（有机化学专业论文）酪氨酸酶催化反应及其应用研究.pdf

中山大学博士学位论文 摘要 题目：酪氨酸酶催化反应及其应用研究 作者：徐迪 指导老师：古练权教授，马林教授 专业：有机化学 酶被广泛用于食品、纺织、制革、医药、日用化工和三废处理。酶的反应体 系也从水溶液转变到与水互溶有机溶剂、水一有机溶剂两相体系、低水有机溶剂、 反相胶束体系、超i 临界流体体系和无溶剂体系，其中无溶剂是刚兴起的新体系。 本论文对酶在有机溶剂体系进行催化反应的影响因素做了总结，并综述了无溶剂 体系酶催化反应的类型和方法。 酪氨酸酶广泛分布于自然界，生物功能足调控生物体内黑色素的生成。酪氨 酸酶催化两个不同反应：单酚选择性羟基化形成邻苯二酚，邻苯二酚进一步氧化 形成邻醌。生物体内黑色素生成机制主要是氧化一迈克尔加成反应，即单酚化合 物在酪氨酸酶催化下形成邻醌，邻醌和亲核试剂发生l ，4 一迈克尔加成，加成产 物进一步聚合形成生物大分子黑色素。 本论文基于酪氨酸酶催化单酚发生的氧化迈克尔加成反应机理，结合酪氨 酸酶在水溶液、水不互溶有机溶剂和无溶剂三个体系的催化反应，做了以下的研 究和应用： 1 研究了酪氨酸酶催化羟基吡啶类化合物的氧化反应及生物学意义。结果 表明，2 一羟基吡啶、4 羟基吡啶不能被酪氨酸酶氧化，也不是酪氨酸酶的抑制剂。 酪氨酸酶可以催化2 ，3 一二羟基吡啶的氧化，氧化过程表现出单酚化合物的延迟期 行为，说明羟基吡啶类化合物在反应条件下主要以酮式结构存在。2 ，3 - 二羟基吡 啶氧化产物可以抑制乳酸脱氢酶活力，机理足氧化一迈克尔加成。 2 在无溶剂体系中，酪氨酸酶可以快速催化对位取代苯酚和芳香胺的氧 化一迈克尔加成反应。载体含量、水含量、酶含量和反应时间对反应速度有影响， 其中水含量影响较大。对反应产物进行结构分析，4 苯氧基苯酚、4 苄基苯酚和4 摘要 苄氧基苯酚在酪氨酸酶和芳香胺作用下得到了相同的三取代胺的主产物3 - 1 ，4 - 苯 基苯酚得到了两个吩嗪环主产物3 - 4 和3 5 。 3 采用固定化酶在有机溶剂中催化了对位取代苯酚和芳香胺的反应，得到相 同类型的三个胺取代产物4 - 1 、4 - 2 、4 - 3 ，取代基从醌环上脱落。基于该反应机理， 设计了酪氨酸酶的三个前药模型化合物并进行了体外模型实验，即以酪氨酸酶的 底物苯酚和邻氨基苯酚作为药物布洛芬和5 一氟脲嘧啶的载体，经酪氨酸酶和亲核 试剂的作用，实现药物的释放。结果表明，前药模型化合物4 5 和4 - 8 可以释放药 物，化合物4 1 2 还在研究中。 4 对合成的化合物进行了乙酰胆碱酯酶的抑制活性测定，结果表明：3 - 4 ( i c 5 0 = 1 0 3 7t t m ) 和3 5 ( i c 5 0 = 2 0 6i a m ) 具有较好的抑制活性：根据化合物3 - 4 和 3 5 对乙酰胆碱酯酶的抑制动力学行为表明它们是竞争型抑制剂。 5 在无溶剂下，研究了一糜蛋白酶催化n 保护的氨基酸葡萄糖酯的合成， 结果表明，底物比、加酶量、加水量、p h 值和反应时间对反应有影响，其中加水 量影响较大，反应产物正在研究中。 本论文主要化合物附图如下 i i 。，7 丫丫o 。 x n n ，7 3 1 a r = o q ) c h 3 - c 0 1 4 驭：砹 3 - 5 a r = o - 0 c | 3 吨6 h 4 ：取0 仑j 一弼叫 4 2 ：a 卢。c l c 6 h 4 4 - 5 l 。a r = c h e m b 趣一毋。b p 螂 o 口卜n h c i净o u 、 4 - 1 2 双 驭 。 联| | | 中山大学博士学位论文徐迪0 1 9 1 0 1 0 2 4 a b s t r a c t t o p i c ：w y r o s i n a s ec a t a l y t i cr e a c t i o n sa n da p p l i c a t i o n s a u t h o r ：x ud i s u p e r v i s o r ：p r o f g ul i a n q u a n ，p r o f m a l i n m a j o r i n g ：o r g a n i cc h e m i s t r y t h em a r k e tf o r b i o l o g i c a lc a t a l y s i s i s c o n t i n u o u s l yg r o w i n g ，e s p e c i a l l y i nt h e p h a r n l a c e u t i c a l ，e n v i r o n m e n ta n d f o o di n d u s t r i e s b u tt h eu s eo fe n z y m e si n a q u e o u s r e a c t i o nm e d i al i m i t e dt h e i ra p p l i c a t i o n si nt h es c o p eo fi n d u s t r i a l t h es n c c e s so fs u c h a p p l i c a