（物理化学专业论文）基于纳米粒子表面的聚合酶链反应.pdf

摘 要 研究基于纳米粒子表面的聚合酶链反应，不仅为 p c r 产物的检测分离和纯化带 来了方便， 而且也为d n a 生物芯片和纳米粒子/ d n a 纳米结构的制备提供了一种新的 方法。目前，国外有一些文献报道了基于固相表面的聚合酶链反应，但是还有许多 地方值得深入地探讨。本文系统研究了基于纳米粒子表面的聚合酶链反应。 ( i ) 首 先采用反 相微乳液的 方法， 利 用正硅酸乙酷在 碱性条件下水解， 在y - f e 2 0 3 的表面包裹一层 s i 0 - 。实验结果表明在磁核 y - f e 2 0 。 的表面成功地包裹了s i 0，形 成了 核壳型 磁性 纳米粒子( m n p ) :而且 在合适的条件下，合 成的核壳型 磁性纳米粒 子具有均匀的粒径和良 好的单分散性。 ( 2 ) 通过共价键合的方 法将o l i g o d n a连 接到m n p 表面，并首 次利 用表面增强 拉曼光谱 ( s e r s ) 方法 对 。 i i g o d n a在m n p 表面的键合进行了检测。实 验结果表 明 疏基在 银基底上有很 好的s r e s 效应，经由 过硫键能 够将 o l ig o d n a成功地键合 到磁性纳米粒了的表面，并且通过其与互补单链 d n a的杂交验证了其仍然有很好 的生物活性。这为基于磁性纳米粒子表面的聚合酶反应奠定了基础。 ( 3 ) 进一步系统地研究了基于磁性纳米粒子表面的聚合酶链反应 ( p c r ) 的规律。 实 验结果表明 ，在 合适的 条件 下， 连接在磁性 纳米粒了 表面的引物能 够顺利地进行 p c r 。 当一条引物连接在磁性纳米粒子表面， 另一条引物没有连接在磁性纳米粒子表 面时，p c r受退火温度的影响较小。两条引物都连接在磁性纳米粒子表面时，p c r 受退火温度的影响较大:并且在一定温度范围里，退火温度越高，p c r产物特异性 越好。同时实验结果还表明通过两条引物连接在磁性纳米粒子表面的 p c r ，可以制 得m n p / d n a 聚合休。 ( 4 ) 树枝状化合物大分子是一类新型合成高分子， 它分子的大小、 形状和功能基 团可以在合成过程中进行严格设计和控制，因此引起了人们的极大兴趣。其中，聚 酞胺一 胺( p a m a m ) 是第一个合成的树枝状化合物大分子。目前，己经对p a m a m 在幕因 和药物载休以及磁共振成像等方面的应用进行了研究。 本文研究了基于 p a ma m分 了表面的 p c r 。实验结果表明，在合适的条件下，不管是一条引物还是两条引物连 接在 p a ma m分子表面， 都能够进行 p c r 。 实验结果进一步表明， 经过两条引物连 接在 p a ma m分子表面的p c r ，能够制备p a ma m / d n a聚合休，该聚合体具有温 度的敏感性。 ( 5 ) 合成了磁性纳米粒子人工内切酶， 并初步地研究了其对 2 6 - m e r s 的目 标单链 d n a进行了定位切断。 实验结果表明， 合成的 磁性纳米粒子人工内切酶对目 标单链 d n a能够初步地进行定位切断。 关键词: m n p ; s e r s ; d n a: p c r : p a ma m: af m: h p l c ; 人工核酸 切割试剂 abs tract t h e s t u d y o f p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( p c r ) b a s e d o n m a g n e t i c n a n o p a r t i c l e w o u l d n o t o n ly b r i n g t h e c o n v e n i e n c e t o t h e d e t e c t i o n , i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f p c r p r o d u c t s b u t a l s o p r o v i d e a n e w m e t h o d f o r p r e p a r i n g d n a c h i p a n d t h e n a n o s t r u c t u r e c o n t a i n e d d n a a n d n a n o p a r t i c l e s . i n r e c e n t y e a r , s o m e l i t e r a t u r e s r e p o r t e d t h a t p c r b a s e d o n s o l i d p h a s e c o u l d p r o c e e d . b u t i t w a s a n in i t i a l s t u d y , a n d s t i l l n e e d e d t o d o a l o t o f w o r k . i n t h i s t h e s i s , w e h a d s y s t e m a t i c a l l y s t u d i e