（发育生物学专业论文）神经系统特异表达的基因hnp22的克隆和初步的功能分析.pdf

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3 a n dt r i p 3 ，w e r e o b t a i n e d 1 4 3 3pi s a r e u l a t o ro fm u l t i p l eo fs i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y s ，a n d i sp r e d o m i n a n t l y 。p 。8 8 。d i nt h ec n st h er e s u i to fy e a s tt w o h y b r i d i z a t i o ns u g g e s t st h a tt h ef a c t i o no f n p 2 2i n t h er e 2 u l a t i o no ft h en e r v o u ss y s t e md e v e l p m e n ti s m e d i a t e dt h r o u g hi t si n t e r a c t i o n w i t h1 4 3 3i nt h em a p kp a t h w a y t h er o l e so f n p 2 2a n d1 4 3 - 3i nr e g u l a t i n gt h e d y n a m i c so fs y n a p t i cv e s i c l e sa n dm e d i a t i n g n e u r o p l a s t i c i t ya r ea l s od i s c u s s e d - k e y w o r d s ：h n p 2 2 ， c hd o m a i n ，n e r v o u ss y s t e md e v e l o p m e n t ，y e a s t t w o - h y b r i d i z a t i o n 4 山东大学硕士学位论文 日u吾 神经系统是生物体最重要、最复杂的系统，它包含的细胞数量巨大，种类繁 多，而且在神经系统中表达的基因种类也超过其它系统。这些基因在时间和空间 的差异表达，使神经系统能够正常发育和行使功能。有些基因在发育的各个时期 及各种细胞类型中广泛表达，这些基因表达产物一般为持家蛋白或结构蛋白；而 那些在发育分化过程中表达有差异的基因，或是只在高度特化的神经细胞亚群中 表达的基因，则可能具有高度特化的功能，与神经系统行使特殊的功能有关。 随着人类基因组计划的实施，越来越多的基因被克隆出来并进行功能研究， 公共数据库中储存有大量已克隆基因的序列和功能信息。我们充分利用这些数 据，设计选择条件，建立了与人类神经系统发育和疾病相关基因的数据库。因此 利用数据库提供的信息，获得相应c d n a ，然后再利用数据库的分析提供其可能 的功能信息，并进一步设计实验证实，是目前有效的研究新基因的途径之一。 在搜索神经系统特异表达基因的过程中，我们将目光集中于n p 2 2 。它是一 个在脑高表达的基因，且在不同的神经细胞亚群中表达有显著差冥，这提示了 n p 2 2 蛋白在中枢神经系统中具有特殊的功能。 c h ( c a l p o n i nh o m o l o g y ) 结构域是一个在进化上保守性很高的结构域，分 为5 个类型。含有c h 结构域的蛋白归为c h 超家族。根据所含c h 结构域的数 量和种类不同，该家组成员可分为l 2 型c h 家族，3 型c h 家族，和4 5 型c h 家族【】。( 图1 ) 虽然c h 结构域有很高的保守性，其功能却是多样化的。c h 结构域最基本 的功能是结合细胞骨架成分a e t i n 。1 2 型c h 家族成员，包括a a c t i n ，s p e c t r i n ， f i l a m i n 等，同时含有位于n 端的l 型c h 结构域和位于c 端的2 型c h 结构域， 两个c h 结构域共同构成一a c t i n 结合结构域( a e t i nb i n d i n gd o m a i n s ，a b d s ) ，将 f - a c t i n 与其它纤维网络，或是将a c t i n 细胞骨架与多种膜结合蛋白相连。