（植物学专业论文）一种褐藻——铁钉菜（ishige+okamurae）凝集素的研究.pdf

福建师范大学学位论文使用授权声明 福建师范大学学位论文使用授权声明 本人( 姓名) 匿旦亟学号2 0 0 5 8 8 6 - 瓠_ k 植塑堂所呈交的论文( 论文 人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文 中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果。本人了解福建师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交的学位论文并允许论文被查阅和借阅；学校可以 公布论文的全部或部分内容；学校可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名篮匝】强 指导教师签名澎盛 签名日期乡堕：笪兰 摘要 摘要 本研究以褐藻门的铁钉菜( i s h i g eo k a m u r a e ) 为试验材料，经p b s 浸提、硫酸铵 沉淀、d e a e s e p h a r o s ef f 离子交换层析和s e p h a d e xg 1 0 0 分子筛层析，分离纯化得 到铁钉菜凝集素( i o l ) ，其对兔血红细胞最小凝集浓度约y g1 5 6 2 5 比g m l 。i o l 在 s d s p a g e 上显示单一蛋白染色带，测定的相对分子量约为4 5 k d a 。 理化特性的研究结果表明，铁钉菜凝集素含有1 7 8 7 7 的中性糖，最大紫外吸 收峰为2 6 9 3 n m ；在氨基酸组成中，谷氨酸( g l u ) 的含量最高，天门冬氨酸( a s p ) 的含量次之，含量最低的是甲硫( 蛋) 氨酸( m e t ) ，不含色氨酸( t r y ) 。凝集活 性只被麦牙糖所抑制。在p h4 0 - 9 0 范围内相对稳定；具有较高的热稳定性，最高 耐热温度为8 0 。c ；此外，i o l 对二价金属离子z n 2 + , 口m 9 2 + 具有不同程度的依赖性。 生物学活性实验显示，i o l 对7 种供试真菌( 菌丝生长及孢子萌发) 及1 1 种细菌 生长具有不同程度的影响，能够凝集斜生栅藻、湛江叉鞭金藻和绿色巴夫藻，对供 试藻类的生长及叶绿素a 含量的影响不同，能抑制多纹膝沟藻和棕囊藻的生长，降低 叶绿素a 含量，但能够促进亚心型扁藻、斜生栅藻和红色蔷薇藻的生长，使它们叶绿 素a 的含量提高。 关键词铁钉菜凝集素理化性质抑制微藻叶绿素a a b s t r a c t a b s t r a c t al e c t i n ，n a m e di o l ，w a si s o l a t e da n dp u r i f i e df r o mab r o w nm a r i n ea l g ai s h i g e o k a m u r a eb ye x t r a c t i o nw i t hp b s ，f o l l o w e db ya m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o na n da c o m b i n a t i o no fi o n - - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yo nd e a e s e p h a r o s ef a s tf l o wa n dg e l f i l t r a t i o no ns e p h a d e xg - 1 0 0 ，a n dt h el o w e s ta g g l u t i n a t i n gc o n c e n t r a t i o no fi o lt e s t e d w i t he r y t h r o c y t e so fr a b b i tw a sa b o u t1 5 6 2 5 m li tw a sp