（分析化学专业论文）青霉素类抗生素快速检测方法的研究.pdf

中文摘要 青霉素等伊内酰胺类抗生素一直广泛应用于人类、畜禽业及水产 养殖中各种细菌感染的防治。随着其产量与用量的不断增加，加之药 品管理的混乱和盲目使用，食物、水体和土壤中抗生素残留的污染问 题日益突出。抗生素残留可增强细菌耐药性，破坏人体和动物胃肠道 以及环境微生态平衡。因此，食物和环境中抗生素残留的监测和控制 十分重要。现有的抗生素残留测定方法主要包括传统的微生物抑制法， h p l c 法，酶联免疫分析法和一些商品化快速检测试剂盒、测试条。 这些方法存在费时、操作繁琐、需要昂贵的仪器、灵敏度较低等缺点。 本文旨在开发灵敏、简便的快速检测方法以克服以上局限性。具体内 容如下： 1 综述了青霉素等伊内酰胺类抗生素药物残留的危害以及抗生素残留 的检测方法的研究进展，并论述了其检测原理。 2 采用层层组装法将多层碳纳米管( m w c n r s ) ，氧化苏木精和青霉素 酶固定在玻碳电极上，研制了电流型青霉素生物传感器。研究了各 种实验参数，包括电极修饰方法的选择、p h 敏感氧化还原化合物的 选择、工作电位、酶浓度、缓冲溶液的浓度和干扰物质对生物传感 器的影响。在最佳的电位0 2vv s a g c l a g 下和1m m p b s ( p h 6 8 ) 中，该生物传感器的检测范围为5 0n m 2 7m m 。该传感器具有响应 时间短( 约8s ) ，灵敏度高、稳定性好、抗干扰能力强和可再生等 优点。 3 在金电极上通过对苯醌电化学还原法诱导沉积壳聚糖包埋m w c n t s 和青霉素酶，研制了电流型青霉素生物传感器。优化了电化学沉积 i 时间、工作电位、青霉素酶的浓度和缓冲溶液的浓度。在最佳的实 验条件下，该生物传感器表现出了持久的稳定性、良好的抗干扰能 力和较高的灵敏度，其检测范围为9 8n m 2 7m m 。用于实际牛奶样 品中的测定，结果令人满意。 4 采用层层组装技术将预吸附氧化苏木精的多层碳纳米管、壳聚糖和 青霉素酶层层组装到印刷电极表面，研制了廉价的电流型青霉素生 物传感器。采用交流阻抗和循环伏安法对修饰电极进行了表征。在 优化条件下，该生物传感器的检测范围为5 7n m 4 8g m ，并且稳定 性好，具有较强的抗干扰能力。 5 利用非水性溶剂对化学发光强度的增强和蛋白质沉淀的特性，在碱 性鲁米诺化学发光体系中建立了一种选择性好、灵敏度高、同时能 消除牛奶中蛋白质组分的干扰，直接对牛奶样品中的氨苄西林钠进 行检测的流动注射一化学发光分析方法。此方法的线性范围为o 1 “g l 一4 0g g l 一，同时对1 0g g l 。1 氨苄西林钠进行l1 次平行测定， 相对标准偏差为2 3 ，检出限为1 0n g l 一。 关键词：电流型生物传感器、流动注射化学发光分析、青霉素、肛 酰胺抗生素、抗生素残留、p 内酰胺酶、多层碳纳米管 a b s t r a c t t h ep r e s e n c eo fa n t i b i o t i cr e s i d u e si nf o o dp r o d u c t s ，d r i n k i n gw a t e r ， a n de n v i r o n m e n tc o n s t i t u t e saw o r l d w i d ec o n c e mb e c a u s eo fi t ss e r i o u s h e a l t h c o n s e q u e n c e s ，i n c l u d i n g t h e e m e r g e n c e o fa n t i b i o t i c r e s i s t a n t b a c t e r i a l s t r a i n s ，d i s t u r b a n c e o r d i s r u p t i o n o ft h en o r m a l e c o l o g i c a l e q u i l i b r i u ma n di n c r e a s i n gi n s t a n c e so fa l l e r g i cr e a c t i o n s p e n i c i l l i n sa n d o t h e rf l - l a c t a ma n t i b i o t i c sa r et h em o s tf r e q u e n t l yu s e da n t i b i o t i c sa n dh a v e l o n gb e e nw i d e l yu s e df o rt r e a t i n gv a r i o u sb a c t e r i a li n f e c t i o n si nh u m a n ， l i v e s t o c k ，p o u l t r y ，a n da q u a c u l t u r e c o n s e q u e n t l y ，d e t e c t i o no ft h er e s i d u e s o ft h e s ea n t i b i o t