虽然 结构相似，但1 型和2 型结构域在结合a c t i n 中所起的作用有所不同。1 型c h 结 构域可独立结合a c t i n ，2 型则不能结合a c t i n t 2 卅。2 型的作用可能在于提供一个 山东大学硕士学位论文 低亲和力的锚定位点，将蛋白定位到a c t i n 纤维上。 f i g 1 t h e s u p e r f a m i l y o f c hd o m a i n c o n t a i n i n g m o l e c u l e s a l le n t r i e sa r e h u m a n ，w i t ht h ee x c e p t i o no f c o r t e x i l l i na n di n t e r a p t i nw h i c ha r eu n i q u ef o r d i c t y o s t e t i u md i s c o i d e u m l i g h tb l u er i b b o n ss y m b o l i z em u l t i p l e ( n ) c o p i e so f i d e n t i c a ld o m a i n s 图1 c h 超家族成员示意图。 除了结合a c t i n 以外，c h 结构域还有极其复杂多样的作用。对3 型c h 结构 域的研究丰富了这方面的认识。含有3 型c h 结构域的蛋白包括c a l p o n i n 家族， v a v 家族，i q g a p 家族等，它们一般只含有一个n 端的c h 结构域，这个结构 域几乎不结合a c t i n 5 i ，那么它们有什么作用昵? 山东大学硕士学位论文 这类c h 结构域蛋白中了解最多的是c a p 家族。其代表成员c a l p o n i n 是一 个主要存在于平滑肌中的蛋白，在平滑肌收缩中起重要作用。c a l p o n i n 虽有结合 a c t i n 的能力，但结合位点并不位于c h 结构域内，而是位于c h 结构域c 端之 后的t a 一l i k ed o m a i n 吼那么c h 结构域究竟起到什么作用呢? 有研究表明， c a l p o n i n 中的c hd o m a i n 虽不结合a c t i n ，但可结合其他细胞骨架成分，包括 t u b u l i n 和中间纤维蛋白。这说明，c a l p o n i n 很可能是作为一种脚手架蛋白，稳定 细胞骨架的结构。 更令人兴奋的发现是，k a t h ym o r g a n 7 , 8 1 的实验室报道，c a l p o n i n 和一a c t i n 的c hd o m a i n 都可以与m a p k 途径中的信号分子e r k l 2 有直接的相互作用。 这使得c a l p o n i n 很可能扮演信号通路中的接头分子( a d a p t o r m o l e c u l e ) 的角色。 另外还有实验证实，c a l p o n i n 同时也可以在体外直接结合p k c ，结合位点位于 p k c 的调节结构域，可能有助于p k c 的活化 9 1 。从这些结果综合来看，c a l p o n i n 很可能作为一个信号分子活化p k c ，并作为接头分子把e r k 和p k c 共同定位 于细胞膜【7 , 9 1 。但究竟是什么作用使他们定位于细胞膜，在共定位的过程中发生 了什么什么样的变化，咀及这过程中还有没有其他分子的参与，目前还不是很 清楚。 c a p 家族还有一个重要成员值得一提，平滑肌特异蛋白s m 2 2 ，又叫 t r a n s g e l i n 。与c a l p o n i n 类似，它有一个n 端的c h 结构域，和一个c a p 1 i k e c 端 重复序列。但s m 2 2 缺少c a l p o n i n 中的t n i 1 i k ea c t i n 结合结构域【1 0 1 。究竟s m 2 2 能否结合a c t i n 尚无定论，但许多证据表明，它确实与细胞骨架的组织有关。s m 2 2 缺失的小鼠中a c t i n 纤维的分布有显著变化。