t i o nh a sl e dt oi n t e r e s ti nn e w m e d i as u c ha so r g a n i cs o l v e n t ，s u p e r c r i t i c a lf l u i d s ， r e v e r s em i c e l l ea n ds o l v e n t f r e e i nt h i sa r t i c l e ，s o m er e c e n td e v e l o p m e n t si ne n z y m a t i c c a t a l y s i si nn o n - a q u e o u sm e d i aw i l lb er e v i e w e da n de n z y m a t i cs o l v e n t - f r e es y n t h e s i s w i l la l s ob ed e s c r i b e d ， i ti sw e l lk n o w nt h a tt y r o s i n a s ei st h ek e ye n z y m eo fm e l a n i nb i o s y n t h e s i s ，w h i c h c a t a l y z e st w od i s t i n c t r e a c t i o n s i n v o l v i n g m o l e c u l a ro x y g e n ：t h e h y d r o x y l a t i o no f m o n o p h e n o l s t o o d i p h e n o l s a n dt h eo x i d a t i o no fb o t ht o o q u i n o n e s w h i c h a r e e l e c t r o p h i l i ca n dk n o w nw i t hu n d e r g o i n gav a r i e t yo fn o n c n z y m a t i cr e a c t i o n ss u c ha s o x i d a t i o n m i c h a e ia d d i t i o nr e a c t i o nw i t ha m i n oo rt h i o lg r o u p s ， i nt h i sa r t i c l e ，o i lt h eb a s i so fo x i d a t i o n m i c h a e la d d i t i o nr e a c t i o nc a t a l y z e db y t y r o s i n a s e ，t h eo x i d a t i o n r e a c t i o n so fh y d r o x y p y r i d i n e s ，t h r e ep r o d r u gm o d e l so f t y r o s i n a s ea n d t h er e a c t i o n si ns o l v e n t f l e es y s t e mw e r es t u d i e d t h er e s u l ts h o w ： 1 t h eo x i d a t i o nr e a c t i o n so f 2 - h y d r o x y p y r i d i n e ，4 - h y d r o x y p y r i d i n e a n d 2 , 3 一d i h y d r o x y p y r i d i n ec a t a l y z e db yt y r o s i n a e w e r es t u d i e d t h er e s u l ts h o wt h a t t y r o s i n a s ec a n tc a t a l y z et h eo x i d a t i o no f2 - h y d r o x y p y “d i n ea n d4 - h y d r o x y p y r i n e ，b u t c a no x i d i z e d2 , 3 - d i h y d r o x y p y r i d i n e i nt h i sr e a c t i o nal a gp e r i o dw a sd i s c o v e r e dw h i c h m a yb e r e s u l t e df r o mi s o m e r i s mo fe n o a n dk e t o n e t h eo x i d a t i o n p r o d u c t o f 2 , 3 一d i h y d r o x y p y r i d i n ec a ni n h i b i tl a c t a t ed e h y d r o g e n a s ea c t i v i t y , a n dt