h ee x p r e s s i o n l e v e l so fe x o g e n o u sg e n ei ns y n e c h o c y s t i s6 8 0 3w i t hd i f f e r e n td e g r e e s o ft h e s er e g u l a t o r y e l e m e n t s ，t h ep r e d i c t e dn o v e lp r o m o t e ri nt h en d h c k - jo p e r o ni st h em o s te f f i c i e n tf o r e x p r e s s i n gt h ee x o g e n o u sg e n ei nc y a n o b a c t e r i a t h e s er e s u l t sw i l lf u t h r e rh e l pi ns o l v i n g t h el o w e x p r e s s i o nl e v e l so fe x o g e n o u sg e n ei nc y a n o b a c t e r i a lh o s t ，a n de s t a b l i s h i n gt h e e x p f i m e n t a lb a s i sf o ro b t a i n i n ge f f i c i e n t l yt h ed r u g sb ya p p l y i n gc y a n o b a c t e r i a lg e n e t i c e n g i n e e r i n g k e y w o r d ：s y n e c h o c y s t i s6 8 0 3 ，e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g r o e s lg e n e ， c p c 8g e n e ，p r o m o t e r , s ds e q u e n c e v 目录 第一章文献综述 1 1 蓝藻遗传学背景 目录 1 1 1 蓝藻基因转移系统的建立 1 1 1 1 遗传转化 1 1 1 2 接合转移 1 1 1 3 噬藻体侵染系统一 1 1 2 蓝藻基因工程载体 1 1 2 1 穿梭表达载体一 1 1 2 2 同源重组载体一9 1 1 3 蓝藻基因组学研究进展 1 1 3 1 蓝藻基因组研究的数据库 1 1 3 2 几种常见蓝藻基因组信息 1 2 报告基因的选择及应用 1 2 1 绿色荧光蛋白基因( 咖) 1 1 1 3 1 5 1 6 1 7 1 2 2p 一半乳糖苷酶报告基因( 1 a c z ) 1 3 外源基因在蓝藻中表达的研究现状 1 3 1 蓝藻表达外源基因的优势一 1 3 2 蓝藻表达外源基因的不足 1 4 外源基因高效表达及调控策略 - l7 1 4 1 转录水平调控外源基因的高效表达 1 4 1 1 启动子的特点 2 0 - 2 0 - ，2 0 1 4 1 2 蓝藻中常用启动子的介绍 1 4 1 3 利用生物信息学进行蓝藻启动子筛选一 1 4 2 翻译水平调控外源基因的高效表达 1 4 2 1s d 序列对外源基因表达的影响 1 4 2 2 遗传密码偏好性对外源基因表达的影响 1 5 本研究的目的与总体设计 第二章集胞藻6 8 0 3 同源重组整合平台的构建 1 材料与方法一 1 1 质粒、菌株和蓝藻藻种一 1 2 主要试剂 2 4 2 6 2 6 1 3 蓝藻的培养 2 7 1 4 蓝藻基因组总d n a 的抽提 1 5p c r 反应 v i j 2 9 2 9 2 9 2 9 3 0 3 0 目录 1 6 同源重组整合平台的构建 1 7 蓝藻的转化 1 8 转基因蓝藻p o 的分子检测 1 9 转基因蓝藻p o 中e g f p 表达分析 2 结果与分析 2 1 上游载体的构建 3 2 2 2 下游载体的构建 2 3p u c - k a r l 的构建一 2 4p u c - e f g p 的构建 3 2 3 2 2 5p o 载体的构建 2 6 转基因p 0 藻株的获得与分子检测 2 7 转基因p o 藻株中e g f p 表达分析 3 5 3 6 3 7 3 8 3 9 3 讨论4 0 第三章g r o e s l 启动子对蓝藻中外源e 暑勿基因表达的影响4 1 材料与方法一4 2 1 1 质粒、菌株和蓝藻藻种4 2 1 2 主要试剂一 1 3 蓝藻的培养一 1 4 同源重组载体p g 和p g