s m 2 2 是p k c 磷酸化的底物，当p k c 与s m 2 2 结合并将其磷酸化后，a c t i n 体外沉淀被抑制【l l j 。 虽然c h 超家族蛋白成员众多，功能复杂，但神经系统特异的成员并不多见。 我们得到的n p 2 2 基因表达产物正是一个中枢神经系统特异表达的c h 结构域蛋 白。研究该基因，有助于我们更深刻的理解c h 家族的功能多样性，进一步丰富 对c h 这一保守结构域的认识。 酵母双杂交系统是近年来发展起来的研究蛋白质相互作用的种遗传体系 分析方法1 1 2 i 。该方法的建立是根据真核细胞转录激活因子的特点，即转录因子 山东大学硕士学位论文 是由功能相对独立的结合结构域( d n a b i n d i n g d o m m n ，b d ) 和转录活化结构域 ( a c t i v a t i o nd o m n n 、a d ) 组成的， 它们之间通过共价或非共价连接建立的空 间联系是导致其结合和激活转录功能序贯发生的关键，任何一方单独均不能产生 转录激活的效应。一对相互作用的蛋白x 、y 可以使分别与它们形成融合蛋白 的b d 和a d 在空间上接近而重新形成一个转录激活功能整体。因此，分别构 建表达上述两种融合蛋白的质粒p b d x 、p a d y ，并使之共转入酵母，分布于 核内的这两种融合蛋白能否使b d 和a d 重新成为具有功能的转录激活因子而使 报告基因表达，即成为间接判断x 和y 是否存在相互作用的标志。该系统由于 借助了酵母的蛋白质合成与加工体系，较之体外环境更能反映复杂而又变化着的 生理条件下的实际情况。通过转录激活作用还可使较弱的蛋白质问相互作用得到 显著放大，是一种灵敏度很高的方法。它的最大优势是可以不经蛋白质，而直 接从文库中筛选目的基因，简便迅速，使得大规模研究蛋白质相互作用成为可能。 本文采用n o r t h e r n 杂交方法初步研究了n p 2 2 基因在胚胎发育和细胞分化过 程中的作用。这些研究是首次对n p 2 2 基因在胚胎发育和细胞分化中的功能进行 的探讨，提示了n p 2 2 与脑的早期发育有显著相关性。 为了进一步探讨n p 2 2 调节胚胎发育和细胞分化的分子机制，及其在中枢神 经系统发育所涉及的一系列信号转导过程中可能的作用，我们利用酵母双杂交体 系寻找n p 2 2 编码蛋白质在体内环境中的作用配体。我们选择n p 2 2 核心区域c h 结构域作为诱饵蛋白，筛选人脑p a c t 2e d n a 文库，寻找该片段的结合物，并 对筛到的基因表达产物1 4 - 3 3b 与n p 2 2 的结合在神经发育和功能中可能的作用 进行了讨论。n p 2 2 的相互作用蛋白以前未见报道，俪且c h 家族成员与1 4 3 3 家族成员之间的相互作用也是第一次发现。这一结果加深了我们对于c h 这一成 员众多、功能多样的超家族的了解。 山东大学硕士学位论文 实验材料 1 主要化学试剂及实验材料 i p t g 购自p r o m e g a 公司。d e p c 、s d s 、明胶、溴化乙锭等为s i g m a 公司产 品。三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) 、琼脂糖、尿素、鲑精d n a 与酵母t r n a 等购自g i b c o - - b r l 公司。其它各种试剂为进口或国产分析纯试剂。 2 工具酶、分子量标准及试剂盒 t 4d n a 连接酶、碱性磷酸酶均购自美国b i o l a b s 公司或日本t a k a r a 公司。各 种限制性内切酶及分子量标准为协和友谊开发公司产品。忍gd n a 聚合酶，p 而 d n a 聚合酶购自上海s a n g o n 公司及大连t a k a r a 公司。总r n a 提取试剂盒t r i z o i 购自美国g i b c ol i f et e c h n o l o g i e s 公司。d n a 凝胶回收纯化及质粒快速提取试 剂盒购自北京博大公司。 3 质粒载体 n p 2 2c d n a 克隆所用载体p g e m te a s y 购自p r o m e g a g 公司，酵母表达载体 p a s 2 一i ，p a c t 2 购自c l o n t e c h 。 所用载体的结构简图如下： 图2 p g e m te a s y 结构及多克隆位点 6 4 7 0 7 7 7 7 8 8 9 0 9 7 1 0 9 1 1 8 1 2 7 1 4 1 a8 ，卵昭的。