（生态学专业论文）薇甘菊对田野菟丝子寄生响应的生理生化和分子机制研究.pdf

t f ，山大学薜十学位论文薇f f f 菊对田野筵丝子寄生响应的生理生化和分子杏猫研究 薇甘菊对田野菟丝子寄生响应的生理生化和分子机制研究 专业：生态学 博士生：李冬梅 导师：彭少麟教授 摘要 薇甘菊是菊科的一种藤本植物，被列为世界上最具入侵力的1 0 0 种外_ 柬物种之一。近二 十年来，薇甘菊入侵华南地区，并对华南地区的生态系统造成严重的破坏。近年来，在华南 地区，用野菟丝子寄生对薇甘菊的生物量积累，生理和生念方面的影响效应研究表明。网野 菟丝子可作为一种控制薇甘菊的有效的方法。为了研究f 同野菟丝子寄生对薇甘菊的生理尘化 和基因表达的影响机理，本论文对此问题进行了初步探讨。结果如下： ( 一) 温室盆栽实验研究表明： ( 1 ) 在田野菟丝子寄生薇甘菊的9 1 8 天内，过氧化氢酶( c a t ) 活性极显著( p 0 0 1 ) 高于对 照，随后在2 7 3 6 天内，降至对照水平；在田野菟丝子寄生薇甘菊的9 1 8 天内，过氧化物酶 ( p o d ) 活性显著( p o 0 5 ) 高于对照，但在2 7 - 3 6 天时，降至对照水平甚至还低于对照；在刚野 菟丝子寄生薇甘菊的9 2 7 天内，抗坏血酸氧化酶( a p x ) 活性极显著( p o 0 1 ) 高于对照，但在 3 6 天时，降至对照水平；在阳野菟丝子寄生薇甘菊的9 3 6 天内，超氧化物歧化酶( s o d ) 活性 均显著( p o 0 5 ) 高于对照。 ( 2 ) 在田野菟丝子寄生薇甘菊的9 3 6 天内，薇甘菊叶片中m d a 含量随寄生时间的延长增 多，并且极显著( p 0 0 1 ) 。 ( 3 ) 田野菟丝子寄生能促进薇甘菊叶中可溶性糖的积累，减少薇甘菊叶片中可溶性蛋白含 量。田野菟丝子寄生使薇甘菊叶中的总叶绿素、叶绿素a 、叶绿素b 含量显著下降，并且随 着寄生时问的延长，下降更为明显。随着田野菟丝子寄生时间的延长，极显著的抑制了r u b i s c o 羧化酶和g o 酶的活性。 ( 4 ) f f l 野菟丝子在寄生薇甘菊的3 6 天内，薇甘菊叶的净光合速率( p n ) ，气孔导度( g s ) ，蒸 腾速率( t r ) 和瞬时水分利用效率( w u e ) 都比对照降低，在3 6 天时，薇甘菊叶的p n ，g s 和w u e 都极显著降低。 ( 5 ) 透射电镜表明，田野菟丝子寄生1 8 天后的薇甘菊叶片的叶绿体形状异常；叶绿体肿 i t i ，山大学博士学位沦文薇”菊对用野菟丝子寄生响应的生理生化和分子机制研究 胀变圆：叶绿体中嗜锇颗粒变多变大，淀粉粒的积累比对照明显增多而且体积增大；病变的 叶绿体呈现小空泡；严重的导致叶绿体从细胞膜脱落，叶绿体膜破裂和叶绿体解体。 ( 二) 构建了两个正向削减文库，共筛选到3 0 3 个薇甘菊的e s t 。这些e s t 编码各种不 同功能的蛋白，如新陈代谢、细胞防御与胁迫反应、转录因子、信号转导、运输和光合作用， 其中一些基因也与其它报道的寄主植物的表达上升的基因有同源性。在薇甘菊的顶芽和茎中， 均发现一些与细胞防御和细胞壁修复相关的基因，但是顶芽和茎中的基因表达模式是不同的。 此外，薇甘菊顶芽中1 6 2 9 的e s t s 和薇甘菊茎中1 7 6 0 的e s t 在n c b i 数据库中匹配到未 知功能。另外，相对定量p c r 检测了2 1 个随机选取的e s t s 在寄生的薇甘菊中的表达水平， 与对照相比，其中1 3 个基因的表达量显著上升。这些结果表明，薇甘菊对阳野菟丝子寄生的 分子响应是一个相当复杂的过程。同时可看出，s s h 文库测序结合定量p c r 可以成功的用来 检测田野菟丝子寄生诱导的薇甘菊基因。总之，本实验构建的削减文库所获得的相关基因， 提供了田野菟丝子寄生对薇甘菊基因表达影响的总的响应情况，同时这些基因片段为以后深 入研究薇甘菊与田野菟丝子的相互作用打下了较好的基础。此外，削减文库中也检测到7 5 个 与植物单链r n a 病毒基因同源性较高的序列，这些发现为田野菟丝子与薇甘菊互作提供了新 的研究视角，即薇甘菊一田野菟丝子一植物r n a 病毒之间复杂的相互作用关系。 ( 三) 利用c d n a 末端快速扩增( r a c e ) 和重叠延伸相结合的方法，从田野菟丝子寄 生的薇甘菊s s h 文库中克隆了一个全长几丁质酶基因的c d n a 和两个n a c 基因的c d n a s ， 并对其进行了基因功能方面的初步研究。 ( 1 ) 根据薇甘菊顶芽的削减文库中的一个与几丁质酶基因有很高同源性的基因片段序 列，设计基因特异引物，采用r a c e 方法克隆了一个全长几丁质酶基因( m m c h i l 基因) ，并对 其进行了生物信息学分析。m m c h i l 基因( g e n b a n k 登录号e u 7 1 6 6 2 5 ) 的c d n a 全长1 2 9 5b p ， 有9 5 7b p 的开放阅读框，预测编码3 1 8 个氨基酸，有5 ib p 的5 u t r ( 非编码区) 和2 8 7b p 的 3 - u t r ，预算编码产物的分子量( m w ) 为3 5 4 2k d a ，等电点( p d 为5 6 9 。m m c h i l 基因的d n a 序列含有两个内含子，长度分别为1 1 7 1b p 和6 2 1b p 。s o u t h e m 杂交结果表明，m m c h i l 基因 在薇甘菊基因组中是一个低拷贝基因家族的成员。r t - p c r 分析表明，m m c h i l 基因在所检测 的组织器官中是特异性表达的。m m c h i l 基因在薇甘菊的顶芽中的表达，受田野菟丝子寄生及 其它非生物因子的诱导。此外，我们构建了原核表达质粒p e t - 3 2 a - m m c h i l ，将其转入大肠杆 菌b l 2 1 ( d e 3 ) 表达菌株，通过i p t g 诱导，经s d s p a g e 分析表明，重组蛋白主要以包涵体 形式出现，相对分子量为5 5k d a 。