d p c r b a s e d o n n a n o p a rt i c l e . ( 1 ) a t h i n s i l i c a - c o a t i n g l a y e r e n c a p s u l a t i n g b a r e y - f e 2 0 3 n a n o p a rt i c l e s w a s f o r m e d b y a b a s e - c a t a l y z e d h y d r o l y s i s a n d p o l y m e r i z a t i o n r e a c t io n o f t e t r a e t h o x y s i l a n e ( t e o s ) i n r e v e r s e m i c r o e m u l s i o n . t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s s h o w t h a t t h e m a g n e t i c n a n o p a rt ic l e s ( mn p ) w i t h t h e s t r u c t u r e o f c o r e - s h e l l i s s u c c e s s f u l l y s y n t h e s iz e d a n d t h e s y n t h e s i z e d mn p h o ld s u n i f o r m s i z e i n d ia m e t e r a n d v e ry f i n e m o n o d is p e r s i o n i n s u i t a b l e c o n d i t i o n . ( 2 ) t h e o l i g o d n a w a s c o v a l e n t l y i m m o b i l i z e d o n t h e s u r f a c e o f m n p b y c h e mi c a l m e t h o d a n d a t e c h n i q u e o f s e r s w a s d e v e l o p e d t o d e t e c t i t . t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s s h o w t h a t t h io l s a t t a c h e d o n a g s u b s t r a t e h a v e e x c e l l e n t s e r s a n d o l i g o d n a w a s c o v a l e n t ly c o 句 u g a t e d t o t h e s u r f a c e o f m n p b y d i s u l f i d e b o n d . a t t h e s a m e t i me , t h e f a c t w a s a ls o d e m o n s t r a t e d t h a t o l i g o d n a i m m o b i l i z e d o n t h e s u r f a c e o f mn p s t i l l m a i n t a i n v e r y f i n e b i o l o g i c a l a c t iv i t y b y h y b r i d i z a t i o n w i t h c o m p le m e n t a ry s i n g l e s t r a n d d n a , w h i c h i s p r e p a red f o r p c r b a s e d o n m a g n e t i c n a n o p a r t i c l e s . ( 3 ) t h e l a w o f p c r b a s e d o n m n p w a s s y s t e m a t i c a l l y s t u d i e d . t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s s h o w t h a t t h e p r i m e r s a n c h o r e d o n mn p c a n s t a rt p c r i n s u i t a b l e c o n d i t io n . t h e a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e a ff e c t s h a r d l y p c r w h e n t h e f o r w a r d p r i m e r w a s i m m o b i l iz e d a n d t h e r e v e r s e o n e i s f r e e , b u t t h e