（药物化学专业论文）海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究.pdf

论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名：盏! l 也日期：绝2 ：! ：! ! 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 储繇蔓j l 导师龆坶魄业 复旦大学博士学位论文 海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究 海绵共附生系状茵中生物活性物质的研究 摘要 本文以稻瘟霉( p y r i e u l a r i ao r y z a e ) 分生孢子和菌丝形态变异或生长抑制为指标， 从海绵共附生系状菌的发酵产物中筛选具有抗真菌和抗肿瘤等生物活性的物质。通过对 1 0 0 株海绵来源的系状真菌的发酵液进行抗稻瘟霉活性筛选，得到9 株具有良好抗稻瘟霉 活性且稳定的菌株。采用代谢产物的提取分离和活性检测同步进行的方法，对活性最好 的菌株，即0 5 j j 吣师1 6 3 ，1 6 5 、0 5 j a n f l 5 1 、0 5 j a n f l 5 4 、0 5 a b r l 4 5 、0 5 a b r i1 6 、9 8 f 1 5 2 和s 1 1 ，进行了大量发酵，从其发酵液中共分离得至l j 2 0 个化合物，根据理化性质和各种 波谱学等方法鉴定了1 9 个单体化合物的结构，分别为f u s a d e l i n a ( 1 ) 、f u s a r i e l i n b ( 2 ) 、 f u s a r i e l i ne ( 3 ) 、( ) - o x y s p o r i d i n o n e ( 4 ) 、r o f i d ma ( 5 ) 、r o f i d i nh ( 6 ) 、r o r i d i nj ( 7 ) 、 v e r r u c a r i na ( 8 ) 、v e t r u c a 血b ( 9 ) 、v e r r u e a r i nla c e t a t e ( 1 0 ) 、v e r r u e a r i nj ( 1 1 ) 、 d e o x y f u s a p y r o n e ( 1 2 ) 、5 - h y d r o x y z e a r a l e n o l ( 1 3 ) 、z e a r a l e n o l ( 1 4 ) 、z e a r a l e n o n e ( 1 5 ) 、 8 - h y d r o x y z e a r a l e n o n e ( 1 6 ) 、z e a e n o n e ( 1 7 ) 、a ，b d e h y d r o e u r v u l a r i n ( 1 8 ) 、m y e o p h e n o l i c a c i d ( 1 9 ) 。其中化合物( 3 ) 和( 1 3 ) 为新的天然产物，并首次得到了化合物( 6 ) 和 ( 7 ) 的x 射线单晶衍射的立体结构。 化合物( 1 ) 和( 3 ) 能使稻瘟霉分生孢子发生严重变形或使菌丝生长发生弯曲变形， 最小抑制浓度均为3 1p , g m l ；化合物( 5 ) 、( 6 ) 、( 9 ) 和( 1 1 ) 能使稻瘟霉菌丝发生弱 卷曲变形，它们的最小抑制浓度分别为1 2 5t t g m l 、3 1t t g m l 、0 2r t g m l 和0 2p g m l ； 化合物( 1 2 ) 能使稻瘟霉菌丝发生弱卷曲强串珠状变形，其最小抑制浓度为3 1p g m l ； 化合物( 4 ) 、( 7 ) 、( 8 ) 、( 1 0 ) 、( 1 5 ) 、( 1 7 ) 、( 1 8 ) 和( 1 9 ) 抑制稻瘟霉菌丝生长的最 小抑制浓度分别为2 5p g m l 、6 2t t g m l 、1 6r t g m l 、0 2l _ t g m l 、3 1t , g m l 、o 1r t g m l 、 2 5t t e , m l 和2 5t t g m l 。利用稻瘟霉生物活性模型筛选出的这些生物活性化合物同文献中 报道的有关它们的其它生物活性试验结果有很好的一致性，这也说明该生物模型能够有 效的指导海洋生物活性物质的分离纯化，是一个适用的初筛体系。 关键词：海绵共附生系状菌，代谢产物，抗稻瘟霉活性 复旦大学博士学位论文 海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究 s t u d i e so nt h eb i o a c t i v em e t a b o l i t e so f s p o n g e - a s s o c i a t e df u n g i a b s t r a c t b i o a c t i v es u b s t a n c e st h a ti n t e r f e r e 埘t l lm i c r o t u b u l ef u n c t i o nc a l lg e n e r a l l yi n h i