我们尝试用不同的表达载体、降低诱导温度、调节渗透压 和改变表达的宿主菌等方法。最后，我们将表达质粒p e t - 3 2 a - m m c h i l 转入r a s o t t a - g a m i o m h ；p 出大学姆学位论文薇l 菊对田野篮丝子寄生耐魔熙生瑾生化黍：分子锐利研究 ( d e 3 ) 大肠杆菌菌株，成功地将目的蛋白在细胞质中进行了表达，最佳诱导温度和时间分别是 2 5 和4h 。目的重组蛋白经h i s - b i n dk i t 试剂盒纯化，并且纯化的重组蛋自的最佳p f t 和最 佳温度活性分别为p h5 5 6 5 和3 5 4 0 。 ( 2 ) 从田野菟丝子寄生的薇甘菊的茎的削减文库中，通过r a c e 的方法克隆了两个n a c 基因，分别命名为m m a t a f l 和m m n a p 。核酸序列信息表明。m m a t a f i 和m m n a p 基因都 含有2 个内含子和3 个外显子，并且它们的基因组结构都非常保守。这两个基因的接合位点是 通过基因组序列和其对应的c d n a 序列分析比较得来的。m m a t a f i 和m m 姒p 基因编码的蛋 自序列都含有一个引入注目的n 束端保守结构域和一个高度多交的c 端结构。基于系统进化 的分析，m m a t a f l 和m m n a p 蛋白分别归于不同功能的a t a f 和n a p 亚类。半定量r t - p c r 分析表明，m m a t a f i 和m m n a p 基因在检测的组织里表现不同的表达模式。m m a t a f i 基因 在所有检测的组织星部有表达，但是表达的丰度不同。m m n a p 基因在茎，叶柄，顶芽和矸中 都衡量表达，但在根中不表达。此外，相对定量p c r 分析表明，删捌几和m m n a p 基因在 薇甘菊的茎中的表达被阳野菟丝子寄生所诱导。另外，m m a t a f l 和m m n a p 基因在薇甘菊的 顶芽中的表达也被机械损伤，z n s 0 4 脱落酸( a b a ) 和水杨酸( s a ) 所诱导。将m m a t a f l 和 m m n a p 基因与表达载体p e t - 3 2 a ( + ) 连接构建融合表达载体，并在ec o l i 菌株b l2 1 中进行了 原核表达，s d s 。p a g e 分析表明，i p t g 诱导产生带有h i s 标签的融合蛋白h i s m m a t a f l 和 h i s m m n a p 的分子量( m 0 分别约为4 9k d a 和5 2 k d a 。 本论文的田野菟丝子寄生对薇甘菊的生理生化的影响、讦l 野菟丝子寄生薇甘菊诱导的s s h 文库的构建、克隆c d n a 全长及其基因功能方面的研究取得了初步结果，发现了大量的薇甘 菊基因，为迸一步研究其基因结构和时空表达特性及其生物学功能奠定了基础。本论文的创新 点为：( 1 ) 首次在国际上研究了薇甘菊的顶芽和茎中差异表达的基因对田野菟丝子寄生早期的 分子响应机制。( 2 ) 首次发现了m m a t e l f l 和m m n a p 基因被m 野菟丝予寄生诱导表达。 关键词：薇甘菊，田野菟丝子，抗氧化物酶，抑制削减杂交，基因表达 i i i 中山大学博十学位论文薇i j 菊对用野菟丝子寄生响应的生理生化和分子机制研究 s t u d i e so up h y s i o l o g i c a l ，b i o c h e m i c a la n dm o l e c u l a rm e c h a n i s m si n m i k a n i am i c r a n t h ab yc u s c u t ac a m p e s t r i si n f e c t i o n m a j o r ：e c o l o g y p h dc a n d i d a t e ：d o n g m e il i s u p e r v i s o r ：s h a o - l i np e n g a b s t r a c t m i k a n i am i c r a n t h a ，o n eo ft h e10 0w o r s ti n v a s i v ea l i e ns p e c i e si nt h ew o r l d ，i sap e r e n n i a l v i n eb e l o n g i n gt ot h ea s t e r a c e a ef a m i l y i nr e c e n td e c a d e s ，mm i c r a n t h ah a sc a u s e ds e v e r ed a m a g e t om a n ye c o s y s t e m si ns o u t h e r nc h i n a r e c e n t l y , t h ee f f e c t so fc u s c u t ac a m p e t r i so nm ，m i c r a n t h a i ns o u t h e r nc h i n ah a v eb e e ns t u d i e dw i t hr e s p e c tt ob i o m a s sa c c u m u l a t i o n ，p h y s i o l o g ya n de c o l o g y t h e s er e s u k ss u g g e s t e dt h a tc c a m p e s t r i sc o u l db eu s e da sa ne f f e c t i v ew a yt oc o n t r o lm m i c r a n t h a 、d a t ao ne f f e c to fm m i c r a n t