（预防兽医学专业论文）猪Ⅲ型干扰素ifnλ1的克隆、表达和抗病毒活性研究.pdf

华中农、lk 大学学位论文独创性声明及使用授仪 t i l l l l ：i i h l 7 h i l 9 f l i f 1 9 l l 8 i i h 8 i t t l l l 。t l l l l l 。化论文 地书保衔 否 如需保密，解密时间年月臼 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 约学位或证书而使用过的材料，指导教疖对此进行了审定。与我一间工作的同志 对本研究所做的壬何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：起( ： 伟 时间：如l 。年月7 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必 须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表传播学位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作裕名：匙付伟 钠始考多，享 签名日期：加7 。年f 月7 日 签名日期：汐( 年易月 7 匠 猪i i i 型干扰素i f n z i 的克隆、表达和抗病毒活性研究 目录 摘要1 a b s t r a c t 3 缩略语表( a b b r e v i a t i o n ) 5 第l 章文献综述。7 1 1 干扰素简介7 1 2i i i 型干扰素的分子结构和编码蛋白7 1 3i i i 型干扰素的产生和调节8 1 4i i i 型扰素的受体9 1 5i i i 型扰素的受体和信号转导9 1 6i i i 型扰素的生物功能1 0 1 7 重组蛋白表达系统简述。1 0 第2 章研究目的和意义。1 4 第3 章材料与方法1 5 3 1 试验材料15 3 1 1 毒株、细胞与菌株1 5 3 1 2 载体与质粒15 3 1 3 工具酶及主要试剂j 1 7 3 1 4 培养基与抗生素及其配制1 7 3 1 5 主要缓冲液与相关试剂及其配制1 8 3 2 试验方法2 0 3 2 1 猪外周血单核细胞( p b m c ) 的分离及诱导培养。2 0 3 2 2 猪p b m c 总r n a 的提取2 0 3 2 3r t - p c r 扩增p o l f n 一九l 2 0 3 2 4r t - p c r 产物或酶切产物的电泳检测2 l 3 2 5p c r 产物或酶切产物回收与纯化2 2 3 2 6 外源d n a 片段与克隆质粒载体的连接反应2 2 3 2 7 大肠杆菌感受态细胞的制备( 氯化钙法) 2 3 3 2 8 连接产物的转化。2 3 3 2 9 质粒的制备与鉴定。2 3 3 2 1 0p o l f n 一九l 的原核表达。2 5 3 2 1 lp o l f n 九1 多克隆抗体的制备2 7 3 2 1 2p o l f n 一九l 的真核表达2 7 3 2 1 3 表达产物的w e s t e r nb l o t 检测2 9 3 2 1 4e l i s a 试验3 0 3 2 1 5 半数细胞培养物感染量( t c i d 5 0 ) 的测定3 0 3 2 1 6p o l f n z i 生物学活性的测定3l 3 2 17p o l f n - z , i 抗p r r s v 、p r v 作用3l 第4 章结果与分析3 2 4 1p o l f n 九l 的扩增及序列分析3 3 4 1 1p o l f n 九l 基因的扩增3 3 i 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 4 1 2p o i f n k l 的核苷酸序列和氨基酸序列3 4 4 1 3p o l f n - m 的氨基酸进化树分析3 4 4 2p o l f n 一九l 原核表达3 5 4 2 1p o l f n k l 原核表达质粒的构建3 5 4 2 2 融合蛋白的诱导表达3 6 4 2 - 3 融合蛋白的可溶性分析3 6 4 2 4 融合蛋白的w e s t e r nb l o t 检测及抗病毒活性测定3 7 4 2 5p o l f n 一九l 多克隆抗体的制备3 8 4 3p o l f n 一九1 真核表达3 8 4 3 1p o l f n - 九l 真核表达质粒的构建3 8 4 3 2p o l f n - m 真核表达产物的w e s t e r nb l o t 检测及抗病毒活性测定3 9 4 4p o l f n - 九1 对p r r s v 和p r v 的抑制作用4 0 4 4 1p o l f n - m 对p r r s vc h - l a 增殖的影响4 0 4 4 。2p o l f n 一九1 对p r r s vw u h 3 增殖的影响4 l 4 4 3p o l f n - 九1 对p r ve a 株增殖的影响一4 2 第5 章讨论与结论一4 4 5 1 讨论4 4 5 1 1 猪i 型干扰素i f n 九i 的克隆及序列分析4 4 5 1 2 猪i i i 型干扰素i f n 一九1 的原核表达4 5 5 1 3 猪i i i 型干扰素i f n - m 的真核表达4 6 5 1 4 猪i 型干扰素i f n x l 对p r r s v 和p r v 抑制作用4 6 5 2 结论4 7 参考文献4 8 致 谢5 4 i i 猪i i i 型干扰素i f n 九l 的克隆、表达和抗病毒活性研究 摘要 干扰素( i n t e r f e r o n ，i f n ) 是一类具有抗肿瘤、广谱抗病毒和增强免疫功能的细 胞因子。根据其生物学活性和抗原活性的不同分为三类：i f n 一仅、i f n b 、i f n 吖，并 将具有共同表面受体的i f n 0 【和i f n 1 3 归属于i 型干扰素；而与i f n a 、i f n 1 3 具有 不同表面受体的i f n - ) , 归属于i i 型干扰素。i i i 型干扰素则是2 0 0 3 年首次报道的一类 不同于i 型干扰素和i i 型干扰素的新家族，又称为九干扰素，包括i f n 九1 、i f n 尥、 i f n x 3 ，由于其基因结构与i l 1 0 相似，所以又称为i l 2 9 、i l 2 8 a 、i l 2 8 b 。