（植物学专业论文）麻疯树核糖体失活蛋白（curcin）的化学修饰与光谱学研究.pdf

四川大学硕士学位论文 麻疯树核糖体失活蛋白( c u r c i n ) 的 化学修饰及光谱学研究 专业：植物学 研究生：崔维科指导老师：陈放教授 摘要 核糖体失活蛋白( r i b o s o m ei n a c t i v a t i n gp r o t e i n ，简称r i p s ) 是一类r r n a n - - 糖苷酶( e c3 2 2 2 2 ) ，可专一水解大鼠2 8 sr r n a 的 4 3 2 4 位的n - - c 糖苷键， 使核糖体失活从而抑制蛋白质的合成。根据r i p s 一级结构的特征，可将其分成 三类。其中i 型r i p s 最主要的一个生理生化特征就是对无细胞体系的蛋白质合 成具有强烈抑制作用，该类蛋白生化性质稳定，制备简便，可与单克隆抗体等 制备免疫毒素，在肿瘤治疗和骨髓移植等方面具有广泛应运前景。本实验室从 四川麻疯树种仁中分离纯化得到一种i 型r i p s ( c u m i n ) 。目前对c u r c i n 的基因 克隆及序列分析已经作了大量工作，但对c u r c i n 的高级结构还知之甚少因此 本文在前人研究的基础上利用特异性的化学修饰剂对c u r c i n 五种氨基酸进行化 学修饰，以其得到与c u r c i n 核糖体失活活性相关的结构信息 麻疯树核糖体失活蛋白( c u r c i n ) 经匀浆，浸取、硫酸铵分级沉淀得粗品， 将粗品于s e p h a d c xg 1 0 0 分子筛层析得纯品，经s d s p a g e 检溯为单一蛋白带。 通过无细胞体系蛋白合成抑制活性的测定，结合荧光光谱和圆二色谱技术，对 麻疯树核糖体失活蛋白( c u r c i n ) 部分氨基酸残基进行特异性化学修饰，探讨 维持c u r c i n 活性的必需氨基酸基团及修饰对c u r c i n 结构的影响结果表明，组 氨酸和半胱氨酸的化学修饰对c u r c i n 活性没有影响。色氨酸和赖氨酸的修饰结 婴型查茎堡主兰竺丝苎 果表明对这两种氨基酸的修饰表现了剩余活性对修饰剂浓度和修饰时阃的依赖 性，随着修饰时间的延长和修饰剂浓度的增大，c u r c i n 失活程度增大最终活 性分别下降了5 0 和1 0 0 ，表明其为维持c u r c i n 活性的重要残基。2 8 0n m 处的 发射光谱最大发射波长发生红移，表明对这两种残基的修饰影响了色氨酸的微 环境。精氨酸修饰也表现出了对修饰时间和修饰剂浓度的依赖性，最终c u r c i n 的抑制活性完全丧失，内源荧光强度下降，最大发射波长发生红移，c d 谱发生 显著变化表明精氨酸是维持c u r c i n 活性的必需残基，并且对空间结构影响较 大，推测对精氨酸的修饰破坏了其与其它基团的连接，导致c u r c i n 分子结构发 生改变，失去和底物结合的能力，因而活性丧失。荧光淬灭研究表明丙烯酰胺 和碘乙酸分别能淬灭e u r e i n 中色氨酸残基9 8 和8 5 的荧光，而几乎不能淬 灭e u r e i u 的荧光，表明几乎所有的色氨酸位于c u r c i n 近分子表面相对疏水的浅 沟或强阴离子区域。 关键词：麻疯树核糖体失活蛋白( c u r c i n ) 化学修饰无细胞体系蛋白合成抑 制活性荧光光谱圆二色谱 v 明川大学颂士学位论文 c h e m i c a lm o d i f i c a t i o na n ds p e c t r a lr e s e a r c h e s o f r i p s ( c u r c i n ) m a j o r ：b o t a n y m a s t e rd e g r e ec a n d i d a t e ：c u iw e i - k e s u p e r v i s o r ：p r o f c h e nf a n g a b s t r a c t r i b o s o m e - i n a c t i v a t i n gp r o t e i n s ( r i p s ) f r o mp l a n t sc a t a l y z et h e s e l e t i v e h y d r o l y s i so ft h en g l y c o s i d i cb o n da tt h ea d e n i n e - 4 3 2 4r e s i d u ei nt h ee u k a r y o t i c 2 8 sr i b o s o m a lr n a b a s e do nt h e i r 砸m a r ys t r u c t u r e s ，r j p sc a l lb ec l a s s i f i e di n t o t h r e et y p e s t y p elr i p sc o n s i s to fs i n g l ep e p t i d ec h a i nw i t ham o