i 山东大学硕士学位论文 鬻t 鬻c g 篙g a g 舞f i t 丽蒜c ；g t 黼c a 6 劂a c t g t a 。疏 t c g 盯 a c c 胁 t t gf 品c 6 丽而e 丽而 蛳 温 t - - 一 4 h i 一“”m ”7 端半镑擎平 篙鬻鼯裟产群唔擎“ s l j l j _ t q 盘 丌c c gg g c g p , t t t c t f a t g 丌t a 鲫丌”耵t t e 丛 丁从叶t t “ m a l 从b t g 船揣 $ t g p i t a t a c a a , e , i i - 丌：a a a g w a c t c t r a 6 6 t 1 3 t h , 岫, a c n _ 1 五商丽磊而孤忑一 m n - - n i 图3 p a s 2 1 结构及多克隆位点 曼世生! 悭- 。! 望錾趟竺 i 试赢币五而面葡而丽前赢汛而爵赢万丽面函高赢i i 面 舞旨意遗必，。蕊孺蒜熟霜瓣丽。 ，卿面蒜耪嘲豁嘴等黜帮黑 ，lc i 轴i ，1 赢弭t _ f 啪i = 2 i i 打却f ?业m “ 塑驾坐盟! 些! 丝! 型堂! 塑垡! 丌c m c l g t 自c t c 口t b c c w c t c 艘错翟i j 棼= 图4 p a c t 2 结构及多克隆位点 山东大学硕士学位论文 4e d n a 文库 人脚n c d n a 酵母双杂交文库购自美国c l o n t e c h 公司，人三月胎脑与大小鼠脑 z a pe x p r e s se d n a 文库由本室构建。 5 细胞株 s h y 5 y 、m 1 7 细胞株均由本室保存。 6 培养基 酵母双杂交培养基所需氨基酸、3 - a t 、c y c l o h e x i m i d e 购自s i g m a 公司。m e m 培养基和d m e m 高糖培养基为g i b c o 公司产品；胎牛血清为h y c l o n e 产品 7 菌株( 见表1 ) 表1 常用菌株一览表 菌株基因型用途 d h 5a s u p e 4 4 a c e l 6 9 ( ，8 0i a c z一种用于铺制与培养质粒和粘 a 艟1 5 1 h s d r l 7f e c a ie n d d i粒平板的重组缺陷的抑制型菌 g y r d 9 6t h f jr e l a l 株 艟a t au r a 3 5 2h f s 3 2 0 0一种用于基于g a l 4 的酵母 y l g o l y s 2 8 0 1 a d e 2 10 1双杂交系统文库筛选的酵 t r p i 一9 0 1l e u 2 一只1 1 2母菌株 g a l 4 。5 4 2g a l 8 0 1 5 3 8 c y h 2 2 l y s 2 ：g a llu $ - - o a l l l t l t h i s 3 。 u r a 3 ：6 a l 4 m ( x3 i c y c l t t t 一l a c z s f y 5 2 6融a t au r a 3 5 2h i s 3 2 0 0一种用于基于g a l 4 的酵母 l y s 2 。8 0 1 a d e 2 1 。10 1双杂交系统相互作用验证 t r p i 一9 0 17 e u 2 一只1 1 2的酵母菌株 g a 7 4 ag a 7 8 0 4 l y s 2 ：g a l lu 。s g a l lt t 一h i s 3 b r a 3 ：g a l lu ts g a l lr it 一l a c z 山东大学硕士学位论文 8 引物( 见表2 ) 引物由上海生工公司合成，p a g e 纯化。 表2 本研究所用的引物 引物名称序列 用途 p lc c a t a t c c c a g c c c c g t c t g 用于扩增n p 2 2c d n a p 2 c c a g g g a c a g a a g g c t t t g a g a 从g p 3g a a t t c a t g g c t 从c a g g g g c c c g 构建酵母双杂交载体扩增 p 4g g a t c c c t a c c a g g g g c a g g a t g cn p 2 2 全编码区 p 3g a a t t c a t g g c t a a c a g g g g c c c g 构建酵母双杂交载体扩增 l 5g g a t c c c t a g c c a t c a t c c t t g g t g a c t g n p 2 2 一c h 结构域 9 放射性同位素 ( 3 2 p 1d c t p 与d a t p 购自英 a m e r s h a m 公司及亚辉公司。 