这种 新型的干扰素和其他的干扰素一样具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物学活性。 i 型和i i 型干扰素已被广泛应用于人医临床多种疾病的治疗，而对于i i i 型干扰素的 研究相对滞后，因此，开展对i 型干扰素研究无论是对动物传染病的控制还是对人 医疾病的治疗都将起到一定的促进作用。鉴于此，本研究以猪i i i 型干扰素i f n 九1 为 研究对象，开展了其对猪繁殖与呼吸综合征病毒抗病毒活性的研究，主要研究内容 包括： 1 猪型干扰素i f n - k l 基因的克隆与序列分析 以猪外周血淋巴细胞中提取的总r n a 为模板，p o i f n 九1 f 2 、p o i f n 九1 r 2 兼 并引物为上下游引物，r t - p c r 扩增获得p o i f n 九1 基因，片段大小为5 7 6 b p ，序列 分析发现与g e n b a n k 登录的人i f n 九1 的核苷酸序列同源性为7 6 1 2 ，氨基酸序列 同源性为6 9 1 5 。s i g n a l p 3 0s e r v e r 软件分析p o l f n 九l 的氨基酸序列，发现前1 9 个氨基酸构成了p o i f n 九l 的信号肽。 2 猪型干扰素i f n - g l 的原核表达 设计引物扩增去除信号肽的p o i f n 九1 片段，e c o ri 、x h oi 酶切后插入原核表 达载体p e t - 2 8 a ( + ) ，获得原核表达质粒p e t - p o i f n 九l ，转化宿主菌b l 2 1 ，i p t g 诱 导，s d s p a g e 分析证实p o i f n 九1 与h i s 融合表达，并主要以不溶性包涵体形式存 在，大小约为2 3 k d a 。将表达产物变性、复性、透析和纯化处理后，利用m d b k v s v ( 水泡性口炎病毒) 微量细胞病变抑制法测定其抗病毒活性，结果原核表达产物的 生物活性为1 8 1 0 3u m g 。 3 猪型干扰素i f n - k l 多克隆抗体的制备 以原核表达产物为抗原免疫新西兰兔制备了兔抗p o i f n 九l 的多克隆抗体， e l i s a 检测血清抗体效价为1 ：3 2 0 。将此血清和抗h i s 单克隆抗体分别作为一抗， 通过w e s t e r nb l o t 检测p o i f n 九l 的原核表达产物，结果均在约2 3 k d a 处出现特异性 反应带，说明血清中存在p o i f n 九l 的抗体，同时也说明p o i f n 九1 与h i s 的融合表 达成功，并具有反应原性。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 4 猪型干扰素i f - k l 的真核表达 构建真核表达质粒p c d n a p o l f n 九1 ，转染p k 1 5 细胞，于转染后2 4 h 、4 8 h 、 7 2 h 收集上清，以p o l f n 一九l 的多克隆抗体为一抗，w e s t e r nb l o t 检测发现转染后不同 时间p o l f n l 1 均有表达，但以转染后4 8 h 的表达量最高。进一步以m d b k v s v 微 量细胞病变抑制法测定转染后4 8 h 上清的抗病毒活性，生物活性为2 3 1 0 3u m l 。 5 猪型干扰素i f n a l 对p r r s v 和p r v 的抑制作用 p o l f n k l 原核表达产物以5 0 u m l 、1 0 0 u m l 、1 5 0 u m l 、2 0 0 u m l 预处理s j p l 细胞2 4 h ，分别接种p r r s vc h 1 a 、w u h 3 毒株，于接种后1 2 h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 收 集细胞悬液，r e a l t i m ep c r 和t c i d s o 检测病毒的增殖情况，结果发现p o l f n 九l 能明显抑制两种不同毒株m r n a 的表达和病毒增殖的滴度，并且对c h 。l a 株的抑制 效果优于w u h 3 株，但对两种毒株的抑制均呈剂量和时间的依赖性。 为了研究p o l f n 九1 对p r v 增殖的影响，以p o l f n - m 原核表达产物处理p k 1 5 细胞，接种p r v 进行空斑检测，结果随着p o l f n l 1 剂量的增加p r v 形成的空斑数 逐渐减少，说明p o l f n l 1 也能抑制p r v 的增殖，并呈剂量依赖性。 关键词：猪i i i 型干扰素；p o l f n 九1 ；猪繁殖与呼吸综合征病毒；伪狂犬病毒； 表达；抗病毒 2 猪i i i 型干扰素i f n 九l 的克隆、表达和抗病毒活性研究 a b s t r a c t i n t e r f e r o n s ( i n t e r f e r o n ，i f n ) a r eac l a s so fe y t o k i n e st h a t h a v eb r o a d s p e c t r u m a n t i - v i r a l ，a n t i - t u r n o ra n de n h a n c i n gi m m u n ef u n c t i o n a c c o r d i n gt oi t sb i o l o g i c a la c t i v i t y a n da n t i g e n i c i t y , i n t e r f e r o n sa r ed i v i d e di n t ot h r e eg r o u p s ：i f n 一位，i f n - p ，i f n 吖i f n - a a n di f n - ph a v eac o m m o ns u r f a c er e c e p t o ra n db e l o n gt ot y p eii n t e r f e r o n ；i f n - 7h a s d i f f e r e n ts u r f a c er e c e p t o r sw i t hi f n 一伐，i f n pa