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色谱饼对生物大分子的快速纯化 摘要 色谱饼是在计量置换理论和短柱原理的基础上设计制造的。现已成功地应用 于基因工程下游产品的分离纯化中。本文将其用予动物组织中活性蛋白与工业粗 酶的提取，并在较短时间内得到了纯度较高的目的蛋白，体现出色谱饼在分离过 程中使用压力低，蛋白回收率高和快速的特点。本文包括五章。 第一章文献综述 第二章人血清白蛋白的纯化 在所选定色谱条件下用色谱饼( 1 0 2 0 哪i d ) 对其流动相种类、浓度、缓 冲液、p h 值、流速进行了优化研究，在优化条件下对标准蛋白混合物进行了在 不同流速条件下分离情况的比较，结果显示装填有小颗粒填料的色谱饼在高流速 条件下仍然具有良好的分离能力，还在较大流速条件下，在1 0 分钟内对人血清白 蛋白进行了快速纯化，其纯化的人血清白蛋白的纯度大于8 8 ，蛋白质回收率大 与6 5 第三章蛋清中溶菌酶的纯化 首先采用疏水色谱对溶菌酶进行分离纯化，由于蛋清中多种蛋白质与溶菌酶 保留时间相近，无法用h i c 将其彻底分离。最后采用离子交换色谱纯化溶菌酶， 建立了用高效液相色谱分离溶菌酶的新方法，结果表明，被纯化的溶菌酶可以与 杂蛋白进行很好的分离，并且得到活性回收率为9 4 ，活性为 该方法具有分离速度快，纯化效率高的特点。 第四章d 一淀粉酶的纯化 本章采用高效疏水色谱分离纯化a 一淀粉酶，详细讨论了纯化的最佳条件， 在给定的条件下纯化工业用a 一淀粉酶，其活性回收率达9 0 ，比活性为1 2 0 u m g ， 此法纯化o l 一淀粉酶简单快速，效率高，不仅可以纯化工业粗酶，也可纯化其他 来源的淀粉酶。 第五章细胞色素c 的纯化 本章分别采用高效疏水色谱和高效离子交换色谱分离纯化猪心中的细胞色 素c ，由于亲水性较强，可以与猪心中其他杂蛋白进行有效分离，得到纯度为 9 0 的目标蛋白，其等电点为1 0 8 ，可以很好地在阳离子交换柱中保留，在优化 了分离条件的情况下，得到纯度为8 5 的细胞色素c 。 关键词：高效疏水色谱高效离子交换色谱色谱饼纯化人血清白蛋白溶菌酶 a 一淀粉酶细胞色素c f a s tp u r i f i c a t i o no f b i o p o l y m e r sb yc h r o m a t o g r a p h i cp i e a b s t r a c t c h r o m a t o g r 印h i cp i ei sa p p l i e ds u c c e s s m l l yi nt h es e p a r a t i o na i l dp 嘶f l c a t i o no f t h ed o v m s t r e a mp r o d u c t si nb i o t e c h r m l o g y i nt h et h e s i s ，t h ec h r o m a t o g r 印h i cp i e w a su s e di nt h ef a s t s e p a r a t i o n a n d p i l r i f i c a t i o n o ft h en a t i v e p r o t e i n s i nt h e o r g a n i z a t i o n so f a n i m a l sa n dt h ei n d u s t r i a lg r a d ee i l z y m e h i 曲p l l r i t yt a r g e tp m t e i n s w e r eo b t a i n e di nar e l a t i v e l ys h o r tt i m e t h ec l l r o m a t o g r 印h i cp i e 、v a s a l s o c h a r a c t e r i z e d b y i t sl o wp r e s s u r e d u r i n g t h e s e p a r a t i o np m c e s s a i l d r a p i d ，h 追h r e c o v e r yo f p m t e i n s t h e t h e s i si n c l u d e s 矗v e p a r t sa sf 0 1 l o w s ： 1 r e v i e wo fl i t e r a t u r e 2 p u r i 丘c a t i o no fh 啪a ns e m m a l b u m i n ( h s a ) t h eo p t i m i z a t i o no ft h ek i n d s ，c o n c e n 仃a t i o n ，b u 虢r ，p ha n dn o wr a t eo fm o b i l e p h a s eb yu s i n gc h r o m a t o g r a p h i cp i ew a si n v e s “g a t e di nt h i st h e s i s i nt