h ap h y s i o l o g ya n db i o c h e m i s t r y , a n de x p r e s s i o no fm m i c r o n t h ag e n e sd u r i n gcc a m f e s t r i si n f e c t i o nh a sn o tb e e na c q u i r e ds of a r , h o w e v e r t h ep u r p o s e o ft h ep r e s e ms t u d yw a st or e s e a r c hc h a n g e so fmm i c r a n t h ap h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l i n d e x e sf o r3 6d a y s 疗o mi n f e c t i o ns t a r t i n gp o i n t a n dt oi d e n t i f yg e n e si ns h o o t sa n ds t e m so fm m i c r a n l h a , w h i c hw e r ei n d u c e di nu p o ni n f e c ti o nw i t hcc a m p e s t r i sa te a r l yp o s t p e n e t r a t i o n s t a g e s t h em a i nr e s u l t so b t a i n e di nt h i ss t u d yw e r ea sf ol l o w s ： p o i n to n e ：t h ec h a n g e so fa n t i o x i d a t i v ee n z y m e s a c t i v i t i e s ，c o n t a i n i n gs u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ，c a t a l a s e ( c a t ) ，g u a i a c o lp e r o x i d a s e ( p o d ) a n da s c o r b a t ep e r o x i d a s e ( a p x ) ，c o n t e n to f m a l o n a l d e h y d e ( m d a ) ，c o n t e n to fs o l u b l es u g a r , c o n t e n t so fs o l u b l ep r o t e i n s ，c o n t e n t so f c h l o r o p h y l l ，i n d e x e so fp h o t o s y n t h e s i s ，a c t i v i t i e so fn a b i s c oc a r b o x y l a s ea n dg l y c o l a t eo x i d a s ea n d s t r u c t u r eo f c h l o r o p l a s t ，w e r ea n a l y z e da f t e rcc a m p e s t r i si n f e c t i o nf o r3 6d a y s t h er e s u h sw e r ea s f o l l o w s ：( 1 ) c a ti n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yt h a nt h a to fc o n t r o l ( p 0 0 1 ) f r o m9t o 1 8d a y sp o s t i n f e c t i o n ( d p i ) ，b u ti t d e c r e a s e dt ot h el e v e lo fc o n t r o lf r o m2 7t o3 6d p i a l t h o u g hp o dw a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fc o n t r o l ( p o 0 5 ) f r o m9t o18a o i ，i tr e d u c e dt ot h ec o n t r o ll e v e l e v e nl e s st h a nc o n t r 0 1 a p xw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h el e v e lo fc o n t r o lf r o m9t o2 7d p i ，b u t r p 山大学博士学位论文薇汀菊对币野蕴丝子寄生响应酌生理生彳乇和分子机制骈究 i td e c r e a s e dt ot h el e v e lo fc o n t r o la t3 6d p i s o dw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fc o n t r o lf r o m 9t o3 6d p i ( p o ，0 5 ) ( 2 ) t h ec o n t e n to fm d ai ni n f e c t e dl e a v e so fm m i c r a n t h aw a ss i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nt h a to fc o n t r o lf r o m9t o3 6d p i ( p o 0 1 ) ( 3 ) i nt h ep r o c e s so fcc a