h em e c h a n i s m o f i n h i b i t i o ni sm i c h a e la d d i t i o no f o x i d a t i o np r o d u c to f 2 ，3 一d i h y d r o x y p y r i d i n ew i t ha m i n o o rt h i o ig r o u p so fl a c t a t ed e b y d r o g e n a s e 2 t h er e a c t i o no f4 - s u b s t l t u d e d p h e n o l s( 4 - h y d r o x y d i p h e n y l m e t h a n e ， 4 - p h e n o x y o n e n o ，4 - b e n z y l o x y p h e n o l ，4 - p h e n y l p h e n o i ) w i t h 2 - m e t h o x y a n i l i n e i i a b s t r a c t c a t a l y z e db yt y r o s i n a s ei ns o l v e n t f r e es y s t e mw a si n t e n s i v e l ys t u d i e d t h ee f f e c t so f w a t e rc o n t e n t ，r e a c t i o nt i m e ，a m o u n to fe n z y m ea n da m o u n to fd i a t o m i t e w e r e i n v e s t i g a t e d t h e s a m em a i n p r o d u c t s 3 1 w e r eo b t a i n e di nt h er e a c t i o n so f 4 - h y d r o x y d i p h e n y l m e t h a n e ，4 - p h e n o x y o n e n o l ，4 - b e n z y l o x y p h e n 0 1 t w o d i f f e r e n t p r o d u c t s 3 - 4a n d3 - 5w e r eo b t a i n e di nt h er e a c t i o no f 4 - p h e n y l p h e n o l w i t h 2 - m e t h o x y a n i l i n e 3 4 - s u b s t i t u t e d 一1 ，2 - b e n z o q u i n o n e sw e r eo b t a i n e dt h r o u g hm o n o p h e n o l i z a t i o n c a t a l y z e db yt h ei m m o b i l i z e dt y r o s i n a s e ，t h e nt h e yw e r er e a c t e dw i t ha r y la m i n e s t op r o d u c em i c h a e la d d i t i o np r o d u c t s i nt h e s er e a c t i o n st h ea l k y la n da l k y l o x y g r o u p si n t h e4 - p o s i t i o n sa r ed i s p l a c e db yt h ea r y l a m i n o g r o u p s i n c et h ee n z y m e t y r o s i n a s e e x i t si nm e l a n o m ac e l l sa n di ti s u n i q u e l ya s s o c i a t e dw i t hm e l a n o c y t e s ， w h i c hs u g g e s t e dah i 曲l yf o c u s e dd r u gd e l i v e r ys y s t e m i ti s e x p e c t e dt h a tt h ed r u g a t t a c h e dt ot y r o s i n a s es u b s t r a t e s ( p h e n o la n d o a m i n o p h e n 0 1 ) w o u l d b el i b e r a t e da tt h e t u l l l o u rs i t e a sar e s u l t ，t h r e ep r o d r u g s ( 4 4 ，4 - 8 ，4 1 2 ) o ft y r o s i n a ew e r es y n t h e s i z e d ， a n da f t e rd e