h eo p t i m i z e d c o n d i t i o n s ，m es 印a r a t i o no fs t a n d a r dp m t e i nw a sc o m p a r e di nd i 脆r e n tn o w r a t e s f r o mt h er e s u l t s ，i ti n d i c a t e st h a tt h ec h r o m a t o g r a p h i c p i ep a c k e d w i t hs m a l lp a n i c l e s s t i l lh a sg r e a ts e p a r a t ea b i l i 够u s i n gh i g hn o w r a i e ，t h er a p i dp u r i f i c a t i o no fh s a w a s a l s ob e e nd o n ei nl0m i n u t e s t h ep u r i t ) rw a sm o r em a n8 8 a n dt h er e c o v e r yw a s o v e r6 5 3 p u r i f i c a t i o no f l y s o z y m e ( l y s ) i n e g g w h i t e f i r s t l y l y s w a ss e p a r a t e da n dp u r i f i e db yu s i n gh i g hp e r f i o m a n c eh y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y ( h p h i c ) t h er e t e n t i o nt i m eo fl y si sn e a rt o m a n y p r o t e i n si ne g gw h i t e ，s ol y sc a nn o tb es e p a r a t e dc o m p l e t e l yb yh i c i nt h i st h e s i s ， i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y w a su s e dt o p u r i t yl y s a san e wm e t h o d t h e s e p a r a t i o nw a sp r o v e dt o b ee 疵c t i v ea i l dt h er e c o v e d ro f b i o a c t i v i t yr e a c h e d9 4 t h em e t h o dw a sa r 印i da n de f 耗c t i v es e p a r a t i o nw a x 4 p u r 嫡c a t i o no f a - a m y l a s e i n d u s t “a lg r a d ec c - a m y l a s ew a sp u r i f l e db yh i ca n dt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o nw a s d i s c u s s e di nt h i sc h a p t e r i nag i v ec o n d i t i o n ，t h eb i o a c t i v i t yr e c o v e r yo f 旺一a m y l a s e c a nr e a c ht o9 1 a n ds p e c i n c a c t i v i t yc a nr e a c h1 2 0 u m g t h i si sas i m p l e ，r a p i da n d e n - e c t i v es e p 撇t i o nm e t h o df o ra a m y l a s e a n dt h i sp r o c e d u r ec a nb eu s e dt op u r i t y n o to n l yi n d u s t r i a l 伊a d ed a m y l a s e ，b u t 也o s e 矗o mo t h e rs o u r c e s 4 p i l r i f i c a t i o no f c y t o c h r o m e ( c ”- c ) c ”o c l l r o m e - ci np i gh e a r tw a sp u r i n e db yh p h i c a n dh p i e c ，r e s p e c t i v e l yi n t h i st h e s i s t h eg r e a th y d r o p h i i i ca m l i t yo f c ”一cm a d e i tc a nb es e p a r a t e de 虢c t i v e