s 的构建一一4 2 1 5 蓝藻的转化 1 6 转基因蓝藻的分子检测 1 7 生长曲线的测定 1 8 蛋白定量一 - 4 4 - - - - 4 4 1 9 表达产物的w e s t e r nb l o t 检测一- 4 5 2 结果与分析 2 1 异源g r o e s l 启动子对外源e g f p 基因表达的影响一一一- 4 5 2 1 1 同源重组载体p g 的构建 2 1 2 转基因p g 藻株的获得及分子检测 2 1 3 不同生长期对外源e g f p 表达的影响 2 1 4 不同诱导温度对外源e g f p 表达的影响 2 1 5 不同诱导时间对e g f p 表达的影响 - 4 5 2 2 异源g r o e s l 启动子及s d 序列对外源基因表达的影响 2 2 1 同源重组载体p g s 的构建 2 2 2 转基因p g s 藻株的获得及分子检测 2 2 3 不同生育期对外源e g f p 表达的影响 2 2 4 不同诱导温度对p g s 藻株中外源e g f p 表达的影响 5 7 2 2 5 不同诱导时间对p g s 藻株中外源e g f p 表达的影响一一5 8 v i i i 2 2 6s d 序列对外源基因表达的影响 5 9 3 讨论61 第四章c p c l b 启动子对蓝藻中外源g 吕章基因表达的影响6 2 l 材料与方法 1 1 质粒、菌株和蓝藻藻种 1 2 主要试剂 6 2 一6 2 6 2 1 3 蓝藻培养一6 2 1 4 同源重组载体p e 的构建一一6 3 1 5 蓝藻的转化 1 6 转基因蓝藻的分子检测 1 7 生长曲线的测定 - - - 一6 4 6 4 1 8 蛋白定量6 4 1 9 表达产物的w e s t e r nb l o t 检测一一6 4 2 结果与分析 2 1 同源重组载体p c 的构建一- 6 4 2 2 转基因p c 藻株的获得及分子检测一 2 3 不同光照强度对外源e g f p 表达的影响 2 4 不同光照时间对外源e g f p 表达的影响 2 5 不同c 0 2 浓度对外源e g f p 表达的影响 3 讨论 - 6 7 第五章p 3 3 0 对蓝藻中外源e g f p 基因表达的影响 l 材料与方法 1 1 质粒、菌株和蓝藻藻种 1 2 主要试剂一 1 3 蓝藻培养一 6 8 6 9 1 4 启动子区域的预测 1 5p 3 3 0 的克隆及载体的构建 1 6 蓝藻的转化 1 7 转基因p 3 3 0 藻株的分子检测 1 8 生长曲线的测定 1 9 蛋白定量 7 l 7 3 7 3 7 4 7 4 1 1 0 表达产物的w e s t e r nb l o t 检测 2 结果与分析 7 6 7 6 7 6 2 1 目的基因的选择及信息学预测 2 2 高光对集胞藻6 8 0 3 中n d h k 表达的影响 2 3p 3 3 0 载体的构建 7 6 - 7 7 7 8 2 4 转基因p 3 3 0 藻株的获得及分子检测 i x 7 9 目录 2 5 生长期对p 3 3 0 藻株中外源e g f p 表达的影响一一8 l 2 6 不同高光诱导时间对外源e g f p 表达的影响 2 7 高低二氧化碳对p 3 3 0 藻株中e g f p 表达的影响 2 8 几种启动子作用的比较一 3 讨论 第六章总结与展望 1 总结v 2 展望 附录i ：发表文章目录 附录i i ：缩写 参考文献 致谢 8 6 8 7 8 9 8 9 9 0 9 3 9 4 9 5 1 1 1 x 第一。章文献综述 第一章文献综述弟一早义陬练迎 蓝藻( b l u e g r e e na l g a e ) 又称蓝细菌，约1 5 0 属，2 0 0 0 余种，是一类能进行 放氧光合作用的原核生物。细胞壁结构与革兰氏阴性菌类似，因此，适用于大肠 杆菌的各种分子生物学操作在蓝藻细胞中同样适用( 王业勤等，1 9 9 1 ) 。蓝藻的光 合机构与高等植物叶绿体类似，含有n t 绿素a ，以藻胆体作为主要的捕光天线，是 地球上最早出现的光合自养生物。有些蓝藻还具有能进行固氮和氢代谢的异型胞。 在长期演化过程中，蓝藻形成了广泛的适应性，能够在海洋、内陆水体、土壤表 面、冰山、极地、温泉和荒漠等各种环境中生存( b 福迪，1 9 8 0 ) 。 1 1 蓝藻遗传学背景 1 9 7 0 年s h e s t a k o v 与k h y e n 首次在聚球藻7 9 4 3 ( s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 3 ) 中发现外源d n a 的转化作用( s h e s t a k o v & k h y e n ，19 7 0 ) 。