m p e s t r i si n f e c t i o n , t h ec o n t e n to fs o l u b l es u g a ri nl e a v e so fi n f e c t e d 膨m i c r a n t h aw a sa c c u m u l a t e d ，a n dt h ec o n t e n to f s o l u b l ep r o t e i n sw a sd e c r e a s e d t h ec o n t e n t so ft o t a lc h l o r o p h y l l , c h l o r o p h y l laa n dbi nl e a v e so f i n f e c t e d 肱m i c r a n t h aw e r er e d u c e ds i g n i f i c a n t l y , a n dd e c l i n e dm o r eo b v i o u s l yw i t hi n f e c t i o nd a y s t h ea c t i v i t i e so fr u b i s c oc a r b o x y l a s ea n dg l y c o l a t eo x i d a s ew e r er e p r e s s e ds i g n i f i c a n t l yw i t h i n f e c t i o nd a y s ( 4 ) d u r i n gcc a m p e s t r i si n f e c t i o n , t h en e tp h o t o s y n t h e t i cr a t e ( p n ) ，s t o m a t a c o n d u c t a n c e ( g s ) ，t r a n s p i r a t i o nr a t e ( t r ) a n dw a t e ru s ee f f i c i e n c y ( w u e = p n t r ) o fi n f e c t e dl e a v e s w e r el o w e rt h a nt h o s eo fc o n t r 0 1 a t3 6d p i ，t h ep n , g sa n dw u ew e r er e d u c e ds i g n i f i c a n t l y ( 5 ) t r a n s m i s s i o ne l e c t r o n i cm i c r o s c o p ed e t e c t i o ni n d i c a t e dt h a tt h es h a p eo fc h l o r o p l a s t so fi n f e a c t e d l e a v e sw a sa b n o r m a la t18d p i t h ec h l o r o p l a s t sb e c a m es w o l na n dr o u n d i s h t h eo s m i o p h i l i c g l o b u l e si nc h l o r o p l a s t sb e c a m e m o r ea n dl a r g e rt h a nt h e s eo fc o n t r 0 1 t h eq u a n t i t ya n dv o l u m eo f s t a r c hg r a n a sb e c a m em o r ea n dl a r g e rt h a nt h e s eo f c o n t r 0 1 m o r es e r i o u s l y , t h e r ew e r es m a l lh o l e s i nc h l o r o p l a s t s f i n a l l y ，t h ea b n o r m a lc h l o r o p l a s t sf e l lo f fc e l lm e m b r a n e ，a n dt h ec h l o r o p l a s t m e m b r a n ew a sf r a c t u r e da n dd i s o r g a n i z e d ， p o i n tt w o ：m o l e c u l a re v e n t so fc c a m p e s t r i s - 膨m i c r a n t h ai n t e r a c t i o na r ep o o r l yu n d e r s t o o d h o w e v e r w ei d e n t i f i e dn o v e lg e n e s 丹o mmm i c r a n t h ai n d u c e db yc c a m p e s t r i si n f e c t i o n g e n e s e x p r e s s e du p o np a r a s i t i z a t i o nb ycc a m p e s t r i sa te a r l yp o s t - p e n e t r a t i o ns t a g e sw e r ei n v e s t i g a t e db y c o n s t r u c t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fs u b t r a c t e dc d n al i b r a r i e sf r o ms h o o t sa n ds t e m sofm m i c r a n t h a t h r e eh u n d r e da n dt h