（物理化学专业论文）荷叶活性成分的提取及对脂肪酶抑制的研究.pdf

上海大学硕士学位论文 摘要 荷叶为睡莲属植物莲( n e l u m b on u c i f e r ag a e r t n ) 的干燥叶片，我国南北方 均有栽培，是一种既是食品又是药品的天然植物原料，其中含有生物碱及黄酮类 化合物等多种功能成分。多年的临床经验表明：荷叶具有降脂减肥功效，其主要 活性成分为黄酮和生物碱类物质。目前其降脂减肥的机理还不十分清楚。本文旨 在研究荷叶总生物碱及黄酮类化合物对脂肪酶的抑制作用及机理，探讨其提取工 艺并进行含量测定。 1 荷叶黄酮类化合物的提取分离。实验采用乙醇为溶剂提取荷叶黄酮类化 合物，结果显示6 0 乙醇的提取效果优于9 5 乙醇。使用经典聚酰胺柱层析对 提取物进行纯化，定性实验显示纯化后的提取物中主要为黄酮类物质，可能含有 少量皂甙。以芦丁为对照品，分光光度法测定提取物中总黄酮含量为7 1 1 1 ， 荷叶中总黄酮的含量为2 6 7 。 2 荷叶总生物碱的提取。实验采用9 5 乙醇及p h 3 4 盐酸水溶液作为荷叶 总生物碱的提取溶剂。实验结果显示，9 5 7 , 醇提取物得率比酸水提取物得率略 高，而且乙醇提取物对脂肪酶的抑制作用大于酸水提取物。定性实验显示，提取 物中主要为生物碱类物质，同时还含有少量葸醌类。以荷叶碱为对照品，分光光 度法测得乙醇提取物中总生物碱含量为4 0 1 ，在荷叶中占o 4 4 。 3 荷叶总生物碱及黄酮类化合物对脂肪酶的抑制作用。采用体外酶抑制法 研究了荷叶总生物碱及黄酮类化合物对脂肪酶的抑制作用。结果表明：荷叶总生 物碱及黄酮类化合物对脂肪酶都有一定的抑制作用，且生物碱对脂肪酶的抑制效 果比黄酮显著。首次研究了荷叶总生物碱对脂肪酶的抑制类型及作用机理。研究 结果表明抑制剂并不直接与酶分子作用，而是间接改变底物乳化液来阻碍底物与 酶的结合，从而达到抑制作用。d i x o n 图和l i n e w e a v e r - b u r k 图的特征表明，荷 叶总生物碱对胰脂肪酶的抑制呈非竞争性抑制。 关键词：荷叶，黄酮，生物碱，脂肪酶 v 上海大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h el e a fo f n e l u m b oh “c i f e r ag a e r t n w h i c hi sc a l l e dl o m sl e a fi sw i d e s p r e a di n o n rc o t m t r y i ti sak i n do f n a t u r a lp l a n tm a t e r i a lu s e db o t hi nf o o da n dm e d i c i n ef i e l d i tc o n t a i n ss o m ef u n c t i o n a l c o m p o n e n t ss u c h a sa l k a l o i d sa n df l a v o n o i d s t h e e x p e r i e n c eo fm a n yy e a r ss h o w st h a tl o t u sl e a fh a st h ef u n c t i o no fw e i g h tr e d u c t i o n a n dd e c o m p r e s s i o n ，a n di t sa c t i v ec o m p o s i t i o n sa r ea l k a l o i d sa n df l a v o n o i d s a t p r e s e n t ，i t sm e c h a n i s mo fw e i g h tr e d u c t i o na n dd e c o m p r e s s i o ni sn o tc l e a r s o ，m y r e s e a r c hf o c u s e so nt h ee x t r a c t e dm e t h o d s ，q u a n t i t a t i v em e a s u r e m e n t s ，a n dt h e i n h i b i t o r ym e c h a n i s mo f t h el i p a s ei n h i b i t o r sd e r i v e df r o ml o t u sl e a f 1 _ t h ee x t r a c t i o no ff l a v o n o i d si nl o t u sl e a f t h ef l a v o n o i d sw e r ee x t r a c t e di n a l c o h o ls y s t e m s ，a n dt h ee x t r a c t i n gr a t eo f6 0 a l c o h o lw a sb e t t e rt h a nt h a to f9 5 a l c o h 0 1 t h ee x t r a c t i o nw a s p u r i f