l e c u l a rm a s s v a r y i n gf r o m1 0t o3 0k d a 1 1 m o s tr e m a r k a b l ec h a r a c t e ro ft y p elp o p si st h e s t r o n gt r a n s l a t i o n i n h i b i t o r yf u n c t i o nt ot h ec e l l f r e es y s t e m , a n dt h en - g l y e o s i d a s e a c t i v i t yo ft h es i n g l ea - c h a i nc a n b em o n i t o r e dw 胁i nv i t r ot r a n s l a t i o na s s a y su s i n g t h er a b b i tr e t i c u l o c y t el y s a t es y s t e m o u rl a b o r a t o r yh a sp u r i f i e dat y p e1r i p s ， c a l l e dc u r c i n 1 1 1 er e s e a r c hw o r ka b o u tt h eg e n ec l o n ea n ds e q u e n c ea n a l y s i sh a v e d o n e b u ts t i i ik n o wl i t t l ea b o u tt h es e n i o rs t u c t u r ei n f o r m a t i o n i no r d e rt ok n o w m o r ea b o u tt h er e l a t i o nb e t w e e nt h es r u e t u r ea n di n h i b i t o r ya c t i v i t y , t h ep a p e r d i s c u s s e dt h er e s u l t so f t h ec h e m i c a lm o d i f i c a t i o nt ot h e5t y p e so f a m o n ia c i d s c u r c i nw a si s o l a t e df r o mt h es e e d so fj a t r o p h ac u r c a s b ye x t r a c t i o n ， p r e c i p i t a t i o nw 池( n i - 1 4 h s 0 4 ，g e lf i l t r a t i o no ns e p h a d e xg - 1 0 0 mp u r i f i e dc u r c i n s h o w e das i n g l ep r o t e i nb a n do ns d s - p a g e n 坨e f f e c t so fm o d i f y i n gt h ea m i n o a c i d si nd a t r o p h ac u r c a sr i p s ( c u r d n ) o nt h ec o n f o r m a t i o na n da c t i v i t yo fc u r c i n w e l es t u d i e db yc e l l f r e et r a n s l a t i o n - i n h i b i t o r ya c t i v i t ya s s a y , f l u o r e s c e n c ea n d c i r c u l a rd i c h r o i s mr e c o r d n 坩r e s u l t si n d i c a t et h a tt h em o d i f i c a t i o no f c y s t e i n ea n d h i s t i d i n er e s i d u e sh a sn oe f f e c to nt h ea c t i v i t ) r t 1 l em o d i f i c a t i o no fl y s i n ea n d v f 【r q 川夫学硕卜学位论文 t r y p t o p h a nr e s i d u e sl e dt o l0 0 0 , 6a n d5 0 0 4l o s so fi n h i b i t o ra c t i v i t yr e s p e c t i v e l y ， i n d i c a t i n gt h a tt h e s et w or e s i d u e sa r ee s s e n t i a l t ot h ei n h i b i t o r ya c t i v i t y t h e m