1 0 杂交探针 p 刀探针采用p c r 方法扩增酶切阳性克隆制备。1 3 a c t i n 探针来自多组织杂 交膜( c l o n t e c h 公司) 试剂盒。 1 1 主要仪器 本实验所用主要仪器有： c 0 2 细胞赔养箱( n a p c os e r i e s5 4 0 0c 0 2i n c u b a t o r ) 低温离心机( i e c 公司) 紫外交联仪( b i o r a d ) p c r 仪 p r o g r a m m a b l et h e r m a lc o n t r o l l e r ，p t c 1 0 0 t m m 】r e s e a r c h ，i n c ) 台式高速离心机( t g l 1 6 g ，上海医用分析仪器厂) 衡压衡流电泳仪( d f c d f d ，北京东方仪器厂) 恒温水浴箱( $ 6 4 8 ，上海医疗器械七厂) 同位素探测器( m i n i m o n i t o r ，s e r i e s9 0 0 ，b r i t i s hm a d e ) 空气浴振荡器( h z q c ，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司) 杂交炉及杂交管( h y b a i d ，英国) - 2 0 低温冰箱( 上海制造) 山东大学硕士学位论文 一7 0 低温冰箱( b a x t e r ，美国) 电子天平( m e t t l e r ，a e2 4 0 ，s w i t z e r l a n d ) 超净工作台( 北京半导体设备一厂) 2 0 0 。c 干烤箱 1 2 d n a 序列分析软件 c d n a 序列的翻译、酶切位点分析多重排列比较、进化树分析与亲疏水分析 d n a m a n4 o 版本( l y n n o nb i o s o f t ) 。引物设计软件为o l i g 0 6 o 版本。 山东火学硕士学位论文 实验方法 一分子克隆 1 酵母表达质粒的构建： p a s 2 1 n p 2 2 ：将n p 2 2 全长c d n a 中的整个读码框克隆于d a s 2 1 ( c o n t e c h ) 载 体中 p a s 2 - 1 c hd o m a i n ：将编码c h 结构域的3 3 6 b p 序列按正确读码框克隆于p a s 2 1 ( c l o n t e c h ) 载体中 2 ，从e d n a 文库中扩增n p 2 2 全基因 以前述p 1 及p 2 引物从人三月胎脑c d n a 文库中进行p c r 扩增，条件：9 4 。c 预 变性3 m i n ，9 4 。c 变性3 0 s ，x 。c 退火3 0 s ，7 2 6 c 延伸l m i n ，9 个循环( x = 6 8 5 8 ，每循环降低1 ) ；9 4 。c 变性3 0 s ，5 8 。c 退火3 0 s ，7 2 。c 延伸i m i n ，2 5 个循环，7 2 。c 再延伸l o m i n 。p c r 产物经1 弘琼脂糖凝胶电泳分离后，胶回收 试剂盒回收。回收的d n a 连接于t - e a s y 载体进行蓝白斑筛选，选出的阳性克隆 进行d n a 测序。 3 p c r 扩增构建酵母双杂和细胞转染所用克隆的目的片段 根据基因e d n a 阅读框架序列设计g l 物扩增所需编码区，引物上的5 端含有酶 切位点。引物序列如前述。 以含全长基因的c m 纠克隆为模板，用p f ud n a 聚合酶扩增。反应体积为2 0ul ， 成分为l o m mt r i s - h c l ( p h9 0 ) ，0 1 t r i t o nx 一1 0 0 ，5 0m mk c l ，1 5 m m 的m g c l ：， 2 0 0i lmd n t p ，上游引物和下游引物各0 5n m ，质粒模板d n a5n g ，l u d n a 聚合 酶。