i e db yp o l y a m i d ec o l u m nc i m a t o g r 印h y q u a l i t a t i v ee x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tf l a v o n o i d sw e r et h em a i n l yc o m p o n e n t si nt h e e x t r a c t i o na n d m a y b et h e r e w e r es o m e g i n s e n o s i d e s i ni t m e a s u r e d b y s p e c t r o p h o t o m e t e ru s i n gr u t i na sc o m p a r i s o n ，t h ec o n t e n to ff l a v o n o i d si nt h e e x t r a c t i o nw a s7 1 1l ，a n di nl o t u sl e a f i tw a s2 6 7 2 t h ee x t r a c t i o no fa l k a l o i d si nl o t u sl e a f t h ea l k a l o i d sw e r ee x t r a c t e di n9 5 a l c o h o la n dw a t e rw i t hp hv a l u eb e t w e e n2 - 3 ，a n dt h ee x t r a c t i n gr a t eo f9 5 a l c o h o l w a sb e t t e rt h a nt h a to fa c i dw a t e r t h ei n h i b i t o r ye f f e c to nl i p a s eo fe t h a n o le x t r a c t i o n w a sm o r ep r o m i n e n c et h a nt h a to fa c i dw a t e re x t r a c t i o n q u a l i t a t i v ee x p e r i m e n t s s h o w e dt h a ta l k a l o i d sw e r et h em a i n l yc o m p o n e n ti nt h ee x t r a c t i o na n dm a y b et h e r e w e r es o m ea n t h r a q u i n o n e si ni t m e a s u r e db ys p e c t r o p h o t o m e t e ru s i n gn u n c i f e r i n ea s c o m p a r i s o n ，t h ec o n t e n to f a l k a l o i d si nt h ee t h a n o le x t r a c t i o nw a s4 0 1 ，a n di nl o t u s l e a fi tw a s0 4 4 3 i n h i b i t o r ye f f e c to nl i p a s eo fa l k a l o i d sa n df l a v o n o i d sd e r i v e df r o ml o t u sl e a f a c i d b a s et i t r a t i o nw a su s e dt os t u d yt h ei n h i b i t i n ge f f e c to nl i p a s eo fa l k a l o i d sa n d f l a v o n o i d si nl o t u sl e a f t h ei n h i b i t i n ge f f e c to ft h ea l k a l o i d so nl i p a s ew a sm o r e 上海大学硕士学位论文 p r o m i n e n tt h a nt h a to ff l a v o n o i d s t h ei n h i b i t o r ym e c h a n i s m sa n dt y p e so fa l k a l o i d s w e r es t u d i e d ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei n h i b i t o rr e a c t e db yi m p e d i n gt h e c o m b i n a t i o no fs u b s t r a t ea n dl i p a s e ，i td i dn o td i r e c t l yr e a c to ne n z y m e t h ef e a t u r e s o fd i x o na n dl i n e w e a v e r - b u r km a p ss h o w e dt h a tt h ei n h i b i t o r ye f f e c to nl i p a s eo f a l k a l o i dw a sn o n c o m p e t i t i v ei n h i b i t k e yw o r d s ：l o t u sl e a f ；a l k a l o i d s ；f l a v o n o i d s ；l i p a s e v 上海大学硕士学位论文 原创性声明 本人声明：所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已发表 或撰写过的研究成果。