n db e l o n gt ot y p ei i i n t e r f e r o n t y p ei i i i n t e r f e r o n ，an e wi n t e r f e r o nf a m i l y , w a sf i r s tr e p o r t e di n2 0 0 3a n dd i f f e r e n tf r o mt h et y p e ia n di ii n t e r f e r o n i tw a sa l s ok n o w na s 九i n t e r f e r o n ，i n c l u d i n gi f n - k l ，i f n l 2 ，i f n l 3 b e c a u s e 九i n t e r f e r o ng e n es t r u c t u r ei ss i m i l a rw i t hi l - 10 ，s oa l s ok n o w na si l 一2 9 ，i l - 2 8 a ， i l 2 8 b t h i sn e wt y p eo fi n t e r f e r o n ，l i k eo t h e ri n t e r f e r o n s ，h a sa n t i - v i r u s ，a n t i - t u m o ra n d i m m u n e r e g u l a t o r yb i o l o g i c a la c t i v i t i e s t y p ei a n di ii n t e r f e r o nh a v eb e e nw i d e l yu s e d i nt h ec l i n i c a lt r e a t m e n t 、i t hm a n yd i s e a s e s ，b u tt h er e s e a r c ho nt y p ei i ii n t e r f e r o ni s l a g g e db e h i n d s ot h er e s e a r c ho nt y p ei i ii n t e r f e r o nw i l lp l a ya r o l ei np r o m o t i n gt h e c o n t r o lo f a n i m a ld i s e a s e sa n dm e d i c a lt r e a t m e n to fh u m a nd i s e a s e i nv i e wo ft h i s ，i nt h i s s t u d y , w ec h i e f l ys t u d i e dp o r c i n et y p ei i i i n t e r f e r o ni f n x la n dc a r r i e do u ti t sa n t i v i r a l a c t i v i t yt op o r c i n er e p r o d u c t i v ea n dr e s p i r a t o r ys y n d r o m ev i r u s ( p r r s v ) 1 1 1 em a i n c o n t e n t si n e h d e ： 1 c l o n i n ga n ds e q u e n c ea n a l y s i so fp i gt y p e i n t e r f e r o ni f n - x l t h et o t a lr n aa sat e m p l a t ew a se x t r a c t e df r o mp i gp e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a r c e l l s ( p b m c ) ，r t - p c rw a sp e r f o r m e du s i n gp r i m e r sp o l f n - a i f 2a n dp o l f n l 1 一r 2 ，a s u p s t r e a ma n dd o w n s t r e a mp r i m e r s ，t oa m p l i f yp o l f n x la n dg e n ef r a g m e n ts i z e i s5 7 6 b p s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tp o l f n x lh a dan u c l e o t i d es e q u e n c eh o m o l o g ya sh i g ha s 7 6 12 c o m p a r e dw i t hh u m a ni f n x l r e g i s t e r e di n g e n b a n ka n dt h ea m i n oa c i d s e q u e n c eh o m o l o g yw a s6 9 15 a n a l y s i so ft h ep o l f n - x la m i n oa c i ds e q u e n c eb yt h e s i g n a l p3 0s e r v e rs o f t w a r ep r e d i c t e dt h a tt h ef i r s t 19a m i n oa c i d se n c o d e das i g n a l p e p t i d es e q u e n c e 2 t h ee x p r e s s i o no fp i gt y p e i n t e r f e r o ni f n - l 1i ne c o l i p r i m e r sw e r ed e s i g n e dt or e m o v et h es i g n a lp e p t i d e c o d i n gs e q u e n c eb yp c r t h ep c rp r o d u c tw a si n s e r t e di n t op