r e ep r e s u m a b l yu p - r e g u l a t e de x p r e s s e ds e q u e n c et a g s ( e s t s ) w e r e i d e n t i f i e da n dc l a s s i f i e di nf u n c t i o n a lc a t e g o r i e s ，s u c ha s m e t a b o l i s m ，c e l ld e f e n c ea n ds t r e s s ， t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，s i g n a lt r a n s d u c t i o n ， t r a n s p o r t a t i o n ，a n d p h o t o s y n t h e s i s ，i ns h o o t sa n d s t e m so fi n f e c t e dmm i c r a n t h a ，g e n e sa s s o c i a t e dw i t hd e f e n c er e s p o n s e sa n dc e l lw a l l m o d i f i c a t i o n sw e r ei n d u c e d ，c o n f i r m i n gs i m i l a rd a t af r o mo t h e rp a r a s i t i cp l a n t - p l a n ti n t e r a c t i o n s h o w e v e r , g e n ee x p r e s s i o np r o f i l e si ni n f e c t e ds h o o t sa n ds t e m sw e r ef o u n dt ob ed i f f e r e n t c o m p a r e dt oi n f e c t e ds h o o t s ，m o r eg e n e si n d u c e di nr e s p o n s et ob i o t i ca n da b i o t i cs t r e s sf a c t o r s w e r ei d e n t i f i e di ni n f e c t e ds t e m s m o r e o v e r , i6 2 9 o ft h ec c a m p e s t r i s - i n d u c e de s t si ns h o o t s a n d17 6 0 o ft h ec c a m p e s t r i s i n d u c e de s t s i ns t e m sm a t c h e dg e n e sw i t hu n k n o w nf u n c t i o ni n t h en c b id a t a b a s e e x p r e s s i o na n a l y s i sb yq u a n t i t a t i v er e a l t i m er t - p c ro f21g e n e s ( f r o m v 中山大学博+ 学位论文薇l 菊对用野菟丝子寄生响席的生理生化和分子机制研究 d i f f e r e n tf u n c t i o n a lc a t e g o r i e s ) s h o w e ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dl e v e l sf o r13t r a n s c r i p t si nr e s p o n s e t oc c a m p e s t r i si n f e c t i o n t h u s ，s e q u e n c i n go fs s hl i b r a r i e sc o m b i n e dw i t hr e a l t i m er t - p c r e x p e r i m e n t sh a sb e e ns u c c e s s f u l l yu s e dt oi d e n t i f ym m i c r a n t h ag e n e si n d u c e du p o nc c a m p e s t r i s i n f e c t i o n i nc o n c l u s i o n , t h i ss t u d yp r o v i d e sa no v e r v i e wo fg e n e sf r o mp a r a s i t i z e dmm i c r a n t h aa t e a r l yp o s t - p e n e t r a t i o ns t a g e s t h ea c q u i r e dd a t af o r mt h eb a s i sf o ram o l e c u l a ru n d e r s t a n d i n go f h o s tr e a c t i o n si nr e s p o n s et op a r a s i t i cp l a n t s t h ei n f o r m a t i o ng e n e r a t e di nt h i ss t u d yw i l lb eag o o d s t a r t i n gp o i n tf o rf u r t h e rr e s e a r c ho nt h ei d e n t i f i e dg e n e s ，i na d d i t i o n ，f r o mt h er e s u l t so fe