i c si nf o o da n de n v i r o n m e n ti sv i t a lf o rp r o t e c t i n gt h ep u b l i c h e a l t h c u r r e n tm e t h o d sa p p l i e df o rt h ed e t e c t i o no ft h e s ed r u g sm a i n l y i n c l u d et r a d i t i o n a lm i c r o b i a li n h i b i t o rt e s t s ，h p l c m sm e t h o d s ，a n ds o m e c o m m e r c i a l s c r e e n i n g t e s t sb a s e do ni n h i b i t i o no fb a c t e r i a l g r o w t h ， i n h i b i t i o no fd - c a r b o x y p e p t i d a s e ，o rt h er e c e p t o rp r o t e i n a n t i b i o t i cb i n d i n g e a c ho ft h e s em e t h o d sh a si t sp a r t i c u l a rl i m i t a t i o n ：t h em i c r o b i a li n h i b i t o r t e s t sn e e dal e n g t h yi n c u b m i o ns t e pa n da r et h u sv e r yt i m ec o n s u m i n g ，t h e h p l c m sm e t h o d sr e q u i r ee x p e n s i v ei n s t r u m e n t sa n de x t e n s i v es a m p l e p r e t r e a t m e n t ，a n dm o s t c o m m e r c i a ls c r e e n i n gt e s t sc a l l p r o v i d eo n l y s e m i q u a n t i t a t i v er e s u l t s t h ea i mo f t h i st h e s i sw o r kw a st od e v e l o pn e w a l t e r n a t i v em e t h o d sf o rr a p i d ，s e n s i t i v e ，s l e c t i v e ，a n ds i m p l ed e t e c t i o no f f l - l a c t a ma n t i b i o t i c s t h em a i nc o n t e n t si n c l u d e ： i i i 1 ar e v i e wo nd e t e c t i o nt e c h n o l o g i e sf o ra n t i b i o t i cr e s i d u e s 2 t h ed e v e l o p m e n to fa na m p e r o m e t r i cp e n i c i l l i nb i o s e n s o rb a s e do n c o - i m m o b i l i z a t i o no fm u l t i w a l l e dc a r b o n n a n o t u b e s ( m w c n t s ) ， h e m a t e i n ，a n df l - l a c t a m a s eo ng l a s s yc a r b o ne l e c t r o d eu s i n ga l a y e r - b y l a y e ra s s e m b l y ( l b l ) t e c h n i q u e u n d e rc a t a l y s i s o ft h e i m m o b i l i z e de n z y m e ，p e n i c i l l i nw a sh y d r o l y z e d ，d e c r e a s i n gt h el o c a lp h t h ep hc h a n g ew a sm o n i t o r e da m p e r o m e t r i c a l l yw i t hh e m a t e i na sa p h s e n s i t i v er e d o xp r o b e m w c n t sw e r eu s e da sa ne l e c t r o nt r a n s f e r e n h a n c e ra sw e l la sa ne f f i c i e n ti m m o b i l