r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 2 8 a ( + ) ，a f t e r v e r i f i c a t i o nb yd i g e s t i o nw i t he c o ri ，x h oi ，t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t - p o l f n x l w a so b t a i n e d ，a n dt r a n s f o r m e di n t oh o s ts t r a i nb l 21 t h ee x p r e s s i o nw a si n d u c e db y i p t g , a n ds d s p a g ea n a l y s i sc o n f i r m e dt h a t p o l f n - x lf u s e dw i t hh i st a gw a se x p r e s s e d ， a n dt h ef u s i o np r o t e i nw a se s s e n t i a l l yp r e s e n ti ni n s o l u b l ei n c l u s i o nb o d i e s ，w i t ht h e s i z e a b o u t2 3 k d a t h ee x p r e s s i o nw a sd e n a t u r e d ，r e n a t u r e d ，d i a l y s e da n dp u r i f i e d ，a n d 3 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 t h e nm d b k v s v ( v e s i c u l a rs t o m a t i t i sv i r u s ) m i c r o - c y t o p a t h i ce f f e c ti n h i b i t i o nm e t h o d w a su s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fi t sa n t i v i r a la c t i v i t y t h eb i o a c t i v i t yo fp r o k a r y o t i e e x p r e s s i o np r o d u c t sw a s1 8x1 0 su m g 3 t h ep r e p a r a t i o no fp o l u c l o n a la n t i b o d ya g a i n s tp i gt y p e i n t e r f e r o ni f n - x l t h ep r o k a r y o t i ele x p r e s s i o np r o d u c tw a su s e da sa n t i g e nt oi m m u n i z ear a b b i t ，a n d r a b b i ta n t i - p o l f n l 1p o l y c l o n a la n t i b o d yw a sp r o d u c e d e l i s at e s ts h o w e dt h a ti t s a n t i b o d yt i t e rr e a c h e d l ：3 2 0 t h i ss e r u ma n da n t i - h i s 6a n t i b o d yw e r eu s e da sp r i m a r y a n t i b o d yt od e t e c tp o l f n - x lp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o np r o d u c tb yw e s t e r nb l o t ，t h er e s u l t s s h o w e di nt h es i z eo fa b o u t2 3 k d ab o t ha p p e a r r e dt h es p e c i f i cr e a c t i o np r o t e i nb a n d t h i s s h o w st h a tt h ep r e p a r e dp o l y c l o n a la n t i b o d yh a si f n - l 1 a n t i b o d y , a n di l l u s t r a t e st h e f u s i o ne x p r e s s i o no fp o l f n l1a n dh i s 6 4 t h ee u k a r y o t i ce x p r e s s i o no fp i gt y p e i n t e r f e r o ni f n l i e u k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i dp c d n a - p o l f n z , 1w a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f e c t e d i n t op k - l5c e l l s ，t h e n2 4 h ，4 8 h ，7 2 ha f t e rt r a n s f e c t i o n ，t h es u p e r n a t a n tw a sc o l l e c t e d r e s p e c t i v e l y w e s t e r nb l o tr e v e a l e dt h a tt h eh i g h e s te x p r e s s i o nl e v e lw a sr e a c h e da t4 8 h a f t e rt r a n s f e c t i o n w eu s e dm d b 刖s vc p ei n h i b i t i o nm e t h o dt od e t e c t t h ea n t i v i r u s a c t i v i t yo fs u p e m a t a n tc o l l e c t e da t4 8 h ，a n di tw a ss h o w nt h a tb i o l o g i c a la c t i v i t yw a s2 3 1 0 3u m l 5 p i gt y p e1 i ii n t e r f e r o ni f n 一九1i n h i b i t sp r r s vc h l a 。