a l tw i t ht y r o s i n a s ea n d a n i m e ，t w o ( 4 - 1 ，4 2 ) o f t h e ml i b e r a t e dd r u g s 4 s o m ec o m p o u n d s ( s y n t h e s i z e d lw e r eu s e dt oe x a m i n et h e i ra n t i c h o l i n e s t e r a s e a c t i v i t y t h ec o m p o u n d s3 - 4 ( i c s 0 2 1 0 3 7 t i m ) ，3 - 5 ( i c 5 0 = 2 0 6 删) w e r ef o u n dt oh a v e g o o d c h o l i n e s t e r a s ei n h i b i t o r ya c t i v i t y 5 s y n t h e s i s o fs u g a ra m i n oa c i de s t e r c a t a l y z e db yo - - c h y m o t r y p s i ni n s o l v e n t f r e ew a ss t u d i e d t h ee f f e c t so fw a t e r c o n t e n t ，r e a c t i o nt i m e ，a m o u n to f e n z y m e ， p h v a l u ea n ds u b s t r a t et a d i ow e r e i n v e s t i g a t e d k e y w o r d ：t y r o s i n a s e ，s o l v e n t f l e e ，h y d r o x y p y r i d i n e ，4 - h y d r o x y d i p h e n y i m e t h a n e + 4 - p h e n o x y o n e n o l ，4 - b e n z y l o x y p h e n o i ，4 - p h e n y l p h e n o l ，a c e t y l c h o l i n e s t r a s e ，p r o d r u g 中山大学博士学位论文 徐迪0 1 9 1 0 1 0 2 4 1 1 引言 第1 章非水介质酶催化反应及其应用研究 近十几年来，随着生物技术的发展，酶催化技术已广泛地应用于有机合成研 究，如不对称合成、光学活性化合物及天然产物的合成等，在医药、食品、轻工 业、纺织业中也得到广泛的应用。据不完全统计，在国际上，酶催化技术的应用 所产生的工业产值己近1 0 0 0 亿美元，而具有应用价值的新酶不断被发现。全世界 工业用酶的价值已经从1 9 9 5 年的l o 亿美元发展到2 0 0 0 年的1 5 亿美元。生物催 化剂在有机合成的应用已经成为一种主要的化学合成方法。大量的酶和酶催化反 应相继被报道，生物催化数据库( b i o c a t a l y s i sd a t a b a s e ) 收录8 0 0 0 篇论文和专利， 介绍了1 8 5 0 0 种酶、微生物和抗体酶催化的生物催化反应，其中有许多反应已经 在合成工业中得到应用。从本质上讲，酶催化反应是一个有利于环境保护的绿色 化学过程。生物合成和生物转化方法不但经济效益明显，而且对环境及社会发展 都有重要的战略意义【1 2 】。 酶在有机合成中的应用有以下优点： 1 酶是一种高效催化剂，能加速化学反应的速度，最高可达非酶催化反应速 度的1 0 ”倍；酶催化反应可在温和条件下进行，反应p h 为5 8 ( 一般在7 左右) ； 反应温度在2 0 - - 4 0 。c ( 一般在3 0 。0 左右) 。这样的反应条件将会减少产物的分解、 异构、消旋和重排反应，而这些正是传统化学催化反应所难于避免的。 2 酶催化反应具有高度的区域选择性、立体异构选择性和对映体选择性，可 以避免敏感官能团发生变化，可得到光学活性物质，还可完成一些用传统的化学 反应很难完成的化学反应。 3 不同酶催化反应的条件往往是相同或相似的，因此，一些连续反应可采用 多酶复合体系，使这些生物催化反应能在同一个反应器中进行，以简化操作步骤， 尤其是可以省去一些不稳定中间体的分离纯化过程。同时应用连续的酶反应体系， 可以使反应过程中某些化学平衡上不利的反应向产物生成的方向进行。 4 酶对底物( 反应物) 表现出专一性，但大多数酶并非是绝对专一性，它们 第1 章非水介质酶催化反应及其应用研究 能接受人工合成的非天然化合物作为反应底物，因此酶又表现出一定的底物适应 性。虽然酶在生物体内主要是催化水溶液中的化学反应，但近二十年研究表明酶 也可以在体外非水介质中催化许多不同化学反应 3 1 4 。 