o d i f i c a t i o no fa r g i n i n er e s i d u e sl e dt oac o m p l e t e l yl o s so fi n h i b i t o r ya c t i v i t y ， s u g g e s t i n gt h a ta r g i n i n ei sc r i t i c a lf o rt h ei n h i b i t o ra c t i v i t y f l u o r e s c e n c es t u d i e so f c u r c i ni n d i c a t et h a tt h em o d i f i c a t i o no fa r g i n i n e ，l y s i n e ，t r y p t o p h a nc o u l dq u e n c h t r y p t o p h a nf l u o r e s c e n c ew i t hc h a n g ei nk w h e ne x c i t e da t2 8 0n m t h e f a r u l t r a v i o l e tc i r c u l a rd i e h r o i s ms p e c t n l ms h o w e dt h a tt h em o d i f i c a t i o no fa r g i n i n e r e s i d u e sa f f e c t e dt h ec o n f o r m a t i o no ft h ec u r c i nm o l e c u l eg r e a t l y , i n d i c a t i n gt h a t a r g i n i n ep l a ya l li m p o r t a n tr o l ei nc u r c i n sc o n f o r m a t i o n , 1 1 1 eb o n d sb e t w e e nt h e a r g i n i n ea n do t h e rr e s i d u e sw e r ed e s t r o y e db ym o d i f i c a t i o n , t h u s ，t h es u b s t r a t ec o u l d n o tr e a c ht h ec u r c i n , a n dt h e r e f o r et h ea c t i v i t yo ft h ec u r c i nw a sl o s t f l u o r e s c e n c e q u e n c h i n gs h o w e dt h a ta c r y l a m i d ea n di o d o a c e t i ca c i dc o u l dq u e n c h9 8 a n d8 5 o f t h ef l u o r e s c e n c eo f t r y p t o p h a ni nc u r c i n ，r e s p e c t i v e l y h o w e v e r ，k ia l m o s td i d n t q u e n c ht h ef l u o r e s c e n c eo fc u r c i n , e - w e nw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fiw a s0 2m 0 1 5 i ts h o w e dt h a tm o s to ft r y p t o p h 龇r e s i d u e sl o c a t e di nr e l a t i v e l yh y d r o p h o b i co r n e g a t i v e l yc h a r g e da r e a sn e a rt oc u r c i ns u r f a c e k e yw o r d s ：d a t r o p h ac u r c a slr i b o s o m e i n a c t i v a t i n gp r o t e i n s ( e u r e i n 、c h e m i c a l m o d i f i c a t i o nc e l l - f l e et r a n s l a t i o n i n h i b i t o r ya c t i v i t y f l u o r e s c e n c es p e c t r u m c i r c u l a rd i c h r o i s m v n 阳川大学顾t 学位论文 女i 身| 。