i z a t i o nm a t r i xf o rt h es e n s i t i v i t y e n h a n c e m e n t t h ee f f e c t so fi m m o b i l i z a t i o n p r o c e d u r e ，w o r k i n g p o t e n t i a l ，e n z y m eq u a n t i t y , b u f f e rc o n c e n t r a t i o n ，a n ds a m p l em a t r i xo n t h eb i o s e n s o rp e r f o r m a n c ew e r ei n v e s t i g a t e d t h eb i o s e n s o ro f f e r e da m i n i m u md e t e c t i o nl i m i to f5 0n m ( 1 9 鹏几) f o rp e n i c i l l i nv l o w e rt h a n t h o s eo ft h ec o n v e n t i o n a lp hc h a n g e b a s e db i o s e n s o r sb ym o r et h a nt w o o r d e r so fm a g n i t u d e t h ed e t e c t i o nr a n g ew a su pt o2 7m m t h e e l e c t r o d e t o e l e c t r o d ev a r i a t i o no ft h er e s p o n s es e n s i t i v i t yw a s7 o r s d ( r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ) 3 t h ed e v e l o p m e n to fa na m p e r o m e t r i cp e n i c i l l i nb i o s e n s o rb a s e do n c o - i m m o b i l i z a t i o no f p e n i c i l l i n a s ea n dm w c n t so ng o l de l e c t r o d ev i a p a r a - b e n z o q u i n o n ee l e c t r o r e d u c t i o n i n d u c e dd e p o s i t i o no f c h i t o s a n t h e e f f e c t so fd e p o s i t i o n t i m e ，a p p l i e dp o t e n t i a l ，e n z y m eq u a n t i t y , a n d c o n c e n t r a t i o no fb u f f e rs o l u t i o no nt h eb i o s e n s o rp e r f o r m a n c ew e r e i n v e s t i g a t e d t h ed e t e c t i o nr a n g ew a s9 8n m 一2 7m m f o rp e n c i l l i nv 4 t h ed e v e l o p m e n to fa na m p e r o m e t r i cp e n i c i l l i nb i o s e n s o rb a s e do n c o i m m o b i l i z a t i o no fm w c n t s ，h e m a t e i n ，a n d1 3 - 1 a c t a m a s eo n s c r e e n s p r i n t e de l e c t r o d e t h es t e p w i s ea s s e m b l yo ft h eb i o s e n s o rw a s i v c h a r a c t e r i z e db ye l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p ya n dc y c l i c v o l t a m m e t r y u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h ed e t e c t i o nr a n g ew a s57 n m 一4 8 “mf o ra m p i c i l l i ns o d i u m 5 t h ed e v e l o p m e n to faf l o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) m e t h o d f o rd e t e c t i o no fa m p