生物体内发生的化学反应绝大多数是酶催化的，酶几乎能催化各种类型的化 学反应，例如，酯、酰胺、内酯、内酰胺、醚、酸酐、环氧化物及腈等化合物的 水解和合成；烷烃、芳烃、醇、醛、酮、硫醚和亚砜等化合物的氧化与还原；水、 胺及氰化氢等化合物的加成与消除；以及卤化与脱卤反应、烷基化与去烷基化、 异构化、偶联、醛醇缩合、m i c h a e l 加成、o 一迁移重排反应( c l a i s e n - 重排反应) 等反应。但也有一些化学反应是酶不能催化的，例如，d i e l s a l d e r 反应和c o p e 一 重排【1 5 一1 6 】。 表1 - 1 有机合成中常用的酶类和反应类型 酶催化反应类型 酯酶脂肪酶酯的水解和合成 酰胺酶( 蛋白酶、酰化酶)酰胺的水解和合成 脱氢酶醛酮的氧化还原 氧化酶( 单加氧酶、双加氧化反应 氧酶)氧化、过氧化和卤化反应 过氧化物酶磷酸化反应( 需a t p ) 激酶缩醛反应( c - c 键反应) 醛缩酶、转酮糖酶糖苷键的水解和形成 糖苷酶、糖基转移酶磷酸酯的形成 磷酸化酶硫酸酯的形成 转磺酸基酶氨基酸合成 转氨酶异构化、加成、消除和取代反 异构酶、裂解酶、水合酶应 其它水解酶( 环氧化物酶)水解反应 酶作为生物催化剂也有其固有的缺点： 1 虽然酶催化反应的条件温和，但是酶反应参数必须精确控制。一般酶催化 中山大学博士学位论文 徐迪0 1 9 1 0 1 0 2 4 反应都有其最适条件，如温度p h 值、离子强度等。这些参数的变化范围较小，一 旦变化幅度超过。b ；f l q 的允许值，将会引起酶的活性丧失。 2 酶一般在水溶液中表现出最高催化活性，而人工合成的有机化合物往往在 水溶液中的溶解度较差，因此必须将酶催化的反应从水溶液体系转移到非水有机 溶剂中进行。在非水介质中酶的活性比在水溶液中低，一般会减低一个数量级水 平。 3 许多酶催化反应容易被底物或产物抑制，在底物或产物浓度较高时，会引 起酶活性丧失。底物抑制可以通过连续滴加法控制低水平的底物浓度，而产物抑 制则比较难以解决。 4 酶对生物大分子也可能会引起过敏反应。 1 2 非水介质中酶催化反应 由于蛋白酶在生理过程中都是处于水环境中，水在酶的生物催化过程中具有 重要作用而有机溶剂则易引起蛋白质变性使酶失活，因此，以往几乎所有的 酶催化反应研究都是在水溶液中进行的。然而，由于许多有机化合物如脂肪、脂 肪酸、芳香化合物和甾族化合物等，在水中的溶解度较低，而较易溶丁_ 有机溶剂 中，因此限制了酶在有机合成中的应用和发展。直到8 0 年代中期 1 7 1 8 1 ，k l i b a n o v 等发现了酶能在接近无水的有机溶剂中起催化作用，从而打破了人们传统观念的 认识，极大地拓展了酶作为催化剂的应用范围。大量研究结果表明，非水介质中 的酶催化反应具有以下优点： ( 1 ) 提高有机底物的溶解度： ( 2 ) 酶的热稳定性显著提高： ( 3 ) 使某些反应的热力学平衡向合成方向移动( 如酯键与肽键的形成等) ； ( 4 ) 抑制了水参与的副反应( 如肽水解等) ； ( 5 ) 产物易于分离纯化： ( 6 ) 酶不溶于有机溶剂，易于回收再利用： ( 7 ) 防止微生物的污染： ( 8 ) 在合成一些具有生物活性的肽键时，氨基酸侧链一般不需保护。 第l 章非水介质酶催化反应及其应用研究 目前非水相中的酶催化技术已衍生出以下几类体系：1 水与有机溶剂的互溶均 相体系：2 水与有机溶剂形成的两相或多相体系：3 单相有机溶剂体系；4 反胶柬 体系：5 超临界液体；6 f 氐温体系。不同的介质体系都有各自的适用范围，研究在 不同介质中的酶催化反应动力学及热力学平衡以及酶催化机制将对某一特定催化 反应所需介质的筛选和使用起到十分重要的指导意义。 1 2 1 水一有机溶剂两相体系 水一有机溶剂两相体系( b i p h a s i ca q u e o u s o r g a n i cs o l u t i o n ) 是指由水相和非极 性有机溶剂相组成的两相反应体系，酶溶解于水相中，底物和产物溶解于有机相 中。有机相一般为亲脂的溶剂，如烷烃、醚和氯代烷烃等，可使酶与有机溶剂在 空间上相分离，以保证酶处在有利的水环境中，而不直接与有机溶剂相接触，水 相中仅存在有限的有机溶剂，从而减少了它对酶的抑制作用。反应中及时将产物 从酶表面移去将会推动反应朝着有利的产物生成方向进行。由于双相体系中酶催 化反应仅在水相中进行，因而必然存在着反应物和产物在两相之间的质量传递， 振荡和搅拌将会加快两相反应体系中生物催化反应的速度。 水一有机溶剂两相体系已成功地用于强疏水性底物如甾体脂类和烯烃类的生 物转化，在两相体系中已成功地运用微生物催化烯烃不对称环氧化，珊瑚诺卡氏 菌( n o c a r d i ac o r a l l i n a ) 生物转化烯烃产生的环氧化物及时转移到有机相中，可使 产物环氧化物对微生物的毒性降低到最低程度 1 9 1 。 1 2 2 水不互溶有机溶剂单相体系 单相有机溶剂体系( m o n o p h a s i co r g a n i cs o l u t i o n ) 是指用水不互溶的有机溶 剂取代所有的溶剂水( 9 8 ) ，形成固相酶分散在有机溶剂中的单相体系。酶处 于这种体系中，其表面必须有残余的结构水，才能保证酶的催化活性。一股有机 溶剂中含有小于2 的微量水。常用的水不互溶性有机溶剂有烷烃、醚、芳香族化 合物、卤代烃等，它们的l g p 较大。