5 3 在读期间发表论文 声明 ，5 4 5 5 图片目录 第一章 图1 - 1 麻疯树毒蛋白( c u r c i n ) 纯化洗脱曲线圈 图1 - 2 麻疯树毒蛋白( c u r c i n ) 的s d s - p a g e 分析图1 0 图1 - 3 不同浓度c h d ( ) 和t n b s ( b ) 下c u r c i n 失活的关系围1 2 图1 - 4 不同浓度n b s 下与c u r c i n 失活的关系图 1 3 图1 - 5 不同浓度c h d ( ) 和t n b s ( b ) 条件下c l i r c i n 的荧光光谱图1 4 图卜6 不同浓度n b s ( a ) 和( b ) d e p c 条件下c u r c i n 的荧光光谱图1 5 图1 - 7c u f c i n 在不同修饰条件下的圆二色谱图1 6 图1 - 8 丙烯酰胺淬灭荧光图2 1 图1 - 9 丙烯酰胺淬灭c u r c i n 图2 j 图卜1 0 碘乙酸淬灭荧光图2 2 图1 - 1 1 碘乙酸淬灭c u r e i n 图2 2 第二章 囤2 - 1 不同类型的rip s 的分子结构示意图3 1 图2 - 2r n an - 糖苷酶活性作用位点示意图3 5 表格目录 第一章 表1 - 1c u r c i n 的化学修饰对无细胞体系蛋白合成抑制活性的影响一 第二章 表2 - 1 已报道的核糖体失活蛋白的活性 i l i 阳川大学颂士学位论文 第一章：麻疯树核糖体失活蛋白( c u r c in ) 的 化学修饰及光谱学研究 1 引言 麻疯树( j a t r o p h ac u r c a sl ) 是大戟科( e u p h o r b i a c e a e ) 麻疯树属( j a t r o p h a l ) 植物，广泛分却于世界热带亚热带地区，在我国主要分布于四j i i 、云南、 贵州、广东、广西、海南、福建、台湾等省区，是一种多用途油料作物。其种 子胚乳中的毒蛋c u r c i n 具有抗癌活性【i i 。e u r e i n 蛋白是麻疯树种子胚乳中大量 积累的贮存蛋白，是种子萌发的氮源。早期研究主要集中在c u r c i n 的毒性上【2 “。 近期，本实验室已经对c u r c i n 的分子生物学基础进行了深入研究。林娟等人首先 从麻疯树种子胚- l m r n a 中克隆得到了e u r c i n m r n a 的c d n a ( g e n b a n k 登录号： a y 0 6 9 9 4 6 ) 以及一条c u r e i n 的基因组基因( g e n b a n k 登录号：a f 4 6 9 0 0 3 ) 1 5 - 6 , 目前己知的r i p s 有三种类型，其中i 型r i p s 的结构和功能是最基本的，它们具 有r n an 。糖苷酶( r _ n an g l y c o s i d a s e ) 活性与多聚腺嘌呤核苷酸糖苷酶 ( p o l y n u c l e o t i d e ：a d e n o s i n eg l y c o s i d a s e ) 活性。i 型r i p s 分子量为3 0 k d 左右1 7 i ， 在植物界中广泛存在，没有细胞结合位点，所以不能穿透正常细胞的细胞膜，因 而只对那些主动摄取外源物质的细胞如滋胚层细胞和癌细胞有毒性t s 。i i 型 r i p s 如蓖麻毒素( r i c i n ) 由两条多肽链( a 链和b 链) 通过二硫键连接而成，a 链具有糖苷酶活性。b 链有糖连接位点可以与细胞表面连接；最近p e u m a n s 等【g l 研究介绍了i 型r i p s ，分子量为6 0 k d ，包括一个n 一末端的r i p 结构域，与功能来 知的c 一末端结构域通过肽键直接相连。i 型r i p s 最主要的一个生理生化特征就 是对无细胞体系蛋白质合成具有强烈的抑止效果i 研。该类蛋白生化性质稳定， 制备简便，可与单克隆抗体等制备免疫毒素，在肿瘤治疗和骨髓移植等方面有 着广泛的应用前景。 麻疯树( j a t r o p h a c u r c a s ) 大戟科( e u p h o b i a c e a e ) 植物。是一种多年生药用植 物。其种仁富含油脂和蛋白质，在我国的西南地区有着丰富的麻疯树资源。本实 验室已从四川麻疯树种仁中分离纯化得到一种核糖体失活蛋白( c u r i c n ) ，并对 塑型叁兰竺兰丝堡兰 其性质和作用机制进行了研究，证实其失活核糖体的机制与天花粉蛋白相似， 是一种n 一糖苷酶型核糖体失活蛋白，属于i 型r i p t 6 1 。除了已阐明其有良好的 抗真菌活性【1 0 】，对特定的癌细胞有一定杀伤作用【1 1 ，对c u r c i l l 的基因克隆，原核 表达及序列分析的研究也已经完成晡l 。在r i p s 家族中，对于各个成员的一级结 构以及高级结构的研究大多采用了化学修饰、定点突变、晶体衍射和核磁共振 等方法，到目前为止已经测定了包括f i c i n 在内的十几种r i p s 的初级机构以及高 级结构。