l y f r o mo t h e rp r o t e i n si np i gh e a r ta n dt h ep u r i t yc a nr e a c ht o9 0 i na d d i t i o n ，p io f c y t ci s 1o 8 ，i ti m p o s s i b l et or e t a i nw e l l _ i nc a t i o n e x c h a n g e c 0 1 u m n i nt 1 1 eo p t i m i z e d c o n d i t i o n s ，t h ep u r i t yo fc ”一cc a nr e a c ht o8 5 k e y w o r d s ：h i g hp e r f o r m a n c eh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n c 1 1 r o m a t o g r a p h yh i g h p e r f o m a n c e i o n e x c h a n g ec h m m a t o g r a p h y c h o m a t o g r 印h i cp i ep u r i f i c a t i o n h u m a ns e m ma 1 b 啪i n l y s o z y m e 0 c a m y l a s ec ”o c h m m e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其 他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 论文作者签名：撇乒 签字日期：2 0 0 3 年5 月2 0 日 第一章文献综述 1 1 概述 色谱法是现代分离分析的一个重要方法，广泛地应用于诸多领域，如石油化 工，有机合成，生物化学，医药卫生，乃至空间探索等，无不运用色谱技术以解 决各种分离分析课题【l 】。 生物大分子是指分子量大于2 0 0 0d a l t o n 的蛋白质、酶、多肽、核酸、糖和 类脂类。生物大分子的分离和纯化是伴随着生命科学发展而兴起的一门新兴科 学，是现代分离科学最活跃的一个分支。现代分离科学理论的计算得出，色谱和 电泳是目前所知的分离效果最佳的两种分离方法，其理论塔板数可达百万数量级 2 + 3 1 。但电泳法目前尚不能用于生产规模的生物大分子的分离和纯化【4 】，液相色 谱( l c ) 就成为实验室和工业生产上分离和纯化生物大分子的最有效和最常用的 方法。某些天然或基因工程生产的治疗蛋白的价格高达千万元克，其主要原因 是分离和纯化的消耗占总成本的6 0 9 0 。可想而知，掌握和熟练地运用制备色 谱技术，可以大大降低重组人治疗蛋白药物的生产成本。 近年来，高效液相色谱( h p l c ) 已成为分离纯化蛋白质非常有效的方法之 一。和经典分离方法相比，其优势在于：h p l c 纯化蛋白质的速度快，一般半 小时左右就可进行一次分离，大大缩短了纯化蛋白质的时间；分离效果好，用 厚度为1 0 c m 或5 c m 的h p l c 柱子便可使多种蛋白质得到有效的分离，而且这种 分离效果是其它纯化方法，如盐析、有机溶剂沉淀法、超滤法以及经典柱液相色 谱法( l c ) 所无法比拟的；适用性强，几乎所有的蛋白质根据其物理性质( 等电 点、疏水性、分子量等) 的不同，都可使用h p l c 进行分离。除此之外，h p l c 还有回收率高，处理量大等优点。在生物技术制备蛋白质的多级纯化过程中，液 相色谱被指定为“必需步骤”( c o m p u l s o r ys t e p ) ，这表明操作条件温和、又具有分 子水平分离能力的l c 为开创现代生物大分子化学树立了一个里程碑。 5 】 1 2 色谱分离模式 1 2 1 色谱理论 液相色谱按照溶质与固定相作用力性质的不同可分为：反相液相色谱 ( r p l c ) 、离子交换色谱( i e c ) 、疏水相互作用色谱( h i c ) 、亲合色谱( a f c ) 以及排阻色谱( s e c ) 等多种分离模式，各种分离模式在生物大分子的分离和纯 化中均有其各自的特点和保留模型。吸附等温线【6 】、平衡扩散模型【7 】和计量置换 保留模型( s t o i c h i o m e t r i cd i s p l a c e m e n tt h e o r yf o r r e t e n t i o n ，s d t - r ) 吲常被用来描述 色谱过程中溶质的色谱保留行为和洗脱曲线。研究表明：s d t - r 是一个可以适合 于除s e c 以外的各类色谱模式的统一保留机理，也是唯一一个可用于表征生物 大分子色谱保留行为的模型，其核心思想可用图1 1 表示，1 0 1 。 n 溶剂 上 7 溶剂 吸附 溶剂化 解吸 图卜l 液相色谱中s d t r 的示意图 f i g u r e 卜las c h e m a t i cd i a g r a o fs d t ro fp r o t e i n si nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 由图1 一l 看出，液相色谱中的计量置换过程是由溶剂化、吸附和解吸附三部分组 成。