b i tt h e c o n i d i ag r o w t ho fp y r i c u l a r i ao r y z a e ( ap l a n tp a t h o g e n i cf u n g u s ) a n di n d u c em o r p h o l o g i c a l d e f o r m a t i o no f c e n i d l ao rm y c e l l ao f p y r i c u l a r i ao r y z a eb ys w e l l i n g , c u r l i n g ，b e a d sf o r m a t i o n a n dh y p e r - d i v e r g e n e ee f f e c t w ea p p l yt h em e t h o du s i n gc o n i d i ao f p y r i c u l a r i ao r y z a e8 8a p r i m a r ys c r e e n i n ga s s a yf o rc o m p o u n d ss u c ha sa n t i f u n g a la n t i b i o t i c sa n da n t i c a n c c r s u b s t a n c e sf i x , ms e c o n d a r ym e t a b o l i t e so f s p o n g e a s s o c i a t e df u n g i f r o m1 0 0 f u n g is a m p l e s i s o l a t e df t o ms p o n g e s ，w eo b t a i n e d9s t r a i n sp o s s e s s i n gb e t t e ra n ds t a b l ea c t i v i t y f r o mt h e f e r m e n t a t i o nb r o t ho fs t r a i n 0 5 j a n f l 6 3 1 6 5 ，0 5 j a n f l 5 1 ，0 5 j a n f l 5 4 ，0 5 a b r l 4 5 ， 0 5 a b r i1 6 ，9 8 f 1 5 2a n ds 1 1 ，t w e n t ya c t i v ec o m p o u n d sw e r ei s o l a t e da n dp u r i f i e db y a c t i v i t y - g u i d e df i a c t i o n a t i o n - s m m m r e so fn i n e t e e nc o m p o u n d s 哪e s t a b l i s h e do nt h e 。 b a s i so fv a r i o u sn m r s p e c t r o s c o p i ca n a l y s e s ，i n c l u d i n gi d a n d2 d - n m rs p e c t r o s c o p i c a n a l y s e s ( t h - 1 hc o s y , r o e s y ，r n v l q c ，a n dh m b cs p e c t r a ) ，a n dm s 伊a b ，e ia n de s i ) t h en i n e t e e nc o m p o u n d s 哪f u s a d e l i na ( 1 ) ，f u s a x i e l i n b ( 2 ) ，f u s a t i e l i ne ( 3 ) ， ( - ) - o x y s p o r i d i n o n e ( 4 ) ，r o r i d i na 固，r o r i d i nh 旧，r o r i d i nj ( 7 ) ，v e r m e a r i na ( 8 ) ， v c r r u c a d nb ( 9 ) ，v e r m c a d nla c e t a t e ( 1 0 ) ，v e r r u c a r i nj ( 1 1 ) ，d e o x y f u s a p y r o n e ( 1 2 ) ， 5 - h y d r o x y z e a t a l e n o l ( 1 3 ) z e a x a l e n o l ( 1 4 ) ，8 - h y d r o x y z e a r a l e n o n e ( 1 5 ) ，7 _ 七a m l e n o n e ( 1 6 ) ， z e a e n o n e ( 1 7 ) ，旺，p - d e h y d r o c u r v u l a r i n ( i s ) a n dm y c o p h e n o l i ca c i d ( 1 9 ) c o m p o u n d s ( 3 ) a n d ( 1 3 ) w e r l gn e w n a t u r ec o m p o u