r o v e dt ob eh o m o g e n e o u s b ys d s p a g e ，a u t h o u rm e a s u r e ds u b u n i tr a l e t i v em o l e c u l a rm a s st ob ea b o u t4 5k d a n eb i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fi o lw e r es t u d i e d i o lc o n t a i n e d1 7 8 7 7 n e u t r a ls a c c h a r i d e i t sa b s o r p t i o np e a ko fu vw a sa t2 6 9 3 n m i ni t sa m i n oa c i d c o m p o s i t i o n ，i th a dt h eh i g h e s tc o n t e n to fg l u ，f o l l o w e db ya s p ，t h el o w e s tc o n t e n tw a s m e t ，b u tt h e r ew a sl a c ko ft r y a g g l u t i n a t i n ga c t i v i t i e so fi o lw a so n l yi n h i b i t e db y b a r l e y - s u g a r i tw a ss t a b l ew i t ha c t i v i t ya tp h4 0 - 9 0 i th a dh i g l lh e a tt o l e r a n c e ，a n di t s p e a kt e m p e r a t u r ew a s8 0 0 c t h ea d d i t i o no fd i v a l e n tm e t a l s ( z n 2 + 、m 矿+ ) i n f l u e n c et h e a c t i v i t yo f t h el e c t i n t h es t u d yo nb i o l o g o c a la c t i v i t yo fi o ls h o w e dt h a ti th a dd i f f e r e n te f f e c t so n7 s p e c i e so ft e s t e df u n g i ( t h eg r o w t ho fh y p h a la n ds p o r eg e r m i n a t i o n ) a n d1 1s p e c i e so f b a c t e r i a i o lc a na g g l u t i n a t es c e n e d e s m u so b l i q u u s ，d i c r a t e r i az h a n j i a n g e n s i sa n d p a v l o v av i r i d i sa n dh a de f f e c t0 1 1g r o w t ha n dc o n t e n to fc h l o r o p h y l l ao fa l g a et e s t e d i t i n h i b i t e dg r o w t ho fg o n i a u l a x p o l y r a m n aa n dp h a e o c y s t i sg l o b o s aa n dr e d u c e dt h e i r c o n t e n to fc h l o r o p h y l l 一如b u t p r o m o t e dg r o w t h o fp l a t y m o n a s s u b c o r d i f o r m i s ， s c e n e d e s m u so b