在流动相中蛋白分子与固定相表面的配基分别被溶剂化，当溶剂化蛋白被 溶剂化固定相表面吸附时，从二者的接触面上会有一定计量的溶剂分子释放出 来；当蛋白从固定相上表面解吸附时，流动相中又会有一定量的溶剂分子重新回 到蛋白质和固定相表面。这一模型可由两个线性方程分别表示为8 9 】： l o g k 2l o g l z l o 驴df l 一1 ) l o g 巧z - 1 0 9 妒( 1 2 ) 式中女表示溶质的容量因子，l o g ，表示与l m 0 1 溶质对固定相亲和势有关的常数， z 表示1 m 0 1 溶剂化溶质被溶剂化固定相吸附时，从溶质与固定相接触面释放出 来的溶剂的摩尔数，幻表示流动相中强溶剂的活度，表示一个与1 m o l 溶剂对 固定相亲和势有关的常数，p 表示柱相比。 在上述两个线性方程中，由于s t d - r 中的两组线性参数第一组线性参数l o g ， 和z 和第二组线性参数_ ，和l o g 妒均有明确的物理意义，包含了许多关于分子构象、 溶质与固定相作用力以及色谱条件影响因素等方面的信息，所以在研究小分子和 譬因盘 生物大分子的性质中获得了广泛的应用。 1 2 2 生物大分子色谱分离基本模式 从色谱分离的基本原理上分类，至少有以下几种分离模式在生物大分子的分 离和纯化过程中常被采用： 1 r p l c ：是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的非选择性作用力特 征所建立的一种色谱模式。在生物大分子的反相液相色谱条件下，流动相多采用 酸性的、低离子强度的有机溶剂水溶液。常用固定相为硅胶烷基键合相，除此 而外，还有多孔碳固定相u ，苯乙烯型共聚微球【1 2 】填料，氧化铝、氧化锆等作 为基质的涂层填料【1 3 1 9 1 。 2 i e c ：作用机理是基于生物大分子和离子交换剂之间的静电作用，导致介质表 面的可交换离子与带相同电荷的蛋白质分子发生交换。其保留次序取决于配体和 蛋白质问的静电作用力，离子交换色谱含盐的缓冲流动相系统十分类似于蛋白质 稳定存在的生理液条件，有利于增加其活性回收率。其固定相基体主要是亲水共 聚物。 3 h i c ：原理与反相色谱有相同之处，所用填料同样分有机聚合物和大孑l 硅胶键 合相两类，区别在于h i c 填料表面疏水性没有砌，l c 强。流动相一般为d h 6 8 的盐水溶液，和普通r p l c 相比，这种表面带低密度疏水基团的填料对蛋白质的 回收率高，蛋白质变性可能性小。由于流动相中不使用有机溶剂，也有利于蛋白 质保持固有的活性。 4 a f c ：是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性吸附而进行选择性分离 的一种生物大分子分离方法。其固定相的载体有陶瓷【2 0 】、扩孔玻璃【2 l 】、硅胶【2 2 2 6 】、 聚苯乙烯和琼脂糖微球2 9 1 ，配体为与被分离的蛋白质问有一种特异生物作用 的物质。 5 s e c ：是一种纯粹按照溶质分子在流动相溶剂中的体积大小分离的色谱法。填 料与有一定范围的孔尺寸，大分子进不去而先流出色谱柱，小分子后流出。在用 水系统作为流动相的情况下，又称为凝胶过滤色谱( g f c ) 。在使用有机物作为 刘流动相时为凝胶渗透色谱( g p c ) 。 1 3 色谱饼 在讨论小分子溶质时，从理论上讲，色谱柱愈长分离效果愈好，只是不要长 到不切合实际的程度即可。而在实际应用时，一般认为直径长度为l 1 0 是色谱 柱较为合适的几何尺寸。但在利用高效液相色谱( h p l c ) 分离生物大分子过程 中，许多研究表明生物大分子的色谱保留行为主要由流动相中置换剂的浓度决定 的，分离度受柱长的影响不大，并用溶质计量置换理论( s d t ) 对此进行了定性 的说明【3 03 ”。m o o r e 等人吲用柱长为6 3 m m 的色谱柱，在反相色谱( r p l c ) 中 分离了五种蛋白，发现其分离度优于在柱长为4 5 m m 的色谱柱上的分离度。 e k s t e e n 等人【3 3 】在离子交换色谱( i e c ) 上，用柱长分别为2 5 0 m m 与2 0 f 1 1 i n 色谱柱 分离了与m o o r e 等所用相同的五种蛋白的混合物，也得出了长度为2 0 m m 的色 谱柱的分离度好于长度为2 5 0 m m 色谱柱分离度的结论。m b t e r u l i k o v 等人【3 4 】 还依据s d t - r ，对这些现象提出了生物大分子在h p l c 上保留的“开关”机理 ( o n o f f m e c h a n i s m ) ，并预计由此可发展一类全新的膜色谱固定相。他们还成功 地从合成的连续棒状阴离子交换棒上切出2 m m 厚的离子交换薄片或膜用于蛋白 质分离，并且认为灌注色谱固定相更好地体现了这种“开关”机理。