n d s ，a n dc o m p o u n d s ( 6 ) a n d ( 7 ) w e r ef i r s te l u c i d a t e dt h e i r s p c c ：f f o s c o p i ct ；t r u c t u r e sb yx - r a ys i n g l e - c r y s t a la n a l y s i s c o m p o u n d s ( 1 ) a n d ( 3 ) i n h i b i t e dt h ec o n i d i ag r o w t ho fp y r i c u l a r i ao r y z a eb ys w e l l i n g e f f e c ta n di n d u c e dm o r p h o l o g i c a lc h a n g e so f t h e m y c e l i ab yc u r l i n ge f f e c tw i t ht h em i l l i i l l m i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o nf m i c ) 3 1 肛e d m l c o m p o u n d s ( 5 ) ，( 6 ) ( 9 ) a n d ( 1 1 ) i n d u c e d m o r p h o l o g i c a lc h a n g e so ft h em y c c l i ab yw e a kc u r l i n ge f f e c tw i t hm i c1 2 5 腭恤l ，3 1 2 复旦大学博士学位论文 海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究 , g m l ，0 2p g m la n d0 2 g m l ，r e s p e c t i v e l y c o m p o u n d ( 1 2 ) i n d u c e dm o r p h o l o g i c a l c h a n g e so ft h em y c e l i ab yw e a kc u r l i n ga n ds t r o n gb e a d sf o r m a t i o nw i t hm i c3 1 g m l c o m p o u n d s ( 4 ) ，( 7 ) ，( 8 ) ，( 1 0 ) ，( 1 5 ) ，( 1 7 ) ( 1 8 ) a n d ( 1 9 ) i n h i b i t e dt h em y c e l i ag r o w t hw i t h m i c2 5 , g m l ，6 2p g m l ，1 6 肛g m l ，0 2u e m l ，3 1 , g m l ，0 1 , g m l , 2 5 , g m la n d2 5 g m l ，r e s p e c t i v e l y t h ea c t i v i t yr e s u l t so f o u rs t u d ya c c o r d e dw i t ht h er e l e v a n tr e p o r t sa n di ts h o w e dt h a tt h e b i o a s s a ym e t h o du s i n gc o n i d i ao fp y r i c u l a r i ao r y z a ec o u l de f f i c i e n t l yg u i d et h ei s o l a t i o no f t h eb i o a c t i v em e t a b o l i t e so fm a r i n e - d e r i v e df u n g ia n dc o u l db eap r i m a r ys c r e e n i n gf o r b i o a c t i v es u b s t a n c e s 3 复旦大学博士学位论文 海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究 前言 随着陆地动植物资源的不断开发利用，人们在天然药物研究领域取得了极大的进 展，已经有很多活性天然产物作为抗肿瘤、抗菌和治疗心脑血管等疾病的有效药物进入 临床。然而医学界仍然有着众多的疑难杂症尚未被攻克，加之新病原菌、新病毒的肆虐， 耐药病原菌的增加和蔓延，使得陆地资源显得日益匮乏，寻找新的活性物质源泉成了当 务之急。因此越来越多的科学家把目光投向了人类尚未很好开发利用的巨大天然资源宝 库海洋。 海洋占地球表面积的7 1 ，体积占生物圈的9 5 ，生息繁衍着地球上8 0 以上的生 物，是生物资源的活宝库。海洋生物物种比陆地生物丰富和复杂，动物界的2 8 个主要门 有2 6 个生活在水中，其中8 门为完全水生【1 1 。据统计海洋有2 0 0 万2 亿种生物，而海洋微 生物种类估计较陆地更为丰富【2 】。如此丰富的海洋生物资源，人类目前己研究的可能仅 有l ，这使得把医药研究的触角深向海洋具有着战略上的重大意义【3 】。