a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e a ff e c t s s e r i o u s l y p c r w h e n b o t h p r i m e r s w e r e i m m o b i l iz e d a n d t h e p u r i t y o f p c r p r o d u c t s w a s e n h a n c e d w i t h t h e i n c r e a s e o f a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e i n a c e rt a i n t e m p e r a t u r e r a n g e . a t t h e s a m e t i m e , t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s a l s o s h o w t h a t t h e mn p / d n a a g g r e g a t e s w e r e c o n s t r u c t e d b y p c r i n w h i c h b o t h p r i m e r s w e r e i m m o b i l i z e d o n t h e s u r f a c e o f m np . 3 ( 4 ) t h e d e n d r i m e r i s a k i n d o f n e w l y s y n t h e s i z e d c o m p o u n d w i t h l a r g e m o le c u l a r w e i g h t a n d t h e f i g u r e a n d s i z e o f i t s m o l e c u l a r a n d t h e f u n c t i o n a l c h e mic a l g r o u p s a t i t s e x t e r io r c a n b e s t r i c t l y c o n t r o l l e d i n s y n t h e t i c a l p r o c e s s , w h i c h a t t r a c t s m a n y r e s e a r c h e r s i n t e r e s t . t h e p o l y a mi d e - a mi n e c o m p o u n d w a s t h e f i r s t s y n t h e s i z e d d e n d r i m e r . a t p r e s e n t , r e s e a r c h e r s b e g a n t o s t u d y a p p l i c a t i o n s o f p a ma m t o g e n e a n d m e d i c i n e c a r r i e r a n d m a g n e t i c r e s o n a n c e i ma g e a n d s o o n . i n t h i s t h e s i s , p c r b a s e d o n p a ma m w a s a l s o s t u d i e d . t h e e x p e r im e n t a l r e s u l t s s h o w t h a t w h e t h e r o n e p c r p r i m e r o r t w o p c r p r i m e r s w e r e i m m o b i l i z e d o n p a ma m, p c r c a n b o t h p r o c e e d . t h e r e s u lt s f u r t h e r in d i c a t e t h a t w h e n t w o p c r p r i me r s w e r e b o t h i m m o b i l i z e d o n t h e m, p a ma m m o l e c u le s w e r e c o n n e c t e d t o g e t h e r b y t h e d o u b l e s t r a n d d n a a ft e r p c r t o f o r m p o l y me r wit h l a r g e s i z e i n d ia m e t e r . a t t h e s a m e t i m e , t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s a l s o s h o w t h a t p o l y m e r h o l d t h e r ma l s e n s i t iv i t y . ( 5 ) t h e n a n o - m a g n e t i c a