固相酶在有机溶剂中具有催化活性是酶的 项重要特性，在过去十多年的研究中，已证明这种体系是可行、可靠和多用途的。 固相酶结构上仍是柔性的，酶分子内部的柔性足以保证酶和底物结合时产生微小 中山大学博士学位论文 的构象变化，形成酶和底物结合的复合体。酶分子体积的1 3 2 3 是空的，充满 了溶剂，因此足够的搅拌可保证底物与酶的活性中心结合从而产生催化作用 g a r g o u r i 等用脂肪酶催化合成了内酯( 图1 - 1 ) ，并研究了酶的类型、温度及 溶剂对反应的影响。实验结果表明，在异丙醚中，用固定化脂肪酶n 一4 3 5 在3 5 催化反应时，得到产率位7 3 8 的化合物1 ，而用d c c 法只能得到7 的产率 2 0 1 。 掣 扒一、7 c o ，h l 孑l i p a 。s e 。 l f 。o ii a 、 图卜1 固定化脂肪酶催化合成内酯 1 2 3 反相胶束体系【2 1 2 3 】 溶剂工程研究经历了从水相到有机溶剂和反相胶束( r e v e r s em i c e l | e ) 的过程。 在水一有机溶剂两相体系和微水有机溶剂单相体系中，酶的催化活性不高。由于 反相胶束体系能够较好的模拟酶的天然状态，因而在反相胶束体系中，大多数酶 能够保持催化活性和稳定性，甚至表现出“超活性”( s u p e m c t i v i t y ) 。1 9 7 4 年w e l l s 发现磷脂酶a 2 在卵磷脂一乙醚一水反相胶束体系中具有催化卵磷脂水解活性以 来，反胶束酶学的研究和应用取得了较大进展，由此产生了一个新的研究领域一 胶束酶学( m i c e l l a re n z y m o l o g y ) 。反相胶束体系酶催化反应的微型反应器 ( m i c m r e a c t o r ) 有可能成为生物催化反应的通用介质。 反相胶束体系是表面活性剂与少量水存在的有机溶剂体系。表面活性剂分子 是由疏水性尾部和亲水性头部两部分组成，在含水有机溶剂中，它们的疏水性基 团与有机溶剂接触，而亲水性头部形成极性内核，从而组成了一个反相胶束。水 分子聚集在反相胶束内核形成“小水池”，里面容纳了酶分子，这样酶被限制在含 水的微环境中，而底物和产物可以自由进出胶束。表面活性剂可以是阳离子型、 第1 章非水介质酶催化反应及其应用研究 阴离子型或非离子型，如a o t ( a e r o s o lo t , s o d i u md i e t h y l h e x y ls u l p h o s u c c i n a t e ) 、 t w e e n 等。 含3 1 0 分子半乳糖和葡萄糖的寡糖( g a l a c t o ro i i g o s a c e h a r i d e ，g o s ) 能刺激 人体双歧杆菌( b m d o b a c t e r i a ) 的生长，因此己被广泛用于健康食品中。c h e n 等以 半乳糖为底物，在a o t 反相胶束体系中用1 3 一半乳睹苷酶催化合成了g o s ，并与 水溶液体系比较，发现在反相胶束体系( 水含量为3 0 ) 得到的g o s 的产率明显高 于水溶液体系。作者也研究了水含量对反应的影响，发现反应产率随着水含量的 升高呈现由低到高，再由高到低的趋势：当水含量为1 5 时，反应产率最高( 5 1 2 ) 5 】。 1 2 4 水互溶有机溶剂单相体系 单相水有机溶剂体系( m o n o p h a s i ca q u e o u s o r g a n i cs o l u t i o n ) 是指由水和与 水互溶的有机溶剂组成的反应体系，酶、底物、产物均能溶解于该体系中。常用 的有机溶剂有二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二嗯烷、丙酮和低级醇等。 这种反应体系主要适用于亲脂性底物的转化，该类底物在单一水溶液中溶解度很 低，反应速度也很慢。有些酶( 如酯酶和蛋白酶) 在水一有机溶剂单相体系中酶 选择性会增加。该体系中水互溶有机溶剂的量可达总体积的i o 。在些特殊的 条件下，甚至可高达5 0 7 0 。如果该体系中有机溶剂的比例高过某阀值， 将夺取酶分子表面的结构水，使酶失活。也有少数稳定性很高的酶如蛋白酶和脂 肪酶只要在水互溶有机溶剂中有极少量的水就能保持它们的催化活性。此外当酶 催化反应在0 c 以下进行时，水互溶有机溶剂体系还能降低反应体系的冰点温度， 这是低温酶学研究的内容之一。 1 2 5 超临界流体体系 除了亲脂性有机溶剂外，超临界气体( s u p e r c r i t i c a g a s e s ) ，如二氧化碳、氟里 昂、烷烃类( 甲烷乙烯丙烷) 或无机化合物等都可以作为酶催化亲脂性底物的溶 剂，酶在这些溶剂中就像在亲脂性有机溶剂中 样稳定。多数酶催化的反应都可 6 ! 坐查堂塑主兰堡堡苎 堡望 坐型竺! 一 在此体系中进行，如酯化、转酯、醇解、经化和脱氢等反应，但目前研究最多的 是水解酶的催化反应。