因此从2 0 世纪9 0 年代后，许多沿海国家都把开发海洋资源作为基本国策。 海洋生物生活的环境与陆地迥异，往往更加恶劣和危险。海洋具有低温、高压、低 光照、寡营养、高盐等独特的环境特点，在这样的生态环境下，各种海洋生物必然具有 特殊的代谢机制，通过释放一些特殊的物质来逃避敌害或制服猎物，保持竞争优势以维 持其生命活动和种的繁衍。这些特殊物质一经分泌就被海水稀释，因此在自然进化过程 f 中，势必要求这些物质具有高活性。现有的研究结果己经表明，海洋生物能够产生出许 多结构新颖、种类多样、活性独特的天然产物吼海洋生物多样性及其生物活性物质化 学结构的多样性远远超过了陆生生物，这些生物活性物质在抗肿瘤、抗病毒、抗炎及抗 真菌等方面已经显示了巨大潜力，有非常广阔的开发前景，是不容忽视的“1 。 现代海洋生物活性物质的研究开发始于上世纪6 0 年代。在海洋生物活性物质的研究 中，最先是以海洋动植物为主要研究对象，但是海洋动植物资源有限，难以工业化生产 一直是阻碍海洋药物研究进一步开展的棘手问题1 4 1 。例如从海绵中提取活性物质1 5 千 克需要3 0 0 0 1 6 0 0 0 吨的海绵1 5 因此寻找可人工再生、对环境无破坏、稳定、经济的药 4 复旦大学博士学位论文 海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究 源已成为海洋药物研究领域最紧迫的课题。从这方面来讲，海洋微生物是具有巨大开发 潜力的资源领域，而且很多文献报道指出许多以前认为是由植物和无脊椎动物产生的活 性物质实际上是由与其共附生的微生物产生的。通常提出此观点的主要依据是：( 1 ) 活性物质产量低( 有的仅占干重的1 0 - 8 ) 且产量易变；( 2 ) 同样的产物可来源于不同 的无脊椎动物；( 3 ) 产生活性物质的生物有微生物与其共存；( 4 ) 产物的分子结构与 以前报道由微生物产生的相像嘲。 。 目前国内外己经从海洋真菌、细菌、放线菌等微生物体内分离到若干具有生物活性 的天然产物。海洋天然产物结构类型复杂多样，主要有生物碱、萜类、大环内酯类、皂 苷类、甾醇、有机酸、多糖、蛋白质等，它们的作用靶点主要有离子通道、信号转导通 路、微管蛋白、d n a 等【”。海洋微生物还产生一些陆地微生物罕见的化学物质，它们的 生物活性同样呈现了多样性1 7 , s 3 。 海绵是最简单、最古老的多细胞动物，细胞己分化，但未形成组织。大多数海绵生 长在热带浅海中，估计约有5 0 0 0 多种。海绵与微生物长期进化形成密切的共生关系，对 于许多类型的共附生微生物来说海绵是良好的宿主，研究发现，海绵各类共附生微生物 可占本体干重的7 0 0 , 5 ，几乎包括了所有微生物的类型嗍。海洋微生物与海绵之间的共附 生关系是多样的，微生物可以共生在海绵皮层表面、海绵体内的细胞间、海绵细胞内部 甚至海绵细胞的细胞核内【1o 1 ”。这类微生物可以提高宿主在海洋中的环境适应性和生存 能力，产生抑制宿主竞争对手的次生物质，故它们产生生物活性物质的几率远远高于非 附生海洋微生物和陆地微生物。海洋微生物药物产生菌与陆地的相反，放线菌不再是微 生物药物的主要来源，取而代之是真菌，依次是细菌、放线菌和藻类，因而海绵共附生 系状真菌吸引着人们极大的研究热情，且有关这方面的研究已经成为海绵研究领域的热 点。 海洋微生物来源的活性化合物筛选的另一关键问题是建立合理有效的活性筛选模 型。一个理想的筛选模型不仅应对检测活性具有良好的灵敏性、选择性、重现性以及与 人类疾病相关等特点，还应是应用简便、快速和经济的。海洋微生物代谢产物的活性筛 选不同于植物药和合成药物的筛选：首先，植物药筛选可以参考传统中草药的临床应用， 合成化合物可以根据先导化合物的活性及定向设计方案进行筛选，而海洋微生物活性代 5 复旦大学博士学位论文 海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究 谢产物的筛选则机遇性较大。这是因为受海洋特殊地形情况所限，人们对海洋生物资源 分布及分类情况都了解的甚少，而海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究更是在2 0 世 纪8 0 年代后期尤其是进入9 0 年代后才开始的，因此只有通过对大量菌株进行活性筛选， 先找到活性菌株和新化合物后，再鉴定菌株，才能保证研究有效、顺利地进行；其次， 微生物代谢产物初筛样品为发酵液或粗提物，成分复杂，活性组分含量低，波动大，因 而对筛选模型与方法的要求更高；再次，海洋微生物代谢产物与培养条件密切相关，同 一菌株在不同的培养条件之下代谢产物存在明显差异，即使在同一条件下其代谢产物的 质量也不可能完全相同，故对实验条件要求苛刻，对菌种保持遗传稳定性和代谢产物的 稳定性均需要进行相关的考察。因此微生物模型由于具有快速、经济、灵敏度高、重现 性好、选择性好、作用机理易于明确等优点而被应用于海洋微生物生物活性物质的研究 中，成为海洋微生物活性代谢产物筛选的重要模型。 真菌与动物同属于真核细胞，在细胞的形态、结构和组成等方面有类似之处，比如 它们都以有丝分裂方式进行增殖，细胞骨架中都包含微管和微丝等，因此以真菌为模型 的筛选体系筛选出对真菌细胞起作用的化合物很可能对人的细胞，包括肿瘤细胞起作 用。