rt i f i c ia l n u c l e a s e w a s s y n t h e s iz e d a n d t h e s e q u e n c e - s p e c i f i c c l e a v a g e o f 2 6 - m e r s s i n g l e s t r a n d e d d n a ( o d n ) w a s r u d i m e n t a r i l y s t u d i e d . t h e e x p e r i m e n t a l r e s u lt s i n d ic a t e t h a t t h e n a n o - m a g n e t i c a r t i f ic ia l n u c l e a s e c a n c l e a v e t a r g e t e d od n in e x p e c t e d s i t e . k e y w o r d s : mn p ; s e r s ; d n a; p c r ; p a m a m; a f m; h p l c : a rt i f i c i a l s it e - s p e c i f ic n u c l e a s e 4 上海师范大学理学硕士论文 第一章 文献综述 1 . 1 研究的意 义 1 9 9 0年，首届国际纳米科技会议在美国巴尔的摩的举办标志着纳米科学的正 式诞生;自此，历经十几年的时间，纳米科学取得了迅速的发展。纳米科学是指 在1 - i 0 0 n m ( 10 9 - 1 0 -7 m ) 的 尺 寸 范围 里 研 究 物 质 所 具 有 的 物 理、 化 学 性 质 及 其 功能 的 科学，它不再仅仅局限于物理、化学或生物等某一学科，而是各门学科交叉形成 的一门高新学科技术。由于它所研究的领域是介于宏观和微观之间的，是过去人 类很少涉及的，从 而将人类认知 世界的 角度推到了 一个新的 层次 ”】 。 2 0 0 0年， 人类基因组带图绘制完毕，为人类征服许多疑难病症铺平了道路。这不仅是达尔 文时代以来生物学领域最重大的事件，而且也是人类 自 然科学史上最重要的里程 碑，它标志着生物科学技术的应用将进入一个新的世纪。随着现代科学技术的不 断发展，人类不断地攻克一个又一个的技术难题:同时却也不断地涌现出一个又 一个新的难题 ，这些难题所涉及到的不再仅仅是某一领域的知识，而是涉及到多 门学利的知识。这样只有不同学科在最大程度上相互结合才能在最大程度上共同 推动科技的进步。纳米科学技术和生物科学技术相结合便产生了纳米生物技术， 它是利用纳米粒了由于粒径小而具有的表面效应、体积效应以及光学或磁学等独 特的性质以及借助生物分了 独特的生物功能，在纳米尺寸范围里制造各种各样的 医疗、生物和化学等产品，例如纳米机器人、生物芯片、药物和基因载体和纳米 生物传感器等高新科技产品。尤其是纳米药物载体和纳米生物传感器等的设计和 制备，将在疾病诊断、治疗和卫生保健等方面发挥其重要作用。为此，纳米生物 学已 成为一 个独立学科越来 越吸 引人们的 注意1 3 . 4 。 众所周知， 随着纳米科学技术向生命科学领域里不断地发展， 纳米材料在生命 科学中的运用将会越来越广泛，也必将越来越多地渗透到各种各样的生物科学技 术里，这将有助于推动纳米生物技术的发展。一方面由于纳米材料具有独特的光 学或磁学等性质，因而可以利用纳米材料对生物大分子 ( 如 d n a分子等)进行分 离和纯化:另一方面由于生物大分子具有良好的识别能力和尺寸易于控制，因而 可以利用生物大分子作为模板对纳米材料进行组装。 所以， 对纳米材料/ 生物大分 上海师范大学理学硕士论文 第一章 文献综述 1 . 1 研究的意 义 1 9 9 0年，首届国际纳米科技会议在美国巴尔的摩的举办标志着纳米科学的正 式诞生;自此，历经十几年的时间，纳米科学取得了迅速的发展。纳米科学是指 在1 - i 0 0 n m ( 10 9 - 1 0 -7 m ) 的 尺 寸 范围 里 研 究 物 质 所 具 有 的 物 理、 化 学 性 质 及 其 功能 的 科学，它不再仅仅局限于物理、化学或生物等某一学科，而是各门学科交叉形成 的一门高新学科技术。由于它所研究的领域是介于宏观和微观之间的，是过去人 类很少涉及的，从 而将人类认知 世界的 角度推到了 一个新的 层次 ”】 。 2 0 0 0年， 人类基因组带图绘制完毕，为人类征服许多疑难病症铺平了道路。这不仅是达尔 文时代以来生物学领域最重大的事件，而且也是人类 自 然科学史上最重要的里程 碑，它标志着生物科学技术的应用将进入一个新的世纪。随着现代科学技术的不 断发展，人类不断地攻克一个又一个的技术难题:同时却也不断地涌现出一个又 一个新的难题 ，这些难题所涉及到的不再仅仅是某一领域的知识，而是涉及到多 门学利的知识。这样只有不同学科在最大程度上相互结合才能在最大程度上共同 推动科技的进步。纳米科学技术和生物科学技术相结合便产生了纳米生物技术， 它是利用纳米粒了由于粒径小而具有的表面效应、体积效应以及光学或磁学等独 特的性质以及借助生物分了 独特的生物功能，在纳米尺寸范围里制造各种各样的 医疗、生物和化学等产品，例如纳米机器人、生物芯片、药物和基因载体和纳米 生物传感器等高新科技产品。