参与同一工作的其他同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：粗日期：里竺厶 本论文使用授权说明 本人完全了解上海大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留论文及送交论文复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可 以公布论文的全部或部分内容。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 上说嘿捌b 矿 上海大学硕士学位论文 1 1 前言 第一章绪论 肥胖 i - 7 是一种常见的病症，已成为一大健康问题，在世界各国普遍存在。 肥胖在欧美等国家的患病率为2 0 左右，在我国为1 0 1 5 。它是由能量摄取 和消耗不平衡所引起的，当机体摄入的热量多余消耗的热量时，多余热量以脂肪 形式储存于体内，达到一定值时就演变为肥胖症。研究表明肥胖不仅是一种危害 健康的慢性病，而且是i i 型糖尿病、心脑血管疾病、呼吸系统疾病等多种慢性非 传染性疾病和社会心理障碍重要的危险因素，是影响生命质量、致残、导致早死 和增加国家财政负担的重要的全球性公共卫生问题。近年来我国经济发展迅速， 肥胖的患病率正以迅猛速度上升，将给人民健康和社会经济带来巨大负担。 现代人常苦于高脂肪的摄入而引起的肥胖和因肥胖而引起的成人病，如果能 够阻止脂肪的消化吸收，同时配合低脂肪膳食，对高脂肪引起的肥胖和疾病将有 很大的改善。目前市场上常见的减肥药物8 。1o 】主要是作用于大脑，通过抑制食欲 减少食物的摄入，如西布曲明( s i b u t r a m i n e ) ；也有一部分即是通过抑制脂肪酶 活性，以减少脂肪吸收而达到减肥目的，如奥利司他( o r l i s t a t ) 。但这些皆是合 成类药物，有不同程度的副作用，可能产生大脑及心血管及神经系统的不良反应， 不宜长期使用。因此越来越多的学者将目光瞄准了天然药物，期望能够找到作用 效果强，无副作用，并可降低肥胖症患者发病率和并发症的天然药物。 我国的天然产物资源十分丰富，在临床应用方面更有丰富的经验积累，这些 都使得我国在天然药物的研究上具有得天独厚的基础。天然药物之所以能够防治 疾病，其物质基础在于所含的有效成分。黄酮类化合物( f l a v o n o i d s ) 广泛存在 于植物界，是目前倍受关注的天然活性产物之一。大量的研究已经表明，黄酮类 化合物具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗菌、抗过敏、减肥等多种生理活性及药 理作用，且无毒副作用。生物碱】类化合物也大多具有生理活性，有解热镇痛、 止咳平喘、抗菌消炎、解痉和解有机磷中毒等作用，在治疗疾病和发展化学药物 方面都起了很大的作用。上世纪中期以来，在抗癌药物研究过程中，更发现一些 生物碱具有较好的抗癌活性，如长春新碱、三尖杉酯碱等。 上海大学硕士学位论文 荷叶是睡莲属植物莲( n e l u m b og l b l c i f e f ag a e r t n ) 的叶片，是中医常用的清 暑利湿、升发清阳的药物，主治暑湿、泄泻、眩晕、水气浮肿等疾患。本草纲 目载：“荷叶服之，令人瘦劣，单服可以消阳水浮肿之气。”民间早就有用荷叶 治疗肥胖症的记载。在1 9 9 1 年1 1 月中华人民共和国卫生部的卫监发( 1 9 9 1 ) 第 4 5 号文件中，荷叶被列入第2 批“既是食品又是药品”的名单之中。其在食用 及药用两方面均有广泛的应用。现代医学研究发现，荷叶中的黄酮和生物碱类物 质都具有调血脂活性的作用，其减肥降脂作用越来越受到人们的重视。 1 2 荷叶的研究概况 1 2 1 荷叶的应用 荷叶是莲的叶子，莲又名芙蕖、芙蓉、荷、水芝、君子花、六月春等，是具 有膨大根茎的多年水生植物1 _ 1 2 】。荷叶原产于中国和印度，现全世界皆有分布。 荷叶呈圆形盾状，叶面绿色，蜡质，背面色淡；初发于水面之嫩小荷叶称为荷钱， 叶柄为荷梗，叶与叶柄相接处的部分为荷蒂( 又称荷鼻) ，三者皆可入药。荷叶 于夏秋两季采收，晒至七、八成千时，除去叶柄，切制成片状，干燥即得。我国 荷叶资源丰富，全国除青海、西藏外，各地均有分布，主要分布在长江、黄河和 珠江等三大流域。