在i 型r i p s 和型r i p s 中，研究最为透彻的分别是天花粉蛋白 ( t r i c h o s a n t h i n ，t c s ) 和蓖麻毒蛋白( r i c i n ) ，并且研究表明天花粉蛋白和 蓖麻毒蛋白的具有r n an 一糖苷酶活性的a 链在序列和高级结构上都具有很高的 同源性j 。目前对c u r c i n 的结构方面的信息知之甚少。 蛋白质分子具有极其复杂的结构层次，用化学修饰的方法研究蛋白质分子 结构与功能的关系一直是生物化学和分子生物学领域的热点。蛋白质的化学修 饰主要包括两方面：一、蛋白质分子的侧链基团的改变。蛋白质侧链基团的化 学修饰是一种广泛使用的研究手段，也是一种比较成熟的经典技术，在蛋白质 特别是酶的结构与功能研究中，曾经起到过十分重要的作用。蛋白质侧链基团 的修饰是通过选择性的试制或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基 团发生化学反应而实现的1 1 2 1 。二、蛋白质分子中主链结构的改变。主要是指主 链结构的化学修饰基因的定点诱变。随着重组d n a 技术的发展，对蛋白 质的结构和功能的研究进入了一个新的阶段，已知一个蛋白质的核酸序列，采 用定点诱变( 突变) 技术在基因的预定位点导入突变，然后通过适当的表达系 统表达经过改造的基因，获得主链结构有特定改变的蛋白质分子，通过比较突 变体蛋白与野生型蛋白的性质，可以鉴别出对蛋白质的结构完整性和生物学功 能至关重要的结构域或个别氨基酸残基，从而获得有关蛋白质分子结构与功能 的信息。本文所研究的化学修饰主要是指前者，即蛋白质侧链基团的化学修饰。 化学修饰的主要作用有如下几方面： ( 1 ) 探测酶和蛋白质的必需氨基酸残基的数目和性质；( 2 ) 用于蛋白质 纯度分析与测定；( 3 ) 用于蛋白质一级序列的测定；( 4 ) 探测蛋白质分子的 构象变化和运动性；( 5 ) 利用亲和标记探测活性部位局部区域的构象状态；( 6 ) 探索蛋白质和酶作用的化学机理；( 7 ) 利用共价交联技术研究蛋白质分子的拓 扑学，构象的运动性以及寡聚蛋白质的亚基结合状态；( 8 ) 利用蛋白质晶体的 会属衍生物( 也属于一种化学修饰) ，进行x 衍射晶体结构分析；( 9 ) 用于 2 ! ! ! ! 型叁兰竺兰兰竺丝兰 蛋白质和酶分子的固定化：( 1 0 ) 定向改造蛋白质分子的性质。用基因定点突 变技术，改变蛋白质主链的化学结构，在蛋白质的肽链结构中删除、替换或增 加某些氨基酸残基，以研究其结构与功能的关系，并可以定向地进行蛋白质的 改造。总之蛋白质化学修饰仍然作为一种有效的研究手段广泛地应用于基础性 研究和应用i i 。 蛋白质分子具有错综复杂的三维结构，而它的所有氨基酸残基的侧链基团 分布于蛋白质分子的各个部分。有的残基处于蛋白质分子的表面，易于受到试 剂的进攻和作用，有的残基则内埋于蛋白质分子的疏水内环境，不易与试剂接 触和反应。 一般地说，选择蛋白质修饰剂要综合考虑如下一些问题【”】：蛋白质的种类 和修饰位点，修饰剂对氨基酸残基的专一性如何，期望的修饰度是多少；在给 定的操作条件下，反应是否需要可逆；修饰荆的水解稳定性和反应活性，修饰 剂与蛋白质的连接键的稳定性，毒性、免疫原性；修饰后蛋白质的构象是否基 本保持不变：修饰后蛋白是否需要进一步分离；是否适合于建立快速、方便、 准确的分析方法：修饰剂的合成是否简便经济，修饰剂是否价廉易得等。蛋白 质的选择化学修饰，除了选择合适的修饰剂外，还必须选择合适的反应条件。 蛋白质与修饰剂的作用所要求的反应条件，除允许修饰过程能够顺利进行外， 还必须满足如下要求：一是不引起蛋白质的不可逆变性；二是有利于选择性地 修饰蛋白质。因此，反应物配比、p h 、反应温度和反应介质等都要控制在一定 的范围。在所有影响蛋白质分子的化学修饰反应的条件中，p h 值是最重要的一 个条件，因为它决定了具有潜在反应能力的功能基所处的可反应和不可反应的 离子状态。一般情况下，增加p h 可以提高反应速率，降低p h 可以减小反应速率。 反应活性较高的修饰剂可以在生理p h 下与蛋白质耦合；而反应活性较低的修饰 剂通常需要较高的p h 。而修饰反应的专一性则对应有一个优化p h 值。通过改变 修饰剂与蛋白质的摩尔比和改变p h 可以迅速地给出对应于特定修饰度的实验 条件。温度也是一个必须要注意的条件，因为温度可以影响到活性巯基的微环 境。恰当选择温度可以减少或防止一些竞争的基团反应。有些蛋白质属于热敏 性蛋白质，修饰反应需要在较低温度下进行。在此情形下，反应时间要适当延 长反应介质可改变蛋白质的构象或封闭反应部位，因而影响修饰反应。通过 f 交实验设计的实验结果，可以容易地得到适宜的修饰反应条件。通过对一个 或多个操作因素的控制，就可以得到所需的连有单个、两个、三个或多个修饰 3 婴型叁兰竺兰兰竺堡苎 剂的蛋白质耦合物。 本文在参考这两种具有代表性的蛋白质结构的基础上，通过对林娟等的实 验结果的分析，利用基团特异性化学修饰剂对c u r e i n 的精氢酸、赖氨酸、色氨酸、 组氨酸和半胱氨酸残基进行修饰，并结合荧光光谱研究和圆二色谱研究以及荧 光淬灭研究，以期通过探讨化学修饰对e u r c i n 活性和构象的影响，研究e u r c i n 分 子中与无细胞体系蛋白合成抑制活性相关的氨基酸残基，从而加深对c u r c i n 核糖 体失活机制的理解，并为下一步的医药应用奠定基础。 