加之，一般的真菌细胞体积较大，形态特殊，便于在显微镜下进行观察。因此以真 菌为靶细胞模型被广泛的用于活性物质的筛选中。研究表明很多抗生素、抗肿瘤化合物、 代谢抑制剂在适当浓度下都能改变真菌的形态1 1 2 1 ，因而利用真菌的形态变异为评价指标 的模型来筛选微生物活性代谢产物被广泛研究”45 】。这类筛选方法快速、灵敏、直观、 经济、待测物用量少，同时根据真菌形态的特异性变化可以揭示化合物结构中的特定基 团与细胞内部特定的生理生化反应的相关性，因此应用此类筛选方法可以将待测化合物 的生物活性进行分类或有目标的筛选具有某类生物活性的化合物，指导化合物的分离纯 化，并为结构鉴定和活性物质作用机理的研究提供参考。 稻瘟霉( p y r i c u l a r i ao r y z a e ) 为植物病原菌，属多细胞系状真菌，其孢子以出芽方 式繁殖。在环境适合条件下，由孢子长出芽管，逐渐延长成丝状( 菌丝) ，菌丝可生出 许多分支，相互交织，称为菌丝体，生殖菌丝体( 气生菌丝) 再产生孢子，完成生殖过 程。其孢子为无性孢子，体积较大，由多个细胞组成，呈典型的鸭梨形。稻瘟霉属真核 微生物，具有细胞壁结构及细胞核结构等真核细胞的特征。细胞壁物质合成的各阶段， 6 复旦大学博士学位论文海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究 核分裂过程的各时期及细胞膜物质等受到干扰，都将引起稻瘟霉分生孢子或菌丝的形态 变化或生长抑制。延崎成夫、小林久芳等发现有丝分裂抑制剂r h i z o x i n 能使稻瘟霉的分 生孢子和菌丝体在生长过程中严重变形【阍。许多不同作用机制的抗真菌、抗肿瘤化合物 也影响稻瘟霉分生孢子及菌丝生长的形态，但其状态和程度却有所不同。实验表明， r h i z o x i n 通过抑制癌细胞微管蛋白的聚合，促进蛋白解聚，从而起到抗有丝分裂的作用。 这说明利用稻瘟霉来筛选抗肿瘤药物的可能机制之一是化合物可逆的与微管蛋白尾部 结合，形成微管蛋白一药物复合物，抑制微管蛋白重组，从而使有丝分裂停止在m 期。 根据此研究结果，小林久芳建立了稻瘟霉生物活性筛选模型，即以稻瘟霉作为检测模型， 以其分生孢子和菌丝体形态变化作为活性指标，快速简便的筛选具有抑制肿瘤细胞和抗 真菌活性的化合物【1 7 1 大量研究结果表明该模型快速、方便、可信，是抗肿瘤和抗真菌 等生物活性物质初步筛选的一种较好手段【l e 聊。一些抗肿瘤和抗真菌的药物对稻瘟霉菌 株的影响见t a b l e 。因此稻瘟霉筛选体系可以广泛用于两类活性化合物初步筛选： ( 1 ) 能使稻瘟霉分生孢子或菌丝体发生严重弯曲变形的化合物可能为抗有丝分裂剂； ( 2 ) 能引起稻瘟霉菌丝体发生其它变化的化合物可能为抗真菌化合物。 t a b l e 一些抗肿瘤和抗真菌的药物对稻瘟霉p - 2 b 菌株的影响 aa ：a p p a r e n t ；m ：m a r g i n a l ；w ：w e a k ；n ：n od e f o r m a t i o n b 卅，+ 匕+ ，一，x 含义见第一章内容 7 复旦大学博士学位论文海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究 我们以稻瘟霉活性筛选模型为指导，对1 0 0 株海绵共附生系状菌菌株进行筛选，得 到9 株具有良好抗稻瘟霉活性且稳定的菌株。并对活性最好的菌株0 5 j 舢师1 6 3 1 6 5 、 0 5 j a n f l 5 1 、0 5 j a n f l 5 4 、0 5 a b r l 4 5 、0 5 a b r l l 6 、9 8 f 1 5 2 和s 1 1 进行了大量发酵，通 过活性追踪与提取分离同步进行的方法，共分离得到2 0 个化合物，其中利用波谱学等手 段鉴定了1 9 个单体化合物( 见f i g u r e ) ，其中化合物( 3 ) 和( 1 3 ) 为新化合物，化合 物( 6 ) 和( 7 ) 首次用x - r a y 单晶衍射方法确定了立体结构。同时也测定了各单体化合 物的抗稻瘟霉活性。 v i g u r e 已鉴定的单体化合物 8 复旦大学博士学位论文 海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究 服肌烈 心缸西- 礅 z c a c n o l ( 1 7 ) a 。b - d e h y d r o c m v u l a r i n ( 1 8 ) m y c o p h e n o l i c a c i d ( 1 9 ) 注：“”为新化合物； 。一”为首次用x - r a y 单晶衍射方法确定了立体结构的化合物。 9 复旦大学博士学位论文海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究 第一章海绵共附生系状菌活性菌株的筛选 1 、稻瘟霉生物活性筛选模型 1 i 活性指标及表示方法 稻瘟霉( p y r i c u l a r i ao r y z a e ) 为植物病原菌，属多细胞系状真菌，其孢子以出芽方式 繁殖。在环境适合条件下，由孢子长出芽管，逐渐延长成丝状( 菌丝) ，菌丝可生出许多 分支，相互交织，称为菌丝体，生殖菌丝体( 气生菌丝) 再产生孢子，完成生殖过程。 