基于s d t - r ， 耿信笃教授设计了变性蛋白复性及同时纯化装置( u n i to fs i m u l t a n e o u s r e n a t u r a t i o na n d p u r i f i c a t i o no f p r o t e i n ，u s 砌) p ) 【”j ，该装置可以制作成大小不同 的实验室或制备型柱子，用于实验室的分析与制备。这些色谱柱柱长很短，仅为 1 c m ，而柱直径可达2 0 c m 或更大，所以可以形象地称为色谱饼。在使用1 0 x 5 0 m m 色谱饼，在流速高达7 m l m i n 的条件下，其柱后压力只有3 m p a ，因其柱径为1 0 c m 常用的直径4 6 m m 色谱柱的2 1 倍，加之其柱长只有通常色谱柱的1 1 0 l 2 5 所以 少许的沉淀聚集在柱子顶端的滤片上或残留在柱填料的顶端，不会造成柱压的升 高。而这些产生的沉淀在常用实验室规模的色谱柱上产生的柱压可能是色谱饼的 1 0 倍乃至l o o 倍【3 ”，所以在色谱饼中装填小颗粒填料不但容易满足分离度的要 求，具有较大的柱负载量，但在此条件下，而且使用压力较低。减少了生产成本。 在分析型h p l c 中，人们强调的是分析的灵敏度、准确性、分离度和分析速 度，进样量很少，一般属于线性色谱范围；而在制备型h p l c 中，主要考虑的是 在一定纯度下的最大生产量，在绝大多数情况下均是在超载状态下运行，属于非 线性色谱。一般实验室规模的制备色谱柱直径不超过2 厘米，而且常常可以在 4 6 和5 毫米内径的分析柱上进行制备分离；克级规模的制备色谱柱内径一般在 5 厘米左右，而工业上大规模的制备色谱内径有时可达数十厘米，从而可以获得 千克级的产品【”j 。 由于制备柱一般用于生产，而产量是生产的一个基本标准，所以在不影响柱 的分离效率的前提下，增加色谱柱的处理量，是制备色谱的关键。增大液相制备 色谱处理容量有三种方法：延长柱的长度，采用多条平行或并联的柱以增大柱的 直径。柱长的增加虽然可以增大色谱柱的处理量，但也会导致柱压上升，从而影 响色谱柱及仪器的使用寿命。采用多条平行柱亦有一定困难，因各平行柱完全一 样是困难和麻烦的事，流动相要均匀分配到各柱，各柱的阻力要完全一样，各柱 冲洗峰流出时间略有不同，就可使总的谱带加宽，并使相邻峰分离度下降【3 射。 研究发现将r p l c 、i e c 、h i c 和金属螯和亲和色谱( m c a c ) 用于生物大分子 分离时，分离度几乎与色谱柱的柱长无关【4 0 j ”，所以可以将柱直径加大以增加色 谱柱处理量而不需将柱加长，这样柱压不会增加，有利于设备结构的选择。制备 型色谱饼就是在这个基础上设计的，由于直径增大，就会带来流动相在柱头不易 均匀分布的问题，解决这个问题的方法是在色谱柱头放置一径向流分布器【4 2 1 。 另一方面，为了将小颗粒填料柱效高和大颗粒填料柱压低有效地结合起来【4 3 1 ， 需采用径向装填方法【4 4 】将小颗粒填料均匀、紧密地装填进色谱饼。 尽管色谱饼的柱长只有1 c m ，但是其对6 种标准蛋白质的分离效果完全可以 与常用的色谱柱相媲美m4 6 瑚】。李翔对体积相同的半制备型色谱柱与色谱饼 作了比较，发现色谱饼在经过多次使用之后，柱压力升高较低，表明在体积相同 的情况下色谱饼比色谱柱更具有优势，适合在更适合于需要在中、低压力下进行 的色谱分离纯化工艺。在质量负载方面，色谱饼是色谱柱的1 2 倍，体积负载为 1 6 倍。并且对蛋白质的活性回收率没有影响。张养军 4 6 1 对生物大分子液相色谱 中柱长与柱径比做了优化，在满足最小柱长【4 8 1 的条件下分离度与柱长基本无关， 可以满足对生物大分子的色谱分离，并且可以用作蛋白质的制备。通过计量置换 理论对其在制备过程中所用色谱流动相的用量做了优化研究，提供了简单的估算 方法和理论依据。可以通过不改变流动相用量的情况下尽可能地缩短梯度时间以 提高分离效率。从而进一步得出了在保持流动相用量不变的条件下，改变线性梯 度变化时间和流动相的流速，对生物大分子的分离度和复性效率几乎没有影响 【4 9 】。 1 9 9 1 年，耿信笃教授首次将疏水相互作用色谱用于重组人干扰素- y 的复性与 同时纯化【5 0 】，他们刚发现配体端基为改性醚键的高效疏水色谱能使变性蛋白复 性，可以将用7 m o l 几g u h c i 溶液从大肠杆菌中提取的r h i f n 吖直接注人h p h i c 柱，在完全除去变性剂的同时，不仅使r h i f n 吖完全复性，而且与大多数杂蛋白分 离。李翔采用新工艺在直径为2 0 0 m m 的制备疏水色谱饼上复性及同时纯化 r h i f n - 丫，r h i f n 吖纯度9 5 5 ，比活5 1 1 0 7 i u ，m g ，并且质量回收率高出文献例5 倍。刘彤对g c s f 发酵液采用色谱饼进行纯化，经s d s p a g e 扫描纯度可接近 1 0 0 。生物活性回收率大于常规稀释法的3 倍。 1 4 基因药物特点及纯化技术 现代生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等四个组成部分， 其中基因工程是现代生物技术的核心。自1 9 7 3 年美国科学家完成了第一例基因 工程实验后【5 4 】，二十多年来，基因工程技术得到了迅速的发展，在医药行业中 得到了广泛的应用。