在r i p s 家族分子中，精氮酸、赖氨酸、色氨酸、二硫键等是分子中重要的 侧链基团，在蛋白质分子的各级结构中以及活性中心均有特殊重要的作用。研 究表明，r i p s 的保守区域，是r n an - 糖苷酶活性中心【1 l l 。c u r c i n 是一种分子量 为2 8 k d a 的糖蛋白。本文在参考其它r i p s 结构的基础上，通过对林娟对c u r c i n 的活性区域和保守序列的推测结果的分析，利用基团特异性化学修饰剂对c u r c i n 的精氮酸、赖氨酸、色氨酸、组氨酸和半胱氨酸残基进行修饰，并结合荧光光 谱、圆二色谱以及荧光淬灭研究，以期通过探讨化学修饰对c u r c i n 活性和构象的 影响，研究c u r e i n 分子中与无细胞体系蛋白合成抑制活性相关的氨基酸钱基，从 而加深对c u r c i n 核糖体失活机制的理解，并为下一步的医药应用奠定基础。 2 实验材料、试剂和仪器 2 1 实验材料与试剂 麻疯树种子采自四川攀枝花地区。 s e p h e d e xg 1 0 0 干粉，s e p h a d e xg 2 5h i t r a pd e s a l t i n g 预装柱购自于 a m e r s h a mb i o s e i e n e e s 公司，中分子量蛋白质标准、叠氮钠一上海华舜公司； 考马斯亮蓝r - 2 5 0 、( 3 - 2 5 0 、丙稀酰胺、n n 甲叉双丙稀酰臌 f l u k a 公司： 牛血清白蛋白( b s a ) s i 掣公司；聚乙二醇2 0 0 0 为上海浦东化工有限公司 产品；四甲基乙二胺( t e m e d ) 上海前进化学试剂公司；s d s 为a l d c i c hc h e m i c a l c o 们产品。 丙烯酰胺凝胶贮备液：3 0 丙烯酰胺- 0 8 亚甲基双丙烯酰胺溶液( 丙烯 酰胺3 0 9 及亚甲基双丙烯酰胺0 8 9 ，溶于蒸馏水并定容至1 0 0 m l ，滤去不溶物， 置于棕色瓶中低温保存) 。 浓缩胶缓冲液；0 ，0 5 m ，p h 6 8t r i s - h c i 缓冲液( 称取6 0 9 t r i s ，加入约5 0 m l 蒸馏水使溶解，用l m o l lh c i 调p h 至6 8 ，再加蒸馏水至总体积1 0 0 m l ，低 婴! ! ! 盔兰竺兰竺丝茎 温保存) 。 分离胶缓冲液：1 5 m o l l ，p h 8 8t r i s - h c l 缓冲液( 称取1 8 矩t r i s ，先用 少量蒸馏水溶解，用l m o l lh c i 调p h 至8 8 ，加蒸馏水至1 0 0 m l ，低温保存) 解离样品缓冲液：含2 s d s ，5 巯基乙醇，l o 甘油、o 0 2 溴酚蓝的0 o l m o v l p h 8 0t r i s h c l 缓冲液 电极缓冲液：含o 1 s d s 的o 0 5 m o l l t r i s ，0 3 8 4 m o l l 甘氨酸p h 8 3 缓冲 液( 称取6 0 9t r i s 、2 8 8 9 甘氨酸，加入1 0 s d s 溶液1 0 m l ，再加蒸馏水溶解 并稀释至总体积1 0 0 0 m l ) 考马斯亮蓝染色液：o 2 5 9 考马斯亮蓝r - 2 5 0 ，加入4 5 4 m l 甲醇和4 6 m l 冰乙酸；脱色液：7 5 m l 乙酸，5 0 m l 甲醇，加水至1 0 0 0 m l ；标准蛋白质溶液： 牛血清白蛋白，l m g c m l 。 化学修饰剂n 乙酰顺丁烯酰胺( n e m ) 、2 , 4 ，6 三硝基苯磺( t n b s ) 、n 溴代 琥珀酰亚胺( n b s ) 、焦碳酸- - 7 , 酯( d e p c ) 、1 2 一环己二酮( 1 , 2 - c y c l o h e x a n e d i o n e c h d ) ，咪唑以及各种氨基酸均购于s i g m a 公司，l u e i f e r a s e a s s a ys y s t e m 试剂盒 购自p r o m e g a 公司。 他试剂均为国产市售商品，所有试剂均为分析纯。 2 2 实验仪器 t u 1 8 0 0 紫外分光光度计为一北京普析通用仪器有限责任公司；b t - 1 0 0 e 恒流泵一上海琪特分析仪器有限公司；b s z - - 1 0 0 自动部分收集仪一上海沪西 仪器厂；h l - 2 d 定时数显恒流泵一上海沪西分析仪器厂；p h s 3 c 型精密p h 计： 上海精科雷磁；电子天平：德国s a r t o f i u s 产品；t s 一8 型转移脱色摇床：南京大 学。 5 8 4 0 r j f k e 温离心机一e p p e n d o r f ；s e p h e d e xg 2 5 - - p h a m a c i a 。 