t t q u u sa n dr h o d e l l ar e t i c u l a t aa n di n c r e a s e dc o n t e n to fc h l o r o p h y l l a k e y w o r d ：i s h i g eo k a m u r a el e c t i n b i o c h e m i c a lp r o p e r t i e s i n h i b i t i o n m i c r o a l g a e c h l o r o p h y l l a i i 中文文摘 中文文摘 凝集素是一类非酶、非免疫起源的蛋白或糖蛋白，分子中含有一个或多个可与 单糖或寡糖特异可逆结合的非催化的结构域，具有对糖、糖脂、糖蛋白高度亲和并 专一结合的特性，具有凝集细胞、抗血小板凝集、抑制肿瘤细胞增殖、抗菌、抗虫、 抗病毒、促淋巴细胞有丝分裂等多种生物学活性。早期对凝集素的研究主要集中在 陆生植物上，直到2 0 世纪6 0 年代后期，才发现海藻中也存在着对人或动物血红细胞 具有凝集作用的物质，即海藻凝集素。随着研究的不断深入，人们才逐渐地发现海 藻凝集素不仅具备陆生植物凝集素所具有的生物功能，而且还含有陆生植物所不具 备的分子结构及生理、生化特性，这就为其进一步的开发和利用奠定了基础。到目 前为止，国内分离纯化的凝集素仅有1 1 种。本试验较详细地对铁钉菜凝集素的分离 纯化、理化性质及部分生物学活性进行研究，以期为海藻凝集素的开发利用提供有 用的资料。 铁钉菜凝集素的分离纯化：铁钉菜( i s h i g eo k a m u r a iy c n d o ) ，隶褐藻门，索藻 目，铁钉菜科，铁钉菜属，俗称铁钉、破网、海茜。本文通过预实验及查阅相关的 资料，发现铁钉菜凝集素对兔血红细胞具有较强的凝集活性，且其易采集、数量多、 分布广。新鲜的铁钉菜组织捣碎后，经p b s 缓冲液浸提、硫酸铵沉淀、d e a e s e p h a r o s e f f 离子交换层析 j 2 s e p h a d e x g 一1 0 0 分子分子筛层析，获得纯化的样品铁钉菜凝集素 ( i o l ) ，其对兔血红细胞的最低凝血浓度为1 5 6 2 5 p g m l 。经过s e p h a d e xg 1 0 0 分 子筛层析和s d s p a g e 凝胶电泳试验，发现i o l 是单亚基的糖蛋白，其分子量约为 4 5 k d a ： 铁钉菜凝集素理化性质：实验表明，i o 晗有1 7 8 7 7 的中性糖，是一种含糖较 高的凝集素，紫外可见光谱扫描，其最大吸收峰为2 6 9 3 n m ；在所测的1 8 种氨基酸中， 谷氨酸( g l u ) 的含量最高，甲硫( 蛋) 氨酸( m e t ) 的含量最低，不含色氨酸( t r y ) ； 糖抑制实验表明，与多数海藻凝集素一样，i o l 的凝血活性不被单糖所抑制，仅有 麦芽糖能够抑制其凝血活性；i o l 在p h4 0 9 0 的范围内具有凝集活性；其凝血活性 依赖于z n 2 + 和m g “；在3 0 8 0 c 的温度范围内具有凝血活性，当温度上升至9 0 c 时， 其凝血活性完全丧失。 铁钉菜凝集素的部分生物学活性：海藻凝集素抗菌活性和凝集微藻细胞的研究 还很少，对微藻细胞生长及生理特性方面的研究几乎是空白。本实验研究的抗菌活 i i l 中文文摘 性包括了对7 种真菌( 菌丝生长和孢子萌发) 及1 1 种细菌的抑制作用。研究结果表 明：i o l 对7 种供试真菌菌丝有不同程度的影响；对黑曲霉及红色链孢霉菌丝生长 无影响，对其它5 种真菌菌丝生长表现出不同程度的抑制作用；相同浓度的i o l 对 稻瘟病菌和圆弧青霉菌丝生长的抑制作用随着培养时间的延长而逐渐降低，对玉米 大斑病菌和绿色木霉菌丝的抑制作用则随着培养时间而不断增强。i o l 对7 种供试 真菌孢子的萌发具有不同程度的影响，其中对黑曲霉孢子的萌发抑制作用最强，在 i o l 浓度为5n l g i i l l 时，抑制率达到了7 7 7 ，对玉米大斑病菌孢子萌发的抑制作 用最弱；而对红色链包霉孢子萌发具有促进作用。