尤其是纳米药物载体和纳米生物传感器等的设计和 制备，将在疾病诊断、治疗和卫生保健等方面发挥其重要作用。为此，纳米生物 学已 成为一 个独立学科越来 越吸 引人们的 注意1 3 . 4 。 众所周知， 随着纳米科学技术向生命科学领域里不断地发展， 纳米材料在生命 科学中的运用将会越来越广泛，也必将越来越多地渗透到各种各样的生物科学技 术里，这将有助于推动纳米生物技术的发展。一方面由于纳米材料具有独特的光 学或磁学等性质，因而可以利用纳米材料对生物大分子 ( 如 d n a分子等)进行分 离和纯化:另一方面由于生物大分子具有良好的识别能力和尺寸易于控制，因而 可以利用生物大分子作为模板对纳米材料进行组装。 所以， 对纳米材料/ 生物大分 上海师范大学理学硕士论文 了复合体的研究具有重要的意义聚合酶链反应 ( p c r )是一种体外特定核酸序列 扩增技术，自从热稳定性聚合酶发现 以 来，聚合酶链反应已发展成为分子生物学 的重要实验方法之一。如果将纳米材料引入到聚合酶链反应中，不仅能够同时发 挥纳米材料和 d n a的优点，而且还将使 p c r 技术由均相体系扩展到复相休系。这 样就为传统的 p c r 技术增添了新的内容， 从而大大地拓宽 p c r 技术的应用范围。 因 此， 研究基于纳米粒子表面的聚合酶链反应，具有非常重要的理论意义和应用价 值，其主要体现在以下几个方面: 首先， 对基于纳米粒了表面的聚合酶链反应的研究有利于对 p c r 产物的检测、 分离和纯化。传统的检测 p c r产物的方法是通过电泳后，用澳化乙陡对 d n a条带 进行染色，再用紫外分析仪对 d n a条带进行分析。同时也可以通过电泳或层析等 方法来分离和纯化 p c r的产物。然而这些操作在程序上非常复杂，而且需要较长 的时间。 如果将引物连接在固相表面， 进行聚合酶链反应， 就能够很容易地对 p c r 产物进行检测，例如 l o c k l e y等人将一条引物固定在固相的表面，进行聚合酶链 反应，通过观察键合在新合成 d n a链上的地高辛标记颜色的变化，方便地检测到 p c r 后的产物【 勺 。 此外， 磁性分离具有操 作程序简单而 且适合大量生物分子的分离 和纯化的优点e . s ， 如果 将引 物连接在磁性纳米 粒子表 面进行聚合酶 链反应， 那么 利用外磁场就可以对 p c r 产物方便地进行分离和纯化。 其次，对基于纳米粒子表面的聚合酶链反应的研究为 d n a生物芯片的制备提 供了一种新的方法。 d n a生物芯片因其具有高通量、 微型化和自动化等优点，目前 在基因测序、基因表达水平的检测以及疾病基因的检测等方面具有巨大的应用价 值。目前通常制备 d n a芯片主要采用表面化学的方法或组合化学的方法来处理固 相基休如玻璃片或硅片等，然后使 d n a片段按特定顺序排列在基片上。如果通过 基于纳米粒子表面的聚合酶链反应，便能够快速地在固相表面扩增出具有特定长 度和序列的d n a 片断， 这就为d n a 芯片的制备提供了新的方法。 例如 c e 1 i n e a d e s s i 等人a 研究了引 物固 定在玻璃 底物上的聚 合酶链反 应， 并探讨了其在d n a 生物芯片 制备方面的应用。 上海师范大学理学硕士论文 第二，对基于纳米粒子表面的聚合酶链反应的研究为纳米粒子/ d n a 的纳米结 构的组装提供了一种新的方法。由于这种纳米结构既含有纳米粒子又含有双链 d n a ， 使得其 不仅具有纳米材料的 独 特性质同时也 具有双链d n a 的复性和 变性的功 能， 因而这种纳米结构在疾病检测和药物基因载休方面有潜在的应用价值。 因此， 对 纳米粒了 /d n a 纳米结构的 应用研究 越来越受到人 们的 关注c w :.5 。 尤其经 过基于 磁性纳米粒了表面的聚合酶链反应能够制得磁性纳米粒子/ d n a的纳米结构，考虑 到其优良的磁性，这种纳米结构可能在靶向药物和临床磁共振成像方面有着重要 的应用。这样就有必要去发展一些简单的方法去组装这种纳米结构，基于纳米粒 了表面的聚合酶链反应正好适应了这一需要。通过上游引物和下游引物都连接在 纳米粒了表面的聚合酶链反应，能够方便地制备出纳米粒了/ d n a 的纳米结构:而 且还可以根据不同的需要改变纳米粒子的粒径和设计具有不同长度和序列的引 物 。 此外，对基于纳米粒子表面的聚合酶链反应的研究还有助于对界面反应规律 的探讨和对纳米材料的表面进行改性等作用口 1 . 2研究进展 1 . 2 . 1核壳型磁性纳米粒子的合成及分类 铁的氧化物有着多种组成形式，不同的组成形式有着不同的磁性，y - f e o :, 和 f e _,。是最常见的具 有良 好 磁性的 铁氧休，它 们都是表现为亚铁磁性【 们 。它 们不仅 在工业上具有重要的用途 ( 如磁性记录材料等) ， 而且在生物医疗等方面也具有重 要的应用前景 ( 如核酸和蛋白质的分离、 磁共振成像造影剂等) 。然而，虽然它们 具有优良的磁性， 但是由于裸露的y - f e 办和 f e 八 的磁性容易受到环境的影响( 尤 其在生物体系中)并且个体容易团聚等，这使得它们的应用受到限制。因此，对 磁性纳米粒子进行表面修饰使其具有更好的分散性和生物相容性的研究具有重要 的意义。 