荷叶自古以来就是一种药食两用的植物，在民间有着非常广泛 的应用，总结起来主要是在以下两个方面： 1 2 1 1 荷叶的食用概况 荷叶气味清香，结构致密，表面有蜡质层，用做包裹食物，不但不会渗漏汁 液，而且还会使食物带上荷叶的清香，所以荷叶常用来包裹点心和佳肴。广东人 常以干荷叶包裹糯米、中间再配以鸡肉、冬菇、咸蛋等材料，蒸熟，名日“糯米 鸡”，其荷香扑鼻，色泽金黄，是茶楼必备的上等点心。用荷叶垫底来蒸排骨、 水鱼等食物，可使食物充分吸收荷叶的清香，很受人们的喜欢。另外，荷叶还可 直接作为食品的配料，如用鲜荷叶与冬瓜、西瓜皮、冰糖等同熬糖水，可清热去 暑、生津止渴，最适应南方人在夏秋季节饮用，鲜荷叶与排骨、鸭肉，再配以薏 米、茨实等熬的汤，有清热去湿、利水消肿的功效。 l 海大学硕士学位论文 1 2 1 2 荷叶的医用概况 荷叶在医药中的功效应用，很早就有记载。神农本草经中将莲藕列为上 品，谓其根为藕，其实为莲，其茎叶为荷。由李时珍参编的食物本草中讲到 荷叶味苦，平，无毒，可止渴，治落胞破血，产后口干，心肺躁烦。本草再新 谓其“清凉解暑，止渴生津，治泻痢，解火热”。清代名医叶天士，吴鞠通，费 伯雄，马培之，陈莲舫，近现代名医丁甘仁，贺季衡，孔伯华，蒲辅周，程门雪 等多喜用荷叶来治病。上海已故名老中医、上海中医药大学徐辉光教授治疗冠心 病，血脂过高，体态肥胖者也常用到了荷叶。荷叶的功效，归纳起来主要有以下 几点：清解暑邪，轻宣透邪，升清降浊，醒脾开胃，止血散淤，降脂减肥。荷叶 用于减肥始于明代，李时珍的本草纲目就有记载“荷叶服之，令人瘦劣，单 服可以消阳水浮肿之气”。用荷叶煎汤代茶或熬粥食用，可明显减轻体重【l 。近 年来，以中草药为原料的减肥降脂保健茶不断面市，其中大部分都含有荷叶。 1 2 2 荷叶化学成分的研究 荷叶除了含有普通植物所共有的碳水化合物、脂质、蛋白质、单宁等常规化 学成分外，还含有多种生物碱及黄酮类化合物。 i 2 2 1 荷叶生物碱类化合物 生物碱( a l k a l o i d s ) 是指一类来源于生物界( 以植物为主) 的含氮有机化合 物，多数分子结构复杂，氮原子在环状结构内，少数为烃胺类。大多呈碱性，一 般具有强烈的生理活性。生物碱在植物中的分布较广，绝大多数分布在高等植物 中，尤其是双子叶植物，现已知至少有5 0 多科1 2 0 属以上的植物中含有生物碱 的存在，在植物体中，生物碱往往和植物酸性成分结合成生物碱盐的状态存在。 自从日本人富田真雄等从荷叶中分离出荷叶碱( n u c i f e r i n e ) 、莲碱 ( r o e m e r i n e ) ，0 一去甲荷叶碱( o - n o m u c i f e r i n e ) 三个单体成分以来，迄今为止， 从植物莲中分离出的生物碱类化合物已多达2 0 个之多，且均为异喹啉生物碱。 荷叶的生物碱主要还有n 去甲荷叶碱( n n o m u c i f e r i n e ) 、牛心果碱 ( a n o n o c i n e ) 、斑点亚美罂粟碱( r o e m e r i n e ) 、亚美尼亚罂粟碱( a r m e p a c i n e ) 、 原荷叶碱( n o m u c i f e r i n e ) 、前荷叶碱( p r o n u c i f e r i n e ) 、番荔枝碱( a n o n a i n e ) 、鹅 上海大学硕士学位论文 掌楸碱( i r i o d e n i n e ) ，n 一甲基衡州乌药碱( n m e t h g l c o c l a n r i n e ) 、n 一甲基异衡州 乌药碱( n m e t h y l i s o c l a u r i n e ) 等。另外，荷叶中还分离出异酸鼠李碱( f r a n g u l a n i n e ) 1 1 5 ，绕袂碱( r o e m e r i n e ) 等。 荷叶碱 n 去甲荷叶碱 0 一去甲荷叶碱 牛心果碱 r = r 1 = r ，= c h 鹅掌楸碱 r = _ r 1 = c h 3r 2 = h r 2 h r 1 2 r 2 2 c h 3 r 十r 1 _ c h 2 _ 一r 2 = h i 伊y 前荷叶碱亚美尼亚罂粟碱 r = r 1 = r 2 = c h 3 n 一甲基衡州乌药碱 r = r 2 = c h 3r i = h n 甲基异衡州乌药碱r = hr l = r 2 = c h 3 ( 1 ) 生物碱的结构与分类 生物碱的分类方法，有按植物来源分，如长春花生物碱、黄连生物碱；有按 生物碱的结构母核分类，目前仍以后者分类较多。按母核类型分主要有吡啶类衍 生物、莨菪烷衍生物类、异喹啉衍生物类以及吲哚衍生物类。此外还有吡啶类衍 生物、喹啉类衍生物、吖啶酮类衍生物、咪唑类衍生物、嘌呤类衍生物、有机胺 类生物碱和其它含氮杂环衍生物等。除去上述氮杂环类生物碱外，尚有萜类生物 减、甾类生物碱和肽类生物碱等。 4 上海大学硕士学位论文 ( 2 ) 生物碱的理化性质 a 形态与颜色：大多数生物碱是结晶性固体，有些是非结晶性粉末，少数 在常温下为液体，这类生物碱的分子一般较小，有些生物碱还具挥发性。生物碱 一般为无色化合物，但有些生物碱的分子结构中共轭系统较长，且有助色基团， 在可见光下呈现颜色，有些生物碱在可见光下不显色，但在紫外光下显示荧光。 b 酸碱性：生物碱分子结构中因含具孤电子对的氮原子，能吸引质子，因 而显碱性，能与酸结合成盐。