其孢子为无性孢子，体积较大，由多个细胞组成，里典型的鸭梨形。稻瘟霉属真核微生 物，具有细胞壁结构及核结构等真核细胞的特征。细胞壁物质合成的各阶段，核分裂过程 的各时期及细胞膜物质等受到干扰，都将引起稻瘟霉孢子或菌丝的形态变化或生长抑 制。我们利用这一性质进行抗稻瘟霉的活性菌株的筛选，并对活性代谢产物进行跟踪分 离。 稻瘟霉分生孢子悬浮液( 含0 0 2 酵母提取物) 2 7 培养1 6 小时，最适合用倒置 显微镜清楚地观察菌丝的生长情况。调节每个分析孔中的孢子浓度，使它们疏散开，就可 以直接比较不同的物质引起菌丝的形态变化。稻瘟霉分生孢子在倒置显微镜下的正常形 态为鸭梨形，正常的菌丝形态为直而中空的管状。若化合物能使正常生长的孢子形态发 生变化( 如膨胀、破裂、变形) ，或者使稻瘟霉的菌丝形态发生变化( 如弯曲、串珠状、 变粗、多歧化) ，以及菌丝生长受到抑制，均可认为该化合物在相应浓度下具有相应的 抗稻瘟霉活性，其引起稻瘟霉分生孢子变形或者菌丝生长抑制的最小浓度为最小抑制浓 度( m i n i m u mi n h i b i t i o nc o n c e a t r a t i o n ) ，用m i c 表示，单位g m l 。 菌丝生长的抑制程度被用作定量的指标，根据由孢子长成菌丝的长度，该指标可分 为六级，分别用符号。一，+ ，+ + ，卅，x ”来区分其活性强弱。各个活性指标的 稻瘟霉孢子或菌丝的形态见f i g u r e1 1 。 “一”表示没有活性，和阴性对照一样，菌丝正常生长； “”表示不能抑制菌丝生长，但是会引起形态变化； 。+ ”表示弱变形活性，孢子萌发且菌丝生长，但菌丝生长状态异常或者与正常生 长的菌丝比较有异常( 变短或变细) ； 1 0 复旦大学博士学位论文海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究 变化； “什”表示中等变形活性，孢子正常萌发或菌丝生长，但菌丝形态发生中等强度的 “卅”表示强变形活性，孢子虽萌发或菌丝虽生长，但孢子形态发生变化或者菌 丝形态发生严重变化： “x ”表示抑制孢子萌发，孢子基本保持原有的形态，此时为1 0 0 抑制浓度 ( i c l o o ) 。 f i g u r e1 1 倒置显微镜下各个指标的稻瘟霉的参考形态 说明： ( 1 ) 阳性对照r h i z o x i n ( f i g u r e1 2 ) ，是从土壤微生物中分离得到的抗肿瘤药物，它 在高浓度时能引起稻瘟霉分生孢子膨胀、变形，低浓度时能使稻瘟霉菌丝发生弯曲变形： ( 2 ) 阳性对照g r i s e o f u l v i n ( f i g u r e1 2 ) ，是从土壤微生物中分离得到的抗真菌药物， 能引起稻瘟霉的菌丝发生弯曲变形，倒置显微镜下观察为菊花状； ( 3 ) 阴性对照为正常生长的稻瘟霉菌丝的标准形态，是生物检测过程中不加任何物质 的孢子悬浮液在倒置显微镜下看到的菌丝形态。 复旦大学博士学位论文 海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究 f i g u r e1 2 s t r u c t u r eo fc o m p o u n dr h i z o x i na n dg r i s e o f u l v l n 1 2 待测样品的配制 1 2 1 水溶性化合物 r h i z o x i u 吨洽 g r i s e o f u i v i a 将待测样品溶于水中配成1 0 m p , m l ，取4 皿加入装有1 0 0 皿孢子悬浮液的加样孔 内，充分混合，使孢子的浓度是2 x1 0 3 ，孔。 1 2 2 水不溶性化合物 水不溶性提取物首先应溶解于与水混溶的有机溶剂中，然后蒸发掉有机溶剂或者用 水稀释后再进行生物测定。 为防止产生假阳性结果，本课题组的同学测定了五种可与水混溶的有机溶剂：丙酮、 二甲亚砜( d m s o ) 、二甲基甲酰胺( d m f ) 、甲醇和乙醇对稻瘟霉菌株生长的影响情况， 见t a b l e1 1 。d m s o 、d m f 和乙醇在极低的浓度下抑制菌丝的生长；丙酮和甲醇在浓 度低于5 时是可用的，但丙酮会损坏塑料制的9 6 孔板。因此如果必要的话，先将待测 物质溶解于甲醇中，然后让分析孔中的有机溶剂挥发掉或者将溶液用水稀释后再进行测 定。 t a b l e1 1 有机溶剂对稻瘟霉菌株的影响 复旦大学博士学位论文 海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究 2 海绵共附生系状菌活性菌株的筛选 2 1 试验材料 2 1 1 样品来源 0 5 年两次采集于日本冲绳阿嘉岛海域的海绵来源的系状真菌样品共计1 0 0 株。筛选 模型用的稻瘟霉( d r i c u a r ao r y z a el - 2 b ) 菌株由日本东京大学分子细胞生物研究所提 供。 2 1 2 样品制备 将1 0 0 株海绵来源的系状真菌样品接入含2 0 m l1 2p d 发酵液的1 0 0 m l 三角烧瓶中， 恒温2 0 1 2 培养2 1 天，发酵液用等体积8 0 丙酮水溶液灭活，取l m l 提取液，浓缩十倍待 用。