i c i l l i ns o d i u mb a s e do nt h ef i n d i n gt h a tt h ec l a r i s i n gf r o mo x i d a t i o no fl u m i n a lw i t hp o t a s s i u mp e r i o d a t ei ns t r o n g a n k a l i n es o l u t i o nw a sg r e a t l ye n h a n c e db yt h ec o m b i n e de f f e c t so fn ， n - d i m e t h y lf o r m a m i d e ( d m f ) a n da c e t o n i t r i l e t h e l i n e a rd e t e c t i o n r a n g ew a so 1 4 0p g l w i t had e t e c t i o nl i m i to f1n g l t h er e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) w a s2 3 a t1 0 嵋l k e y w o r d s ：a m p e r o m e t r i cb i o s e n s o r ；f l o wi n je c t i o n c h e m i l u m i n e s c e n c e a n a l y s i s ；p e n i c i l l i n ；f l - l a c t a ma n t i b i o t i c s ；a n t i b i o t i cr e s i d u e s ；f l - l a c t a m a s e ； c a r b o nn a n o t u b e s v 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识 到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：锹 山解以月 日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，研 究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 i 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：勺骘碧日期：船6 否月砂日 导师签名：、萝勺反， 日期：矽，。年多月1 日 青霉素类抗生素快速检测方法的研究 1 1 课题背景 第一章绪论 i i 1 青霉素临床应用、药物动力学 伊内酰胺类抗生素是一类最广泛使用的抗菌药物，其中青霉素【l 】 是此类抗生素药物的代表品种。所有的青霉素都拥有伊内酰胺环的基 本结构，它是内酰胺类抗生素的活性基团。不同的伊内酰胺类抗生素 因所含侧链基团不同，从而决定其化学和药理特性上的差异。 青霉素具有很好的杀菌作用，它的作用机制是抑止细胞壁上构建 肽聚糖所必需的细菌转肽酶，进而干扰细菌细胞壁的合成，主要用于 革兰氏阳性细菌。由于青霉素在胃酸作用下极易分解，所以一般不用 作口服给药，而是用于静脉注射、肌内注射、乳房内注射和皮下注射。 当生物体给药之后，青霉素一般分布于细胞外液，但发生炎症时，它 却很容易进入炎症组织内部。青霉素还易透入到脑、肾脏和肝脏内， 大部分通过肾脏排泄，在肝脏内代谢的只有少部分，这就导致其在尿 液中的浓度很高。它在体内的吸收、消除速度主要受给药途径的影响。 i 1 2 抗生素残留的来源、危害 抗生素残留的来源主要有以下几种途径2 石】：不正确使用动物药 品、使用违禁动物药品、兽药产品质量差、检测标准不健全、食品质 硕十学侮论文 量的监管力度不够、防疫体系的不完善和违反休药期规定。 抗生素残留危害主要表现在以下几点【4 7 】： 毒性作用：若一次摄入残留物的量过大，则会出现急性中毒反应、 过敏反应和变态反应。比如，饮用含有抗生素残留的牛奶，这些抗生 素对有过敏体质的人会产生过敏反应，轻者皮肤瘙痒和荨麻疹，重者 引起急性血管性水肿或休克，甚至出现死亡； 破坏胃肠道微生态平衡：正常机体肠胃内寄生的大量菌群，如果 人和动物长期与动物源性食品中的低剂量的抗菌药物残留接触，就会 抑制或杀死敏感菌、耐药菌以及条件性致病菌，从而破坏了胃肠道微 生态平衡； 细菌耐药性增强，以致抗菌药物失效； 对生态产生影响，间接破坏了生态平衡：对土壤生物、水生生物 和昆虫产生影响，间接破坏了生态平衡。首先在环境中进行转归( 进 入环境的兽药残留，在对环境产生多方面的影响的同时，也受环境中 光、热、湿度和其他因素的作用，本身产生转化和转移或在动物、植 物中富集、) ，然后在动、植物体内富集，最后进入食物链，间接污染了 生态环境。 抗生素残留给人类、环境产生的诸多危害，引起了国际许多国家 和相关组织的关注。例如，欧洲联盟规定8 。1 1 1 了8 - 内酰胺类抗生素在牛 奶中的最高残留限量( m r l ，m a x i m u mr e s i d u el i m i t ) 标准( 表1 1 ) ， 其中青霉素g 在牛奶中的最高残留限量为4g g k g 1 或1 2 x 1 0 m 。 