根据氮原子在分子中存在的状态，生物碱可分为伯 胺、仲胺、叔胺和季胺碱。一般季胺碱呈离子状态，碱性较强，其次为叔胺碱， 仲胺碱及伯胺碱碱性较弱。 c 溶解度：按生物碱在亲脂性溶剂或水中的溶解能力的不同，可将生物碱 分为亲脂性生物碱和亲水性生物碱两大类。亲脂性的生物碱数目较多，大多数叔 胺碱和仲胺碱都属于这一类。它们易溶于极性较低的有机溶剂，如苯、乙醚、不 完全的卤代烷烃，尤其是氯仿中；它们在饱和烃、全卤代烃类( c c l 4 ) 中溶解度 较小；绝大多数在水中溶解度不大。亲水性生物碱数目较少，季铵型生物碱为离 子型化合物，可溶于水，难溶于亲脂性有机溶剂。 d 沉淀反应：大多数生物碱可以与一种或多种生物碱沉淀试剂反应，生成 不溶于水的复盐或络合物。常用的生物碱沉淀试剂有：碘化汞钾( m a y e r 试剂， k 2 h g l 4 ) 、碘化铋钾试剂( d r a g e r d o r f f 试剂，k b i l 4 ) 、碘- 碘化钾试剂( w a n g n e r 试剂，1 2 ) 、硅钨酸试剂( b e r t r a n d 试剂，s i o r l 2 w 0 3 n h 2 0 ) 、磷钼酸试剂 ( s o n n e n s c h e i n 试剂，h 3 p 0 4 1 2 m 0 0 3 - h 2 0 ) 、苦味酸试剂( h a g e r 试剂) 等。 e 显色反应：某些生物碱能与一些试剂反应生成不同颜色的产物，这种试 剂又称为生物碱的显色剂。常见的生物碱显色试剂有：m a n d e l i n 试剂( 1 钒酸 铵的浓硫酸溶液) 、f r o h d e 试剂( 1 铝酸钠( 铵) 的浓硫酸溶液) 、m a c q u i s 试剂( 浓硫酸含少量甲醛) 。 ( 3 ) 荷叶总生物碱的提取 荷叶总生物碱的提取，主要有醇提法和水提法两种。赵俊 17 - 1 8 等研究了不同 溶媒和不同提取方法对荷叶中总生物碱的提取，实验结果显示，用9 5 乙醇提取 纯度较高，且乙醇浓度越低提取量越少；盐酸浓度的减少，总生物碱的提取量也 减少，认为o 5 盐酸提取为最佳。以荷叶醇提液经处理后的水液为样本，利用 上海大学硕士学位论文 d 1 0 1 、d 4 0 0 6 、a b - 8 、n k a 9 型四种大孔吸附树脂纯化荷叶生物碱，结果显示， d 1 0 1 型大孔吸附树脂对荷叶生物碱的比吸附量很大，n k a 9 型最小，d 4 0 0 6 型 和a b - 8 型相当，介于两者之间。若不考虑其他问题，应首选比吸附量最大的 d 1 0 1 型树脂，且荷叶碱最易被4 0 左右乙醇洗脱。蒋益虹【1 9 将人工神经网络与 正交试验相结合，获得了优化的荷叶中生物碱水提取的工艺条件，即p h 2 5 ，提 取温度8 5 。c ，提取时间1 7 5 h 和固液比1 ：3 5 。陈海光【2 0 等研究了荷叶生物碱水 提的最优工艺条件为提取水量为3 0 倍，提取温度9 0 。c ，提取时间1 5h ，提取液 p h 值为2 3 。 1 2 2 2 荷叶黄酮类化合物 黄酮类化合物( f l a v o n o i d s ) 是广泛存在于自然界的一大类化合物，由于这 类化合物大多呈黄色或淡黄色，因此称为黄酮。黄酮类化合物在植物体内大部分 与糖成甙，一部分以甙元形式存在。其生理作用多种多样，且毒副作用小，是目 前人们都较为关注的一类化合物。 荷叶中的黄酮类化合物主要是荷叶甙，其次是槲皮素、异槲皮素等常见的黄 酮类物质。a w a t i f 等叫人从荷叶中分离出n y m p h o l i d ea ，n y m p h o l i d eb 和 m y r i c e t i n 一3 一o 一( 6 ”- p c o u m a r o y l ) g l u c o s i d e 三种黄酮类物质。 h o 葡萄糖 荷叶甙 ( 1 ) 黄酮化合物类的结构与分类 在1 9 5 2 以前，黄酮类化合物主要指基本母核为2 - 苯基色原酮 ( 2 p h e n y l c h r o m o n e ) 的类化合物，目前黄酮类化台物是泛指两个苯环( a 与b ) 通过中间三个碳原子相互联结而成的有c 6 一c 3 一c 6 结构的一系列化合物。在自然界 分布最广的是具有2 一苯基色原酮( 2 一p n e n y l e h r o m o n e ) 母核的化合物，其基本结 构为： e 海大学硕士学位论文 5 4 o c 6 c 3 一c 6 2 一苯基色原酮 根据中间三碳链的氧化程度，b 环( 苯基) 连接的位置( 2 或3 位) 以及三 碳链是否与b 环构成环状结构等特点，可将主要的天然黄酮类化合物分为：黄 酮( f l a v o n e ) ，黄酮醇( f l a v o n 0 1 ) 、二氢黄酮( f l a v a n o n e ) 、二氢黄酮醇( f l a v a n o n 0 1 ) 、 异黄酮( i s o f l a v o n e ) 、查尔酮( c h a l c o n e ) 、花色素( a n t h o c y a n i d i n ) ，橙酮( a u r o n e ) ， 黄烷3 醇( f l a v a n 一3 一0 1 ) 、黄酮一3 ，4 一二醇( f l a v a n 一3 ，4 - o l i 0 1 ) 等十三大类。