原因可能是i o l 通过与某些真菌 菌丝或孢子表面的葡聚糖、半乳糖、甘露糖或异源多糖结合，干扰细胞合成，影响 细胞的正常代谢，从而达到一定的抑制真菌生长的作用；对于在不同的时间段内， 抑制强度不同，可能是在不同生长期，真菌菌丝或孢子成分有所不同而造成的。 i o l 对1 1 种细菌生长具有不同程度的影响。研究结果表明：i o l 对温和气单胞 菌、肠球菌、甘薯薯瘟病原菌、普通变形杆菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄八 叠球菌、金色葡萄糖球菌有不同程度的抑制作用，而对大肠杆菌、荧光假单胞菌和 蜡样芽孢杆菌无抑制作用：在同一时间段，i o l 对细菌生长的抑制作用随其浓度的 升高而增强，即2m g lm g o 5m g o 2 5m g ；而对于在不同的时间段，同一浓度的 i o l 对同种细菌的抑制率也不相同；当t = 1 2 h 时，i o l 对温和气单胞菌、绿脓杆菌、 枯草芽孢杆菌和金色葡萄糖球菌生长的最低抑制浓度为0 5m g m l ( p 0 0 5 ) ；对肠 球菌、普通变形杆菌和藤黄八叠球菌生长的最低抑制浓度为1m g m l ( p 0 0 5 ) ；而 对甘薯薯瘟病原菌无抑制作用；当t - - 4 8 h 时，i o l 对温和气单胞菌生长的最低抑制 浓度为2m g m “p 2 0 ，0 0 0 ) 的凝集素的活性易被 单糖所抑制，而低分子量( m r 2 0 ，0 0 0 ) 的凝集素的活性易被甘露聚糖所抑带1 j 1 6 1 , 6 2 1 。 1 2 1 5 热稳定性 由于海藻生活在温度相对稳定的海洋环境中，因此，其生理活性的保留与温度 有重要的关系。而海藻凝集素的热稳定性主要取决于其活性位点的性质，若此活性 位点为肽或蛋白质，由于肽链和蛋白质在受热情况下空间构象易发生改变而变性失 活，因此，此海藻凝集素的热稳定性就较差，如从迪尤对枝藻( e n t a n t i o c l a d i a d u p e r r e y i ) 中提取的凝集素在5 0 加热6 0 m i n ，保持原来的活性，在6 0 加热 2 0 m i n 贝j 失活5 0 ，7 0 c 加热l o m i n 贝j j 全部失活【吲。若活性位点为糖链，由于糖链相 对对热不敏感，故此凝集素的热稳定性就较强，如以含糖量为主的凝集素，如k a k i t a 等从英国海岸中提取的一种江蓠凝集素，则对热不敏感，在1 0 0 c 下加热3 0 m i n ，其 活性没有受到影响1 6 4 j 。 1 2 2 海藻凝集素的分离纯化 1 2 2 1 分离纯化方法 凝集素的分离纯化方法目前有很多种，并无固定的标准模式，根据凝集素提取 部位的差异，纯化的步骤也不一样，但是一般可以遵循传统的蛋白质分离方法。传 统纯化凝集素的方法一般是先将提取物或浸提物经硫酸铵分级沉淀，然后进行阴离 子或阳离子交换层析。分离海藻凝集素通常先用生理盐水或缓冲液浸提样品，浸提 液经硫酸铵分级沉淀后，取含有凝集素活性部分进行分离纯化。如海藻凝集素常用 的浸提液是p h7 2 的磷酸盐缓冲液( 浓度一般为o 0 1 加0 5m o l lp b s ，含0 1 4 m o l l n a c i ) ，然后海藻凝集素浸提液经过硫酸铵分级沉淀后，用d e a e 纤维素或 d e a e s e p h a r o s e 等进行离子交换层析，最后用s e p h a d e sg 1 0 0 或s e p h a d e sg 2 0 0 等系列进行分子筛凝胶过滤，经过冷冻干燥得到所需要的纯化样品。 7 福建师范大学陈国强硕士学位论文 1 2 2 2 纯化的海藻凝集素 目前，国际上研究海藻凝集素较多的主要是美国、英国、日本、西班牙、巴西 和波多黎各等沿海国家，国内则主要集中在福建、台湾、大连和青岛等沿海省市的 科研院所。直到目前为止，已有5 4 种海藻的凝集素被分离纯化，主要集中在红藻门、 绿藻门和褐藻门，其中，红藻门种类最多，有3 4 种，绿藻门为1 8 种，褐藻f - j n 较 少，仅见2 种。