自上世纪9 0 年代以来，我国的畜产品开始进入国际市场，但出口 2 青霉素类抗生素快速检测方法的研究 的畜产品曾经被许多国家和地区退货甚至销毁，其主要原因之一是产 品中兽药残留超标。国家有关部门非常重视兽药残留，制定了各种监 控兽药的法规，于2 0 0 2 年12 月2 4 日发布了2 3 5 号文件动物或产品 中兽药最高残余限量的标准，该公告中针对动物食品中青霉素等伊 内酰胺类抗生素的最高残留限量作了一系列规定1 2 1 ( 表1 2 ) 。 t a b l e1 - 1t h em a x i m u mr e s i d u el i m i t s ( g k g 。1 ) o f f l - l a c t a ma n t i b i o t i c ss e tb ye u r o p e a n u n i o n t a b l e1 - 2t h em a x i m u mr e s i d u el i m i t s ( g k g 。1 ) o f f l o l a c t a ma n t i b i o t i ci nc h i n a 硕十学位论文 1 2f 1 内酰胺类药物残留的检测方法 1 2 1 微生物抑制检测法( m i c r o b i a li n h i b i t o r s ) 检测原理：根据抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用来 定性或定量样品中的抗生素残留。如国家标准g b t 4 7 8 9 2 7 2 0 0 3 t t c 法( r p 2 ，3 ，5 氯化三苯四氮唑法) 1 1 3 ；欧洲国家常采用的a o a c 纸片 法【1 4 1 ；管碟法。a o a c 纸片法是用嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢纸片来检测。 与a o a c 纸片法相比，国标t t c 法的检出限远高于欧盟食品法典规定 的m r l 标准，这样就使得经国标法检测合格的奶样，欧盟的检测结果 可能为抗生素含量超标，对食品加工及消费者都存在很大的潜在危害 【1 5 】。管碟法是由f o s t e r 和w o o dr u f f 两人于1 9 4 4 年创建的，是用含有敏 感菌( 枯草杆菌) 的琼脂做成平皿，上面放装了已知抗生素标准液和 未知试样液的小管各一支，经培养后抗生素标准液的周围不生长细菌， 即为抑菌圈，如试样周围也出现抑菌圈表示含有抗生素。 微生物法因费用较低，所以在基层单位使用较广泛。但是，由于 该方法是靠观察微生物的生长情况来检测的，因此检测时间较长。而 且特异性不够，只能测出抗生素是否存在，不能定性、定量分析抗生 素的种类和含量。此外，微生物法的精密度、准确度不高，并易受其 它抗菌药物的干扰。 4 青霉素类抗生素快速检测方法的研究 1 2 2 免疫法( i m m u n o a s s a y ) 免疫法检测原理是利用抗原与抗体的特异性结合反应。免疫分析 方法1 6 1 7 1 主要有放射免疫分析法( 刚a ) 、酶联免疫吸附法( e l i s a ) 和免 疫亲合色谱( i a c ) 。此检测方法检测时间较长，样品前处理较复杂，同 时也很难进行现场检测。 1 2 3 快速检测试剂盒 根据微生物检测原理研发的试剂盒0 s - 2 1 】，也是抗生素检测的常用 方法，如荷兰g i s t b r o c a d e sb v 公司开发了d e l v o t e s tp d e l v o t e s ts p , d e l v o t e s tc o w t e s t ，d e l v o t e s tm c s 检测系列。美国i d e x xl a b o r a t o r i e s 公司根据酶联免疫吸附( e l i s a ) 原理研发了s n a p 法和c h a r mm r l 法。 在英国应用最广泛的免疫试剂盒就是由美国i d e x xl a b o r a t o r i e s 公司 研发的l a c t e k 法。 1 2 4 理化检验法 抗生素残留的各种理化检测方法中，高效液相色谱法( h p l c ) 及其 联用技术 i i , 2 2 - 3 1 】，如h p l c m s ，最为常用。化学发光法 3 2 , 3 3 、荧光分 光光度法 3 4 ，3 5 1 等也能用于抗生素残留的测定。h p l c 具有较高的准确性。 和灵敏度，但因其样品预处理复杂，流程繁琐，设备昂贵，需要专业 技术人员等，很难实现现场检测和普及推广，不能满足社会对检测快 5 硕十学位论文 速、及时的要求。 总之，抗生素残留分析是对复杂混合物中微量或痕量组分的分析， 既需要精细的微量操作手段，又需要高灵敏的痕量检测技术。现行方 法难度大、仪器化程度和分析成本高。随着广大消费者对无抗生素残 留需求越来越高，因此研制准确、快速、低廉，适合我国国情的抗生 素残留检测方法已成为十分迫切的课题。