d y l 卜l o c 型电泳仪；d y y 一2 4 d 型电泳槽一北京六一仪器厂； d k 一8 d 型电热恒温水槽一上海精密实验设备有限公司； f 一4 5 0 0 荧光分光光度；j - 5 0 0 c 型自动记录分光偏振仪；l m a x ”i i “ m i c r o p l a t el u m i n o m e t e r 冷光检测仪- - m o l e c u l a rd e v i c e sc o r p o r a t i o n ( 美 国) 3 方法 婴型叁兰堡主兰垒丝兰 3 1 麻疯树核糖体失活蛋白的制备j 麻疯树种仁1 2 0g 加5m m o f lp b s ( 磷酸盐缓冲液，含0 2m o l ln a c i ， o 1 p v p ，2 0 m m o l l 毓基乙醇，0 1 m m o l le d t a ， d h7 2 ) 8 0 0m l 于4 浸 泡过夜，次日，匀浆后，用磁力搅拌器搅拌，6h ，4 c 静置过夜。溶液以1 0 0 0 0 r m i n 4 c 离心2 0r a i n ，小心刮去上层油脂，过滤上清液以除去残油，弃掉离心 管底部的残渣。上清液采用州h 4 ) 2 s 0 4 沉淀蛋白质，加入6 0 饱和度的州h 4 ) 2 s 0 4 固体并不断搅拌，静置4h 后，以1 6 0 0 0r m i n 离心1 0m i n 收集沉淀。离心后在 上清中再加入固体( n h 4 ) 2 s 0 4 至8 0 饱和度，静置4 6 h ，离心后收集沉淀。将 两次沉淀溶于尽可能少的p b s 缓冲液中，装入透析袋，用同一缓冲液流动透析 4 8h ，取透析过的溶液，以1 6 0 0 0r m i n 离心2 0m i n ，弃去沉淀，上清液即为蛋 白质粗提液。 采用凝胶过滤法进行麻疯树蛋白质的纯化。取蛋白质糨提液4m l ，上样于 s e p h a d e xg 1 0 0 杜进行杠层析( 凝胶柱尺寸为o 8 x 9 0 c m ) ，杜在上样前先用 p b s 缓冲液平衡。上样后用同一缓冲液洗脱，洗脱速度1 6 m f l h ，每管收集4 m l ， 共收集4 0 管。将沈脱后的各管蛋白质溶液用t u 1 8 0 0 紫外分光光度计a 2 8 0 检 测，合并相同组分，收集峰样品，p e g 2 0 0 0 浓缩，s d s p a g e 检测蛋白质的 分离情况。 将纯化的蛋白于s e p h a d e xg 2 5d e s a l t i n g 除盐小柱除盐后冷冻干燥得纯 品，于- 2 0 保存。 3 2 蛋白质浓度测定： 采用l o w r y 法【l s l ，以牛血清蛋白为标准。 3 3 c u r c i n 无细胞体系蛋白合成抑止活性测定： 非放射性的兔网织红细胞体外蛋白翻译系统( c e l l f r e e ，n o n - r a d i o a c t i v e r a b b i tr e t i c u l o e y t el y s a t ei nv i mt r a n s l a t i o ns y s t e m ) 检测e u r e i n 抑制活性。按文献 1 1 6 1 方法并略有变化。 反应体系包括：兔网织红细胞裂解液2 0 u l ，氨基酸混合液l u l ( 缺l e u 氨基酸 混合液0 5 u l + 缺m e t 氨基酸混合液0 5 u 1 ) ，r n a 酶抑制剂( 2 0 u u 1 ) 2 u l ，荧光 素酶m r n a ( 1 0 0 n g u 1 ) 2 u l ，对照：未加修饰剂的反应溶液2 u l ，样品组：加入 含c u r c i n 的修饰溶液2 u l 。 6 ! ! 竺型叁兰堡! ：兰竺丝苎 反应在3 0 水浴中进行，标准反应时间3 0 m i n ，用液氮迅速冷冻中止荧光素 酶的翻译。 取2 0 u l 反应混合物加入9 6 孔板，每孔加入5 0 u l 过量的荧光素酶检测剂l a r ( l u c i f e r a s ea s s a yr e a g e n t ) 于l m a x “i i ”m i c r o p l a t el u m i n o m e t e r 冷光检 测仪上设营整合时间l s ，延迟时r b j 5 s ，读数时问l o s ，s o f t m a xp r o 钡f l 定相对发 光值r l u ( r e l a t i v el u m i n e s c e n c eu n i t ) 。 麻疯树毒蛋白c u r c i n 抑制荧光素酶蛋白质合成，荧光素酶活性百分率按以 下公式计算：荧光素酶活性百分率= r l u ( 样品) r l u ( 对照) 1 0 0 ，c u r c i n 剩余抑制活性= 卜荧光素酶活性百分率。 3 4c u r e i n 化学修饰 3 4 ，1 精氨酸残基的修饰 a r g 修饰参照l a s z l op a u h y 等的方法f r 丌。