国内仅见1 1 种海藻凝集素被分离纯化【5 销9 ，件删。 1 2 3 海藻凝集素的生物活性 1 2 3 1 细胞凝集作用 细胞凝集作用其实就是凝集素与细胞相互作用的效果中最易检测的一种形式， 是凝集素与细胞表面的糖分子结合，在细胞表面形成许多相互交叉的“桥”的结果。 海藻凝集素对动物血红细胞的凝集作用较为广泛，一般来说，多数海藻凝集素对动 物血红细胞的凝集作用强于对人血红细胞的凝集作用，对酶处理过的兔和绵羊红细 胞的凝集作用尤其强烈，对胰蛋白酶及链酶蛋白酶处理过的兔及绵羊红细胞的最低 凝集浓度可达n g m l 6 7 - 6 9 。 经过不断的研究发现，凝集素不仅能凝集动物及人的血红细胞，而且还能凝集 其他类型的细胞，如淋巴细胞、肿瘤细胞及细菌等【7 0 】。海藻凝集素对细胞凝集作用 的报道最多的就是对血红细胞的凝集活性，而对其他类型的细胞的凝集作用的研究 则很少【7 l 】。细胞凝集作用其实是一种高度复杂的现象，其决定因素可能是凝集素的 性质和细胞表面可与凝集素作用的分子素以及细胞和细胞表面的若干性质，如细胞 表面刚性，细胞表面的代谢状态，细胞表面携带的电荷，凝集素受体在细胞膜上的 分布和流动等。h o d 等【7 2 】( 1 9 9 6 ) 首次报道了几种陆生植物和海藻凝集素对某些海 洋微藻的凝集作用。郑怡等【5 6 , 7 3 1 ( 2 0 0 2 ) 发现坛紫菜凝集素( p h l ) 能够凝集一定 浓度范围内的单细胞藻类，如蛋白核小球藻和绿色巴夫藻，脆江蓠凝集素( g b l ) 能凝集蛋白核小球藻和盐生杜氏藻。而郑怡等再对三种海藻凝集素细胞凝集活性比 较时发现，在1 2 种供试的微藻中，有6 种单细胞种类分别被1 种或1 种以上的海藻 凝集素所凝集，其中，盐生杜氏藻最敏感，能被3 种海藻凝集素凝集，其次是蛋白 核小球藻。3 种海藻凝集素对海洋微藻的凝集作用明显强于对淡水微藻的凝集。同 时，3 种海藻凝集素都凝集自然状态下的枯草杆菌，不能凝集大肠杆菌和胃癌细胞。 但经过热处理后的枯草杆菌，3 种海藻凝集素对其无凝集活性【7 4 1 。红藻的羽状翼藻 ( p t i l o t af i l i c i n a ) 凝集素对肿瘤细胞、淋巴细胞、鱼类精子、酵母、海洋细菌及单 8 第1 章绪论 细胞蓝藻具有很强的凝集活性。 1 2 3 2 激活淋巴细胞 近年来研究发现，绝大部分的海藻凝集素能够激活人的淋巴细胞，并且与凝集 素浓度的高低有一定的关系。从齿状麒麟菜( e u c h e u m as e r r aj ) 分离出的2 种同工 凝集素e s a - 1 ( p i4 7 5 ) 和e s a 2 ( p i4 9 5 ) 能促进小鼠淋巴细胞的有丝分裂【7 5 1 。 从红藻a m a n s i am u l t i f i d a 分离出的凝集素能诱导和抑制人淋巴细胞的有丝分裂 7 6 1 。 直到目前为止，所有凝集素对小鼠的淋巴细胞均是t 细胞特异性，而对人体淋巴细 胞则是b 细胞特异或b 、t 细胞特异。某些海藻凝集素对t 淋巴细胞具有很强的促 分裂作用，但目前对其作用机制尚不清楚，有待于进一步的研究。 1 2 3 3 对肿瘤细胞的抑制作用 与陆生植物凝集素一样，海藻凝集素也具有抗肿瘤的功能。海藻凝集素能与肿 瘤细胞膜上的受体结合，致使细胞表面结构发生变化，从而抑制肿瘤细胞的活性。 海藻凝集素还能通过激活人体免疫功能和抑制肿瘤细胞繁殖作用发挥其抗肿瘤的功- 能。粗状红翎藻( s o l i e r i ar o b u s t a ) 的3 种同族凝集素及h y p n i n 在体外能分别抑制 自血病细胞l 1 2 1 0 及小鼠乳腺癌细胞f m 3 a 的增殖，有望成为抗癌药物。李丹彤等 5 s l ( 2 0 0 7 ) 研究发现，高剂量的绒线藻凝集素( d v l ) 能显著地抑制小鼠肿瘤细胞 的生长。 1 2 3 4 抑制血小板凝集作用 冻沙菜( h y p n e a j a p o n i c a ) 凝集素等4 种海藻凝集素能阻止a d p 或胶原蛋白诱导 的人血小板的凝集，并且具有浓度依赖性。