近年来，科学界涌现出了许 多新的技术平台来克服现有检测方法的不足，生物传感技术就是其中 之一。 1 2 5 生物传感器检测法 1 2 5 1 抗生素残留生物传感器的研究及进展 微生物抑制检测法、免疫法、快速检测试剂盒、理化检验法这四 种检测方法虽然对抗生素的残留检测和监控行之有效，但这些方法都 存在一定的缺陷。比如，微生物抑制法比较耗时，而理化检测方法虽 然灵敏度较高，但样品前处理繁琐，检测程序较复杂，费用较高且对 操作人员的要求比较高。目前，正在发展的生物传感器检测方法，有 望克服以上缺点。它具有选择性高、灵敏度高、分析速度快、操作简 单、成本低廉且易于实现在线或活体检测的潜在优点。 随着生物技术的日益发展，相关研究人员已经研制出一系列具有 实用价值的生物传感器。这些生物传感器在医药分析、环境监测、生 化分析等方面得到了广泛的应用，可以对糖类、有机酸、氨基酸、蛋 6 青霉素类抗生素快速检测方法的研究 白质、抗原、抗体、d n a 、激素、微生物、抗生素残留、杀虫剂残留 等进行有效的检测和监测3 6 - 4 2 】。 抗生素生物传感器也取得了一定的发展，近年来有关抗生素生物 传感器的报导也非常之多。对于抗生素生物传感器，主要有以下几种： 微生物传感器 4 3 - 4 5 】、免疫生物传感器 7 , 4 6 - 4 9 和 酶生物传感器 5 0 - 6 9 】。其中， p 内酰胺酶传感器在青霉素的残留检测中占一定比重。从青霉素生物 传感器的信号转换器的不一样，又可以分为表面等离子体共振传感器 【7 0 ，7 1 1 、热生物传感器【5 3 ，6 4 , 7 2 1 、光生物传感器【6 】、电导阻抗生物传感器 【4 3 ，4 6 1 、半导体生物传感器和电化学生物传感器【3 6 铘，4 1 - 4 8 , 5 4 ，5 6 1 。其中， 电化学生物传感器具有操作简单、响应时间短等优点。 伊内酰胺酶电化学生物传感器的检测原理是基于, a - 内酰胺酶催化 青霉素水解引起溶液中p h 的改变。溶液中p h 的改变最常使用离子选 择性电极电位法【5 1 ，5 3 , 5 4 , 5 7 , 5 9 , 6 0 , 叫来进行定量测定，虽然电位检测法广 泛应用到抗生素残留检测，但是也具有一定的局限性，比如：当样品 中分析物的浓度较低时响应信号比较迟缓、易被干扰。 电流型酶电极分析法【6 3 ，7 3 。8 1 具有灵敏度高、响应快、稳定性好等 特点。有些化合物在氢离子的催化作用下容易发生氧化还原反应，如 对苯二酚、对苯醌、多酚物质：酸碱指示剂、邻苯二胺、没食子酸月 桂酯等。在一些文献【6 3 ，7 3 ，7 7 抛1 中，这些p h 敏感氧化还原探针被用来开 发p h 敏感型电流生物传感器。此类生物传感器具有选择性好、灵敏度 高、分析速度快、成本低并能在复杂体系中进行连续测定的潜在优点。 7 硕十学位论文 1 2 5 2 酶在电极上的固定方法 酶的固定是制备性能优良电化学酶传感器的关键一步。目前，酶 的固定方法可以分为：吸附法、包埋法、共价键合法、电化学聚合法、 交联法、层层组装法等等。 ( 1 ) 吸附法 根据吸附剂的不同吸附法可分为：物理吸附和离子交换吸附。物 理吸附是通过氢键、疏水键和7 【电子亲和力等物理作用将酶修饰于不 溶性载体上的方法。常用的载体有多孔玻璃、纤维素、醋酸纤维素、 硅藻土、水凝胶等有机吸附剂。 离子交换吸附法是指在最适离子强度和p h 条件下，利用酶的侧 链解离基团和离子交换基团间的相互作用而达到酶的固定化的方法。 常用的交换剂有二乙胺基乙基纤维素隅3 1 和二乙胺基乙基琼脂糖【8 4 i 笙 1 r0 ( 2 ) 包埋法 包埋法是将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂( 包 括交联剂) 的作用进行聚合，将生物分子酶包埋于聚合物中以达到固 定化的目的。常用的酶包埋载体有：凝胶1 6 4 , 8 5 1 、海藻酸盐1 6 6 、可控孔 径玻璃( c p gc o n t r o l l e d p o r eg l a s s ) i 7 2 , 8 6 、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯等。 包埋法由于一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，几乎不 改变酶的高级结构，所以酶活性回收率较高。但当在包埋时，如果发 生化学聚合反应，则生物酶容易失活，因此必须巧妙地设计反应条件。 青霉素类抗生素快速检测方法的研究 由于只有小分子可以通过高分子凝胶的网格进行扩散，并且这种扩散 阻力还会导致固定化酶动力学行为改变，降低酶活力，因此，此方法 有一定的局限性。 ( 3 ) 共价键合法 共价键合法是将电极表面进行化学处理和修饰，然后将生物分子 识别物质以共价的方式结合固定于电极表面。共价键合法的方法主要 有两种：一种是在载体上接上一个偶联试剂，然后将生物酶偶联上去； 另一种将载体有关基团活化，再与酶的相关基团发生偶联反应。如李 源勋8 7 1 等，以反应性单体丙烯酸和交联剂二乙烯基苯，以石油醚为致 孔剂，通过悬浮聚合制备了固定化酶的载体，并用于青霉素酰化酶的 固定。