反应体系为硼酸硼砂缓冲液( 5 0 m m o l f l ，p h 8 5 ) ，纯化的c u r c i n ( 0 5m g m 1 ) 与不同浓度的c h d ( 0 ，0 1 5 5m m o l l ) 于3 0 。c 密封黑暗反应，日j 隔取样1 0 u l ，加入等体积的l - a r g ( 5m m o l l ) 终止反 应，测定蛋白剩余活性。空白对照无修饰剂。 3 4 2 赖氨酸残基的修饰 l y s 修饰参照v i e k yp h 等的方法【堋。反应体系为硼酸硼砂缓冲液中( 5 0 m m o t l ，p h9 0 ) ，c u r c i n ( o 2 m g m g ) 与不同浓度的t n b s ( o 0 2 5 - 1 0m m o l l ) 于3 7 黑暗反应。日j 隔取样1 0u j ，加入等体积的盐酸( o im o l l ) 终止反应， 测定剩余活性。反应溶液在3 4 6r g n 处光吸收值不断上升并趋于稳定，表明修饰 完成。 ， 3 4 3 色氨酸残基的修饰 1 印修饰按s p a n d e 和w i t k o p 法【1 9 1 。反应体系为醋酸缓冲液( 5 0 m m o l l ， p h 5 5 ) ，c u r c i n ( 0 5m g m 1 ) 与不同浓度的n b s ( 0 5 ，5m m o l ，l ) 于2 5 反应， 修饰刺每次加入1 0 山，反应间隔，取少量加入l o 倍体积的l - t r y ( 5 0r e t o o l l ) 终止反应，测定剩余活性。反应溶液在2 8 0 啪处的光吸收值不断下降，并趋于 稳定，再加入修饰剂吸收值略有回升，表明修饰完成。 婴型盔兰竺堂竺堡：苎 3 4 4 组氨酸残基的修饰 h i s 修饰按照m i l e s 法( 2 0 1 反应体系为硼酸一硼砂缓冲液中( 5 0m m o l l ，p h 6 0 ) ，c u r c i n ( o 2 m g m 1 ) 与不同浓度的d e p c ( o 0 5 1 0 m m o 儿，冰乙醇新鲜配 霄，反应体系中乙醇的浓度不超过5 ( v v ) ) 于2 5 反应，f b j 隔取样l o u l j j l 入等体积的1 0 0m m o f l 的咪唑( p h 6 8 ) 终止反应，测定剩余活性。反应溶液 2 4 2 n m 处吸收值不断上升并趋于稳定，表明修饰完成。 3 ，4 5 半胱氨酸残基的修饰 c y s s h e g d es u b m y 等的方法i “1 。反应体系为硼酸一硼砂缓冲液( 5 0 m m o l l ，p h7 0 ) ，籼e u r c i n ( o 2 m g m 1 ) 与不同浓度的n e m ( o 0 5 5r e t o o l l ) 室温下反应，间隔取样1 0 u l ，g 2 5 去除多余试剂，进行活性测定。 以上修饰间隔取样，测定荧光光谱，修饰结束后测定圆二色谱。 3 5 光谱测定 。 3 5 1 内源荧光光谱的测定 荧光光谱的测定在f - 4 5 0 0 荧光分光光度上进行，样品测量温度为室温，发 射光谱带宽为5 n m 。测量时分别以2 8 0 n m ，2 9 5 n m 为激发光，测得荧光发射光谱。 每个样品测定三次取平均值。 3 5 2 圆二色谱测定 测定在j 5 0 0 c 型自动记录分光偏振仪上进行，测定温度为室温，所有测定 样品均为生理盐水溶液。扫描波长范围为1 9 0 2 5 0 n n l 。平均残基分子量为1 1 0 ， 光程o 0 2 e r a ，灵敏度2 m * e r a 。圆二色谱用平均椭圆度【0 】表示，单位为度厘米 2 分摩尔( d e g b m 2 d m o l 。1 ) 。 3 6 荧光淬灭研究 一些特殊的物质能使产生荧光的物质的荧光强度减弱甚至不产生荧光，这 种现象称为荧光淬灭。通过对荧光淬灭的研究，能够获得物质中发荧光的基团 所处微环境的有用信息。因此，荧光淬灭可以用于研究蛋白质分子中t r p0 2 戈t y r 残基所处的微环境 8 婴型叁兰堡主兰竺堡苎 3 6 1k i 对c u r c i n 荧光的淬灭作用 参照l e h r e r , s s 和e f l i n k ，m ，r 1 2 2 2 3 1 等的方法。溶液由p h 7 4 ，2 0 m m o l l 的p b s 缓冲液配制成0 0 0 m o l l 、o 0 3 m o l l 、0 0 6 m o i l 、0 0 9 m o l l 、0 1 2 m o l l 、 0 1 5m o ll 五种不同浓度( 内含2 m m o l l n a 2 s 2 0 3 作还原剂，以防止h 生成) 。 向五种溶液 自i n c u r c i n 样品使其终浓度为o 2 m g m l ，然后进行荧光光谱的测 定。 3 6 2 丙烯酰胺对c u r e i n 荧光的淬灭作用 丙烯酰胺对c u r c i n 荧光的淬灭参考l e h r e r ，s s 和e f t i n k ，m r 2 2 2 3 1 等的方 法，用p h 7 2 ，2 0 m m o l l 的p b s 缓冲液将丙烯酰胺分别配成0 0m