w u h 3a n dp r vs t r a i n s s j p lc e l l sw e r ep r e t r e a t e dw i t h5 0 u m l ，10 0 u m l ，15 0 u m l ，2 0 0 u m lp o l f n x l p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o np r o d u c t so r2 4 h ，t h e ni n f e c t e dw i t hp r r s vc h 1aa n dw u h 3 s t r a i n s s u p e r n a t a n tw e r ec o l l e c t e da t12 h ，2 4 h ，3 6 h ，4 8 hr e s p e c t i v e l ya n dr e a l t i m ep c r a n dt c i d 5 0w e r ep e r f o r m e dt od e t e c tt h ep r o l i f e r a t i o no ft h ev i r u s t h er e s u l t ss h o w e d t h a t p o l f n - l 1w a sa b l et os i g n i f i c a n t l yi n h i b i tt h em r n a e x p r e s s i o na n dt h et i t r eo fv i r a l r e p l i c a t i o no ft h et w os t r a i n s ，a n dt h ei n h i b i t i o ne f f e c to nc h la i sb e t t e rt h a no nw u h 3 n ea n t i v i r a le f f e c to fp o l f n 一九lp r e s e n t e dad o s ea n dt i m e d e p e n d e n tm a n n e r i no r d e rt o s t u d yt h ea f f e c to fp o l f n - x lo np r vp r o l i f e r a t i o n ，i nt h i ss t u d y p o l f n xl p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o np r o d u c t sw e r eu s e dt op r e t r e a tp k - 15c e l l s ，w h i c h w e r e t h e ni n o c u l a t e dw i t hp r v p l a q u er e d u c t i o ne x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tp r vp l a q u e w a s g r a d u a l l yd e c r e a s e d 、v i mt h ed o s ei n c r e a s i n g ，i n d i c a t i n gp o l f n 一九li n h i b i t e dt h ep r v p r o l i f e r a t i o ni nad o s e - d e p e n d e n tm a n n e r k e yw o r d s ：p i gt y p eh ii n t e r f e r o n ；p o l f n - 九l ：p o r c i n er e p r o d u c t i v ea n dr e s p i r a t o r y s y n d r o m ev i r u s ；p s e u d or a b i e sv i r u s ；a n t i v i a l ；e x p r e s s i o n 4 猪i i i 型干扰素i f n - 九l 的克隆、表达和抗病毒活性研究 5 华中农业大学2 0 1 0 届硕上学位论文 n cn i t r o c e l l u l o s ef i l t e r硝酸纤维素滤膜 n t o d p a g e p b m c p b s p c r p k 1 5 p r r s v p o l f n 一九 p r v r m i n r e r t - p c r s d s p a g e s e e ，m i n ，h s j p l s t a t t e m e d t c i d 5 0 v s v u l a g ，m g ，g l ，m l ，l n u c l e i ca c i d o p t i c a ld e n s i t y p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l s p h o s p h a t eb u f f e r ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p r r sv i r u s p o r c i n ei n t e r f e r o n 1 a m b d a p s e u d o r a b i e sv i r u s r o t a t i o np e rm i n u t e r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e r e v e r a s et r a n s