他们研究了丙烯酸与二乙烯基苯在不同摩尔比时对青霉素酰化 酶固定活性的影响，以及悬浮聚合时水相和油相比例的不同所合成的 载体对固定化酶性能的影响。 共价键合法的优点是酶与载体结合牢固，但是该方法操作复杂， 反应条件苛刻，会引起酶蛋白高级结构变化从而破坏酶的部分活性中 心，因此往往不能得到比活力高的固定化酶，酶活度的回收率一般为 3 0 左右，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。 ( 4 ) 电化学聚合法 将聚合体与生物酶和相关物质( 辅酶、介体等) 同时混合于电解 液中，通过电位循环或恒电位扫描法使单体在电氧化或电还原的作用 下聚合在基础电极表面，同时由于吸附或静电吸附作用可以将生物酶 和相关物质包埋于高分子膜内，直接固定于电极表面。如朱亚琦1 7 明等， 9 硕十学位论文 将青霉素酶和亚甲基蓝通过循环伏安法共聚合在玻碳电极上，制成青 霉素酶电极，并通过交流阻抗对酶电极进行了表征。在一定电位范围 内，青霉素微小浓度变化与亚甲基蓝还原峰电流成正比，据此可间接 测定牛奶中残留青霉素的含量。 ( 5 ) 交联法 交联法是利用双功能试剂或多功能试剂，在酶分子之间、分子与 凝胶或聚合物之间交联形成网状结构而使酶固定化的方法。常用的双 功能试剂和多功能试剂主要有苯基二乙硫氰、环氧氯丙烷、戊二醛等， 其中最常用的交联剂为戊二醛【5 7 ，6 0 ，6 2 1 。 交联反应可能发生在酶分子间，也可能发生在酶分子内部。分子 间交联和分子内交联的比例在一定程度上与酶和交联剂的浓度有关， 也与p h 值和离子强度有关。一般地说，在低的酶浓度下，主要形成 分子内交联，交联后的生物酶通常保持溶解状态，当生物酶的浓度升 高时，分子间的交联比例上升，形成的固定化酶往往变为不溶态。 上述各种固定化酶的方法都有各自的不足之处。如吸附法中无机 吸附剂在固定化之后，常引起吸附变性，酶的活度回收率低；包埋法 中对高分子凝胶或半透膜的分子尺寸的选择不利于大分子底物与产物 的扩散；以及交联法与共价结合法会使酶活力损失较大等。 ( 6 ) 分子层层组装法 分子自组装是利用分子之间自发的相互识别，通过非共价键相互 作用力( 如氢键、范德华力、静电力、疏水作用力、堆积作用、兀- 兀、 阳离子7 c 吸附作用) 形成具有特定排列顺序的分子聚合体。这种人工 1 0 青霉素类抗生素快速检测方法的研究 自装体系在分子尺寸、组织模型和膜自然形成三个方面类似于天然的 生物双层膜。基于静电作用的分子自组装可以形成超分子多层膜结构， 实现蛋白质和酶的直接电化学。分子自组装法有以下优点1 8 8 - 9 3 】：能够 使组装的生物传感器上固定的物质均匀的分布，为生物分子提供了良 好的微环境，组装的生物传感器具有较好的稳定性且具有很好的电化 学行为。 近几年来酶在碳纳米管上的固定用的最多的是采用静电吸附，比 如葡萄糖酶通过静电吸附在碳纳米管上【8 8 ，8 9 , 9 1 1 ，同时由于大多数聚合 膜对酶的活性有降低作用，加上生物材料特有的生物结构为生物酶分 子提供良好的微生物环境，使酶活力保持率高、寿命长，如壳聚糖、 丝素蛋白、甲壳素等。壳聚糖是一种自然存在的纤维状聚合物，是应 用较为广泛的固定化酶的载体材料，比如x i n h u a n gk a n g t 9 2 1 等，将葡萄 糖酶固定在用铂金纳米( a u p t n p s ) 修饰的玻碳电极上，组装铂 金纳米( a u p t n p s ) 碳纳米管( c n r s ) 壳聚糖( c s ) 玻碳电 极( g c e ) 生物传感器。壳聚糖中含有氨基，当溶液中的p h 小于 壳聚糖的水解常数时，壳聚糖所带的静电荷为正，因此有利于酸化处 理后的碳纳米管均匀地固定在玻碳电极上，此生物传感器响应时间低 于5s ，有较好的选择性、稳定性和重现性。 1 3 本文构思 青霉素等伊内酰胺类抗生素一直广泛应用于人类、畜禽业及水产 养殖中各种细菌感染的防治。随着其产量与用量的不断增加，抗生素 硕十学何论文 残留对食物、水体和土壤的污染问题日益突出。抗生素残留可增强细 菌耐药性，破坏人体和动物胃肠道以及环境微生态平衡，因此，食物 和环境中抗生素残留的监测和控制十分重要。现有的抗生素残留测定 方法主要包括传统的微生物抑制法，h p l c 法和一些商品化快速检测 试剂盒、测试条等，这些方法均存在一定的局限性，如费时，操作繁 琐，需要昂贵的仪器，灵敏度较低等。本研究旨在开发灵敏、简便的 青霉素类抗生素快速检测方法，以克服以上局限性。 基于上述情况，本文拟开展的研究工作如下： ( 1 ) 采用预吸附氧化苏木精的多层碳纳米管( m w c n t s ) 、壳聚 糖和青霉素酶层层组装到玻碳电极表面，获得一种高灵敏的电流型青 霉素生物传感器，通过电化学循环伏安法和计时电流等分析技术对修 饰电极进行表征，再结合酶修饰电极的生物电化学特性以及酶电极对 青霉素安培响应的各种影响因素，研究开发层层组装p h 电流型青霉素 高敏酶传感器。 ( 2 ) 基于1 ，4 苯醌电化学还原诱导沉积壳聚糖，采用电化学沉积 高分子聚合膜包埋生物分子的方法制备厚度可控的壳聚糖多层碳纳 米管复合膜修饰电极。