植 物体内的黄酮除少数以游离状态存在外，大多数与糖结合成甙，且多数为氧糖甙， 只有少数为碳糖甙。 ( 2 ) 黄酮类化合物的理化性质 a 颜色形态：黄酮类化合物多为结晶性固体，少数( 如黄酮甙类) 为无定 形粉末。一般来说，黄酮、黄酮醇及其甙类多呈灰黄色至黄色；查耳酮呈黄色或 橙黄色，有游离羧基时呈淡黄色；而双氢黄酮、双氢黄酮醇、异黄酮则无色。 b 酸碱性：黄酮类化合物因分子中具有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水 溶液、吡啶中。其酸性强弱酚羟基数目的多少和位置有关。例如黄酮的酚羟基酸 性由强到弱顺序是：7 ，4 - 二o h 7 一或4 - o h 一般酚羟基 5 o h 。 c 显色反应：黄酮类化合物的颜色反应主要是利用分子中的酚羟基及y - 吡 喃环的性质。 ( i ) 还原显色反应。盐酸一镁粉( 锌粉) 反应，是检查中药中是否有黄酮 类化合物的最常用方法之一。另外常用的还有钠汞齐还原反应、四氢硼钠还原反 应等。 ( 1 i ) 与金属盐类试剂的络合反应。黄酮类化合物分子中若具有3 - 羟基、4 - 羰基，或5 一羟基、4 羰基或邻二酚羟基，则可以与许多金属盐类试剂如铝盐、锆 盐、锶盐、镁盐、铅栽等反应，生成有色的络合物。常用的有醋酸镁、三氯化铝、 氨性氯化锶等。 ( 3 ) 荷叶总黄酮的提取 上海大学硕士学位论文 目前常用于荷叶总黄酮的提取分离方法有以下几种：水提取法、乙醇水溶 剂提取法、大孔树脂吸附分离法、乙醇水溶液加微波和树脂提取分离法。陈海 光 2 0 】等研究了荷叶黄酮水提的最优工艺条件，提取水量为3 0 倍，提取温度8 0 。c ， 提取时间1 5h 。蒋益虹 2 2 】将传统的正交试验和人工神经网络方法相结合，获得 了乙醇提取的优化工艺条件，即固液比1 ：3 0 、提取温度9 0 、提取时间1h 和乙 醇浓度5 0 。李彩侠，张赞彬2 3 。2 卅等研究了荷叶黄酮浸提最佳工艺条件为乙醇溶 液浓度7 0 ，浸提温度8 0 。c ，料液比l ：3 0 ，浸提时间2 h ，浸提次数3 次。同时用 三种方法对荷叶提取物进行分离纯化，结合薄层层析和颜色反应，对各分离组分 跟随鉴定，结果表明高速逆流色谱( h s c c c ) 分离效果最好，且得到两种黄酮 醇类单体，s e p h a d e xl h 2 0 柱层析分离效果次之，硅胶柱层析分离效果最差。蔡 为荣| ：2 5 等以水，无水乙醇，乙醇水溶液及乙醇水溶液结合微波照射浸提荷叶黄 酮，采用d a 2 0 1 等树脂分离纯化荷叶黄酮提取液，结果以6 0 乙醇水溶液作提取 剂，固液比l ：3 0 ，微波照射1 5 分钟，浸提2 5 小时，荷叶黄酮浸出最多。赵俊 2 6 2 7 j 等采用微波法提取荷叶黄酮苷结果优于超声法及乙醇回流法，并且以含荷叶总黄 酮苷的醇提液为样本，分别在d 1 0 1 、d 一4 0 2 0 、a b - 8 、n k a 型四种树脂上进行平 行吸附试验，采用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，比较其吸附与解吸附性能，结 果a b _ 8 型树脂对荷叶黄酮苷的比吸附量最大，d 一1 0 1 型和d 一4 0 2 0 型次之，n k a 型最小，证明大孔吸附树脂纯化荷叶黄酮苷方法是可行的。 1 2 2 3 荷叶的香气物质 曾虹燕等2 8 2 9 采取超临界c 0 2 萃取和水蒸气蒸馏提取荷叶挥发油，利用 g c m s 对它们进行了定性、定量分析，两种方法提取的荷叶挥发油共被鉴定出 7 0 种成分，其中有1 4 种相同成分，超临界萃取挥发油的主要化学成分为反式石 竹烯、反式异柠檬烯、十六酸、1 1 ，1 4 二烯二十酸甲酯、白菖油萜、b 法昵烯等， 水蒸气蒸馏所得挥发油的主要化学成分为反式石竹烯、反式异柠檬烯、1 一莰醇、 环辛烯、樟脑、白菖油萜、2 一炔一1 一醇等，且超临界c o z 萃取的荷叶挥发油更具 天然性。傅水玉等 3 0 l 用x a d 一2 型树脂采集荷叶天然香气，一双柱毛细管 g c m s d s 联用法和三柱毛细管保留指数法分离鉴定了8 7 种组分，其中5 0 种组 分是用上述两种方法共同确证的，含量较大的组分有顺3 己烯醇、二苯胺、长 叶烯、正己醇、苯。另外，傅水玉【3 1 以同时蒸馏萃取法( s d e ) 提取荷叶精油， 上海大学硕十学位论文 用毛细管g c m s d s 联用法分离鉴定了9 1 种组分，再用双柱g c 标样程升保留 指数确证了其中的3 8 种组分，主要成分是顺3 己烯醇、反2 戊烯醇，1 一戊烯3 醇，反一2 一己烯醛。刘密新i ：1 6 】等用色谱法、色谱一质谱法和标准品核对，对荷叶精 油进行分析，从中鉴定了4 8 种精油成分，占总峰面积的9 2 5 。 1 2 2 4 荷叶中其它成分 荷叶中尚含有维生素c ，枸橼酸、酒石酸、苹果酸、草酸、琥珀酸等徐珞珊 1 3 2 1 。