由于基因工程药物具有其它药物无法比拟的优点，所以基因 工程药物的生产已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。 基因工程生产蛋白药物的特点【5 5 】：( 1 ) 样品组成复杂，目标产品的含量很低。 如大肠杆菌为宿主菌，得到的目标产品多处于细胞内，细胞破碎后，大量杂蛋白、 核酸等就会与目标产品混杂在一起；动物细胞培养时常需加胎牛血清，除其成份 比较复杂，还会引入病毒、支原体和细菌等。( 2 ) 对产品纯度要求高，一般认为 杂质含量应低于2 ，对于某些药用蛋白，其纯度需要达到9 9 9 9 以上。( 3 ) 活 性回收率和质量回收率低。基因工程生产的蛋白药物通常需要进行繁琐的复性和 纯化过程。在复性过程中，蛋白质有聚集沉淀的趋势，且对于含有多个二硫键的 蛋白来说，还存在着二硫键的错配问题。因此，要得到合格的基因工程产品并不 容易。大多数细胞破碎提取液的纯化需要经过粗纯化和精纯化，其中粗纯化方法 包括口6 】：盐析、等电点沉淀、超滤等。精纯化则包括上述的多步液相色谱法的 联合使用。这种多步骤组成的生产工艺的缺点是：操作繁琐，耗时长，且最终产 率往往很低。 1 5 人血清白蛋白 人血清白蛋白( h u m a ns e r u ma l b u m i n ，h s a ) 是含一种内含有585 个氨基酸 的单链无糖基化的蛋白质，分子量6 6 ，0 0 0 69 ，o o o d a ，含有1 7 对二硫键，等电 为4 7 4 9 。它是人血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的6 0 左右。在人体 内，血清白蛋白具有维持血液渗透压和携带血液中多种配基( 包括脂肪酸、氨基酸、 类固醇、金属离子及药物) 与组织进行交换等生理功能，临床用于手术输血和危重 病人补液，治疗创伤休克、发烧、水肿、低蛋白血症和红细胞过多症等，而且能增 强人体抵抗能力，是重要的临床药物【5 7 l 。由于h s a 适应症多、用量大( 每个病人 每天用h s a 量达几克范围) ，因此h s a 拥有巨大的市场需求量。据近年报道，目 前h s a 全球年销售量高达6 0 0 吨左右，按目前5 0 美元1 0 9 计，每年销售额在3 0 亿美元以上。中国市场近年销售约7 0 吨，年销售额在人民币3 0 亿元左右。h s a 在全球的需求量呈上升态势。然而市售h s a 主要从捐血者血浆或人胎盘中提取。 但近年来越来越多的人因输入血制品h s a 而感染了艾滋病、肝炎等传染性疾病。 人们迫切期望开发新的来源。用基因工程技术生产重组人血清白蛋白替代血源白 蛋白是目前最有发展前景的高科技途径。 1 9 4 6 年c o l l l l 等人首先研究出大规模分级分离人血浆白的方法：利用乙醇的 低介电常数性质以及蛋白质在一定温度、p h 、强度及浓度条件下，在不同浓度乙 醇中溶解度不同分离血浆蛋白质，可以生产出多种血浆医用蛋白，成为著名的 c d h n 乙醇沉淀法。1 9 7 1 年n e w m a n 等人对此方法进行改进，将血浆在2 4 进行沉淀分离，可在同一过程中得到更多产物，成为目前广泛使用的冷乙醇沉淀 法。1 9 7 7 年c u l i n g 等人提出用色谱技术纯化白蛋白，但当时仅仅进行了实验室 尝试。1 9 8 3 年b e r g l f 等人应用色谱集成技术进行了h s a 的试验性生产，该方法有 效地减少了蛋白质聚集及变性，聚集蛋白低于1 ，纯度达9 9 。为弥补色谱法的 不足，近期发展了色谱与冷乙醇沉淀相结合的方法，二者优势互补，应用于h s a 工 作化生产后效果显著，澳大利亚c s l 公司就是成功的例子。该公司1 9 9 5 年全部投 产以后，现已成为世界最大的色谱法生产h s a 的基地。其产品纯度达9 9 5 ，年产 约3 0 0 吨，生产稳定，并实现完全自动化控制【5 8 】。近年来发展的离子交换色谱、凝 胶过滤色谱、亲和色谱、膜色谱等多种色谱分离技术具有自动化程度高、生产周 期短、更符合g m p 等特点，正在逐步取代传统的冷乙醇沉淀法。同时高效、集成 型生产工艺成为研究的重点。苏志国5 9 】采用自己合成的染料亲和配基，成功地应 用一步亲和色谱法从人胎盘血中提取h s a 收率可达9 0 以上，纯度达到电泳纯， 其一步纯化效果优于传统沉淀方法十几步的分离结果，大大提高了生产效率。朱 家文等用不同类型阴离子交换柱，分离纯化了重组人血清白蛋白。杨利等1 6 1 用i d a 型固定化镍离子金属螯合亲和膜色谱对人血清白蛋白的分离纯化，得到 了电泳纯的h s a 。 1 6 溶菌酶 溶菌酶( 1 y s o z y m e ) 是一种碱性蛋白质，广泛存在于禽类的卵清、哺乳动物的 眼泪、乳汁以及其它体液。某些植物如木瓜、无花果、卷心菜中也含有丰富的溶 菌酶。溶菌酶由1 2 9 个氨基酸残基排列构成单肽链，有四对二硫键，分子量为 1 4 ，3 8 8 d a ，1 9 6 5 年p h i l l i p s 及其同事用0 2 姗分辨率的x 射线结构分析法，第一 次成功地测出了溶菌酶的分子构象，为一扁长椭球体，大小为 4 5 m n 3 0 m 3 0 m 。