利用多层碳纳米管良好的催化性能和导电性能 以及1 ，4 苯醌良好的氧化还原性质和在固定电位下其氧化还原电流随 着溶液中p h 的改变而改变的特性，加上壳聚糖特殊的理化性能和生物 性能，利用步电沉积法获得高灵敏度和厚度可控的p h 敏感电流型伊 内酰胺类抗生素传感器。 ( 3 ) 利用碳纳米管的多孔性和良好导电性，采用层层组装技术将 预吸附氧化苏木精的多层碳纳米管( m w c n t s ) 、壳聚糖和青霉素酶 1 2 青霉素类抗生素快速检测方法的研究 层层组装到印刷电极表面，并通过电化学循环伏安法和交流阻抗等分 析技术对修饰电极进行表征。探讨酶修饰电极的生物电化学特性、影 响酶电极对青霉素安培响应的各种因素以及对实际样品的测定。 ( 4 ) 利用非水性溶剂对化学发光强度的增强和蛋白质沉淀的特 性，在碱性鲁米诺化学发光体系中建立选择性好、灵敏度高的青霉素 类抗生素快速检测的流动注射化学发光分析方法。 硕十学何论文 第二章基于层层组装的电流型青霉素生物传感器 2 1 引言 抗生素被广泛用于人类、畜禽业及水产养殖中各种疾病的防治。 随着各类抗生素产量与用量的不断增加导致了大量的抗生素在生活环 境中的残留，从而造成了畜类食品、禽类食品、水产品、水体和土壤 的污染。因而，控制和检测抗生素残留是非常必要的。目前，抗生素 残留检测方法主要包括高效液相色谱法、色质联用测定法 2 7 , 2 8 , 9 4 - 9 6 、 微生物检测法【9 7 ，9 8 1 和免疫分析法【1 刀等。大多数的检测方法具有一定可 靠性和较好的灵敏度，但是这些方法也存在一定的局限性，如微生物 检测法费时和操作繁琐、色质联用测定法使用的仪器昂贵且样品前处 理比较复杂。因此，迫切需要研发操作简单、成本低和灵敏度高的检 测方法来检测抗生素残留。 青霉素属于伊内酰胺类抗生素，它是抗生素中使用量最大的一类。 青霉素类抗生素分子结构中含有伊内酰胺环，而内酰胺环在酸、碱 或青霉素酶的存在下具有高度的不稳定性，容易发生水解和分子重排 生成青霉噻唑酸，进而可电离产生矿。以青霉噻唑酸电离产生的氢离 子为检测的目标物，采用电位法1 6 0 、电导分析法1 5 5 1 、比色法【吲、荧光 法【6 】等可间接检测出抗生素的含量。电位法和电导法仪器较为简单， 但灵敏度较低和响应慢。光检测相对于电位法响应时间短但检测限高， 在应用中存在一定的局限性。近年来，基于场效应电容【1 0 0 1 或电荷转移 检测技术【1 0 1 1 研s utp h 值敏感生物传感器。 葡萄糖电流生物传感器由于灵敏度高、选择性好、响应时间短、 1 4 青霉素类抗生素快速检测方法的研究 操作简单和成本较低，而成为研究的热点。然而基于p h 改变组装的电 流型生物传感器的报道却很少，s t r e d a n s k y 等【6 3 】率先提出了一种以氧 化苏木精、没食子酸月桂酯和亚甲基蓝等为p h 敏感电化学探针的电流 型传感器用来分析青霉素和其它物质，利用氧化苏木精作为p h 敏感 电化学探针成功地分析了青霉素g 钠，其最低检测限为4 “m ，优于电 导法、光分析法，从而促进人们对这种生物传感器类型的进一步研究 7 7 - 7 9 。马洁等和朱亚琦等分别利用氧化苏木精和亚甲基蓝通过交 联法组装青霉素酶电流型生物传感器，并利用此类传感器检测了磷酸 缓冲溶液中的青霉素g 钠，获得了分别为2 8n m 和0 2 8 “m 的检测限。 另一方面，电化学生物传感器的灵敏度主要取决于生物分子与电 极之间电子的直接迁移速率，近年来许多研究是通过在电极表面引入 电子传递介质亚甲基蓝 7 3 1 、二茂铁衍生物 1 0 2 , 1 0 3 】、离子液体1 1 0 4 , 1 0 5 1 矛1 j 纳 米材料【1 0 6 。1 0 8 1 等来提高生物传感器的电子直接迁移速率。碳纳米管 1 0 6 - 1 0 8 具有良好的导电性、催化活性和较大的比表面积，能够改善生物 分子氧化还原可逆性、降低氧化还原反应的过电位、提高电子的迁移 率。碳纳米管分为多层碳纳米管和单层碳纳米管，由于多层碳纳米管 相对于单层碳纳米管具有较高的电子传输速率和较高的吸附容量0 9 ， 因此，多层碳纳米管更利于加强电化学生物传感器的灵敏度。 氧化苏木精的高敏p h 电化学特性、多层碳纳米管的独特的导电性 和壳聚糖生物特性，为构建高灵敏p h 电流型生物传感器提供了充分和 有利的条件。基于以上特点，本实验采用层层组装法将碳纳米管、壳 聚糖、氧化苏木精和青霉素酶固定到玻碳电极上，成功的研发了一种 硕十学位论文 层层组装电流型青霉素高敏酶传感器。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器与试剂 c h l 6 6 0 c 电化学工作站，玻碳电极作为工作电极( 直径3 0m m ) ， 铂电极为对电极，a g c i a g 电极为参比电极，h j 一2 磁力加热搅拌器( 江 苏金坛恒丰仪器厂) ，p h s j 4 a 酸度计( 上海雷磁) 。去离子水( m i l l i q 纯水系统b e d f o r dm au s a 制得) 。所有的试剂均为分析纯。 多层碳纳米管( 美国c h e a pt u b e si n c 外径2 0 3 0n l n ，长度 l o 3 0 m ，纯度 9 5 ) ，青霉素酶( e c3 5 2 6 ，