g u n n l a u g s d o t t i r 等人对商用固定化酯酶( e c 3 1 1 3 ) 在起 临界c 0 2 中催化从鱼肝油中提取不饱和脂肪酸e p a 和d h a 的反应，结果表明可 以从反应混合物( 甘油三酸酯，_ = 油二酸酯，甘油单酯和乙醇酯) 中优先提取含 e p a 和d i i a 的乙醇酯，因为乙醇酯在超临界中的溶解比其它酯大得多，并且乙醇 酯的提取有利于反应的进行。预计这一工艺不久就可实现工业化 2 4 】。 酶在非水介质中催化天然产物、医药、精细化学品、高分子的合成已经得到 广泛的研究，酶催化反应的高度专一陛和温和反应条件吸引人们对复杂生物活性 物质的合成研究。但是，由于酶在有机介质中呈不溶解状态，采用冻干酶粉进行 催化反应，常常表现出极低的催化活力和较低的生产能力，反应需要很长时间， 所以不得不使用大量的生物催化剂，而目前大多数酶的价格仍然较高。为此深入 研究酶在非水介质中催化反应的影口向因素、反应动力学是提高酶催化反应效率和 生产能力所必需。 1 3 非水介质中影响酶催化活性影响的因素 许多天然酶在非水介质中的催化活性下降，如d 一胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌 蛋白酶的催化活性在脱水正辛烷中降低了4 5 个数量级，在其它有机溶剂中也有类 似的情况。影响非水介质中酶活性的因素很多，如溶剂的性质、水含量、p h 值、 扩散因素、底物和产物的溶剂化等，其中非水介质中的水含量( w a t e r c o n e n t ) 对 酶的催化活性影响最大。 1 3 1 水含量 用x 射线晶体衍射法和傅立叶变换红外光谱法测定表明，有机溶剂对酶的二 级结构( q 一螺旋和b 一折叠) 并无大的影响。酶只有当分予本身具有一定的空 间构象时才能表现出催化活性，蛋白质分子即使以晶体存在时也处于不断的运动 状态中，整个分子有相对刚性和柔性两部分。为保汪酶与底物的诱导契合，酶活 性部位保持一定柔性是酶表现催化活性所必需的。 第! 主苎查坌垦墼堡些垦堕墨墨里塑里! 塑 一 酶分子的构象主要由静电作用力范德华力、疏水作用以及氢键等构成一个复 杂的网络来维持。水分子直接或间接地参与这些非共价作用的形成或维持，其作 用类似于润滑剂和增塑剂。酶与底物的结合足一个双方雳导契合的过程，在相互 作用的过程中酶和底物都要做微小的结构变化。因此酶必须有一定的“柔性 ( f l e x i b i i i t y ) ”以使酶能趋于最佳催化状态所需的构像。有机溶剂缺乏提供形成 多种氢键的能力，不具备象水那样的调节功能，相反有机溶剂由于使蛋白质带电 基团之间更强的静电作用，而使蛋白质的“刚性( r i g i d i t y ) ”增加，因此也使酶在 脱水溶剂中比在水溶液中的活性低。事实上，酶之所以在有机溶剂中表现出催化 活性，是因为它们能牢固地结合一些“必需水( e s s e n t i a lw a t e r ) ”，并保持它在催化 反应中起调节作用。 酶催化反应是在环绕着酶分子表面的水层内进行的。所谓非水体系并不是绝 对无水的，而是一种含有微量水的有机溶剂体系( 水 3 应小心使用 不互溶 不会引起酶的变形靖保持酶的高活性 从表中可以看出1 9 p 值介于中间( o 3 ) 的溶剂不直作为酶催化反应的非水 介质。只有在少数情况下，对强极性底物如多羟基化合物才考虑使用中等极性或 与水互溶性溶剂如四氢呋哺、二嗯烷、嘧啶等，在这些溶剂中，除极少数特别稳 定的酶如枯草杆菌蛋白酶外，绝大多数酶都会失活。一般认为，酶在疏水性大的 介质中反应活性高，因此酶催化反应在非极性( a p o l a r ) 或与水不混溶的( i m m i s c i b l e w i t hw a t e r ) 疏水性有机溶剂中进行。 溶剂剥夺酶分子表面结构水的能力取决于溶剂的极性和水含量。有机溶剂的 水含量必须调整到酶保持最佳活性所必需的水活度( w a t e r ，a c t i v i t y ) 值。有些酶在 高极性有机溶剂中仍有相当高的活性，实验结果表明，酶活性除受溶剂极性和水 含量影响外，还与溶剂的介电常数、底物极性和酶活性中心的亲水性与疏水性有 关。酶和底物的结合能是酶催化反应的主要推动力，底物必须从反应介质中解析 出来与酶活性中心结合。枯草杆菌蛋白酶、q 一胰凝乳蛋白酶和很多其它酶的活 性中心都是疏水性的，它们与疏水底物反应最有利，因为疏水性底物更容易从水 中解析到达疏水性活性中心。然而当有机溶剂代替水后，疏水性底物与有机溶剂 间的相互作用增强，底物从溶剂到达活性中心就比在水中困难，从而减慢了酶催 化反应的速度。而亲水性底物在疏水性较强的溶剂中则容易进入酶的活性中心， 从而加快酶催化反应速度。因此亲水性底物应选择疏水性较强的溶剂，而疏水性 底物应选择疏水性弱的溶剂。k l i b a n o v 在研究枯草杆菌蛋白酶( s u b s t i 1 i s i n ) 催化 的转酯反应中，发现亲水性底物n a c ，l s e r o e t 在疏水性溶剂c h c l 2 中反应速度 o 第l 章非水介质酶催化反应及其应用研究 快，而疏水性底物n a c l - p h e o e t 在亲水性溶剂叔丁醇或叔丁胺中反应速度快 【2 7 2 9 。 1 3 3 溶剂的p h 值 反应介质的p h 值是影响非水介质酶反应的重要因素之一，p h 影响酶的离子 化，而离子化状态决定了酶的构象，酶的构象又影响了酶的活性和选择性。