除了槲皮索( q u e r c e t i n ) 、荷叶碱( n u c i f e r i n e ) 外，李志诚【3 3 】等对荷叶的化 学成分进行系统研究时还得到了另外9 种化合物，分别为：正二十八烷 ( o c t a c o s a n e ) 、正二十八烷酸( s t e a r i ca c i d ) 、苯甲酸( b e n z o i ca c i d ) 、邻羟基苯 甲酸( o h y d r o x y b e n z o i ca c i d ) 、没食子酸( g a l l i ca c i d ) ，1 3 - 谷甾醇( b s i t o s t e r 0 1 ) 、 胡萝h 苷( d a u c o s t e r 0 1 ) ，2 - 羟基一1 一甲氧基阿朴菲( 2 一h y d r o x y 1 m e t h o x y a p o r p h i n e ) 、 杏黄罂粟碱( a r m e p a v i n e ) 。 1 2 3 荷叶的药理研究 在荷叶的众多化学成分中具有明显生物活性和生理功能的是黄酮和生物碱 这两大类物质。近年来对荷叶药理作用的研究主要集中在以下的几个方面： 1 2 3 1 降脂、降血压作用 荷叶中的黄酮及生物碱具有调血脂活性的作用。 ( 1 ) 单味药研究 杜力军等以急性高脂血症小鼠为整体模型观察荷叶水提物对血清胆固醇 及甘油三酯的影响，结果表明荷叶水提物具有调脂作用，其活性部位在黄酮和生 物碱，其作用特点在于促进胆固醇的代谢方面。而生物碱盐的降血脂作用强于生 物碱【3 5 】。关章l j l 页 3 6 1 等通过给高血脂症病人服用荷叶水提物制作的胶囊，发现荷 叶水提取物对人体具有较好的降脂作用，且无毒，未发现副作用。许腊英【”1 等 以荷叶提取物中的生物碱为指标，通过对小鼠正常状态以及高血脂状态下的药理 实验研究证实，荷叶具有良好的降血脂作用，是一种具有广泛开发前景的中药。 徐长春 碉等以肥胖高脂血症大鼠模型，对荷叶生物总碱的药效作用进行了研究， 证实了荷叶生物总碱具有较明显的减肥及降脂作用。陶波等3 9 1 研究发现荷叶水 上海大学硕士学位论文 煎剂能使高脂血症大鼠的血清胆固醇及甘油三酯下降，同时能改善血液浓粘状 态，说明荷叶水煎剂具有明显降脂作用。 ( 2 ) 复方药研究 荷叶冲剂能降低家免试验性高脂血症中的血清胆固醇及甘油三酯含量， 对动物组织中脂质沉淀和动脉粥样硬化均有抑制作用。荷叶合剂h 卜4 2 ( 荷叶、苍 术、泽泻等) 预防大鼠高血脂症的试验证明，该药有改善高m 脂症大鼠血液的浓 粘状态、减缓体重增值、抑制脂肪肝发生的作用。此外，降脂中药煎剂h 3 】( 由 苍术，荷叶等组成) ，通过对高血脂动物模型的干预试验，证实该方能够明显抑 制实验大鼠体重的升高，具有一定的减肥和降低血脂的作用。余以刚【删等以荷 叶为主要原料，配以绿茶、l l i 楂、决明子等原料配成荷叶减肥茶，动物实验表明 该方具有减肥和调节血脂的功能。 1 2 3 2 清除自由基、抗氧化作用 陈海光、m i n g j i u a nw u 等4 5 圳1 研究发现荷叶水提取物对羟基自由基( o h ) 超氧阴离子自由基( 0 2 一) 有很强的清除能力，且荷叶提取物对0 2 - 。的清除能力比 对o h 的清除能力要大得多，显示荷叶是一种优良的抗氧化剂，其水提物对人体 有较好的保健作用。肖华1 1 1 4 7 】等采用化学发光方法发现荷叶提取液对体外氧自 由基有很好的清除效果，与已知的氧自由基清除剂维生素c 相比较，荷叶是一 种有效的自由基清除剂。同时以果蝇为观察对象，用荷叶提取液喂养果蝇，结果 显示荷叶具有延缓果蝇衰老和延长寿命的功效。纪丽莲等h 明研究了荷叶甲醇提 取物在食用大豆油中的抗氧化活性，结果显示荷叶的甲醇提取物具有强抗氧化活 性，与b h a 的抗氧化性相当，而略高于生育酚的抗氧化性，并且荷叶抗氧化 物质的主要成分为b 一胡萝h 素、a 生育酚和黄酮类化合物。荷叶乙醇提取物也表 现较强的抗氧化性 4 9 1 ，可以显著地消除体外过氧化氢自由基，有较强的还原能 力，可以明显地延缓油脂的自动氧化过程；而且随着提取物浓度的增加，提取物 的抗氧化性会随之增强。梁晓春等5 0 1 观察了降脂中药片( 由太子参、生荷叶等 组成) 对血氧化及抗氧化指标的影响，结果表明用药后血中氧自由基( s o d ) 含 量无明显变化，但其活性增强，同时血清丙二醛( m d a ) 的含量下降，提示该 方有清除自由基的作用。目前的药理研究表明，黄酮类化合物的抗衰老、抗突变、 抗动脉粥样硬化都与其抗氧化的作用有关。 1 0 上海大学硕士学位论文 1 2 3 3 抑菌作用 研究发现荷叶具有抑菌的功效，纪丽莲等口1 对7 种常见的食品腐败菌及致 病菌的活性试验表明，荷叶8 0 l 醇提取物对细菌及酵母等主要靠无性裂殖繁殖 的微生物具有明显的抑制作用，且抑菌效果在弱碱条件下最强。荷叶的抑菌活性 成分主要为抗有丝分裂的碱性成分，该成分抑制细胞的有丝分裂，故而抑制细菌 和酵母的繁殖。陈健芬等 5 2 - 5 3 】对荷叶提取物有效成分通过层析柱分离和化学结构 鉴定及对口腔致病菌的药理筛选，得到了对引起牙龈炎等病状的致病菌有较强抑 制作用的荷叶正丁醇提取物有效成分，并发现有效成分主要是荷叶提取物中的黄 酮类物质，并将其有效的应用于牙膏产品中。唐裕芳等【5 4 46 用荷叶生物碱提取液、 荷叶超临界c 0 2 萃取物( 精油) 分别进行抑菌实验，发现它们对细菌、酵母、 霉菌都有较强的抑菌作用，且在碱性环境比酸性环境中效果显著。