可以用来作为消炎药，与抗菌素合用可以治疗溃疡、口腔 和鼻腔粘膜炎，也可以用作食品添加剂。工业上多采用直接结晶法以卵清为原 料生产溶菌酶。关于溶菌酶的分离和纯化方法主要有结晶法【6 2 】、离子交换法蚓 和亲和色谱法【删，龙泪等【6 5 】对这些方法的近期发展作了综述。结晶法操作简单、 成本低，适于工业化生产，但得到的产品纯度不高，不能分离微量的溶菌酶。亲和 色谱法分离溶菌酶具有较高的选择性，用溶菌酶分解胞壁的消化产物作配体制成 的亲和柱【6 ，有可能直接从蛋清中分离出溶菌酶。但由于亲和柱造价高、制作困 难、柱寿命短等缺点使其应用受到一定的限制。离子交换色谱是制备高纯度溶菌 酶最常用的方法，常用的离子交换剂有d a o l i t ec 4 6 4 、磷酸纤维素( p c ) 、羧甲基纤 维素( c m c ) 和羧甲基琼脂糖( c m s ) 等，它们对溶菌酶都有较强的吸附能力。由于 这些填料刚性小，收缩性大，再生手续麻烦，使其分离速度和效率受到影响，李蓉吲 等用高效阳离子交换色谱纯化了蛋清中的溶菌酶，得到比活为1 5 ，4 3 6 u m 2 的高 纯度溶菌酶，整个方法快速、纯化效率高，酶活性回收率高。 1 7 细胞色素c 自然界中，细胞色素c 存在于一切生物细胞里，其含量与组织的活动强度成 正比。以哺乳动物的心肌( 如猪心中含2 5 0 m g l ( g ) 、鸟类的胸肌和昆虫的翼肌含量 最多，肝肾次之，皮肤和肺中最少。 细胞色素c 是一大类天然物质，它又包括极其相似的若干种。现已对将近 1 0 0 多个生物种属，包括动物、植物、真菌、细菌等细胞色素c 的化学结构进行 了测定，研究得比较清楚。 细胞色素c 是含铁卟啉的结合蛋白质，铁卟啉和蛋白质部分比1 ：1 猪心细 胞色素c 相对分子质量1 2 ，2 0 0 d a ，酵母细胞色素c 相对分子质量1 3 ，0 0 0 d a 左 右，p i1 0 2 1 0 8 。因以赖氨酸为主的碱性氨基酸含量较多，故呈碱性。每个分子 含一个铁原子，约为相对分子质量的0 4 3 ，细胞色素c 特别适用于因组织缺氧 引起的一系列疾病如一氧化碳中毒、安眠药中毒、初生儿假死、心肌梗塞等。 不同原料提取的细胞色素c ，在结构、组成、相对分子质量、含铁量和p i 等方面可有不同。有趣的是不同种属生物的细胞色素c 的1 0 4 个氨基酸组成比 较表明，人与大猩猩没有差异，人与猴有一处差异，人与鸡有1 3 处差异，人与 酵母有4 4 处差异。见表l 一1 表1 1 不同生物与人的细胞色素c 相比较的氨基酸差异数目 生物名称与人不同的氨基酸数目生物名称与人不同的氨基酸数目 黑猩猩o响尾蛇1 4 恒河猴1海龟1 5 兔9金枪鱼2 l 袋鼠1 0狗鱼2 3 鲸1 0小蝇2 5 牛、猪、羊1 0蛾3 l 狗 1 l 小麦3 5 驴1 1粗糙链孢霉4 3 马1 2酵母4 4 鸡1 3 细胞色素c 干燥、热和酸稳定，目前临床应用的注射用细胞色素c 主要是 从猪心中分离纯化的制品。其技术路线为： ( 原料处理)( 提取、压滤)( 中和吸附) 1 新鲜猪心i ! 坠堡宣i 剖兰坚鲨ij 墅警 l 一 ( 洗脱)( 盐析)( 浓缩1 厂聂雨荔1 婪丝鹳l 吸脱液i 业出趣叫滤液 _ 兰骘 l 一 一相对密度为1 2 l _ l2 3 一( 透析) ( 吸附)( 沈脱1 陌i 卜塑虾磊磊磊 竺当冈竺竺譬 网马陌磊习一际磊稠 目前，细胞色素c 主要采用上述技术路线进行生产。袁艺【6 8 】采用与上述方法 类似的工艺，纯化了辅酶q l o ，并且联产细胞色素c ，每千克猪心可以得到1 0 0 m g 细胞色素c 。武龙6 9 1 采用2 2 6 型弱酸性阳离子树脂和葡聚糖凝胶g - 7 5 层析柱组 合的方法，制得了a 5 5 0 r e d a 2 8 0 值高达1 2 8 的高纯度细胞色素c 。何炳林制 备了一种微多相聚氨酯大孔树脂对细胞色素c 的吸附进行了研究，由于聚氨酯大 孔树脂中小的分散相微区同样是疏水性的，周围则是亲水性的连续相，这一结构与 细胞色素c 环状的亲水疏水结构相对应，故有很高的吸附率。适合于从混合溶液 中提取细胞色素c 。 1 8 仪淀粉酶 淀粉酶是一类能分解淀粉糖苷键的酶类总称或称淀粉水解酶。包括有d 一淀粉 酶，0 【淀粉酶等，水解产物为麦芽糖、糊精和少量葡萄糖，在微生物制剂中，淀粉 酶是最重要的一种，生产历史长，用途最广，也是我国目前产量最大的一种酶。 0 【一淀粉酶也称淀粉l ，4 糊精酶，是能够切开a 1 ，4 糖苷键的内切酶，不能水 解淀粉分支点上的0 c 一1 ，6 糖苷键和分支点附近的a 一1 ，4 糖苷键，但可以超越a 一1 ，6 糖苷键而作用于a 1 ，4 一糖苷键，其水解产物除麦芽糖和少量葡萄糖外，还可产生 a l ，6 键的寡糖。由于作用于淀粉分子内部的a 1 ，4 键，将长链的淀粉水解成短链 的糊精，使黏稠的淀粉糊液化，又称液化性淀粉酶。 c c - 淀粉酶主要是由芽孢杆菌中的枯草芽孢杆菌、马铃薯芽孢杆菌、嗜热芽孢 杆菌等微生物产生，但不同菌株产生的淀粉酶，其耐热性、最适p h 值、对淀粉 的水解程度以及产物的性质等均有差异。