酶蛋 白中的可电离基团在有机溶剂中不能电离，因此在使用前必须对酶进行预处理。 酶可以是晶体粉末等物理状态，酶也可以吸附在无机或有机载体表面产生理想的 分布态，常用的载体有无机材料如硅胶、硅藻土，或有机材料如非离子载体x a d 一8 ， a c c u r e l 等。在非水介质中p h 值不易测定和调控，为此强酶先溶解在少量最适d h 值缓冲溶液中直接冻干或从最适p h 值缓冲溶液中沉淀，可以保持酶的电离状态， 后者被描述为酶“p h 值记忆”。这样处理后可增加酶的反应速率，有时可增加一 个数量级，从最适p h 值水溶液中沉淀的酶在有机溶剂介质中也表现出较高的酶活 性 3 0 1 。 1 3 4 酶的形态 酶溶于水而几乎不溶于有机溶剂，在有机溶剂中酶呈悬浮状态，所以反应所 使用的酶量不宜过多，否则酶容易形成聚集体而影响酶的反应速度。另外酶与底 物的接触也会受到扩散速度和立体障碍的影响，消除这种不利因素的方法是强化 搅拌和使酶颗粒的直径尽可能小。固定化酶、交联酶晶体和反胶束酶等不同形态， 可以改善酶的分散性，减少扩散限制，有利于底物和酶的活性中心结合从而加快 催化反应速度。 酶在有机溶剂中的催化反应是一个非均相反应体系。为了使酶能在均相体系 中反应，可以对酶进行修饰以提高它在亲脂性有机溶剂中的溶解度。常用的修饰 剂为两性聚合物如聚乙二醇( p e g ) 。例如h e m a i zm j 等用聚乙二醇共价修饰 c a n d l d a r u g o s a 脂肪酶，在异辛烷中催化酯合成反应，酶的催化活力比末修饰的酶 g 是n g 9 5 图l 1 5 环己酮单加氧酶催化的不对称的拜尔一维利格氧化反应 1 4 5 非水介质酶催化的转移和裂合反应 转移酶能催化一种底物分子上的特定基团( 例如酰基、糖基、氨基、磷酰基、 甲基、醛基和羰基等) 转移到另一种底物分子上。在很多场合，供体是一种辅助 c 。了正。 第1 章非水介质酶催化反应及其应用研究 因子( 辅酶) ，它是被转移基团的携带者，所以大部分转移酶需有辅酶的参与。这 类酶包括氨基转移酶、糖基转移酶、糖苷酶和磷酸化酶。 在非水介质酶催化反应中，糖苷酶是应用较多的一种酶。许多糖苷化合物具 有抗癌、抗氧化、抗病毒作用，但是糖苷类化合物的化学合成是非常困难和复杂 的工作。糖苷水解酶在水溶液中可催化糖苷键的水解反应，而在有机介质中，糖 苷水解酶可以催化水解反应的逆反应一糖苷键的合成反应。例如在水互溶有机溶 剂中( d n f 、毗啶、甲醇、乙醇、二氧六环、丙酮等) ，o 、0 一葡萄糖苷酶( 或 葡萄糖淀粉酶) 、b 一半乳糖苷酶等可以催化烷基糖苷的形成 4 9 - - 5 0 1 。 葡萄糖营酶 + r c h 2 0 h + 水互溶有机溶剂 图1 1 6 葡萄糖苷酶催化合成糖苷 o c h 9 r 裂合酶( 1 y a s e ) 能催化一种化合物分裂为两种化合物或其逆反应。裂合酶催 化小分子在不饱和键碳碳单键、碳氮单键和碳氧双键上的加成或消除。裂合酶中 的醛缩酶、转羟乙醛酶和醇腈( 醛化) 酶在形成碳碳键时具有高度的立体选择性。 醇腈酶能催化氰醇的分解和合成，它能使氢氰酸不对称加成到醛或是酮分子 的羰基上，形成手性氰醇，而手性氰醇是合成多种具有药学活性的化合物中间体。 m e o n t e r d e 等用“锅煮”的方法和成了具有旋光性的( r ) 醛基氰醇，接着再用 化学法合成了具有光学活性的2 ，3 - 二取代哌啶( 如图1 - 1 7 ) 。另外m e n e n d e a 等也 用该方法合成了具有光学活性的( r ) 一2 - 氰基四氢吡喃和( r ) 2 - 氰基四氢呋哺， 这些化合物都是具有生物活性化合物的基本骨架。 51 - - 5 2 1 。 从上面的一系列酶在非水介质中的催化反应来看，虽然部分酶已经大量用 于工业生产上，如脂肪酶、酰胺酶、蛋白酶等，但还有很多酶由于底物或辅因子 不能溶于有机相的原因而不能用于工业生产。我们从影响酶在非水介质因素来看， 微量水的存在是酶保持活性所必需的。但同时也表明一定水相或有机相的存在并 不是先决条件。为此人们试图用某一种过量的反应物做溶剂( 在某些情况下，tj 加入少许有机溶剂) 完成酶催化反应。如c a m b o n 和k l i b a n o v 将消旋醇溶解在过 中山大学博士学位论文 ( r ) 一羟腈酶 e r 艋磁： h “芦“ 、小 s ， 筒o 。h ! 竺- 。八f 夕 l l l h 7 8 。m 3 c n c n 双暇r联“ 图卜1 7 醇腈酶催化u 一溴乙醛和外消旋的醇氤化一转氰反应 量的酯中进行拆分。另外，在酶催化酯合成和酯交换反应中，乙酸乙烯酯电常作 为反应溶剂和乙酰化试剂。然而在这些情况下，既作为低物又作为溶剂的反应物 比另一个反应物要过量很多，因而这种方法丧失了在生产实践中的优势。在这种 情况下，人们从有机化学中的无溶剂体系有机合成方法得到启示，开展了无溶剂 体系下酶催化反应的研究。 1 5 无溶剂体系中酶催化反应 大多数酶是水溶性的蛋白质，工业用酶常常是以丙酮干粉或冻干酶粉形式存 在。在最初非水介质中酶催化反应的研究中，多采用这种