如冻沙菜凝集素( h y p n i na 2 ) 在1 0 0 曙m l 时能够完全抑$ i j a d p ( 2 m g m l ) 诱导的人血小板凝集，而在5 m g m l 时就可低 浓度抑制血小板凝集抑制胶原蛋白( 0 2 m g m l ) 诱导人的血小板凝集【7 7 1 。依据海藻 凝集素的这种作用，可以研究血小板膜上的糖协同作用，并可以根据此方法设计新的 血小板抗凝因子。 1 2 3 5 抗菌作用 植物凝集素能够结合到细菌细胞壁的肽聚糖上，且能与某些真菌表面的葡聚糖、 半乳糖、甘露糖等多糖或不同的异源多糖结合，达到干扰细菌或真菌细胞的合成， 从而影响细胞的正常代谢的目的。研究发现，从墨角藻中提取的一种类凝集素，对 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 和脑膜炎双球菌( n e i s s e r i am e n i n g i t i d e s ) 有毒性。从 锯齿麒麟菜( e u c h e u m as e r r a ) 和扁乳节藻( g a l a x a u r am a r g i n a t a ) 中提取的2 种凝 9 福建师范大学陈国强硕士学位论文 集素e s a t f ：i g m a 能强烈地抑s u v 珈莎c “s 的生长【7 8 1 。红藻勋l i e r i a f i l i f o r m i s 凝集素在 浓度为l m g m l 时能抑制革兰氏阴性细菌，如粘质沙雷氏菌( s e r r a t i am a r c e s c e n s ) ， 伤寒沙门氏菌( s a l m o n e l l at y p h i ) ，肺炎杆菌( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) ，产气肠杆菌 ( e n t e r o b a c t e ra e r o g e n e s ) ，普通变形杆菌( p r o t e u sv u l g a r i s ) 和绿浓杆菌 ( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 等的生长【2 9 1 。因此，海藻凝集素抗菌活性的研究将是一 项具有潜在发展前景的研究课题。 1 2 3 6 其他生物活性 由于凝集素对不同细胞的作用不同，且不同细胞在其外形及性质上不同，因此， 可用凝集素的糖结合专一性对其进行分类。王盛等【7 9 l ( 2 0 0 4 ) 等从海洋绿藻孔石莼 ( u l v ap e r t u s a l ) 分离出一种具有抗烟草花叶病毒( t m v ) 的新型凝集素u p l l 。江 蓠( g r a c i l a r i av e r r u c o s a ) 凝集素能改变造成赤潮危害的浮游生物c h a t t o n e l l aa n 嘶u a 的细胞形态，使之皱缩，从而抑制浮游生物的生长。刘长发等【8 1 l ( 1 9 9 6 ) 发现， 红藻扇形盾果藻和冻沙菜凝集素能使海胆受精卵胚胎在囊胚期停止发育，能使海盘 车在原肠期显示形态异常，抑制原口陷入。 1 3 海藻凝集素的应用 1 3 1 药物的潜在应用 由于海藻凝集素具有抗菌性、抗病毒性、抗虫性，因此，可以利用海藻的这些 功能进行抗菌、抗病毒和抗虫方面的研究。某些海藻凝集素能抑制血小板的凝集， 由此有利于研究血小板膜上的糖协同作用，并能按照此研究出新的血小板抗凝因子。 1 3 2 细胞分类学上的应用 不同的细胞在外在形态和性质方面有很多的不同，海藻凝集素具有糖结合专一 性，不同的海藻凝集素可以结合不同的细胞，由此就可以达到鉴定不同的微生物的 目的。如f a b r e g a s 等【8 2 】发现3 种褐藻的类凝集素提取物能鉴别4 种吉利蒙氏念珠菌 ( c a n d i d ag u i l l i e r m o n d i i ) 的变体。j i a n j u nh o u 等【8 3 】( 2 0 0 8 ) 发现，f i t c 标记麦胚凝 集素( w g a ) 能识