根据在磁核表面修饰的主要成分， 核壳型磁性纳米粒子可分为有机物高分子 磁性纳米粒子和无机物磁性纳米粒子。有机物高分子磁性纳米粒子有着多种合成 上海师范大学理学硕士论文 第二，对基于纳米粒子表面的聚合酶链反应的研究为纳米粒子/ d n a 的纳米结 构的组装提供了一种新的方法。由于这种纳米结构既含有纳米粒子又含有双链 d n a ， 使得其 不仅具有纳米材料的 独 特性质同时也 具有双链d n a 的复性和 变性的功 能， 因而这种纳米结构在疾病检测和药物基因载休方面有潜在的应用价值。 因此， 对 纳米粒了 /d n a 纳米结构的 应用研究 越来越受到人 们的 关注c w :.5 。 尤其经 过基于 磁性纳米粒了表面的聚合酶链反应能够制得磁性纳米粒子/ d n a的纳米结构，考虑 到其优良的磁性，这种纳米结构可能在靶向药物和临床磁共振成像方面有着重要 的应用。这样就有必要去发展一些简单的方法去组装这种纳米结构，基于纳米粒 了表面的聚合酶链反应正好适应了这一需要。通过上游引物和下游引物都连接在 纳米粒了表面的聚合酶链反应，能够方便地制备出纳米粒了/ d n a 的纳米结构:而 且还可以根据不同的需要改变纳米粒子的粒径和设计具有不同长度和序列的引 物 。 此外，对基于纳米粒子表面的聚合酶链反应的研究还有助于对界面反应规律 的探讨和对纳米材料的表面进行改性等作用口 1 . 2研究进展 1 . 2 . 1核壳型磁性纳米粒子的合成及分类 铁的氧化物有着多种组成形式，不同的组成形式有着不同的磁性，y - f e o :, 和 f e _,。是最常见的具 有良 好 磁性的 铁氧休，它 们都是表现为亚铁磁性【 们 。它 们不仅 在工业上具有重要的用途 ( 如磁性记录材料等) ， 而且在生物医疗等方面也具有重 要的应用前景 ( 如核酸和蛋白质的分离、 磁共振成像造影剂等) 。然而，虽然它们 具有优良的磁性， 但是由于裸露的y - f e 办和 f e 八 的磁性容易受到环境的影响( 尤 其在生物体系中)并且个体容易团聚等，这使得它们的应用受到限制。因此，对 磁性纳米粒子进行表面修饰使其具有更好的分散性和生物相容性的研究具有重要 的意义。 根据在磁核表面修饰的主要成分， 核壳型磁性纳米粒子可分为有机物高分子 磁性纳米粒子和无机物磁性纳米粒子。有机物高分子磁性纳米粒子有着多种合成 上海师范大学理学硕士论文 第二，对基于纳米粒子表面的聚合酶链反应的研究为纳米粒子/ d n a 的纳米结 构的组装提供了一种新的方法。由于这种纳米结构既含有纳米粒子又含有双链 d n a ， 使得其 不仅具有纳米材料的 独 特性质同时也 具有双链d n a 的复性和 变性的功 能， 因而这种纳米结构在疾病检测和药物基因载休方面有潜在的应用价值。 因此， 对 纳米粒了 /d n a 纳米结构的 应用研究 越来越受到人 们的 关注c w :.5 。 尤其经 过基于 磁性纳米粒了表面的聚合酶链反应能够制得磁性纳米粒子/ d n a的纳米结构，考虑 到其优良的磁性，这种纳米结构可能在靶向药物和临床磁共振成像方面有着重要 的应用。这样就有必要去发展一些简单的方法去组装这种纳米结构，基于纳米粒 了表面的聚合酶链反应正好适应了这一需要。通过上游引物和下游引物都连接在 纳米粒了表面的聚合酶链反应，能够方便地制备出纳米粒了/ d n a 的纳米结构:而 且还可以根据不同的需要改变纳米粒子的粒径和设计具有不同长度和序列的引 物 。 此外，对基于纳米粒子表面的聚合酶链反应的研究还有助于对界面反应规律 的探讨和对纳米材料的表面进行改性等作用口 1 . 2研究进展 1 . 2 . 1核壳型磁性纳米粒子的合成及分类 铁的氧化物有着多种组成形式，不同的组成形式有着不同的磁性，y - f e o :, 和 f e _,。是最常见的具 有良 好 磁性的 铁氧休，它 们都是表现为亚铁磁性【 们 。它 们不仅 在工业上具有重要的用途 ( 如磁性记录材料等) ， 而且在生物医疗等方面也具有重 要的应用前景 ( 如核酸和蛋白质的分离、 磁共振成像造影剂等) 。然而，虽然它们 具有优良的磁性， 但是由于裸露的y - f e 办和 f e 八 的磁性容易受到环境的影响( 尤 其在生物体系中)并且个体容易团聚等，这使得它们的应用受到限制。因此，对 磁性纳米粒子进行表面修饰使其具有更好的分散性和生物相容性的研究具有重要 的意义。 根据在磁核表面修饰的主要成分， 核壳型磁性纳米粒子可分为有机物高分子 磁性纳米粒子和无机物磁性纳米粒子。有机物高分子磁性纳米粒子有着多种合成 上海师范大学理学硕士论文 方 法， 例如单体聚 合法0 s . 16 1舌 性溶胀 法 17 . 1 1 1 等。 其原 理一般都是利用高分子有机 物的长链缠绕在磁核的外围而形成，其优点在于容易引进多种活性基团 ( 如一 o h , - 0 0 0 h以及一 n h , 等) ，有利于生物分子的连接;其缺点在于磁核容易泄漏以及在合 成过程中引进的杂质难于除去等。无机物磁性纳米粒子一般是由二氧化硅等无机 物基体与磁核纳米粒子组成，其中二氧化硅包裹的磁性纳米粒子通常是经过正硅 酸乙酷在碱性条件下水解而形成。二氧化硅包裹的磁性纳米粒子因其良好的稳定 性和与核酸键合的特殊性质，近午来，受到科学家们的广泛关注。