彭清忠等建立了短短芽孢杆菌建立 分泌表达系统来生产a 淀粉酶，钟穗生等详细研究了酸度、温度、c a 2 + 对枯草 杆菌d - 淀粉酶活性的影响，研究确立了酶一步失活模型，指出p h 值对酶活力影响 较大，最适作用温度随底物种类及其浓度而异。0 【淀粉酶的纯化方法主要有离子 交换色谱7 3 ，7 4 1 和亲和色谱7 5 7 6 】，李华儒等首次合成一种硅胶基质的具有对a 一淀 粉酶特异性吸附的亲和色谱介质，分离纯化工业o 【一淀粉酶。k a t o 等曾用高效疏 水色谱纯化了粗品，回收率为9 0 。王林海【7 9 】用疏水吸附法和d e a e c e l l u l o s e 分离纯化，得到活力为1 1 0 0 0 u g ，活性回收率约8 0 。白泉高效疏水色谱对 脲变一淀粉酶的折叠中间体进行了研究，发现其至少有1 9 个中间体，并且用离 子交换色谱和排阻色谱进行了证明。 参考文献 1 e t t r els ，z l a t k i sa ，7 5y e a r so fc 1 1 r o m a t o g r a p h y - ah i s t o r i a ld a l o g u e ，e l s e v i e r s c i e n t i f i cp u b i l i s h i n gc o m p a n y ，1 9 7 9 ，p 2 4 2 耿信笃，现代分离科学理论导引，西北大学出版社，1 9 9 0 3 e 1 v i n gp j ，g r u s h k ae a | 1 dk o l t h o f ri m ，t r e a t i s eo na n a l ”i c a lc h e m i s t p a n i t h e o r va n dp r a c t i c e 2 n qe d 、，0 1 5 j o h na i l ds o n s n e w y 0 r k 4 l a d i s c hm s ，w i l s o nr c ，p a i n t o nc c ，a n db u i l d e rs e ，p r o t e i np u r i n c a t i o n f r o mm 0 1 e 砌甜m e c h a n i s m st ol a r g e s c a l ep r o c e s s e s ，a c ss y m p o s i u ms e r i e s4 2 7 ， a m e r i c a nc h e m i c a ls o c i e t y ，w a s h i n 昏o n ；d c1 9 9 0 5 师圣贤，王俊德，生物大分子的液相分离和制备，科学出版社，1 9 9 9 6 傅献彩，沈文霞，姚天扬，物理化学( 下册，第四版) ，高等教育出版社，北京， 1 9 9 0 7 g u i o c h o ng ，g o l s h a n s h i r a z is ，k a t t ia ，f u n d 蛐e n t a l so fp r e p a r a t i v ea n d n o n l i n e a rc h r o m a t o g r a p h y a c a d e m i cp r e s s ，b o s t o n ，m a ，1 9 9 4 8 g e n gx d ，r e g n i e rfe ，j c l l r o m a t o 站，1 9 8 4 ，2 9 6 ：1 5 3 0 9 g e n gx d ，r e g n i e rf e ，j c h o m a t o g l ，1 9 8 5 ，3 3 2 ：1 4 7 1 0 耿信笃，中国科学( b 辑) 1 9 9 5 ，2 5 ( 4 ) ：3 6 4 3 7 1 1 1 u n g e rk k ，a n a l c h e m ，1 9 8 3 ，5 5 ( 3 ) ：3 6 1 1 2 b e n s o nj r e ta 1 ，j c b f o m a t o 叠r s c i ，1 9 8 4 ，2 2 ( 9 ) ：3 8 6 1 3 h a l ( yj e e ta 1 ，j c 1 1 r o m a t o g r ，1 9 9 7 ，5 4 1 ：3 0 3 3 1 5 1 4 h a k yj e e ta 1 ，j l i q u i dc h r o m a t o 瓯1 9 9 2 ，1 5 ( 1 1 ) ：1 8 3 1 1 8 5 2 1 5 t h e d i n g e re ta 1 ，j c h m m a t o 盯，1 9 9 0 ，5 3 5 ：1 1 1 1 2 5 1 6 1 如j e ta 1 ，j c l m ) m a t o g r 1 9 9 3 ，6 3 1 ：9 1 1 0 6 1 7 y uj e ta 1 ，j l i q u i dc 1 1 r o m a t o 甄1 9 9 3 ，1 6 ( 1 4 ) ：2 9 3 1 2 9 5 9 1 8 砌g n e ym p e ta 1 ，j c 1 1 r o m a t o g r ，1 9 8 9 ，4 8 4 ：2 7 3 2 9 1