此外，荷叶的 挥发油吲、荷叶乙醇提取物h 明也具有一定的抑菌效果。一些黄酮类化合物如银 杏黄酮、槲皮素、山奈酚等均具有抑菌和抗病毒作用。 1 2 3 4 其他药理作用 许多含黄酮类化合物的植物均具有抗癌作用。黄酮类化合物主要通过3 个途 径达到抗癌、防癌作用，即抗自由基作用，直接抑制癌细胞生长和抗致癌因子。 黄酮类化合物对急慢性肝炎、肝硬化、脂肪肝以及因半乳糖胺和c c l 4 等引起的 中毒性肝损伤有一定的疗效，其护肝机制最终归结于其抗氧化及抗自由基的作 用。黄酮类化合物能够促进胰岛b 一细胞的恢复，改善血糖量，对抗肾上腺素的升 血糖作用，同时还能抑制醛糖还原酶，因此可以治疗糖尿病及并发症。另外，黄 酮类化合物因结构与己烯雌酚相似而具有雌性激素样作用，与甾类激素一样具有 兴奋和抑制的双重作用。荷叶生物碱成分具有抗病毒、抗炎抗敏作用，一些生物 碱具有较好的抗癌活性。 1 2 4 荷叶开发的应用现状 目前我国对荷叶已经进行了开发，主要用于肥胖症及冠心病、高血压病、糖 尿病、脑血管疾病的预防，但大多都还处在初步的开发阶段。有很多的降脂减肥 药物都用到了荷叶，如云南盘龙云海药业有限公司生产的“排毒养颜胶囊”，主 上海大学硕士学位论文 爱成分即为大激、荷叶、脊阳参、西洋参等，还有轻僦胶囊( 海军总医院) 、降 脂中药煎剂( 福建医科大学) 、荷叶饮( 又名荷叶合剂，浙江中医药研究院) 、祛 爨溺( 复旦大学瓣震中医黧) 、费时拳蒸雾l ( 黑龙江中豢骜大学) 、跨耱 号荻囊 ( 华北药厂职工医院) 、红荷散( 青海省人民医院) 、减脂茶( 江苏省药品标准) 等都用到了荷叶。另外还有北京天龙保健荼有限公司的三叶减肥茶、江西省宁红 祭濯公霹豹宁红缓器茶、上海中药裁药一厂懿三花减瓣絷、l 索臻褥梦攥霞瑟热 工厂的降脂减肥茶等。 1 3 本论文研究意义及工作内容 1 3 1 研究意义 多年静羲臻经验表疆蕊时簇有箨l 蓦竣麓功效，萁主簧潼往藏分为黄酮稻重耪 碱类物质。然而临床更多的魁以复方制剂的形式用于减肥降脂，虽然近2 0 年来 凰内研究已证实单昧荷叶商降脂作用，假也仅限于粗加工，较少对荷叶的有效部 位避行深灭磷究。嚣蓠蘸时降l 鹭减器兹梳理逐不努滚楚。本研究对褥时其畜鞠 熙生物活性的黄酮类及生物碱类化合物溅行提取分离，研究了其对脂肪酶的抑制 作用及抑制类型，并对抑制机理进行判断，旨在研究葡叶降脂减肥的作用机理。 逡不仅可戳为含灌、有效、全菇匏综台开发蘅时提供婆实静应霜理论鍪穑，对予 肥胖症的治疗、推动中草药应用的新进展也有重大意义。 1 3 2 骚究痰各 ( 1 ) 采用溶剂提取、聚酰胺柱层析方法分离荷叶中黄酮类化合物 ( 2 采强溶粼提取、滚液攀取分离薪时中生物碱类纯含甥 ( 3 ) 采用分光光度法测定搿叶中总黄酮、总生物碱的含量 ( 4 ) 采用体外酶抑制法筛谯葡叶降脂减肥的功能成分，并研究其抑制类型和作 用瓿理 上海大学硕士学位论文 第二章荷叶总生物碱的提取 荷叶中的生物碱有几十种之多，其中大部分的碱性都较弱，不能直接溶于水， 但能溶解于氯仿、乙醇、甲醇等有机溶剂。生物碱与酸作用生成盐类后，可溶于 水，可以用水将其提取。考虑到食用安全性等因素，所以本研究确定用乙醇提取 和水提取两种方法来提取荷叶中的生物碱。用水提取时，加入盐酸使提取液的 p g 值降低，以利于生物碱的溶出。提取物中总生物碱含量的测定采用分光光度 法1 8 【5 8 ，并用荷叶碱标准品作为比较。 2 1 实验材料与仪器 2 1 1 实验材料 荷叶( 购自上海养和堂药房) ；鲜荷叶经清洗后干燥，药房未对其进行化学 处理。 荷叶碱标准品( 购于中国药品生物制品检定所) 2 1 2 实验仪器 索氏抽提器( 中国医药集团上海化学试剂公司) 旋转蒸发仪( b u c h l r o n l 廿o r ) 循环水泵( 河南太康教材仪器厂) 分析天平( 日本岛津公司) 电热恒温水浴锅( 上海医疗器械五厂) 紫外可见分光光度计：u v - 2 5 0 1p c ，( s h i m a d z uc o r p o r a t i o n ) 红外光谱仪：a v a t a r 3 7 0f t - i r ( 美国n i c o l e t 公司) ( k b r 压片) p h s 3 d c 精密数显酸度i - t + ( 沪新科学仪器厂) 真空干燥箱( 上海益恒实验仪器有限公司) 上海大学硕士学位论文 2 1 3 实验试剂 无水乙醇，石油醚( 沸程6 0 9 0 ) ，氯仿，醋酸，硫酸，浓盐酸，氨水， 乙醚，碘，碘化钾，氢氧化钾，氢氧化钠，醋酸镁，三氯化铝，三氯化铁，明胶， 氯化钠，磷钼酸，硫酸铜，酒石酸钾钠，苦味酸，邻苯二甲酸氢钾( 以上均为分 析纯) ，溴甲酚绿 2 2 实验方法 2 2 1 荷叶总生物碱的提取 ( 1 ) 亲脂性生物碱的提取 从中药中提取亲脂性生物碱，除挥发性生物碱用水蒸汽蒸馏法提取外，通常 用溶剂法提取。 a 水或酸水提取法：根据生物碱盐易溶于水，难溶于亲脂性有机溶剂的性质， 可直接用o 5 1 的酸水溶液提取。使中药中溶解度较小的游离生物碱或生物 碱有机酸盐，转变为溶解度较大的无机酸盐而被溶出。常用的酸有盐酸、硫 酸、醋酸等。 b 醇类溶剂提取法：利用生物碱和生物碱盐都能