从发酵液中吸取l m l 丙酮混合液，浓缩至5 0 0 止，用l m l 7 , 酸乙酯分三次萃取，合 并乙酸乙酯层浓缩得浸膏，加入1 0 0 吐，甲醇配成样品溶液。 2 1 3 孢子悬浮液的制备 稻瘟霉p - 2 b 菌株斜面培养基的成分：0 2 酵母提取物，1 可溶性淀粉和2 的琼脂。 稻瘟霉p - 2 b 菌株接种于斜面培养基，在2 7 的霉菌培养箱中培养1 2 1 4 天。培养好的 菌，在试管中加入4 0 m l 蒸馏水，完全刮取孢子，过滤除去菌丝，得到孢子悬浮液。在 悬浮液中加入2 酵母提取物，并调节最终溶液中酵母提取物的浓度为0 0 2 。加入酵母 提取物前，在显微镜下观察滤液中的孢子数目，要求加入蒸馏水后悬浮液中的孢子的浓 度为4 x 1 0 4 m l 。 2 2 实验方法 生物活性检测是利用9 6 孔细胞培养板来进行的。9 6 孔板共有8 行1 2 列，第1 、2 列用 来做阳性对照，最后- - n 用来做阴性对照。阳性对照的标准品采用的是r h i z o x i n 和 g r i s e o f u l v i n 。r h i z o x i i l 最终浓度依次为7 4 0 n m 、2 5 0 r i m 、8 2 r i m 、2 7 r i m 与9 r i m 。每孔内加 入孢子悬浮液，加样品或者对照用标准品的，每孔加1 0 0 此，其余每孔加入5 0 皿，。第l 列和第2 列的第一个孔内分别加入对照品溶液，纵向倍倍稀释直到最后一孔。第3 列加入 样品4 皿，( 每块板可以做8 个样品) ，横向倍倍稀释直到第1 1 列。阴性对照的一列，每一 孔中仅仅加) k 5 0 此孢子悬浮液加样后的9 6 孔板在2 7 1 2 下培养1 6 , b 时，然后在倒置显 微镜下观察孢子生长及菌丝生长形态变化情况，根据前述活性指标，判断活性。 1 3 复旦大学博士学位论文海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究 2 3 活性结果 对0 5 年1 月采集的海绵共附生系状菌5 0 株样品，进行稻瘟霉活性检测，共筛选得 到1 5 株活性菌，测定结果见t a b l e1 2 。再对这1 5 株活性菌进行活性稳定性检测，得到 活性强且稳定的菌株6 株，即0 5 j j 心j f l 5 l 、0 5 j a n f1 5 4 、0 5 j a n f1 5 5 、0 5 j a n f1 6 3 、 0 5 j a n f1 6 5 和0 5 j 肘盯1 6 6 。 对0 5 年4 月采集的海绵共附生系状茵5 0 株样品，进行稻瘟霉活性检测，共筛选得 到1 5 株活性菌，测定结果见t a b l e1 3 。对这1 5 株活性菌进行活性稳定性检测后，得到 活性强且稳定的菌株3 株，即0 5 a b r l l 6 、0 5 a b r l 2 1 和0 5 a b r l 4 5 。 t a b l e1 2 a c t i v i t ya g a i n s tp o , y z o eo f 1 5s p o n g e - a s s o c i a t e df u n g is t r a i n s ( 0 5 j a n f ) 编号丙酮提取乙酸乙酯提取 0 5 j 蕊1l 2l 4ll 21 ，41 ，81 1 6 1 4 2+ b x h+b+b 1 4 8士xx h + + ，+ - 趱 x | + h 抖h 羹5 毒 4 - 1 - if4 -xxx卅十m 鹣誊 + + xxx卜 1 6 0xxx 抖bxxx + 遵 x 卅+ + x x ，斗+ 1 6 s +- xx + h + + 士 邋 一xx懈h ，+ 1 7 0 - if- i - - 1 7 l+ + b 一x x + + b 1 7 4+ + b - + + b 1 7 6x - xx 卅 1 7 9 士 - 斗_ 卜b b 1 8 2 卜b - x+ + b “1 ”指原样品：“1 2 ”指浓度稀释到的。l ”的1 2 ：“1 4 ”指浓度为“1 ”的1 4 ：依此类推。 1 4 复旦大学博士学位论文海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究 t a b l e1 3 a c t i v i t ya g a i n s tr o w 挪eo f1 5s p o n g e - a s s o c i a t e df u r i g ls t r a i n s ( 0 5 a b l n 丙酮提取乙酸乙酯提取 0 5 a b r ll 2l ，411 2 1 ，4 l 8 1 0 2- h - b+ b 1 1 4xx卅xx 阡x ，卅+ + ，+ b 1 1 5- i - bb 粼x ，卅 卅+ + + 1 1 7卅一b 1 1 8+ bb一 1 1 9+ bb 1 2 0x h卅，h - b+ bx+- h -+ i 缢x + 什x ，十h卅 + 1 2 3 + + + l 、七+ 一+ 抖+ + f + bb 1 2 6j-b? 鼬+ h -持h bb 1 3 3+ b一 1 3 5-bb 1 4 0j-bbb i 猫xh 斗，抖b 一x 卅x h卅卅 “1 ”指原样品：。