d n a l i b r a r i e s ，w eo b t a i n e d7 5e s t s ，w h i c hw e r eh o m o l o g u et op l a n ts i n g l e s l r a n dr n av i r u s t h e s e d e t e c t i o nr e s u l t ss u p p l i e du san e wr e s e a r c ha n g l eo fv i e w , w h i c hw a st h ep e r p l e x i n gi n t e r a c t i o n a m o n g 膨m i c r a n t h a ，cc a m p e s t r i s ，a n dp l a n tr n a v i r u s ， p o i n tt h r e e ：w eu s e dr a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s ( r a c e ) a n ds p l i c i n go v e r l a pe x t e n s i o n p c rt oc l o n et h ef u l l - l e n g t hc d n a so f an o v e lp u t a t i v ec h i t i n a s eg e n ea n d t w on a c g e n e sf r o mm m i c r a n t h a ，a n dr e s e a r c h e dt h ep r e l i m i n a r yf u n c t i o n so ft h e s eg e n e s ( 1 ) b a s e do na ne s t w i t hh i g hh o m o l o g u et oc h i t i n a s eg e n e sf r o mg e n b a n kd a t a b a s e ，an o v e l p u t a t i v ec h i t i n a s eg e n ef r o m 肱m i c r a n t h as h o o t si n f e c t e db ycc a m p e t r i s ，d e s i g n a t e da sm m c h i l ， w a si d e n t i f i e db yu s i n gr a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s ，t h ef u l l l e n g t he d n ao fm m c h i lw a s 12 9 5b p ，w h i c hc o n t a i n e da9 5 7 一b po p e nr e a d i n gf r a m e ，a51 - b p5 - u t ra n da2 8 7 - b p3 - u t r m m c h i le n c o d e d318a m i n oa c i d s w i t ha p r e d i c t e dm o l e c u l a rm a s so f 3 5 4 2k d aa n dap lo f5 6 9 t h eg e n o m i ec l o n eo fm m c h i lw a s2 7 4 9b pl o n g ，c o n t a i n i n gt w oi n t r o n si ns i z eo f1 171a n d6 21b p ， r e s p e c t i v e l y , a n dt h r e ee x o n si ns i z eo f3 7 9 ，16 0a n d418b p ，r e s p e c t i v e l y s o u t h e r nb l o ta n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tm m c h i lw a sp r e s e n ta sal o w c o p yg e n e r t - p c ra n a l y s i sa l s os h o w e dt h a tt h e c o r r e s p o n d i n gm r n a w a s e x p r e s s e ds t r o n g l yi ns h o o ta n dr e l a t i v e l yl o wl e v e li ns t e ma n dr o o t ，b u t n o ti nl e a fa n dp e t i o l e b o t hs e m i q u a n t i t a t i v er t - p c ra n dr e l a t i v er e a l t i m er t - p c ra n a l y s e s r e v e a l e dt h a tt h eh i g h e s tm m c h i lt r a n s c r i p ti ns h o o t so fi n f e c t e d 必m i c r a n t h ao c c u r r e da t2d a y s p o s ti n f e c t i o n ( d p i ) a n dt h e nm a r k e d l yd e c r e a s e df r o m2t o14d p i ，m e a n w h i l e ，o u rr t - p c r f i n d i n g si n d i c a t e dt h a tt h em m c h i lt r a n s c r i p tl e v e li ns