p c r 扩增程序均为9 4 3 m i n ：9 4 3 0 s ，m c 3 0 s ，7 2 n s ，共3 0 个循环，7 2 l o m i n ( m ，h 值根据引物及扩增片段不同而不同) 。 4 d n a 的酶切、连接 p c r 产物及t - e a s y 载体连接，4 过夜，转化d h 5a 菌进行蓝白斑筛选，3 7 。c 过 夜培养后，挑取白斑小提质粒，酶切，琼脂糖电泳后切下相应的条带，用博大公 司的胶回收试剂盒回收d n a 片段。插入片段和质粒载体的的连接、转化方法同前。 5 d n a 片段的回收 d n a 片段的胶回收使用博大公司的胶回收试剂盒( q i a q u i c kg e l e x t r a c t jo n k i t ) 。 1 4 山东火学硕士学位论文 1 ) 切下含d n a 的琼脂糖块，使它尽可能小。放入1 5 m l 离心管中。 2 ) 按每l o o m g 琼脂糖3 0 0 u1 溶胶液的比例加入溶胶液，置5 5 。c 水浴1 0 分钟。 每2 分钟颠倒混匀一次。 3 ) 待凝胶完全溶解后，加入1 0ul 玻璃奶，振荡混匀，将离心管置于冰浴中1 0 分钟，每隔2 分钟颠倒混匀一次。 4 ) 1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 分钟。吸出上清。 5 ) 向离心管中加入5 0 0u1 漂洗液，吹打混匀后，离心3 0 秒钟。 6 ) 重复步骤( 4 ) 一次。再将离心管1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 分钟。 7 ) 将离心管置于3 7 。c 培养箱中干燥约1 5 分钟。 8 ) 待玻璃奶干燥后，向离心管中加入3 0 u 卜4 0 u1 无菌水，置于6 0 水浴中温 育1 0 分钟后，1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 分钟。 9 ) 小心吸取上清，即为回收的d n a 。 。 6 d n a 片段的克隆和鉴定 6 1 连接反应体系 1 0 t 4d n al i g a s eb u f f e r 目的d n a 片段 质粒载体d n a d d h 2 0 lul 1 0 0 3 0 0 n g 2 0 5 0 n g 补足1 0 u l t 4d n al i g a s e5 1 0u 1 6 。c 或46 c 连接( t e a s yv e c t o r ) 过夜 6 2 转化 连接产物加入2 0 0u1 c a c l 2 法制备的d h 5a 感受态细菌 1 0 ，冰上放置 3 0 m i n ，4 2 。c9 0 s e c ，加入8 0 0 “ll b 液体培养基，3 7 。c 轻摇4 5m i n 。将转化的 细菌涂于含特定抗生素的平板上，3 7 。c 倒置培养1 2 一1 8h r 。 6 3 重组克隆的鉴定 6 3 1 阳性克隆的酶切鉴定 1 0 b u f f e r ( 根据所用的内剀酶采用公司 提供的最适b u t l f e r ) 质粒d n a 相应的内切酶 u 扣l ；) 山东大学硕士学位论文 d dh 0 0 3 7 2h r s 总体积2 0 i jj 6 3 2 阳性克隆的p c r 鉴定 p c r 反应体积为2 0 ul ，含l o m mt r i s h c ( p h9 0 ) ，0 1 9 6t r j t o nx - 1 0 0 ， 5 0m mk c i ，1 5m mm g c l 22 0 0 i jmd n t p s ，0 8 ut a qd n a 聚合酶，引物为载体 多克隆位点两侧的测序引物或克隆d n a 的特异引物，浓度为0 5 l lm ，牙签挑取 单菌落在p c r 反应体系中漂洗，在另一含相应抗性的l b 平板上复制并做标记。 循环条件如下：9 4 。c 预交性3 分钟，9 4 3 0 秒、m 4 c 3 0 秒、7 2 c n 秒、共3 5 个循环，7 2 cl o 分钟。p c r 产物用琼脂糖电泳检测。将平板放于3 7 c 培养过夜 后，从复制平板上挑取p c r 阳性的克隆提取质粒作进一步分析( m ，n 值根据引 物及扩增片段不同而不同) 。 