此外，由于二 氧化硅层非常致密使得磁核不容易泄漏而能够得到磁含量较高的磁性纳米粒了， 同时二氧化硅的表面非常容易功能化，因此经过表面改性的二氧化硅包裹的磁性 纳 米粒子在生物分离、 超声成像和生化 合成及催化等方面有 广泛的应用 1勺 一 川 。 1 . 2 . 2 核壳型磁性纳 米粒子在生物大分子 分离 和纯化中 的 应用 表面功能化的核壳型磁性纳米粒子能够高效地偶联目 标产物， 因而利用其优良 的磁性，在外磁场的作用下，能够方便地对目标生物大分子进行分离和纯化。与 传统的电泳、层析以及离心等方法相比较，磁性分离操作程序上简单而且适合大 量生物分了的分离和纯化，因而在核酸细胞蛋白质的分离和提纯中有着广泛的应 用。 在核酸的分离纯化中， 传统方法有超离心密度梯度技术和凝胶电泳等， 例如目 前纯化质粒 d n a最常用的是氯化艳密度梯度平衡超离心法，分离提纯 r na 和 d n a通常采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酞胺凝胶电泳等。 然而这些方法操作程序 比较复杂、需要较长的时间而且成本也较高。如果采用磁性分离，能够节省大量 时 间而且操 作也非 常方便，例如偶 联有 o l i g o ( d t ) z s 的磁性纳 米粒子可以 快速、 高 效地对 mr n a 进行纯化，且纯化后的 m r n a 可以直接用来建立 c d n a 库和 r t - p c r扩增2 5 % smithz6等人发明了 一种用磁性二氧化 硅纳 米粒子分离生物目 标 物质的方法，利用此法可以从混合溶液中分离出目 标生物大分了 ( 例如核酸，包 括d n a和r n a )。在 该方法中二氧 化硅磁性纳米粒了与生 物目 标物质在一定的 环境中形成一种复合物，用外加磁场从混合体系中分离该复合物。最佳状态时， 上海师范大学理学硕士论文 方 法， 例如单体聚 合法0 s . 16 1舌 性溶胀 法 17 . 1 1 1 等。 其原 理一般都是利用高分子有机 物的长链缠绕在磁核的外围而形成，其优点在于容易引进多种活性基团 ( 如一 o h , - 0 0 0 h以及一 n h , 等) ，有利于生物分子的连接;其缺点在于磁核容易泄漏以及在合 成过程中引进的杂质难于除去等。无机物磁性纳米粒子一般是由二氧化硅等无机 物基体与磁核纳米粒子组成，其中二氧化硅包裹的磁性纳米粒子通常是经过正硅 酸乙酷在碱性条件下水解而形成。二氧化硅包裹的磁性纳米粒子因其良好的稳定 性和与核酸键合的特殊性质，近午来，受到科学家们的广泛关注。此外，由于二 氧化硅层非常致密使得磁核不容易泄漏而能够得到磁含量较高的磁性纳米粒了， 同时二氧化硅的表面非常容易功能化，因此经过表面改性的二氧化硅包裹的磁性 纳 米粒子在生物分离、 超声成像和生化 合成及催化等方面有 广泛的应用 1勺 一 川 。 1 . 2 . 2 核壳型磁性纳 米粒子在生物大分子 分离 和纯化中 的 应用 表面功能化的核壳型磁性纳米粒子能够高效地偶联目 标产物， 因而利用其优良 的磁性，在外磁场的作用下，能够方便地对目标生物大分子进行分离和纯化。与 传统的电泳、层析以及离心等方法相比较，磁性分离操作程序上简单而且适合大 量生物分了的分离和纯化，因而在核酸细胞蛋白质的分离和提纯中有着广泛的应 用。 在核酸的分离纯化中， 传统方法有超离心密度梯度技术和凝胶电泳等， 例如目 前纯化质粒 d n a最常用的是氯化艳密度梯度平衡超离心法，分离提纯 r na 和 d n a通常采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酞胺凝胶电泳等。 然而这些方法操作程序 比较复杂、需要较长的时间而且成本也较高。如果采用磁性分离，能够节省大量 时 间而且操 作也非 常方便，例如偶 联有 o l i g o ( d t ) z s 的磁性纳 米粒子可以 快速、 高 效地对 mr n a 进行纯化，且纯化后的 m r n a 可以直接用来建立 c d n a 库和 r t - p c r扩增2 5 % smithz6等人发明了 一种用磁性二氧化 硅纳 米粒子分离生物目 标 物质的方法，利用此法可以从混合溶液中分离出目 标生物大分了 ( 例如核酸，包 括d n a和r n a )。在 该方法中二氧 化硅磁性纳米粒了与生 物目 标物质在一定的 环境中形成一种复合物，用外加磁场从混合体系中分离该复合物。最佳状态时， 上海师范大学理学硕士论文 二氧化 硅磁性纳米粒子和目 标物质能形成2 m g / g 的复 合物， 在洗涤步骤中，至 少 能得到 6 0 %的目 标物质。 b o s e 和王柯敏等人分别通过抗生素与生物素的特定相互 亲 和作用2 7 -2 9 1 ， 把与目 标d n a互补的探 针d n a连接到 磁性 底物上， 并利用 磁性 纳米粒了的磁性对 目 标单链 d n a进行富集和分离。 核壳型磁性纳米粒子在细胞和蛋白质的分离方面的应用， 也取得了一系列的进 展。 例 如j o s e p h s o n 130 和u g e ls ta 等 人 13 1分 别 用 磁 性纳 米 粒子 分 离出 人 血 中 的 淋巴 细胞和嗜碱细胞; c h e n 等人用万古霉素修饰的磁性纳米粒子对革兰氏阳性病原休 进行了 成功地分离，并 用质谱技 术对 这一过程 进行了 验证1 3 2 1 ; 与传统分离方 法相 比 较，蛋白 质的 磁性分离技术具有速度快、 纯度高、回收率高等优点1 3 3 1 。 