c r i p tp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s o d i u m d o d e c y l s u l p h a t e p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s s e c o n d ，m i n u t e ，h o u r s i g n a lt r a n s d u c e ra n da c t i v a t o r s t e t r a m e t h y le t h y l e n e d a m i n e 5 0p e r c e n tt i s s u ec u l t u r ei n f e ：c t i v ed o s e v e s i c u l a rs t o m a t i t i sv i r u s u n i t m i c r o g r a m ，m i l l i g r a m ，g r a m m i c r o l i t e r , m i l l i l i t e r , l i t e r 核苷酸 光密度 聚丙烯酰胺凝胶电泳 外周血单核细胞 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 猪肾细胞 猪繁殖与呼吸综合征病 毒 猪九干扰素 伪狂犬病病毒 每分钟转速 限制性内切酶 反转录聚合酶链反应 十二烷基磺酸钠聚丙 烯酰胺凝胶电泳 秒钟，分钟，小时 猪肺上皮细胞 转录激活因子 四甲基乙二胺 组织培养半数感染量 水泡性口炎病毒 单位 微克，毫克，克 微升，毫升，升 6 猪i i i 型干扰素i f n 九l 的克隆、表达和抗病毒活性研究 1 1 干扰素简介 第1 章文献综述 1 9 5 7 年，i s a a c sa 与l i n d e m a n nj 发现鸡胚尿囊膜能在热灭活流感病毒的作用下， 产生一种可溶性糖蛋白，进而干扰活流感病毒的繁殖，将其命名为干扰素 ( i n t e r f e r o n ，i f n ) ( i s a a c sa ，l i n d e n m a n nj ，1 9 5 7 ) 。干扰素具有抑制肿瘤形成、抗病 毒、免疫调节和调节细胞生长( s a m u e l ，2 0 0 1 ；s e n ，2 0 0 1 ；d o m i n g u e z ，2 0 0 6 ) 等多种 生物学功能，但这些生物学功能要依靠细胞中功能基因转录和多种信号传导通路的 开放的相互协同作用才能正常发挥( a v e n d a n o ，2 0 0 6 ) 。 干扰素根据其生物学活性和抗原活性分为三类：第一类是由病毒诱导白细胞产 生的0 【干扰素( i f n a ) ；第二类是由病毒诱导纤维母细胞产生的p 干扰素( i f n d ) ， 与a 干扰素( i f n n ) 具有共同的表面受体，都属于i 型干扰素；第三类是由病毒诱 导淋巴细胞产生的y 干扰素( i f n - ) , ) ( h a u s ，2 0 0 0 ) ，与a 干扰素( i f n 0 【) 、b 干扰素 ( i f n 1 3 ) 的表面受体不同，属于i i 型干扰素。 2 0 0 3 年1 月，s h e p p a r d 等人运用反向生物学原理，鉴定出了一组新型的白细胞介 素i l 2 8 a 、i l 2 8 b 和i l 2 9 ( s h e p p a r dpe ta 1 ，2 0 0 3 ) 。它们是由一些病毒或d s r n a 活 化外周血单核细胞( p b m c ) 、h e l 卿树突状细胞( d c ) 等多种细胞而产生的一组新 型细胞因子。由于基因结构与i l 1 0 家族相似，但氨基酸水平上与干扰素更相似， k o t e n k o 等将它们也相应的称为i f n k l ( i l 2 9 ) 、i f n k 2 ( i l 一2 8 a ) 和i f n k 3 ( i l 2 8 b ) ( k o t e n k osve ta 1 ，2 0 0 3 ) 。d u m o u t i e rl 等在对其信号转导途径、受体及生物学功能 进行进一步的研究后，将他们定名为i i i 型干扰素家族( d u m o u t i e rle ta 1 ，2 0 0 4 ) ，又 称九干扰素家族。 1 2 i 型干扰素的分子结构和编码蛋白 干扰素家族由i 型干扰素家族( n 和d 干扰素家族) 、i i 型干扰素家族( y 干扰 素家族) 和新发现的i i i 型干扰素家族组成。人类的i 类干扰素由至少1 3 种i f n a ( 亚 型i f n a l 、i f n a 2 、i f n a 3 等；亚亚型i f n a 1 a 、i f n a 1 b 、i f n a 1 c 或i f n a 2 a 、i f n a 2 b 、 i f n a 2 c 等) 、一种i f n d 、i f n 扒i f n 1 c 和l i m i t i o n 组成，其基因全部定位在9 号 染色体( l a f l e u rdw e ta 1 ，2 0 0 1 ；o r i t a n ike ta 1 ，2 0 0 0 ) 。人的l i 型干扰素只有1 个成 员，即i f n y ，基因定位在1 2 号染色体。 人类的i i i 型干扰素家族三个基因都定位于1 9 号染色体上，而小鼠i i i 型干扰素家 族只包括i f n l 2 和i f n x 3 两个基因( b a r t l e t tnw e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。与i 型干扰素基因只 有1 个外显子不同的是：人类的i i i 型干扰素家族的i f n 九1 基因含有4 个内含子和5 个外 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 显子，基因长约2 5 k b ；i f n 尥和i f n 一地基因都含5 个内含子和6 个外显子，基因长约 2 k b ( s h e p p a r dp e ta 1 ，2 0 0 3 ；k o t e n k osv e ta 1 ，2 0 0 3 ) ，这与i l 一1 0 家族基因非常相似， 两者都含有多个