7 ，质粒的提取和纯化 7 1 试剂 溶液i 5 0i i l m葡萄糖 2 5m m t r i s c l ( p h80 ) 1 0m m e d t a ( p h 8 0 ) 溶液i l i 5m 乙酸钾6 0m l 冰乙酸 1 1 5m 1 水2 8 5m l 溶液1 1 0 2mn a o h ( 由1 0mn a o h 新鲜配制) 1 s d s 7 2 碱裂解法提取质粒及质粒快速提取法 挑耿单个菌落接种于含相应抗生素的3 m l 培养基中，3 7 振荡培养过夜。 取菌液于离心管中，1 2 ，0 0 0 9 离心1 分钟。将沉淀悬浮于l o o ul 溶液i 中，加 入2 0 0 ul 新配制的溶液1 i ，混匀，冰浴5 分钟，然后加入1 5 0 ul 溶液i i l ，混匀 后冰浴5m i n 。在室温下，离心l o 分钟，收集上清液。5p _ r n a s e ( 1 0m g m 1 ) 3 7 消化3 0m i n ，等体积的酚氯仿抽提，上清加入两倍体积的无水乙醇，混匀， 室温沉淀5 分钟。l ，2 0 0 0 9 离心1 0 分钟，7 0 乙醇洗涤。室温晾干沉淀，溶于 2 0ul d d h 2 0 中。 质粒快速提取法的原理、摇菌及菌液沉淀步骤同碱裂解法。在沉淀中加入 5 l r n a s e a ( 1 0m g m 1 ) 及1 0 0 1 _ i i 溶液i ，混匀后加入1 5 0 p l 新配溶液i i ，颠 1 6 山东大学硕士学位论文 倒6 次，冰浴1 分钟，然后加入1 5 0 9 i 溶液i i i ，混匀后冰浴5 分钟。随后再加 入4 2 0 p lb i n d j n gb u f f e r ，混合后加入吸附管中。离心8 分钟，弃废液。洗涤 液3 0 0 p 清洗2 次，第二次离心2 分钟完全去除洗涤液。在吸附管中加入3 0 “l 洗脱液，放置1 分钟后离心1 分钟，离心液于一2 0 。c 保存。 7 3 质粒大量提取的方法按照q i a g e n 质粒纯化手册进行。 二细胞诱导分化后m r n a 表达水平检测 1 细胞培养 u 2 5 1 和s h s y 5 y 细胞分别生长于含1 0 热灭活胎牛血清、2 m m 谷胺酰胺、 5 0 u i m l 青霉素和5 0 m g m l 链霉素的m e m 和d m e m 培养基中，在3 7 ( 2 并充以5 c 0 2 的细胞培养箱中培养生长。 2 细胞诱导分化 正常培养条件下的神经母细胞瘤细胞株m 1 7 和s h s y s y ，当细胞长满培养瓶 表面的7 0 一8 0 ，在m e m 培养基中加入诱导剂全反式维甲酸至终浓度为2 0 m m ，诱 导的时间分别为6 h ，1 2 h ，2 4 h ，4 8 h ，7 2 h 后收获细胞提取总r n a 。 3 组织及细胞r n a 的提取 1 ) 取不同发育阶段胎鼠，称重5 0 9 ，放入预先加入l m l t r i z o l 裂解液的组织研 磨器，上下反复匀浆，直至没有组织块可见。( 细胞提取无此步骤) 2 ) 研磨的粘稠液体吸入1 5 m l 离心管中，静止1 5 分钟，加入2 0 0 pl 的氯仿，剧 烈振动后于室温3 分钟，1 1 , 0 0 0 x g ，4 。c 离心1 0 分钟。 3 ) 吸取上层水相，转移至一新离心管，加入5 0 0 u1 异丙醇，上下混匀，室温放 置1 0 分钟，1 1 ，0 0 0 g ，4 c 离心1 0 分钟，弃上清，每l m l t r i z o l 试剂加入 1 5 m l7 5 的乙醇，振荡，7 ，5 0 0 x g ，4 c 离心5 分钟，弃上清于室温下干燥， 溶于2 0 5 0uld e p c 处理水，测o d 值定量，以a 2 6 0 a 28 0 ，a 2 6 0 a 2 3 0 比值判断 r n a 样品是否有蛋白、苯酚的污染。 4 r n a 的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳及转膜 将适量的琼脂糖加热溶于d e p c 水中，冷却至6 0 ，加入5 x m o p s 凝胶电 泳缓冲液和甲醛，至终浓度分别为1x 和2 2 m o l l ，灌胶并放置至凝固。在 山东大学硕士学位论文 无r n a 酶的离心管中加入r n a ( 约2 0u