如从 e r w i n ia c a r o t o v o r a 中分离l 一 天冬酞胺酶， 若用琼脂 糖凝胶亲 和层析分 离1 3 4 1整 个 过程需要耗时 6 8小时， l 一 天冬酞胺酶的纯度大于9 0 %，回收率为3 8 %: 而用甲苯 磺酞氯活化的 磁性纳米粒子进行分离时13 5 3整个 过程只需耗时 3 小时， l 一 天 冬酞 胺酶的纯度可高达 9 9 .9 %，回收率为 9 5 %。此外，表面功能化的核壳型磁性纳米 粒了在靶向药物和磁共振成像造影剂等方面的应用也受到了广泛地关注。 1 . 2 . 3 以d n a 为 模板的 纳米结构的 组装及其 应用 以d n a为模板的纳米结构的组装是近几年发展起来的新兴研究领域， 并在实际 的医疗诊断和生物传感器等方面己经取得了相应的应用，因而吸引人们的广泛关 注。 由于双链d n a 分子是由两条寡聚脱氧核营酸单链通过碱基互补配对而形成的， 具有严密的分了识别能力，从而使得其在分了组装中具有高度的选择性。因此， 在纳米粒了的组装技术中，d n a分子作为一种组装的模板备受青睐卜 ，3卜 ，3卜 ， ,卜 ， 3 6 - 4 2 ) a l i v i s a t o s 1 1和m i r k i n c 1 等 人 最 早 报 道了 用d n a 为 模 板 组 装金 纳 米 粒 子 形 成 了 二维和二维的纳米结构， 由于这种纳米结构中含有双链 d n a , 所以具有温度的敏感 性，可以通过控制温度使其变性和复性。同时由于均匀的金溶胶呈现红色，而金 纳米粒子的团聚体呈现蓝色，因而可以利用这种性质制成选择性高的寡聚核营酸 传感器t+ + 1 。 此外， 由 于d n a 分了可以 根据 不同 需要 而设计成不同长 度和不同序 列 的 组成， 因而 在很大 程度上丰富了d n a 纳米 结构在实际中的 应用a ; - x 1 。 除金纳米粒 上海师范大学理学硕士论文 二氧化 硅磁性纳米粒子和目 标物质能形成2 m g / g 的复 合物， 在洗涤步骤中，至 少 能得到 6 0 %的目 标物质。 b o s e 和王柯敏等人分别通过抗生素与生物素的特定相互 亲 和作用2 7 -2 9 1 ， 把与目 标d n a互补的探 针d n a连接到 磁性 底物上， 并利用 磁性 纳米粒了的磁性对 目 标单链 d n a进行富集和分离。 核壳型磁性纳米粒子在细胞和蛋白质的分离方面的应用， 也取得了一系列的进 展。 例 如j o s e p h s o n 130 和u g e ls ta 等 人 13 1分 别 用 磁 性纳 米 粒子 分 离出 人 血 中 的 淋巴 细胞和嗜碱细胞; c h e n 等人用万古霉素修饰的磁性纳米粒子对革兰氏阳性病原休 进行了 成功地分离，并 用质谱技 术对 这一过程 进行了 验证1 3 2 1 ; 与传统分离方 法相 比 较，蛋白 质的 磁性分离技术具有速度快、 纯度高、回收率高等优点1 3 3 1 。 如从 e r w i n ia c a r o t o v o r a 中分离l 一 天冬酞胺酶， 若用琼脂 糖凝胶亲 和层析分 离1 3 4 1整 个 过程需要耗时 6 8小时， l 一 天冬酞胺酶的纯度大于9 0 %，回收率为3 8 %: 而用甲苯 磺酞氯活化的 磁性纳米粒子进行分离时13 5 3整个 过程只需耗时 3 小时， l 一 天 冬酞 胺酶的纯度可高达 9 9 .9 %，回收率为 9 5 %。此外，表面功能化的核壳型磁性纳米 粒了在靶向药物和磁共振成像造影剂等方面的应用也受到了广泛地关注。 1 . 2 . 3 以d n a 为 模板的 纳米结构的 组装及其 应用 以d n a为模板的纳米结构的组装是近几年发展起来的新兴研究领域， 并在实际 的医疗诊断和生物传感器等方面己经取得了相应的应用，因而吸引人们的广泛关 注。 由于双链d n a 分子是由两条寡聚脱氧核营酸单链通过碱基互补配对而形成的， 具有严密的分了识别能力，从而使得其在分了组装中具有高度的选择性。因此， 在纳米粒了的组装技术中，d n a分子作为一种组装的模板备受青睐卜 ，3卜 ，3卜 ， ,卜 ， 3 6 - 4 2 ) a l i v i s a t o s 1 1和m i r k i n c 1 等 人 最 早 报 道了 用d n a 为 模 板 组 装金 纳 米 粒 子 形 成 了 二维和二维的纳米结构， 由于这种纳米结构中含有双链 d n a , 所以具有温度的敏感 性，可以通过控制温度使其变性和复性。同时由于均匀的金溶胶呈现红色，而金 纳米粒子的团聚体呈现蓝色，因而可以利用这种性质制成选择性高的寡聚核营酸 传感器t+ + 1 。 此外， 由 于d n a 分了可以 根据 不同 需要 而设计成不同长 度和不同序 列 的 组成， 因而 在很大 程度上丰富了d n a 纳米 结构在实际中的 应用a ; - x 1 。 除金纳米粒 上海师范大学理学硕士论文 子以 外， 磁性纳米粒子由 于其良 好的 磁性近年来也逐渐被人们所认识t 9 - e lj ，例如 b y r n e 等人 用d n a 组装了 磁性 纳米粒子， 由 于双 链d n a