i 2 ”指浓度稀释到的。1 ”的1 2 ：“1 4 ”指浓度为“1 ”的1 4 ：依此类推。 复旦大学博士学位论文 海绵共附生系状菌中生物活性物质的研究 第二章活性菌株0 5 j a n f l 6 3 1 6 5 中生物活性物质的研究 l 、活性菌株0 5 j a n f l 6 3 1 6 5 的分离和纯化 海绵来源的系状真菌样品0 5 j a n f l 6 3 1 6 5 采集自日本冲绳阿嘉岛海域，挑取少量 带有菌丝的琼脂置于装有1 0 0 0 止无菌水( 含5 0 海水) 的离心管中，搅拌振荡后吸取上 清液1 0 0 皿加入第二个装有9 0 0 皿，无菌水( 含5 0 海水) 的离心管中，得到l o 2 的 稀释度，并依次稀释至1 0 、1 0 一、1 0 一，取1 0 2 1 0 一5 各浓度的稀释液1 0 0 止分别 涂布于固体琼脂平板( 1 2p d a 培养基，含5 0 海水) ，2 0 c 倒置恒温培养4 7 天。从 培养好的平板中挑取单菌落划线于分离培养基上，2 0 c 倒置恒温培养4 7 天。该菌株 在琼脂平板表面呈粉红色绒状，琼脂板背面呈紫红色。培养时间越长，红色越深。 2 、真菌0 5 j j j 岍1 6 3 1 6 5 发酵液浸膏提取与化合物分离纯化 2 1 挑取带有真菌0 5 j a n f l 6 5 的琼脂块置于l l 发酵液中，2 0 静置恒温培养2 l 天后，加入等体积的8 0 丙酮水溶液灭活。抽滤除去菌丝得丙酮水溶液，减压蒸去丙 酮。用乙酸乙酯依次萃取三遍( 1 l 水溶液a 8 0 0 、6 0 0 、4 0 0 m l 乙酸乙酯) ，乙酸乙酯层合 并浓缩得乙酸乙酯浸青0 5 j a n f l 6 5 e ( 1 9 4 7 r a g ) 。s e p h a d e xl h - 2 0 柱层析分离，用正 己烷：二氯甲烷：甲醇( 4 ：5 ：1 ) 的溶剂进行洗脱，t l c 检测后合并得到8 个组分。分别将 组分和组分用正相硅胶柱及反相o d s 柱进一步分离和纯化，最终得到化合物 0 5 j a n f l 6 5 2 2 2 ( 1 1 4 m g ) 和0 5 j a n f l 6 5 3 - 2 - 2 - 2 ( 3 3 m g ) 。f i g u r e2 1 是化合物 0 5 j a n f l 6 5 - 2 2 - 2 和0 5 j a n f l 6 5 3 2 2 - 2 分离流程图。 2 2 真菌0 5 j a n f l 6 3 的3 l 发酵液，2 0 c 静置恒温培养2 l 天，方法同2 1 得乙酸 乙酯浸膏0 5 j a n f l 6 3 e ( 8 0 0 m g ) 。s e p h a d e xl h - 2 0 柱层析分离( 正己烷：二氯甲烷：甲醇 4 ：5 ：1 洗脱) ，t l c 检测后合并得到6 个组分。将组分用正相硅胶柱进一步分离和纯化， 得到化合物0 5 j a n f l 6 3 - 5 - 5 ( 2 8 m g ) 。f i g u r e2 2 是化合物0 5 j a n f l 6 3 5 - 5 分离流程图。 再次发酵5 l ，得到乙酸乙酯浸膏0 5 j a n f l 6 3 e ( 1 0 2 5 2 9 ) 。s e p h a d e xl h - 2 0 柱层析分 离得到9 个组分。将组分与第一次发酵得到的组分合并得到3 4 9 m g ，用正相硅胶柱 进一步分离和纯化，得到化合物0 5 j a n f l 6 3 - 2 3 - 1 1 - 6 ( 9 3 m g ) 。f i g u r e2 3 是化合物 0 5 j a n f l 6 3 - 2 3 1 1 - 6 分离流程图。 1 6 兰呈查兰堡主兰竺丝苎 堡丝茎堕生墨鉴堕生望重丝塑堕盟! 壅 t l c f i g u r e2 1 真菌0 5 j a n f l 6 $ 分离流程 真菌0 5 j a n f l 6 5 发酵液i l ( 2 1 天) 乙酸乙酯e x t 浓缩除去乙酸乙醇 乙酸乙彳膏1 姐蚀 水层 i 取l m l ，浓缩l o 倍测活性， 几乎无活性 丙酮e x t ) n b 。( n o ) 前渍弓 6 - 78 - 1 2 1 3 2 02 1 2 82 9 3 13 2 旧 甲醇洗脱 g r a y ( m g ) 1 2 6 0幽幽8 9 2 3 1 82 9 2 0 0 - 3 0 0 目硅胶4 9 ( 外 1 0 3 0 0 m m ) 2 0 0 - 3 0 0 目硅胶l g 洗脱剂( c m - - s 0 ：i ) 洗脱剂( c m = 3 0 ：1 1 洗脱速度( 5 0 0 u l t u b e ) 非常慢 洗脱速度( 2 m l 2 m i n t u b e ) i t u b e ( n o ) g r a v ( r a g ) m i c0 , g m 1 ) 8 4 5 0 1 1 cc m l 5 ：1 l l l1 2 2 22 3 3 1 甲醇洗脱l 89 - 1 51 6 - 2 4 甲醇洗脱 6 1 幽2 3 5 1 2 1 篮0 9 1 4 1 l co 订1 0 ：1 2 0 逛懿 2 0 05 0 2 0 0 塑簋 5 0 5