h o o tw a si n d u c e db yw o u n d i n g ，s a , a b a ， s a l ta n dz n s 0 4 m o r e o v e r , t h ef u l lc o d i n gs e q u e n c eo fm m c h ile d n aw a sc l o n e du s i n gp c ra n d f u r t h e rs u b c l o n e di n t op e t - 3 2 a ( + ) t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t - 3 2 a - m m c h ilw a se x p r e s s e di na p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e ma f t e ri t st r a n s f o r m a t i o ni n t oec o i ls t r a i nb l 21 ( d e 3 ) t h e s d s p a g ed i s p l a y e dt h a tt h er e c o m b i n a n t p r o t e i nw a sm a i n l ya p p e a r e da si n c l u s i o nb o d i e sb y v l i 山大学跨十学位论文薇 菊对田野菟丝子寄生响应的生理生化和分子机制研究 i p t gi n d u c t i o n , w i t has i z eo f5 5k d a t h e nw et r i e dt ou s ed i f f e r e n te x p r e s s i o nv e c t o r s ，t od e c r e a s et h e c u l t u r et e m p e r a t u r e , t oa d j u s to s m o t i cp r e s s u r ea n dt ot r a n s f o r md i f f e r e n te x p r e s s i n gg r a i n s f i n a l l y , t h e p l a s m i dp e t - 3 2 a - m m c h i lw a se x p r e s s e di nec o l ts t r a i nr a s o t t a - g a m i t m ( d e 3 ) ，m a i n l ya p p e a r e d a ss o l u b l ef o r m t h eo p t i m a lc u l t u r et e m p e r a t u r ea n dt h eo p t i m a lt i m ea f t e ri n d u c t i o nw e r ef o u n dt o b e2 5 a n d4h ，r e s p e c t i v e l y t h er e c o m b i n a n tp r o t e i nm m c h ilw a s p u r i f i e db yu s i n gh i s b i n dk i t a c c o r d i n gt ot h eu s ep r o t o c 0 1 t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ea n dp ho fp u r i f i e dr e c o m b i n a n tm m c h i l w e r ed e t e r m i n e dt ob e3 5 - 4 0 a n d5 5 6 5 ，r e s p e c t i v e l y ( 2 ) t w on a c - l i k eg e n e sf r o ms t e m so fcc a m p e t r i s - i n f e c t e d 必m i c r a n t h a ，d e s i g n a t e da s m m a t a f la n dm m n a p ，r e s p e c t i v e l y , w e r ei d e n t i f i e db yu s i n gr a c e n u c l e o t i d es e q u e n c ed a t a i n d i c a t e dt h a tb o t hm m a t a f la n dm m n a pc o n t a i n e dt w oi n t r o n sa n dt h r e ee x o n s ，r e s p e c t i v e l y , a n d t h a tt h e ys h a r e dc o n s e r v a t i v es t r u c t u r eo fg e n o m i co r g a n i z a t i o n t h es p l i c ej u n c t i o n si nt h e s eg e n e s w e r ec o n f i r m e db ys e q u e n c ea n a l y s e so fc o r r e s p o n d i n ge d n ac l o n e s t h et r a n s l a t i o np r o d u c t s r e v e a l e dt h a tt h e ye a c hc o n t a i n e das t r i k i n g l yc o n s e r v a t i v er e g i o na tt h e i rn - t e r m i n a le