随后，由于蓝藻基因转 移系统的建立、蓝藻质粒载体的构建以及基因随机和定点突变等技术的发展，使 得蓝藻分子遗传学的基础得以迅速奠定( 王业勤等，1 9 9 1 ) 。到九十年代中后期， 某些蓝藻全基因组序列测定完成，加上基因的系统敲除、转录组学、蛋白质组学 和生物信息学在内的一些实验手段和方法的确立与完善，蓝藻分子遗传学的研究 跨入了基因组和后基因组学时代( 魏兰珍等，2 0 0 4 ；孔任秋等，2 0 0 1 ) 1 1 1 蓝藻基因转移系统的建立 蓝藻基因改造的发生大致可分为三个阶段：l 、外源d n a 通过基因转移系统 进入宿主细胞；2 、外源d n a 在宿主细胞中稳定复制并表达；3 、外源d n a 与宿 主细胞染色体或内源质粒结合，或者在宿主细胞中进行自主复制( v i o q u e ，2 0 0 8 ) 。 由上可知，基因转移系统的选择和建立是对蓝藻细胞进行遗传操作的先决条件。 至今为此，只有极少数的蓝藻种类可被用于转化，且外源基因在这些蓝藻中的转 化效率也较低，从而使得蓝藻外源基因的转化效率远低于大肠杆菌，这也成为阻 碍蓝藻基因工程发展的重要因素之一。目前，蓝藻的基因转移系统主要有两类： 一类是遗传转化，包括自然转化、诱导转化、电击转化；另一类是接合转移。另 外也有少数种类蓝藻可以通过噬藻体侵染系统吸收外源d n a 。 1 1 1 1 遗传转化 蓝藻的遗传转化包括自然转化、诱导转化、电击转化。 第一章文献综述 1 自然转化 自然转化是指对数生长期的蓝藻细胞在不经任何处理的情况下，直接吸收外 源d n a 的基因转移系统。聚球藻7 0 0 2 ( s y n e c h o c o c c u ss p p c c7 0 0 2 ) 、聚球藻7 9 4 2 ( s y n e c h o c o c c u ss p p c c7 9 4 2 ) 和集胞藻6 8 0 3 ( s y n e c h o c y s t i ss p p c c6 8 0 3 ) 等一 些无异型胞分化的单细胞蓝藻，在进行外源基因转化过程中，无需诱导成感受态 细胞，就具有自然吸收外源d n a 的能力( p o r t e r , 1 9 8 6 ) 。目前可进行自然转化的 蓝藻绝大多数属于聚球藻( s y n e c h o c o c c u s ) 和集胞藻( s y n e c h o c y s t i s ) 两个属( 秦 松等，1 9 9 9 ) 。 s t e pl ：c o n s t r u c t i o n o f t h ep l a s m i dd n ao s t e p3 ：m i x t u r eo f t h ec e l l s u s p e n s i o nw i t he x o g e n o u sd n a s t e p4 ：i n c u b a t i o no f c e l l s w i t hd n ab e f o r ep l a t i n g ( i n c u b a t i o n ) s t e p5 ：i n c u b a t i o no f c e l l s w i t hd n aa n di n d u c e m e n t o f c o l o n i e so ft r a n s f o r m e d c e l l so nt h ep l a t e s l i g h tt r e a t m e r l l a l i g h tt r e a t m e n t s 2 o 删洮 除嘁套 唧m s o 斤v 开v上 第一章文献综述 蓝藻自然转化的机制至今仍不太清楚。k u f r y k 等的研究表明，集胞藻6 8 0 3 体内存在一种编码单链核酸内切酶r e e j 的基因( 础1 3 5 4 ) ，该基因的缺失使集胞 藻6 8 0 3 的转化效率提高两个数量级，这一结果表明，该基因可能参与集胞藻6 8 0 3 的自然转化( k u f r y k e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。其它一些因素也会影响蓝藻自然转化效率： ( 1 ) 外源d n a 的浓度。外源d n a 的浓度可以影响蓝藻自然转化的效率， 当外源d n a 浓度从0 0 1 斗g m l 提高到1 0l x g m l 时，蓝藻的转化效率可以提高1 0 4 倍( p o r t e r ，1 9 8 6 ) 。对于不同的蓝藻株系而言，其吸收外源d n a 的饱和浓度也不 相同。聚球藻7 0 0